PŘEHLED KLASICKÝCH A MODERNÍCH MIKROSKOPICKÝCH METOD Jan Hošek Ústav přístrojové a řídící techniky, Fakulta strojní, ČVUT v Praze, Technická 4, 166 07 Praha 6, Česká republika Ústav termomechaniky AV ČR, Dolejškova 5, 182 00 Praha 8, Česká republika
[email protected] Abstrakt: Příspěvek podává krátký přehled o historickém vývoji mikroskopové techniky od jejích počátků až k současným běžně a experimentálně používaným zařízením. Jsou sledovány hlavní vývojové kroky od běžné optické mikroskopie, metody zlepšení rozlišení specifických pozorovaných předmětů, až k mikroskopové technice jdoucí za hranici difrakčního limitu. Kromě vývoje optické mikroskopie jsou v článku také prezentovány další, v poslední době používané mikroskopické metody, vedoucí až na rozlišení jednotlivých atomů měřeného předmětu. Úvod: Mikroskopie je vědecká disciplína, která se zabývá pozorováním a měřením malých předmětů pomocí různé zvětšovací techniky. Počátky lidského zájmu o pozorování zvětšených předmětů lze dokumentovat již od 13. století, kdy Brit Roger Bacon pozoroval zvětšené obrazy pomocí vodních kapek, segmentů skleněných kuliček a zvětšovacích částí skel a doporučoval tato pozorování jako příjemnou zábavu. Nicméně pokusy s aktivním broušením zvětšovacích čoček nastaly až v následujícím století a základy současné mikroskopie lze datovat až do počátku 17. století, kdy Holanďané Hans a Zacharias Jansenové vytvořili první složený mikroskop. Používání mikroskopu se velmi rychle rozšířilo po celé Evropě a na základě jeho konstrukce vytvořil roku 1609 Galieo Galiei svůj astronomický dalekohled. Další vývoj spočíval ve snaze dosáhnout co největšího dosaženého zvětšení mikroskopu. S velkým úspěchem si počínal Antoni van Leeuwenhoek, jehož dochovaný složený mikroskop dosahoval 275 násobné zvětšení a jeho mikroskopy pravděpodobně dosahovali zvětšení až 500, při použití kulových čoček s ohniskovou vzdáleností pod 1 mm. Tyto první mikroskopy však vykazovaly řadu aberací, které významným způsobem zkreslovaly pozorované předměty, a mnohdy měli zásadní vliv na výklad pozorování. Proto další vývoj vedl k pokusům o minimalizaci optických vad mikroskopu. Prvním takovým úspěchem byla minimalizace barevné vady zobrazení Davidem Gregorym roku 1695, který použil kombinaci několika čoček s různou hodnotou disperze. Další významný krok k minimalizaci aberací mikroskopu učinil roku 1771 Leonhard Euler, který navrhl teoretický princip achromatického objektivu a matematickou metodu jeho výpočtu. Hlavní příspěvek ke konstrukci moderních optických mikroskopů je však spojován s hlavním konstruktérem firmy Karl Zeiss Ernstem Abbe, který koncem 19 století na základě vlastních experimentů teoreticky vysvětlil princip mikroskopového zobrazení a za pomoci optických výpočtů navrhl roku 1886 apochromatický objektiv korigující zbytkové barevné vady a sférické vady zobrazení i pro vysoké hodnoty jeho numerické apertury. Významný
12
krok také udělal roku 1893 August Köhler, který navrhl způsob osvětlení předmětu maximálně využívající numerickou aperturu Abbého objektivů. Na počátku 20. století pak finalizovaly funkční principy současných běžných optických mikroskopů objev parfokalních objektivů umístěných na otočném revolveru a roku 1924 také objev objektivu korigovaného na nekonečnou vzdálenost. Běžné optické mikroskopy: Optické schéma běžného mikroskopu se skládá ze dvou optických prvků – objektivu a okuláru umístěných ve vzájemné konstantní vzdálenosti t nazývané optický interval, jak je naznačeno na obrázku 1:
Obr. 1: Schéma běžného složeného mikroskopu [1]. Pozorovaný předmět je umístěn těsně před předmětové ohnisko objektivu, který vytváří jeho zvětšený obraz. Ten je pak pozorován neakomodovaným okem v rovnoběžném svazku paprsků ve výstupní pupile okuláru. Celkové zvětšení mikroskopu (1) je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru, který je v tomto uspořádání používán jako lupa. t 250 Γ= (1) f ob ´ f ok ´ Nicméně jak Ernst Abbé experimentálně zjistil, kvalita detailů zobrazení není dána velikostí zvětšení mikroskopu, ale hodnotou numerické apertury použitého objektivu, kdy se na tvorbě obrazu předmětu podílejí i nejvíce difraktované paprsky obsahující informace o nejvyšších prostorových frekvencích předmětu. Pro určení velikosti nejmenších pozorovatelných detailů, omezených difrakčním limitem, se pak používá Abbé-Rayliegho kritérium dané rovnicí:
d = 1,22
λ
, (2) 2 NA kde λ je vlnová délka použitého záření a NA je numerická apertura objektivu vyjádřená rovnicí: NA = n sin α , (3) kde n je index lomu v předmětovém prostoru a α je polovina vrcholového úhlu světelného kužele, které se podílí na tvorbě obrazu. Velikost kolektivního úhlu α nemůže být nikdy větší než 90° a obvykle jeho maximální hodnota bývá 72°. To dává pro vzduch maximální numerickou aperturu objektivu NA = 0,95. Tuto hodnotu lze zvýšit použitím různých imersních kapalin až na hodnoty NA 1,2-1,6. Po dosazení těchto hodnot do rovnice (2) lze určit velikost nejmenších pozorovatelných detailů na hodnotu d = 0,2 µm. Odtud při uvažování úhlové rozlišovací schopnosti běžného oka 1´ lze určit maximální hodnotu užitečného zvětšení optického mikroskopu na Γ = 500-1000. Současné kvalitní mikroskopy uvedených parametrů již dosahují, ačkoliv běžně používané zvětšení bývá nižší. 13
Mechanická konstrukce uspořádání mikroskopu je ovlivněna především typem vzorku, pro který je mikroskop určen a způsobem jeho osvětlení. Kromě klasických typů mikroskopů, jak je naznačeno na obrázku 2 vlevo se vyrábějí také invertované typy mikroskopů, viz obrázek 2 vpravo, kde je vzorek přikládán shora. V obou konstrukcích je pak možné zvolit způsob osvětlení vzorku na průchod nebo na odraz a to pomocí difúzního světla a nebo Köhlerova osvětlovače, případně vertikálního iluminátoru umožňující rovnoměrné osvětlení předmětu ve všech směrech apertury mikroskopu.
Obr. 2: Ukázka klasické vertikální – vlevo a invertované – vpravo konstrukce mikroskopu. Způsob osvětlení vzorku má zásadní vliv na kvalitu kontrastu jeho zobrazení a pozorovatelnost jeho jednotlivých detailů. Proto byly kromě osvětlení ve světlém poli, kdy je kromě předmětových paprsků pozorováno i rozptýlené osvětlovací záření, navrženy i další metody osvětlení předmětu. Nejjednodušší způsob zvýšení kontrastu vhodný pro povrchově strukturované vzorky je použití mimoosého, případně šikmého osvětlení. Tím se posune optická přenosová funkce soustavy a ve směru osvětlení dojde k lepšímu rozlišení detailů v důsledku protažení stínu jednotlivých povrchových detailů. Inverzní metodou k osvětlení ve světlém poli je metoda osvětlení předmětu ve tmavém poli. V tomto případě není předmět osvětlen v kuželu odpovídajícímu numerické apertuře mikroskopu, ale naopak v části kuželu mimo ni tak, aby se do roviny obrazu předmětu dostaly pouze předmětové paprsky. Příklad uspořádání osvětlovače pro pozorování v temném poli na průchod je uveden na obrázku 3.
Obr. 3: Příklad realizace osvětlení předmětu v temném poli – vlevo a pomocí Rheinbergova barevného osvětlení - vpravo [2]. 14
Kontrast pozorovaného předmětu lze také zvýšit použitím nikoliv polychromatického záření, ale částečně monochromatického záření například zařazením barevných, interferenčních nebo polarizačních filtrů do optické soustavy osvětlovače nebo mikroskopu. Kombinací konstrukce osvětlení v temném poli, kde jsou jednotlivé části clony nahrazeny vhodnými barevnými filtry, lze získat Rheinbergovo barevně selektivní osvětlení, jak je naznačeno na obrázku 3 vpravo. Zásadní význam pro zlepšení pozorování běžně průhledných, zejména biologických vzorků přinesl objev využití fázového kontrastu v mikroskopii Fritsem Zernikem v roce 1934. Základním principem této metody je zviditelnění změny fáze záření difraktované vzorkem pomocí interference s vhodně fázově posunutým nedifraktovaným zářením. Obvyklá konstrukce mikroskopu ke zviditelnění fázového kontrastu se skládá z clony ve tvaru mezikruží umístěné v osvětlovací soustavě. V ohniskové rovině objektivu je pak umístěna fázová clona ve tvaru mezikruží, na které dochází k fázovému posunu mezi předmětem difrakotovanými a nedifraktovanými paprsky tak, aby jejich vzájemný fázový posun byl λ/2 a tím bylo dosaženo maximálního kontrastu intenzity. Schematické uspořádání konstrukce mikroskopu pro pozorování s fázového kontrastu je uvedeno na obrázku 4:
Obr. 4: Obvyklé optické uspořádání mikroskopu pro fázový kontrast. [Balpan Instruction Manual] Nevýhodou tohoto zobrazení ovšem je, že v důsledku prstencové aperturní clony dochází na okrajích pozorovaných předmětů ke vzniku prstencového hala. Kromě tohoto uspořádání ale lze využít k vizualizaci fázového kontrastu i různé principy interferenčních mikroskopů. Pro polarizující a dvojlomné vzorky, jakými jsou například krystaly minerálů, se běžně používají polarizační mikroskopy, které jsou vybaveny polarizátorem v osvětlovací části mikroskopu a analyzátorem v mikroskopu. Na základě tohoto jednoduchého polarizačního mikroskopu ovšem Georges (Jerzy) Nomarski vytvořil princip diferenciálního interferenčně kontrastního mikroskopu. Běžné schéma polarizačního mikroskopu je za polarizátorem doplněno Nomarskim upraveným Wollastonovým hranolem, který polarizované záření pod 45° rozdělí na dva vůči sobě kolmé polarizované svazky s mírným příčným posunutím přibližně 0,2 µm. Ty procházejí dále vzorkem a objektivem mikroskopu až k dalšímu Wollastonovu hranolu, kde se obě fázově neposunuté polarizace svazků natočí do úhlu 135° a odfiltrován analyzátorem. Nicméně vzhledem k tomu, že díky mírnému posunutí každý svazek procházel jinou částí vzorku, je za analyzátorem pozorován střihově 15
interferenční intenzitní obraz fázové struktury vzorku, stejný jako v případě metody fázového kontrastu. Příklad optického uspořádání tohoto typu mikroskopu je uveden na obrázku 5:
Obr. 4: Uspořádání diferenciálního interferenčně kontrastního mikroskopu [2]. Ovšem vizualizaci fázových nebo dráhových rozdílů vzorku lze provést i dalšími typy interferenčních mikroskopů. Ty lze realizovat pomocí specielních objektivů typu Mirau nebo Michelsonova interferometru, nebo lze Michelsonův nebo Mach – Zehnderův interferometr umísti přímo do svazku paprsků uvnitř mikroskopu.
Obr. 5: Optická schémata interferenčních objektivů typu Mirau – vlevo a Michelsonova – vpravo interferometru. Pomocí těchto typů interferenčních mikroskopů je možné vizuálně rozlišit rozměry detailů ve směru podél optické osy na zlomky vlnových délek. Nicméně s rozvojem elektroniky a zejména dostupnosti CCD kamer během 90. let 20. století se zcela změnil způsob vyhodnocování mikroskopových obrazů, kdy okuláry mikroskopu slouží spíše pro orientaci při přípravě vzorku a vlastní pozorování, vyhodnocování, zpracování obrazu a jeho záznam je prováděn na připojeném počítači. Při numerickém vyhodnocení obrazů interferenčních mikroskopů pak lze v extrémních případech rozlišit v ose z zlomky nm. Nutnost připojení kamer, interferometrů, laserových zdrojů či optických manipulátorů k jednotlivým mikroskopům vedla v průběhu posledních 20 let ke celkové změně jejich konstrukce. Klasické řešení optického mikroskopu s pevnou tubusovou vzdáleností v rozsahu 150-210 mm bylo nahrazeno mikroskopy s objektivy korigovanými na nekonečnou vzdálenost a modulární mechanickou konstrukcí, kde do rovnoběžného svazku paprsků je možné snadno zařadit jednotlivé volitelné komponenty. 16
I přes vysoké rozlišení a kvalitu zobrazení všechny uvedené typy mikroskopů postrádají jeden člověku velmi přirozený vjem a to stereoskopické vidění. Tento nedostatek byl vyřešen již roku 1896, kdy Ernst Abbé zkonstruoval první stereoskopický mikroskop na základě diskuse s americkým biologem Horatiem S. Greenoughem. První stereomikroskop byl zkonstruován jako dva samostatné mikroskopy s převratnými hranoly, které spolu svírají úhel 15°, který odpovídá úhlu konvergenci očí na předmětovou vzdálenost 250 mm. Nicméně toto uspořádání má nevýhodu v různoběžnosti předmětových rovin obou mikroskopů a z mechanických důvodů také větší pracovní vzdáleností, což snižuje hodnotu užitečného zvětšení na Γ <100. Proto se častěji používá konstrukce dalekohledového typu se společným objektivem, jak je naznačeno na obrázku 6 uprostřed.
Obr. 6: Koncepty stereomikroskopů [Zeiss] a bezokulárový stereomikroskop [Linxx] Současné konstrukce stereoskopických mikroskopů se již však také snaží minimalizovat pozorování předmětu prostřednictvím okulárů a tak jsou konstruovány bezokulárové stereomikroskopy. Další variantou je snímání obou obrazů CCD kamerami a pozorování stereoobrazu na monitoru pomocí dvou barevných stereobrýlí a nebo polarizačních brýlí na LCD monitoru. Optické mikroskopy s vysokým rozlišením:
Konstruktéři moderních mikroskopů si byli vždy vědomi limitujícího faktoru svých zařízení daných difrakčními vlastnostmi záření, avšak vždy hledali cesty ke zvýšení jejich rozlišovací schopnosti. Pokusy o zvýšení rozlišení pomocí zkrácení vlnové délky pozorování vedly ve 20. letech minulého století až ke konstrukci mikroskopu pro UV záření. Tato konstrukce pak byla využita v následujících letech ke konstrukci prvních fluorescenčních mikroskopů. Hlavní výhodou tohoto typu mikroskopie je, že sledovaný předmět září svým vlastním světlem, pomocí něhož lze vizualizovat i detaily libovolně malých rozměrů. Současná konstrukce fluorescenčních mikroskopů pochází z roku 1932 od E. Singera [3]. Jako zdroj je použit intenzivní zdroj UV záření typu výbojky, laseru nebo LED diody. Jeho záření je pomocí dichroického zrcadla přivedeno do objektivu mikroskopu v uspořádání pro pozorování v temném poli. Ozářený předmět je excitován a autofluorescenční záření vzorku, případně navázaných fluorescenčních barviv je zobrazeno objektivem zpět do mikroskopu přes dichroický filtr, který zabraňuje průchodu excitačního záření dále do mikroskopu. Za ním
17
následuje výměnný filtr propouštějící fluorescenční záření pouze požadovaných vlnových délek. Optické schéma toho uspořádání fluorescenčního mikroskopu je uvedeno na obrázku 7:
Obr. 7: Optické schéma uspořádání osvětlovací části fluorescenčního mikroskopu. [http://micro.magnet.fsu.edu] Výsledný fluorescenční obraz vzorku je možné pozorovat pomocí okulárů a nebo je zaznamenáván pomocí jedné nebo více CCD kamer na požadovaných vlnových délkách vymezených soustavou filtrů. Kromě tohoto nejobvyklejšího transmisního uspořádání se používají i další metody excitace vzorku. Roku 1980 byla Danielem Axelrodem vyvinuta metoda excitace vzorku pomocí evanescentních vln při totálnímu odrazu. To vede k rozlišení velmi malých detailů vzorku, protože hloubka excitační vrstvy záření dosahuje hodnot přibližně jen 100 nm. Další významný vývojový krok, který vycházel z potřeb zlepšení rozlišení a kontrastu fluorescenčních mikroskopů pro tlusté tkáňové vzorky, vyvrcholil v konstrukci konfokálního mikroskopu na přelomu 50. a 60. letech 20. století. Vývojem tohoto typu mikroskopu se nezávisle zabývaly tři vědecké skupiny a to Marvin Minski v USA, Petráň a Hadravský v Československu a Svischchev v Rusku, kteří postavili tři odlišné typy konfokálních mikroskopů. Díky náročnosti zpracování dat se však použití konfokálních mikroskopů rozšířilo teprve v 80. letech 20. slotetí. Komerčně nejúspěšnější se pak stala konstrukce laserového rastrovacího konfokálního mikroskopu Marvina Minského, která je zobrazena na obrázku 8. Hlavní výhodou konfokálního uspořádání zobrazení mikroskopu je omezení obrazu zdroje záření pouze na 0. difrakční řád při jeho známé poloze, potlačení záření z jiných směrů a tím výrazného zvýšení rozlišovací schopnosti ve směru optické osy a mírného zlepšení rozlišení v příčném směru. Měřený vzorek je tedy osvětlován postupně rastrovacím způsobem bodovým zdrojem o velikosti odpovídajícímu maximálnímu rozlišení objektivu mikroskopu. Odražené, rozptýlené a fluorescenční záření z osvětleného bodu je pak stejným objektivem zobrazeno na druhou konfokální clonu, která zamezuje průchodu záření na detektor z jiné než právě měřené roviny. Tím je docíleno vysoké rozlišovací schopnosti 0,14 µm v příčné a 0,23 µm v podélné rovině pro případ použití numerické apertury objektivu 1,4 a modrou vlnovou délku laserového zdroje. Fotodetektorem umístěným za druhou konfokální clonou pak obvykle je velmi citlivý fotonásobič, případně lavinová dioda.
18
V konstrukci těchto mikroskopů se používají se dva různé způsoby rastrovacích systémů. V prvním případě je pro rastrování použito pohyblivé dichroické zrcadlo. Ve druhém případě je celá optická soustava v klidu a rastrovací pohyb je prováděn vzorkem umístěném na polohovacím stolku, což zlepšuje rozlišení a zajišťuje shodné optické zobrazení po celém měřeném vzorku. Nevýhodou ovšem je delší čas pro rastrování vzorku. Proto většina komerčních mikroskopů využívá pro rastrování různých konstrukcí pohyblivých zrcadel nebo rozmítačů.
Obr. 8: Optické schéma uspořádání laserového konfokálního mikroskopu. [http://www.microscopyu.com] Ještě vyššího rozlišení bylo dosaženo pomocí speciálních úprav konfokálního mikroskopu a to 4π konfigurací nebo theta mikroskopu vyvinutého Stelzerem a Lindekem a patentovaném v roce 1996. Tyto mikroskopová metody vycházejí z omezení velikosti pozorovaného osvětleného objemu použitím více laserových zdrojů. V případě 4π konfigurace jdou laserové svazky proti sobě a měřený objem je tvořen jejich interferenční strukturou. V případě theta mikroskopie jsou laserové svazky zkříženy a v ideálním případě jsou pozorovány pod úhlem θ = 90°. To vede k výraznému až 2,5 násobně menšímu měřenému objemu oproti běžnému konfokálnímu mikroskopu, který je navíc isotropně osvětlen a má kulový tvar. Schémata vzniku tvaru osvětleného prostoru pro konfokální, 4π a theta mikroskopii jsou zobrazena na obrázku 9:
Obr. 9: Srovnání měřených objemů různých úprav mikroskopů. [www.nanoscale-optics.de] K dosažení vyššího rozlišení vede cesta zkracováním vlnové délky záření použitého k optické mikroskopii. Proto v současné době nejvyššího rozlišení dosahují mikroskopy založené na použití Röntgenova záření. To s sebou ovšem přináší řadu komplikací, a to jak 19
z bezpečnostního hlediska, tak i nutnost vývoje vhodných zdrojů a detektorů záření a samozřejmě všech optických členů. Vzhledem k používaným energiím fotonů v rozmezí 1-16 keV není možné použít pro zobrazovací optiku běžné optické prvky, ale využívají se objektivy na bázi difraktivní optiky, jako zonální destičky s rozměry zón 20-30 nm a ohniskovou vzdáleností 1 mm, segmentová optika na bázi totálního úhlu odrazu a nebo specielní vrstvová optika. V posledních 40 letech tak bylo vyvinuto několik typů röntgenovských mikroskopů a příklad jednoho konstrukčního schématu takového mikroskopu je uveden na obrázku 10:
Obr. 10: Příklad optického schéma röntenovského mikroskopu [6]. Postupným vývojem röntgenovských mikroskopů byly realizovány různé způsoby pozorování vzorku. Běžně se používají techniky transmisního, difrakčního a fluorescenčního měření. Ale byly vyvinuty také rastrovací, polarizační nebo tomografické techniky. Tento typ optických mikroskopů tak v současné době dosahuje nejvyšších hodnot prostorového rozlišení a to 8 nm pro krystalické vzorky a 30 nm pro ostatní typy vzorků. Neoptické mikroskopy:
Ve 30. letech minulého století se konstrukce optických mikroskopů přiblížila svým teoretickým možnostem rozlišení. Proto se hledal další způsob zvýšení rozlišení s použitím elektronů, jejichž de Broglieho vlnová délka je výrazně kratší než vlnová délka světla. První elektronový mikroskop vytvořili Němci Ernst Ruska a Max Knoll roku 1931. Konstrukce prvního mikroskopu vycházela z uspořádání běžného optického transmisního mikroskopu a toto řešení se stále úspěšně používá, jak je zobrazeno na obrázku 11. K pozorování se používá měření absorpce vzorku pro elektrony urychlené napětím 20-150 kV. S dalším vývojem elektronových mikroskopů byl v laboratořích univerzity v Cambridgi v Anglii roku 1965 vytvořen první typ rastrovacího elektronového mikroskopu. Dále pak byl vyvinut odrazný elektronový mikroskop a další jeho varianty. Kromě elektronových mikroskopů byly vyvinuty také iontové a neutronové mikroskopy ve snaze snížit vady elektronových mikroskopů v důsledku odpudivých sil v elektronovém svazku. Nicméně svůj teoretický rozlišovací potenciál plně využil až transmisní elektronový mikroskop s vysokým rozlišením, kde je
20
místo měření intenzity svazku po průchodu vzorkem je vyhodnocován fázový kontrast interference elektronového svazku za vzorkem. V současné době dosahuje tento typ elektronového mikroskopu podatomového rozlišení až 0,05 nm.
Obr. 11: Ukázka běžného transmisního elektronového mikroskopu. I přes svoje vysoké rozlišení je hlavní nevýhodou elektronových mikroskopů nutnost pracovat pouze s kovovými a nebo polovodivými vzorky ve vakuu, což s sebou přináší značné komplikace, zejména při pozorování biologických preparátů, které je nutné pokovovat. Pro zmírnění těchto komplikací byly v současné době vyvinuty mikroskopy, které dovolují pozorovat například hydratované vzorky nikoliv v obvyklém vakuu při tlaku ~ 0,01 Pa, ale jen za sníženého tlaku při 2,7 kPa. Byly vyvinuty i další typy neoptických mikroskopů využívající například ultrazvukových vln k pozorování vzorku, nicméně převratný objev v mikroskopové technice zaznamenaly objevy tunelovacího mikroskopu a po té i mikroskopu atomových sil a jejich derivátů. Princip rastrovacího tunelovacího mikroskopu byl vyvinut pány Gerdem Binnigem a Heinrichem Rohrerem v Zürichské pobočce firmy IBM na přelomu 70 a 80. let minulého století. Principielně stejné mechanické uspořádání svého mikroskopu použil již o deset let dříve Russell Young, avšak ten se s hrotem mikroskopu nepřiblížil k vzorku tak blízko (pod 1 nm), aby k detailnímu zobrazení využil tunelovaní proud mezi vzorkem a hrotem. Schéma funkce principu rastrovacího tunelovacího mikroskopu je uvedeno na obrázku 12:
Obr. 12: Princip funkce rastrovacího tunelovacího mikroskopu. Základním principem měření STM mikroskopu tedy je využití exponenciální závislosti tunelovacího proudu na vzdálenosti mezi měřeným vzorkem a rastrovacím hrotem 21
umístěným v jeho těsné blízkosti. Tato exponenciální závislost je tak strmá (~ 1 řád /0,1 nm), že 90% protékajícího proudu prochází pouze posledním atomem hrotu a to dává STM mikroskopům jejich vysoké podatomové rozlišení. To je ovšem dosažitelné pouze s použitím vysoce přesného řízení vzájemné polohy mezi vzorkem a hrotem pomocí piezoposuvů s přesností polohování na 0,01 nm, perfektní vibroizolace, velmi vysokého vakua a nízkých teplot. To je hlavním limitujícím faktorem většího použití tohoto typu mikroskopu, který je navíc použitelný pouze pro elektricky vodivé nebo polovodivé vzorky. Nicméně záhy po dokončení vývoje rastrovacího tunelovacího mikroskopu začal Gerd Binnig pracovat na mikroskopu atomových sil AFM, který poprvé představil v roce 1986. Tento typ mikroskopu ovšem využívá k měření vzájemného silového účinku mezi vzorkem a rastrujícím hrotem. K měření se pak používají jen takové vzdálenosti, kdy má funkce vzájemné síly lineární charakteristiku, jak je zobrazeno na obrázku 13 vlevo.
Obr. 13: Průběh silové interakce mezi vzorkem a hrotem při AFM – vlevo a schéma principu AFM mikroskopu – vpravo [www.uni-leipzig.de]. To má ovšem za následek mnohem vyšší nároky na kvalitu zakončení rastrovacího hrotu. Ten se v současné době vyrábí především fotolitograficky v podobě raménka, jehož vychýlení je nejčastěji měřeno pomocí odrazu laserového paprsku a segmentové fotodiody. To umožňuje měření nejen vertikálních silových účinků, ale také smykových sil. Protože silový účinek mezi hrotem a vzorkem je vždy přítomen, je možné použít AFM mikroskopii na vzduchu nebo ve vodě a dokonce lze funkci hrotu dále modifikovat pro měření magnetických sil, chemických potenciálů, statického náboje a kapacity, elektrické nebo tepelné vodivosti či akustických či optických vlastností nebo pro vytváření a modifikaci nanotruktur či manipulaci s jednotlivými atomy. To dává AFM mikroskopii obrovskou použitelnost v širokém spektru oborů i díky jeho malým rozměrům a možnosti zařazení AFM mikroskopu jakou součásti běžných optických mikroskopů. Závěr:
Tento článek podal krátký přehled o vývoji mikroskopové techniky od svých prvopočátků, až po moderní mikroskopy umožňující rozlišení jednotlivých atomů vzorku. Článek se z důvodů obsáhlosti všech vývojových a konstrukčních typů mikroskopů snažil prezentovat pouze jejich základní varianty a jejich příspěvek ke zvýšení rozlišovací schopnosti měřeného vzorku. Každý z uvedených typů moderních mikroskopů pak představuje podstatě samostatnou vědeckou disciplínu, a pro správné proměření vzorku a jeho vyhodnocení je nezbytná dlouhodobá praxe a zkušenost. I proto je veškerá mikroskopová technika neustále zlepšována a jsou vytvářeny nové postupy měření, aby mohl být dokonale prozkoumán jakýkoliv typ měřeného vzorku. 22
Literatura
[1] Bumbálek, J.: Základy technické optiky. Skripta ČVUT. 1995. [2] Davidson, M. W. - Abramovitz, M.: Optical Microscopy. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/pdfs/microscopy.pdf [3] Singer, E.: A microscope for observation of fluorescence in living tissues. Science 1932, vol. 75, pp. 289-291. [4] Mc Namara, G. – Difilippantonio, M. J. – Ried, T.: Microscopy and Image Analysis. Current Protocols in Human Genetics 2005, 4.4.1-.4.4.34. [5] Plášek, J. Konfokální mikroskop. Vesmír 1995, vol. 74, no. 9, pp. 508 [6] Ade, H.: X-ray spectromicroscopy, In:Vacuum Ultraviolet spectroscopy, 225262, ACADEMIC PRESS, 2000.
23
