Přednáška 6: Neuropřenašeče: neuropeptidy a puriny V této přednášce se zastavíme u dvou tříd signálních molekul, které byly objeveny až po neurotransmiterech „standardních“. Podobně jako např. acetylcholin, u neuropeptidy mají v CNS spíše modulační úlohu. I když víme, že fungují jako neuropřenašeče, mnoho jejich dalších funkcí, popsaných u jiných neurotransmiterů, zatím zůstává neobjasněno. Jakkoliv to jsou především látky centrálně zapojené do intermediátního metabolismu, jsou koncentrovány na určitých typech synapsí a po patřičném stimulu se z ní uvolňují, aby vyvolaly patřičnou odpověď. Výrazně modulují účinky různých látek, např. kofeinu. CHARAKTERISTIKA NEUROPEPTIDŮ Poté, co vědci objevili, že i neuropeptidy mohou sloužit jako signální molekuly, nastala v neurofamakologii menší revoluce. Farmaceutický průmysl v nich a v jejich receptorech viděl nové cíle různých látek, které by mohly ovlivnit celou řadu neuronálních funkcí. Objev neuropeptidů vedl také k získání nových poznatků o normálním fungování synapse. Přes to, že o signální roli neuropeptidů se ví až asi 30 let, jejich farmakologie je však stále poměrně omezená. Peptidy jsou malé molekuly složené z aminokyselin navzájem kovalentně propojených peptidickou vazbou. Termín neuropeptidy je rezervován pro malé proteiny, které mají neurotransmiterům podobnou funkci v rámci nervového systému. Jiné signální molekuly jako růstové faktory nebo cytokiny jsou od neuropeptidů tradičně odlišovány, jakkoliv se jejich funkce mohou částečně překrývat. Některé neuropeptidy zprostředkovávají signalizaci jen v rámci CNS, jiné jsou využívány i na periferii. Kromě jejich neurotransmiterové funkce jsou některé neuropeptidy neurony uvolňovány přímo do krevního řečiště a slouží jako hormony. Jiné jsou jako hormony uvolňovány endokrinními žlázami. Neuropeptidů je popsána zatím asi stovka a mnoho jich ještě jistě bude objeveno. Oproti „klasickým“ neuropřenašečů, jsou syntetizovány jiným způsobem a vykazují i další odlišné charakteristiky. Peptidy se tradičně dělí do skupin podle oblastí, ve kterých byla jejich funkce poprvé popsaná, nebo podle svého účinku. Tato klasifikace je ovšem lehce nepřesná, např. ACTH a α-MSH se nachází nejen v neurohypofýze, ale i non-neuroendokrinních neuronech a mají i non-neuroendokrinní funkce. Stejně tak CRF účinkuje v mnoha oblastech mozku. Příklady jednotlivých skupin neuropeptidů a jejich koexistence s „klasickými“ neuropřenašeči máte uvedeny v tabulkách. Berte ovšem prosím tyto tabulky spíš jako „návod ke třídění“, než jako striktní klasifikaci neuropeptidů. Noradrenalin galanin enkephalin neuropeptid Y
GABA somatostatin cholecystokinin neuropeptid Y
ACh VIP substance P
Dopamin cholecystokinin neurotensin
Adrenalin neuropeptid Y neurotensin
Serotonin TRH substance P enkephalin
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 α, β, γ - endorphin, dynorphin, enkephaliny vasopresin, oxytocin, neurophysiny, thyrotropin (TSH), prolaktin, luteinizační hormon (LH), FSH, ACTH, růstový hormon (GH), α-melanocyty stimulující hormon (α-MSH) kortikotropin-relaeasing faktor (CRF), gonadotropin-releasing hormon (GnRH), hormon uvolňující růstový hormon (GHRH), somatostatin, thyrotropn-releasing hormon (TRH) substance P, neurokinin A (NKA, = substance K, SK), neurokinin B (NKB, = substance P, SP), kassinin, eledosin gastrin, cholecystokininy (CCKs), galanin, gastrinuvolňující protein (GRP), neurotensin
opioidní peptidy neurohypofysální peptidy
hypothalamické peptidy
tachykininy gastriny (gut-brain peptidy) od glukagonu odvozené od pankreatických polypeptidů odvozené jiné
VIP (vasoactive intestinal polypeptide), glukagon neuropeptid Y (NPY), insuln bombesin, bradykinin, angiotensin, CGRP (calcitonin gene-related peptide), neuromedin K
Prekurzorové proteiny Mnoho klasických nízkomolekulárních neuropřenašečů vzniká krokovou enzymatickou reakcí z nějakého aminokyselinového prekurzoru, který je do mozku často dopraven přes hematoencefalickou bariéru z cirkulace. Oproti tomu syntéza neuropeptidu vyžaduje transkripci DNA, její přepis do mRNA a tvorbu proteinu. Proteinový produkt uvolněný z ribosomu pak není ještě přímo signální molekulou, ale velkým prekurzorovým polypeptidem vyžadujícím posttranslační úpravy. Typickým příkladem je vznik a zpracování prepropeptidu proopiomelanokortinu (POMC). POMC je prekurzorem mnoha aktivních peptidů a jeho produkty zahrnují např. adrenokortikotropní hormon (ACTH), α-melanocytystimulující hormon nebo β-endorfin. Prepropeptid obsahuje N-koncovou signální sekvenci, která nasměruje nově vzniklý protein z ribosomů do lumen endoplasmatického retikula (ER). Po transportu do ER je signální sekvence odštěpena signální peptidasou a vzniká propeptid. Propeptid je následně přenesen do Golgiho aparátu a uskladněn do velkých denzních váčků, ve kterých podléhá dalšímu zpracování. V nich je z těla buňky transportován na synapsi. Proteolytické zpracování Propeptidové prekurzory jsou konvertovány na aktivní neuropeptidy sérií kroků zahrnujících štěpení konvertasami a modifikaci na specifických aminokyselinových zbytcích. Během tohoto procesu endoproteasy rozpoznávají a štěpí dibasické aminokyselinové páry (Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg nebo Arg-Lys). Vzniklé peptidy jsou dále zpracovány exopeptidasami a různými modifikujícími enzymy. Fenomén zpracování prohormonů konvertasami byl popsán roku 1967 Donaldem F. Steinerem během studia vzniku insulinu. Dva klíčové enzymy, účastnící se zpracování POMC a dalších prekurzoruů, jsou konvertasa prohormonů 1 a 2 (PC1 a PC2). PC1 a PC2 náleží do velké rodiny prohormonových konvertas, která zahrnuje (zatím) devět členů. Bývají také označovány PCSK1-9, přičemž PSK1 = PC1 a PCSK2 = PC2. Tyto enzymy postupují krokově, nejprve rozštěpí v závislosti na typu tkáně patřičný dibasický pár a následně pokračují v dalších štěpeních. PC1 a PC2 štěpí různými způsoby POMC a stejnou proteolytickou aktivitu vykazují na proinsulinu a proglukagonu v pankreatu. PC2 hraje menší roli než PC1 v případě 2
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 proinsulinu než proglukagonu, PC1 je naopak pro štěpení glukagonu důležitější a méně využívaná pro štěpení proinsulinu než PC2. Výsledkem proteolytické aktivity PC1 i PC2 na POMC jsou malé peptidy, jejichž C nebo N konce obsahují lysinové nebo argininové zbytky. Jiný enzym, karboxypeptidasa E, pak odstraňuje Ckoncové zbytky. Zatím neidentifikovaná aminopeptidasa odstraňuje zbytky Nkoncové. Mnoho neuropeptidů je po štěpení konvertasami a peptidasami dále ve dvou krocích upravováno. Může docházet k Nkoncové acetylaci, které často reguluje aktivitu neuropeptidu – příkladem je zesílení biologické aktivity α-MSH jeho acetylací. Naopak, pokud je acetylován β-endorfin, jeho aktivita výrazně klesá. Peptidy obsahující C-terminální glycin procházejí αamidací pomocí enzymu peptidglycin αamidující monooxygenasy (PAM). Tento amidační krok podstupuje např. α-MSH. Vícekrokový mechanismus, kterým z prepropeptidů vznikají propeptidy, z těch peptidy a jejich aktivita je dále modifikována, může být zajímavě farmakologicky ovlivněn. Konvertasy prohormonů antagonisticky ovlivňují mnohé malé peptidy. Inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu (ACE), jako např. captopril, jsou klinicky využívány v léčbě hypertenze (angiotenzin fyziologicky zvyšuje cévní tonus) nebo diabetické nefropatie. Diversita neuropeptidů Jediný propeptid, jakým je např. POMC, může dát vzniknout několika bioaktivním neuropeptidům. Jednotlivé kroky proteolytického štěpení jsou tkáňově specifické: např. v předním laloku podvěsku mozkového je POMC typicky konvertován na ACTH. V intermediátním laloku této žlázy a v neuronech produkujících POMC jsou hlavními koncovými produkty α-MSH a β-endorfin. Produkty typické pro tu kterou tkáň podmiňuje tkáňově specifická exprese různých konvertas prohormonů. Značná část úprav neuropeptidů se navíc děje ve váčcích, a protože konvertasy jsou vysoce citlivé na pH a Ca2+, závisí jejich aktivita i na změnách těchto parametrů uvnitř váčků. K diversitě neuropeptidů přispívá i jejich alternativní sestřih. Prvními neuropeptidy, u kterých se zjistilo, že jsou produkovány alternativním sestřihem, byly kalcitonin a kalcitoninovému genu příbuzný peptid (calcitonin gene-related peptide, CGRP). Tachykininy také produkují několik zástupců své rodiny alternativním sestřihem dvou preprotachykininových genů. Jeden z genů je alternativně sestřižen nejméně ve tři prepropeptidy, které dále posttranslačně produkuji pět rozdílných bioaktivních peptidů včetně neurokininu A a substance P.
Skladování a výlev 3
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
Synaptický výlev neuropeptidů se od výlevu nízkomolekulárních přenašečů poněkud liší. Oproti např. acetylcholinu neuropeptidy vznikají transkripcí, translací a dále jsou upravovány posttranslačně. Tyto procesy probíhají v somatu i axonu. Další odlišností je velikost a typ váčků, ve kterých jsou skladovány: neuropeptidy jsou obsaženy ve velkých denzních vesikulech skládaných v Golgiho komplexu a transportovanýc h na synapsi, zatímco jiné (nízkomolekulár ní) přenašeče jsou skladovány v malých světlých váčcích sestavovaných v terminále. Mnoho neuronů obsahuje v synaptickém zakončení OBA typy váčků. Neuropeptidy jsou poměrně typicky kolokalizovány s „klasickými“ neuropřenašeči; např. v podstatě každý serotoninergní nebo katecholaminergní neuron obsahuje ve váčcích jeden či více detekovatelných neuropeptidů. Ačkoliv tyto dva odlišné typy váčků se mohou společně nacházet v jednom nervovém zakončení, uvolňovány jsou odlišným mechanismem a často za jiných fyziologických podmínek a potřeb. Malé denzní váčky (ACh a spol.) jsou sdruženy do klastrů v aktivních zónách a uvolňovány po rychlém a přechodném depolarizací navozenémvzestupu hladiny Ca2+. K výlevu neuropeptidů je potřeba delšího a většího zvýšení hladiny Ca2+ v nervovém zakončení, aby vápník mohl dodifundovat v dostatečné koncentraci až k jejich váčkům. Jinými slovy, k výlevu non-peptidového neuropřenašeče typu katecholaminů stačí i jediný akční potenciál, zatímco k výlevu neuropeptidů je potřeba salva akčních potenciálů. Typický
4
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 vzorec vzruchové aktivity může tedy vést k preferenčnímu výlevu jednoho nebo druhého typu neurotransmiteru, případně za sebou . mohou následovat. Funkční význam kolokalizace klasických neuropřenašečů s neuropeptidy není zatím zcela uspokojivě objasněn. Podle některých prací neuropeptidy modulují postsynaptický účinek klasických neuropřenašečů, a to buď stimulačně nebo inhibičně. Vzhledem k tomu, že k výlevu neuropeptidů je potřeba delší vzruchová aktivita, mohou pozitivní i negativní zpětnou vazbou regulovat aktivitu silně stimulovaných zakončení. Neuropeptidová signalizace „na dálku“ Jednou z nejzajímavějších položek, ve kterých se neuropeptidy liší od klasických neuropřenašečů, je jejich osud po výlevu do synaptické štěrbiny. Zatímco například dopamin je velice rychle zpětně vychytáván do terminály a podobným způsobem je ze synaptické štěrbiny odstraněna s výjimkou acetylcholinu většina klasických neuropřenašečů, neuropeptidy tak rychle ze synaptické štěrbiny odstraňovány nejsou. Jejich deaktivace probíhá štěpením endoproteasami a exoproteasami lokalizovanými na extracelulárních membránách (nezaměňovat s konvertasami!) Peptidy také mohou urazit značnou vzdálenost, než doputují ke svým receptorům; proto také ostatně lokalizace mnoha neuropeptidů neodpovídá lokalizaci jejich receptorů. Např. substance P je vysoce koncentrována v substantia nigra, ale její receptory v této struktuře téměř chybí, zatímco v jiných částech mozku jsou detekovány hojně. Většina receptorů pro neuropeptidy je spřažena s G-proteiny. Stejně jako receptory pro klasické neuropřenašeče, i receptory pro neuropeptidy vykazují různé subtypy, nicméně tyto receptory mají pro své ligandy podstatně větší afinitu než receptory pro neuropřenašeče „klasické“. Např. acetylcholinový receptor váže acetylcholin s afinitou 100 µM – 1 mM, zatímco neuropeptidové receptory mají afinitu ke svým ligandům v řádu nanomolů. Interakce mezi neuropeptidy a jejich receptory je poměrně komplexní. Představte si třeba molekulu noradrenalinu – jen těch několik atomů, které obsahuje, může iontově nebo stericky interagovat s patřičným vazebným místem na odpovídajících receptoru, a modelování této interakce není extrémně obtížné. Teď si zkuste představit interakci neuropeptidu Y (NPY) o délce 36 aminokyselin – jak se takové molekula vůbec „vejde“ do vazebného místa receptoru spřaženého s G-proteinem? Která konformace bude mít nejvyšší afinitu pro vazbu, který aminokyselinový zbytek je pro vazbu kritický? A z kterého farmakologického pohledu mohou být připravovány nové látky, které budou dané vazebné místo antagonizovat nebo na něj budou působit agonisticky? Tyto otázky není lehké zodpovědět a v praxi se zatím pohybujeme hlavně v rovině modfikovaných peptidových analogů. Syntetické peptidy jsou degradovány různými peptidasami a nemohou procházet skrze hematoencefalickou bariéru, takže jsou užitečné v podpůrné léčbě poruch zasahujících CNS. Receptorové typy a subtypy Neuropeptidové receptory jsou příliš početné na to, abychom se jim věnovali individuálně, takže si je rozdělíme do jednotlivých rodin. Jejich přehled máte v následující tabulce. Některé neuropeptidy (TRH) se sice váží jen na jediný receptor, ale mnoho jiných (např. somatostatin) obsazuje až pět receptorových typů. V rámci každé receptorové rodiny vykazují jednotlivé subtypy receptorů své vlastní vzorce exprese v CNS i PNS. Např. dva receptory pro kortikotropin-uvolňující faktor (corticotropin-releasin factor, CRF), označované jako CRF1R a CRF2R, svou expresí alterují: tam, kde se vyskytuje jeden, není téměř detekovatelný ten druhý. Vzhledem k tomu, že se liší i afinitou k ligandům (CRF1R stejně silně váže CRF i příbuzný peptid urocortin, zatímco
5
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 CRF2R má vyšší afinitu k urocortinu než CRF), má tato rozdílná distribuce fyziologický význam. Tak jako CRF receptor, i další neuropeptidergní receptory mohou vázat víc než jeden peptid. Tato vlastnost je typická zejména pro receptory melanokortinové rodiny – MC1-5 receptory. Každý z těchto receptorů může s různou potencí aktivovat ACTH, α-MCH a γMCH. MC4 receptor může být antagonizován také vzdáleně příbuzných endogenním peptidem nazvaným agouti-related peptid. Tento receptor byl prvním receptorem, u kterého byl v mozku nalezen endogenní agonista i antagonista. Poměrně dlouho panovalo přesvědčení, že specifita receptoru pro ten který peptid je dána výhradně vnitřními vlastnostmi receptoru – mnohé domény na extracelulárních i transmembránových doménách byly známy jako specifická vazebná místa pro určité ligandy. Toto přesvědčení vzalo za své až s objevem proteinů modifikujících aktivitu receptoru (receptor activity modifying proteins, RAMPs), které např. ovlivňují transport CGRP receptoru do membrány a jeho glykosylaci. RAMP také podmiňují afinitu GRPR receptoru k příbuznému proteinu adrenomedullinu. Zda RAMPs regulují funkce většího počtu receptorů spřažených s G-proteinem zatím není známo. Peptidergní receptory se nacházejí nejen na synapsi, ale v menší míře i na plasmatické membráně axonů, těl neuronů i dendritů. U některých subtypů je možná jejich extrasynaptická lokalizace primární. Po delší vazbě ligandu na tyto receptory spřažené s G-proteiny jsou receptory internalizovány a následně buď recyklovány, nebo degradovány. Existují ovšem i peptidergní výjimky: receptor pro neurotensin je i s navázaným ligandem transportován do těla neuronu a byl prokázán poblíž jádra. Jakkoliv zatím tato hypotéza není potvrzena, zdá se tedy, že peptidergní receptory by mohly hrát i roli v kontrole genové transkripce. Funkce neuropeptidů Funkce většiny malých neuropřenašečů byla popsána poměrně záhy, neboť existovalo množství agonistů a antagonistů, kteří mohli mimikovat jejich působení, nebo naopak simulovat jejich nedostatek. V případě neuropeptidů je ovšem množství těchto farmakologických nástrojů poněkud limitované a navíc jen někteří z peptidergních agonistů a antagonistů procházejí přes hematoencefalickou bariéru. Podobně nesnadné je stanovit tkáňovou koncentraci neuroppetidů. Například, pokud je neuronální aktivita inhibována, může koncentrace neuropeptidů v tkáni růst, protože neuropeptidy se v „tichých“ buňkách akumulují. A naopak, vyšší aktivita neuronů může vést až ke tkáňovému vyčerpání neuropeptidů. Jakkoliv je tedy nesnadné přesně určit, zda vybraný typ zásahu vyvolá vzrůst nebo pokles hladiny neuropeptidů, mikrodialýza alespoň umožňuje přesně a přímo změřit extracelulární koncentrace neuropeptidů ve vybraných mozkových oblastech. Vzhledem k problémům s měřením hladin neuropeptidů je většina psrací zabývajících se funkcí neuropeptidů postavena na přímé injikaci neuropeptidů do specifických oblastí mozku či míchy a na pozorování fyziologických a behaviorálních změn tímto podáním vyvolaným. Injikované dávky jsou často miligramové, což je vzhledem k nannomolové afinitě neuopeptidergních receptorů nefyziologické, nicméně takto byly popsány první účinky neuropeptidů. Pozorování zpřesnila až molekulární biologie a „vypínání“ genů pro jednotlivé neuropeptidy – objasnila nová fakta a naštěstí potvrdila ta stará :)
6
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
Vybrané peptiderdní receptorové typy a sybtypy
7
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 JEDNOTLIVÉ SYSTÉMY NEUROPEPTIDŮ Opioidní peptidy Opiodní peptidy jsou farmakologicky jedny z nejdůkladněji studovaných látek – primárně kvůli svým silným analgestickým vlastnostem, ale také kvůli svému působení proti kašli (antitussika) a průjmu (antidiarhoetika). Např. morfin byl užíván už v 19. století. Velká spotřeba opiátových analgetik spolu s rizikem vzniku závislosti na nich vedla k vývoji opiátových farmak, která by závislost nezpůsobovala. Ani dnes sice nelze oddělit nejúčinnější analgetické vlastnosti opiátů od těch, které navozují závislost, výsledkem studia nicméně bylo přinejmenším objevení malých, lipofilních molekul jako naloxon a naloxetron. Naloxon se užívá v léčbě předávkování opiáty a nalotrexon, jehož působení je déledobější, se využívá při léčbě závislostí na opitátech a při léčbě alkoholismu. Termín opioidní je spojen s endogenními peptidy, které vykazují podobnou farmakologii jako opiáty, zatímco termín opiáty odkazuje na morfin a jemu příbuzná nonpeptidová analoga. Všechny známé opiodní peptidy jsou produkty tří velkých prekurzorových proteinů. Každý z nich je kódován vlastním genem. Tyto prekurzory jsou • • •
POMC, z něhož jsou odvozeny, β-endorfin a několik nonopiodních petidů, proenkefalin, z něhož pochází met-enkefalin a leu-enkefalin a prodynorfyn, který je prekurzorem dynorfinu a jemu příbuzných proteinů.
Ačkoliv jsou syntetizovány z různých prekurzorů, sdílejí opioidní peptidy určité stejné aminokyselinové sekvence. Velmi často obsahují např. sekvenci čtyřech aminokyselin TyrGly-Gly-Phe na svém N-konci, která bývá následována buď Met nebo leucinem. Morfinu podobné opiátové alkaloidy z opia pravděpodobně mimikují konformaci N-koncového tyrosinu endogenních peptidů. Molekulární klonování potvrdilo existenci tří typů opiodních receptorů: µ, κ a δ. Je pravděpodobné, že vznikají i jejich podtypy a že µ a δ receptory jsou schopny formovat heterodimery. Všechny tyto receptory jsou spřaženy s G-proteiny, konkrétně s Gi/o rodinou. Morfinu podobné opiáty se preferenčně váží na µ receptory, které jsou spojeny se sestupnými drahami bolesti (periakaveduktální šedá hmota, rostroventrální medulla, thalamus či zadní kořeny míšní). Vyskytují se i v jiných oblastech mozku (ventrální tegmentum, ncl. accumbens), kde jsou zodpovědné za zesílený efekt opiátů. µ receptory se také vyskytují ve striatu (motorická kontrola) a locus coeruleus, ve kterém mohou vyvolávat mnohé somatické projevy závislosti na opiátech a opiátové abstinence. µ receptory také hrají z opioidních receptorů nejdůležitější roli v supraspinální analgesii. Vykazují vyskou afinitu k benzomorfanové třídě opiodních látek, jako je pentazocin. δ receptory jsou hlavními vzabnými partnery enkefalinů. Tyto receptory se vyskytují nejen z zadních kořenech míšních, ale i v oblastech mozku, které nejspíše nehrají v nocicepci žádnou úlohu. Klinické využití agonistů δ receptorů zatím není známo. Z endogenních opioidních peptidů se β-endorfiny preferenčně váží na µ receptory, enkefaliny na δ receptory a dynorfin vykazuje nejvyšší afinitu ke κ receptorům. Nicméně tyto peptidy se neváží jen na receptor, ke kterému vykazují nejvyšší afinitu, ale ke všem receptorovým subtypům opioidních receptorů. Zajímavé antiopioidní efekty vykazují látky označované jako nociceptiny nebo orphaniny. Váží se na receptory spřaženéné s G-porteiny, které vykazují vysokou míru homologie s receptory opioidními. Zvyšují vnímavost k bolestivým stimulům.
8
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 Kortikotropin uvolňující faktor Corticotropin-releasing factor (CRF) je peptid o délce 41 aminokyselin, který byl prvně izolován jako hypothalalmický faktor napomáhající podobně jako vasopressin sekreci ACTH.Je syntetizován populací neuronů paraventrikulárního jádra hypothalamu, odkud je uvolňován do portálního spojení s hypofýzou. CRF ale není secernován jen do této portální cirkulace - neurony paraventrikulárního jádra hypothalamu projkují do různých mozkových struktur. CRF je syntetizován také mimo hypothalamus, např. v centrálním jádře amygdaly. CRF uvolňovaný z amygadaly hraje kritickou roli v odpovědi mozku na stres a zřejmě přispívá i ke vniku pocitů strachu a úzkosti. Částečně je zodpovědný za negativní projevy odvykacího syndromu závislých jedinců. Může být také zapojen do long-term deprese v mozečku. Byly naklonovány dva subtypy CRF receptorů. CRF1 R je široce exprimován v celém mozku. Jeho antagonisté mohou sloužit jako látky v terapii úzkosti a deprese. CRF2 R je koncentrován v bočních jádrech septa. Laterální septum je spojeno s emocemi, strachem a kognitivními funkcemi. Endogenním ligandem CRF2 R je urocortin (a urocortin II, jemu příbuzný). Substance P Substance P, neurokinin A (NKA, dříve označovaný jako substance K) a neurokinin B (NKB) patří do rodiny tachykininů. Všichni členové této rodiny sdílejí stejnou C-koncovou sekvenci Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2. Substance p a NKA jsou kódovány genem pro preprotachykinin A a vznikají alternativním sestřihem. NKB je kódován genem pro preprotachykinin B. Všechny známé tachykininové receptory (s G-proteinem spřažené) jsou označovány jako NK1, NK2 a NK3 receptory. Substance P vykazuje nejvyšší afinitu k NK1 receptoru, NKA preferenčně váže NK2 receptor a NKB zejména NK3 receptory. Substance P je předmětem výzkumu už dlouho. V 70. letech se věřilo, že by mohla být hlavním transmiterem nocicepce. Synapse primárních aferentních noiceptorů zadních kořenů míšních obsahují značné množství neuropeptidů, z nichž nejhojnější jsou calcitonin generelated peptid (CGRP), substance P a NKA. Substance P je v nocicepčních C vláknech kolokalizována s glutamátem. Její výlev z velkých denzních váčků vyžaduje silnější stimulus, než který by stačil pro klasický výlev glutamátu. Substance P se uvolňuje i retrográdně z volných nervových zakončení nocicepčních neuronů a přispívá k fenoménu neurogenního zánětu, při kterém interaguje s peptidem bradykininem. Při studiu myší knock-outovaných pro NK1 receptor nebo gen pro preprotachykinin A došlo k mnoha překvapením. Tyto myši sice nevykazovaly projevy neurogenního zánětu, ale jejich nocicepce byla omezena jen v určitých nocicepčních drahách. Žádnou změnu oproti přirozenému fenotypu např. nevykazovaly v mechanické hypersenzitivitě navozené zánětem. Deficity v nocicpci vykazovaly jen při aplikaci nocicepčních stimulů se vzrůstající intenzitou. Roli substance P v nocicepci tedy evidentně mohou přebírat i jiné nocicepční neuropřenašeče. Substance P a NK1 Rs se nacházejí v amygdale. Antagonista NK1 Rs v pokusech prováděných na mládětech morčat izolovaných od matky snižoval zvukové projevy jejich stresu. Na základě tohoto typu preklinických studií začali být antagonisté NK1 Rs testováni jako antidepresiva a anxiolytika. Zdají se být slibní i v léčbě chemotarapií navozené nausey, kdy oproti antagonistům 5-HT3 receptorů (odasetron) blokují nejen časnou, ale i pozdní fázi tohoto fenoménu.
9
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 Neurotensin Neurotensin (NT) je peptid o délce 13 aminokyselin, vznikající z prekurozru obsahujícího také peptid neurotensinu podobný, velký 6 aminokyselin. NT je exprimován v mozku, nadledvinách a střevu, a to v mírně odlišných formách podle své tkáňové distribuce: jeho C-konce obsahuje alternativně jednu ze tří Lys-Arg sekvencí, které jsou podle typu tkáně rozdílně štěpeny. V mozku z prekurzoru vzniká NT a neuromedin N, zatímco v nadledvinách vzniká delší forma neuromedinu N, neurotensin a jeho o něco delší štěpný produkt. Ve střevu vzniká NT a delší forma neuromedinu N. Jsou známy dva typy receptorů pro neurotensin : NTS1 a NTS2 receptory. NTS1 mRNA je produkována v substantia nigra, ale ne ve striatu. Kupodivu, vlastní protein NTS1 receptorů se na dopaminergních terminálách striata nachází. NT tak zřejmě moduluje dopaminergní transmisi. Exprese mRNA pro neurotensin je ve striatu vyvolaná antaginisty D2 receptorů, z nichž mnohé souží jako antipsychotika a nebo psychostimulační drogy (kokain, amfetamin). Byl naklonován i NTS2 receptor, ale jeho úloha zatím zůstává nejasná. Neuropeptid Y Neuropeptid Y (NPY) je jedním z řady navzájem příbuzných peptidů, které tvoří rodinu pankretaických polypetidů. Jejími dalšími členy jsou pankreatický polypeptid (PP) a polypeptid YY (PYY). NPY je nejhojnějším neuropeptidem mozkové kůry. Koncentrován je i zadních kořenech míšních a v hypothalamu. V symaptiku i v CNS bývá kolokalizován s noradrenalinem. NPY a jemu příbuzné peptidy se váží na receptory označované Y1 až Y6, které vykazují různou afnitu pro NPY, PP i PYY. Tyto receptory se nacházejí persynapticky i postsynapticky v různých oblastech mozku. Aktivace Y1 receptoru zřejmě souvisí s poklesem úzkostného chování, asi na úrovni amygdaly a kůry mozkové. Agonisté Y1 receptoru by mohla být slibná anxiolytika, a vykazují i určitý antinocicepční efekt. Naproti tomu aktivace Y5 receptoru vede ke zvýšení příjmu potravy (nejspíše na úrovni hypothalamu). Antagonisté Y5 receptorů by tedy mohli být úspěšní v léčbě obezity. PURINY Puriny nejsou jen stavebními kameny RNA a DNA, metabolickými kofaktory nebo druhými posly jako cAMP nebo cGMP. Hrají také důležitou roli v signalizaci mezi neurony. Biochemie Puriny jsou dusíkaté heterocykly tvořené kondenzovaným pyrimidinovým a imidazolovým kruhem. V purinergní transmisi jsou využívány nukleosidové a nukleotidové deriváty samotného purinu. V nukleových kyselinách jsou využívány dva purinové deriváty, adenin a guanin. V rámci signalizace mezi neurony jsou využívány hlavně adenosin a ATP. Jim příbuzný je adenindinukleotid (ApnA), což je molekula sestávající ze dvou adenosinů kovalentně spojených řetězcem dvou až šesti fosfátů. Zdá se, že na neurotransmisi se do určité míry mohou podílet i nukleotidové deriváty pyrimidinového typu.
10
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
adenin purin
Skladování a výlev Navzdory strukturní podobnosti, adenosin a ATP vykazují i odlišné vlastnosti. ATP a ApnA jsou skladovány v malých synaptických váčcích a uvolňovány exocytosou navozenou depolarizací a vtokem Ca2+ do zakončení podobně jako jiné neuropřenašeče. Často jsou také detekovány ve stejných synaptických váčcích na stejné synapsi. Oproti nim je adenosin uvolňován z nonvesikulárních cytoplasmatických zásob. Mimo cytoplasmu jej mohou uvolňovat obousměrné nukleosidové transportéry. Případně může vznikat rovnou v synaptické štěrbině, kam je uvolňován ve formě ATP a během sekundy metabolizován: na membráně navázaná ectodiphosphohydrolasa konvertuje ATP na ADP a AMP. AMP je rozpustnou či s membránou asociovanou ecto-5´-nukleotidasou konvertován na adenosin. Výlev ATP tedy rovněž může být vydatným zdrojem extracelulárního adenosinu. ApnA je hydrolyzován pomaleji a zůstává v synaptické štěrbině delší dobu. Purinové transportéry Nukleosidové transportéry jsou k membráně vázané proteiny sloužící k přenosu purinových a pyrimidinových nukleosidů dovnitř a ven z mnoha typů buněk. Liší se svou substrátovou specifitou (jsou purin- nebo pyrimidinselektivní) a termodynamickými vlastnostmi. Některé koncentrují nukleosidy v buňce v závislosti na Na+. Jiné transportují nukleosidy ve směru jejich koncentračního gradientu. Farmakologicky bylo odlišeno nejméně sedm nukleosidových transportérů, z nichž čtyři byli klonováni. Jejich struktura funkce příliš známa není, ale jejich farmakologie zahrnuje některé terapeuticky využitelné látky. Patří mezi ně několik chemoterapeutik nádorového bujení (gemcitabin) a silná antivirotika jako zidovudin (AZT) užívaný v léčbě AIDS. Jsou to obvykle nukleosidové analogy. Potenciálně by se mezi nimi mohla najít i farmaka užitečná v léčbě neuropsychiatrických poruch. Purinové receptory Purinové receptory tvoří relativně velkou a různorodou skupinu proteinů, dělenou do dvou hlavních podskupin, označovaných jako P1 a P2 receptory. P1 receptory jsou také známy jako adenosinové receptory A1, A2 a A3. Váží adenosin a jeho analoga a jsou spřaženy s G-proteiny. Byly vyklonovány čtyři subtypy. A1 subtyp je nejrozšířenější v mozku a v páteřní míše a vykazuje nejvyšší afinitu k adenosinu. Za jeho aktivací stojí pravděpodobně anxiolytické, antikonvulsační, analgestické a sedační účinky adenosinu. Antagonisté A1 receptoru vyvolávají stimulační efekty. V nižších dávkách např. zvyšují pozornost (kofein), ve vyšších dávkách vyvolávají pocity úzkosti a podráždění.
11
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 A2 receptorů byly vyklonovány dva podtypy, A2A a A2B, které mají k adenosinu poněkud nižší afinitu než A1 receptor. A2B receptory jsou široce rozšířené v celém lidském těle, ale jejich exprese v mozku a páteřní míše je nízká. Oproti nim jsou A2A receptory vysoce koncentrovány v zadním striatu, ncl. accumbens a čichovém laloku - třemi mozkvými oblastmi s dopaminergní inervací. Interakce dopaminu a adenosinu jsou v těchto oblastech popsány. Ve striatu agonisté A2A receptorů inhibují odpovědi navozené D2 receptory a naopak antagonisté je mimikují – i to přispívá se stimulačním účinkům kofeinu a jiných methylxanthinů. Inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné v terapii Parkinsonovy choroby. A3 receptor je v nízkých hladinách exprimován v mozku a jeho funkce zatím není dobře popsána. Ze všech adenosinových receptorů vykazuje k adenosinu nejnižší afinitu. Zatímco A1 a A2 receptory váží adenosin s nanomolární afinitou, A3 receptor potřebuje mikromolární koncentrace. P2 receptory zahrnují dvě rodiny zástupců: P2Y receptory spřažené s G-proteiny a P2X receptory, které jsou ligandem ovládané iontové kanály. Bylo vyklonováno 14 P2Y receptorů. Váží difosfáty i trifosfáty purinových i pyrimidinových nukleotidů, stejně jako ApnA. Jejich afinita k různým ligandům se liší. Např. P2Y1 receptor váže ATP a ADP, ale ne UTP nebo UDP. Naopak, P2Y2 receptor je aktivován ATP i UTP se stejnou potencí. Oba P2Y1 i P2Y2 receptory byly detekovány v mozku. Nomenklatura P2Y receptorů je poněkud zmatečná, protože některé subtypy, u kterých se mělo za to, že jsou nakolonovány, naklonovány vlastně nebyly :) Jejich přehled máte v následující tabulce. Protein P2RY1 P2RY2 P2RY4 P2RY5 / LPA6 P2RY6 P2RY8 P2RY9 / LPAR4 / GPR23 P2RY10 P2RY11 P2RY12 P2RY13 P2RY14
Gen
Spřežení
Nukleotid
P2RY1 Gq/11 ADP P2RY2 Gq/11 ATP, UTP P2RY4 Gi a Gq/11 UTP LPAR6 lysofosfatidová kyselina P2RY6 Gq/11 UDP P2RY8 orphan receptor LPAR4 lysofosfatidová kyselina P2RY10 orphan receptor P2RY11 Gs a Gq/11 ATP P2RY12 Gi ADP P2RY13 Gi ADP P2RY14 Gq/11 UDP-glukosa
Všimněte si, že P2Y3, P2Y5, P2Y7, P2Y8 a P2Y9 , receptory vlastně nejsou ;) P2X receptorů bylo charakterizováno 7 subtypů, u člověka se nacházejí zejména na chromosemoech 12 a 17. Jsou to kationtové kanály aktivované ATP nebo ApnA, sestávající z více podjednotek. Jejich přesná stechiometrie sice není známa, ale in vitro formují homomerní receptory. Aktivace P2X receptorů vede k rychlým tokům Na+, K+ a Ca2+ a tím k depolarizaci buňky. Vyskytují se na periferii, na nervosvalovém spojení, v míše i mnoha oblastech mozku. Ovlivňují srdeční rytmus, svalový tonus, kontrakci vas deferens při ejakulaci nebo nocicepci – overexprese P2X4 Rs v míše vede k hypersensitizaci. Tyto 12
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 receptory jsou citlivé na makrocyklický lakton ivermectin, který zvyšuje jejich vodivost a zvyšuje pravděpodobnost otevření kanálu. Přehled charakteristik některých purinergních receptorů je v následující tabulce.
Funkce purinů Purinům je připisovaná celá řada funkcí, ale jen některé byly s určitostí potvrzeny. Adenosin má anxiolytické a hypnotické vlastnosti, což potvrdilo i podávání antagonistů adenosinových receptorů. kofein a jiné methylxanthinové sloučeniny zvyšují bdělost a kognici, jak už jsme se zmiňovali výše. Antagonisté purinergních receptorů by mohli být využívání jako podpůrná léčba symptomů u deficitů spojených a Alzheimerovou chorobou a jinými formami demence. Byly studovány rovněž neuroprotekční účinky adenosinu, např. po mozkové mrtvici. Mrtvici doprovází ischemie spojená se zvýšením koncentrace glutamátu, a tím navozeným masivním vtokem Ca2+ do buněk a jejich excitotoxickou smrtí. Ideální neuroprotektivum by tedy za ischemických podmínek inhibovalo presynaptický výlev glutamátu a zabraňovalo depolarizaci postsynaptické membrány a vtoku Ca2+ do postsynaptické buňky. Adenosin vyhovuje oběma parametrům. Aktivace presynaptických A1 receptorů adenosinem blokuje výlev glutamátu a jiných neuropřenašečů. Aktivace postynaptických A1 receptorů otevírá draslíkové a chloridové kanály a vede k hyperpolarizaci membrány. Celkovým výsledkem pak je snížený vtok vápníku a nižší úmrtnost neuronů. Pokusy na zvířecích modelech tuto hypotézu potvrzují. Podání selektivníh agonistů A1 receptorů bezprostředně před ischemickou atakou nebo v jejím průběhuu zvířat významně snižuje ztráty neuronů a chrání před následnými deficity paměti. A naopak, podávání selektivních antagonistů ischemické poškození mozku zhoršuje. Je ale důležité si uvědomit, že množství adenosinu se v mozku během ischemie dramaticky zvyšuje. Ačkoliv aktivace A1 receptorů může být do určité míry neuroprotekční,
13
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6 na jiných subtypech purinergních receptorů vyvolává opačný efekt. Aktivace A2 receptorů měla na zvířecích modely mozkové mrtvice výrazně negativní dopad, zatímco podávání selektivní antagonistů A1 receptorů působilo neuroprotekčně. Stejně tak bezprostřední aktivace A3 receptorů výrazně zvyšovala u pokusných zvířat poškození mozku a úmrtnost. Kupodivu, dlouhodobé podávání tohoto farmaka mělo efekt naprosto opačný. Na různorodosti těchto pozorování se zřejmě podílí vliv adenosinu na cévní tonus a agregaci krevních destiček. Adenosinová signalizace by se mohla uplatnit i v léčbě Parkinsonovy nemoci. Ve striatu jsou poměrně hojně exprimovány A2A receptory. Inhibují odpovědi navozené D2 receptory a naopak antagonisté je mimikují – aktivace A2A receptorů navozuje pokles motorické aktivity. Inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné v pomocné terapii alespoň těchto projevů. Bylo popsáno několik látek, které při perorálním podání selektivně blokují A2A receptory. Při současném podávání s L-dopa snižují její vedlejší účinky. U některých parkinsonických pacientů může zmírňovat dyskinesii i theofylin.
Co si pamatovat z dnešní přednášky:
⇒ neuropeptidy: klasifikace ⇒ neuropeptidy: vznik a aproteolytické štěpení ⇒ neuropeptidy: rozdíly v signalizaci oproti „klasice“ ⇒ neuropeptidy: funkce ⇒ puriny: skladování a výlev ⇒ puriny: receptorové třídy ⇒ puriny: příklad farmakologie receptorů
14
[email protected]
