Pathologiai Diagnosztika Molekuláris pathologia Semmelweis Egyetem, II. Pathologia Intézet MOLEKULÁRIS PATHOLÓGIA LABORATÓRIUM
Dr. Kiss András
2013 október 29.
Pathologiai diagnosis Klinikai Laboratórium Orvosi Mikrobiológia Pathologia
- Anatomical pathology (+ clinical pathology) - Molekuláris pathologia
Cytologia Histologia Immunohisztokémia Flow Cytometria Molekuláris pathologia
MORPHOLOGIA
Vizsgálati anyagok
• Műtéti preparátum • Biopsia – szövethenger/darab • Sejtek – CYTOLÓGIA • Folyadékok • Emberi test
A pathológus munkája • Szövettani minták elemzése, diagnosis, vélemény • Cytológiai vizsgálat – sejtek morphológiája • Speciális vizsgálatok végzése: dg. pontosítása • Kórboncolás elvégzése, értékelése • Oktatás • Tanácsadás (szóban is!!!)
Rutin eljárás szövettani vizsgálat során
1. Makroszkópos vizsgálat – „indítás” 2. Kivágott szövetdarabok Szövettani asszisztens fixálása 3. Lemetszés 4. Festés 5. Vizsgálat
Mit indítunk?
Festési eljárások • RUTIN: – haematoxylin-eosin – – – –
PAS (perjódsav-Schiff) Alciánkék + PAS Giemsa Papanicolau
Speciális festések Masson
Nissl Grimelius
Kristályibolya
Gomori Schmorl
Best
Gram
Ziehl-Neelsen Gallyas Van Gieson
Orcein
Romeis
Grocott Tri-króm
Mallory Resorcin-fuchsin Congo
Kossa
Ezüstözés
Endoscopia
Gyomorbiopsia
2 mm
Alciánkék-PAS
Helicobacter pylori
Giemsa
Warthin-Starry festés
Amyloidosis Congo
Congo: POLARIZÁLT fényben
Metastasis
Metszetek: 2 Dimenzióban !!
Biológiai struktúrák: 3 Dimenzióban !!
1
2 3 4
1 2
3
5 4
5 6 6
Invazív carcinoma -cervix
Specimen-mammográfia - mikrokalcifikáció
GENETIKA, CYTOGENETIKA PATHOLOGIA MICROBIOLÓGIA A K I
B A L
T Z S O N G A I D R CY O
TO LO GIA
M
BI OL O EK LÓ U G LÁ IA R I
S
MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA
ALAPJAI Molekuláris biológia
=
Molekuláris Pathologia
MULTIDISZCIPLINÁRIS tud. terület Az anyag kezelése, a diagnózis kiadása és értelmezése konzultációt igényelhet !!
Ideális DIAGNOSZTIKA
HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF CANCER
| 0.0
| 1.0
| 2.0
| 3.0
100% Specificity
| 4.0
| 5.0
| 6.0
| 7.0
| 8.0
100% Sensitivity
| 9.0
| 10.0
±
Ng/mL
| 100.0
A realitás
HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF
Malignancy
| 1.0
| 2.0
| 3.0
| 4.0
20% FALS NEG.
ELENGEDTÜK Tumor tovább progrediál
| 5.0
| 6.0
| 7.0
| 8.0
| 9.0
| 10.0
±
| 0.0
| 100.0
70% FALS POS.
TOVÁBB VIZSGÁLJUK VÉGÜL KIZÁRJUK
ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK - SPECIFICITÁS, SZENZITIVITÁS - Mire való a pathologia (beleértve a molekuláris pathologiát) ? Kérdések ? Mit mond a morfológia / genetikai infromáció ? Fejlődési rendellensség ? Örökölhető ? Gyulladás ? Akut vagy krónikus ? Daganat ? Tumor like lesion, benignus, malignus ? Therápia / Prognosis / Predikció !
SPECIFICITÁS, SZENZITIVITÁS nagyságrendileg jobb
FAP
NEOPLASIA
Traverso G, Shuber A, Olsson L, Levin B, Johnson C, Hamilton SR, Boynton K, Kinzler KW, Vogelstein B.: Detection of proximal colorectal cancers through analysis of faecal DNA. • Lancet 2002 Feb 2;359(9304):403-4
Positive Predictive Value ( PPV) : It is the probability that a patient with a positive test result actually has ancer. PPV, unlike NPV,markedly influenced by the prevelance of disease in the population tested.
Negative Predictive Value (NPV) : It is the probability that a patient with a negative test result does not have cancer.
TUMOR MARKEREK - CEA Levels higher than normal have also been found in Heavy smokers and in persons with cirrhosis, pancreatitis, Uremia, peptic ulcer, intestinal metaplasia of the stomach, as well as ulcerative colitis. The antigen has been reported in tissue of intestinal polyps: colonic inflammatory mucosa, and normal intestinal mucosa of children. The antigen is detected in about 50% of tumors of the breast, stomach, lung, and in other solid tumors.
CEA – Posztoperatív prognosztikus indikátor Serial CEA in Monitoring Cancer therapy •
Assessment of the adequacy of Surgical Removal
of primary tumor. If the preoperatively elevated CEA level fails to decrease to normal range of 2.5 ng / ml or less within 4 to 8 weeks postoperatively, this strongly suggests persistent disease . Patients with a persistently elevated CEA level postoperatively may indicate an incomplete surgical resection or metastatic disease.
Prostata RÁK ¾Prostate rák a betegség elején ritkán okoz tüneteket. ¾A betegek sokszor előrahaladott vagy metasztatikus prostata rákkal kerültek felismerésre. ¾MA, a prostata rák többsége RDV eltérések vagy PSA szint emelkedése alapján kerülnek felismerésre.
PSA és Prostata Rák Incidencia és Cancer Incidencia (U.S. 1975-2000)
250
15
PSA Screening
200
14
175
13
150 12
125 100
11
75
Source: Surveillance, Epidemiology, and End Results Program, 1975-2000, Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute, 2003.
2000
1995
1990
1985
1980
10 1975
50
Mortality
Incidence
225
- Mintavétel - Hibalehetőségek Minta:-
aspirációs cytologia (fine needle aspiration biopsy (FNAB) - cytologiai kenet - PAP kenet - core biopszia - sebészi rezekátum
HIBALEHETŐSÉG: - Jelölés ( anyag / név / szám csere) - Az anyag reprezentatív ? Pl. túl kicsi, nem jól orientált, felszínes, kifaragódott ? Elég az anyag a diagnózisra ? Mintavétel száma, mélysége. Makroszkópia, Protokollok ?
WHIPPLE MŰTÉT
Periampulláris Tumorok • • • •
Pancreas cc Ampulláris cc Duodenális cc Distalis epeút cc
Chronic pancreatitis
WHIPPLE SPECIMEN PANCREAS CC Tumor leírás • • • • • • • •
Méret Szín Konzisztencia Cystták Helyzete az anatómiai struktúrákhoz. DTávolság a rezekciós szélektől Vezeték elzáródása Maradék pancreas állomány
ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK malignus tumorok:
Kérdések ?
Primer vagy secunder (metastasis) ? Ha metastatis: hol a primer tu. ? Terápia ? Parameters a terápiához: grade és stage Ezek meghatározzák a terápiát: Rezekció + Radiotherapia + Chemotherapia (preoperatív vagy postoperatív) KOMMUNIKÁCIÓ a KLINIKUSSAL ! Biztos malignus, biztos benignus: O.K. Pathologus nem tudja: MIÉRT ? Sebészi rezekció: R0 ? Rezekciós szélek ?
ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK malignus tumorok:
Kérdések ?
Pathologus nem tudja: MIÉRT ? Nincs elég tapasztalat / tudás – elméletileg lehetséges – konzultáció ! (pl. két szakorvos aláírása kell egy malignus diagnózis kiadásához !) Klinikai minta nem alkalmas definitív diagnózisra ! Malignus tumor ? Válasz : talán = NEM SEGÍTSÉG A DÖNTÉSHEZ Mennyire megbízható a lelet: Új biopszia ? Control ? Más technikák ?
KOMMUNIKÁCIÓ a KLINIKUSSAL ! A legjobb lelet sem ér semmit, ha a klinikus nem érti meg a lényeget ! SEBESSÉG és INFORMÁCIÓ ÁTADÁS a siker titka !
90’s:
IMMUNOCHEMISTRY WAS CONSIDERED USEFUL OTHER TECHNIQUES WERE NOT IMPORTANT
2000’s: IMMUNOCHEMISTRY WAS ESSENTIAL FLOW CYTOMETRY WAS USEFUL OTHER TECHNIQUES WERE NOT IMPORTANT RECENT YEARS: IMMUNOCYTOCHEMISTRY TUMOR MARKERS FLOW CYTOMETRY PCR FISH IN SITU HYBRIDIZATION CYTOGENETICS TISSUE MICROARRAYS
Almost every dpt. Clin. laboratories Path. Centers Path. Centers Path Centers Path Centers Spec. centers
INTER-PERSONAL SKILLS TRIPLE A: AVAILABILITY, AMICABILITY, ABILITY (AFFABILITY) EMOTIONAL INTELLIGENCE, INTEGRITY MOTIVATION, SELF STARTERS PROACTIVELY ENGAGE CLINICIANS NEED TO UNDERSTAND CLINICIANS’ PROBLEMS NEED TO KNOW HOW TO DO CONSULTATIONS BECOME INVOLVED
SEBÉSZI PATHOLOGIA FAGYASZTÁS MAKROSZKÓPIA CYTOLÓGIA GYN CYTOLÓGIA FNAB MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS – ISO MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA ELVÁRÁSOK IMMUNOHISZTOKÉMIA MINDEN TECHNIKÁT KELL TUDNI INTERPRETÁLNI !
Módszerek - Immunhisztokémia - Deparaffinálás - Antigén feltárás / mikrohullám előkezelés Szubsztrát Színreakció
- Blokkoló szérum
Peroxidáz
- Primér antitest
Biotin
- Secunder antitest - Avidin - Biotin - komplex
Avidin
Secunder AB Anti-egér
- Peroxidáz reakció / DAB / - Háttérfestés / haematoxylin /
Primér antitest egér
Blokkoló fehérjék
Anti-nyúl
Antigén:
nyúl
Melan A
100x
Cytokeratin ellenes antitesttel pozitiv reakció
Immunfluorescens vizsgálat IgM ellenes antitesttel
PATHOLOGIA – TÜDŐRÁK Kissejtes (SCLC)
?
Nem-kissejtes (NSCLC)
Subtyping of undifferentiated non-small cell carcinomas in bronchial biopsy specimens. Loo PS, Thomas SC, Nicolson MC, Fyfe MN, Kerr KM. J Thorac Oncol. 2010 Apr;5(4):442-7. A reevaluation of the clinical significance of histological subtyping of non--small-cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol. 2009 Jun;17(3):206-18. Review.
PATHOLOGIAI DIAGNOSZTIKA PRIMER TÜDŐRÁK NE markerek + TTF-1 + p63 – HMWCKs (CK 5/6) – CD56 +
Neuro-endokr. markerek
EGYÉB
NSCLC, n.o.s. SQC
SCLC / LCCNEC ADC TTF-1 + p63 – CK7 + HMWKCKs -
-
rosszul diff. carcinoma átmeneti fenotípus TTF-1 P63 -
TTF-1 p63 + CK7 -/+ CK 5/6 + HMWKCKs + S100A7 +
A reevaluation of clinical significance of histological subtyping of non-small cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol. 2009 Jun;17(3):206-18. Review
CITOLÓGIAI MINTAVÉTEL hazai gyakorlat
Bronchoszkópos ( + transthroracalis) szövettani mintavétel
1
Bronchoszkópos citológiai mintavétel
4
Hátránya:
- mintavételi hibák - fixálási hibák - kevesebb pontos diagnózis
Sebészi Rezekátum
Makrodisszekció…..
Transbronchialis biopszia
T/N<1:8
T/N <1:2
Bronchus kefecitológia
T/N>1/10 (10%)
T/N>10/1 (90%)
SQC TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 +
p63
TTF-1
SQC
HMW CK
TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 +
Chromogranin
bronchoszkópos biopszia
p63
p63
SQC
TTF-1
TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 +
TTF-1
ADC TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 +
CK-7
TTF-1
ADC CK-7
TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 +
TTF-1
bronchoszkópos biopszia
CK7
CK7
ADC TTF-1
TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 +
TTF-1
50,297 80 éves férfi Anamnézis: Strumektomia, Diabetes Mellitus II. típus Parkinson bet. Katarakta (opus) Stroke Agyi atrophia, Demencia Ösophagusfekély Hospitalizáció bronchitis miatt Felvételkor: Hypoglikémia, Exsiccatio Gastroskopia: szövettan: gyomorrák US: multiplexeUH: májmet. asp. Citologia, FNAB : kolorektalis cc. Met. ??? Primer Tumor ??? Gravis Anémia - Transfusiók - ext: tumoros kachexia
CK-20 CK-7 DARM – Sigma cc.
CK-20 CK-7 gyomor cc.
CK-20 CK-7 MÁJ MET.
IHC vizsgálatból következik: A májmetastasist a vastagbélrák adta.
MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA
METHODIKA DNS • DNS szekvenálás, genotipizálás • PCR, hybridizációs technikák: Southern blot, gén polymorphysmus detektálása: PCR, SNP chipek • gén kópiaszám meghatározása: FISH, competitív PCR, real time PCR: HER-2, n-myc • fertőző ágensek meghatározása: HPV, Chlamydia pn., mycobacterium tuberculosis, EBV, Helicobacter pylori, Cytomegalovirus...
A Southern blot ( Northern blot , Western blot)
PCR: Polymerase Chain Reaction 30-40 ciklus
1. lépés:denaturáció 1 perc 94°C
reverse primer
2. lépés: annealing forward primer
45 sec 54 °C Taq polimeráz
3. lépés: extenzió
3’
2 perc 72°C 3’ dNTP
Exponenciális - 2n! 236 = 68 billió kópia!!
Gélelektroforézis
Makromolekulák keveréke
futás iránya
elektroforézis
gél
Kapilláris elektroforézis/mikrofluid technológián alapuló automata elektroforézis rendszer
Multiplex PCR Species-specifikus primerek
Nested PCR
Szekvencia specifikus PCR (Sequence-specific PCR, SSP-PCR)
MINDKETTŐ!!! Különböző hosszúságú termék!!
Valósidejű (Real -Time vagy kvantitatív) PCR
Szekvenálás – klasszikus módszerek - kémiai (Maxam-Gilbert)
Szekvenálás – automata (fluoreszcens) szekvenálás Automata „dye primer” szekvenálás
Automata „dye terminator” szekvenálás
MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA
FISH Fluorescent In Situ Hybridization
Cytogenetika- kariogram
Large B-cell lymphoma, hidden and complex translocations: der (14)t, (1:14), (?; q32), t(3:14), (q27,q32) – multicolor FISH
t: 1:14 whole chromosome „painting”
MOLECULAR PATHOLOGY
Comparative Genomial Hybridization CGH
Formalinban fixált, paraffinba ágyazott: FFP (E) ► MIÉRT CSINÁLJUK ?
► NAGY SZÖVETI MINTAKÉSZLET + ADATBÁZIS
► MIT SZERETNÉNK ELÉRNI ?
► MINDENT, DE ……..
► - DNS - RNS - FEHÉRJE
SZEKVENÁLÁS KLÓNOZÁS MUTÁCIÓ ANALÍZIS mRNS EXPRESSZIÓ (real time RT-PCR, DNS CHIP) mikroRNS-ek IMMUNHISZTOKÉMIA WESTERN BLOT ANALÍZIS PROTEOMIKA
m
m
Optimális fixálandó anyagméret ? /ó ra
1
5 mm vastag alternatív archiválás: RNAlater, foly. nitr. fagyasztás
Példa: 8 cm-es tumor rezekátum Ha a rezekátum közepéből származik a pathologiai mintavétel: kb. 3-4 óráig fixálatlan degradáció + műtéti relatív ischemia degradáció
MI HAT A SZÖVETRE ? ?
FORMALIN (pufferolt ?) ALKOHOLSOR HŐMÉRSÉKLET !!! PARAFFIN (száraz hő)
FEHÉRJÉK KÖZTI KERESZTKÖTÉSEK FEHÉRJE DEGRADÁCIÓ KONFORMÁCIÓ VÁLTOZÁS TÖRÉSEK FEHÉRJÉK és NUKLEINSAVAK KERESZTKÖTÉSEK (methylol keresztkötés) DNS, RNS DEGRADÁLÓDIK DNS, RNS ÖSSZETÖREDEZIK
„ Igaz ” következtetések levonására alkalmatlan a FFP anyag ? Kérdés: minek a megválaszolására alkalmas a FFP anyag ?
FFP anyagok
Szöveti lokalizáció
In vitro
Immunhisztokémia
DNS alapú technikák
In situ hibridizáció
RNS alapú technikák
(CISH, FISH)
Fehérje alapú technikák
A fixálási idő hatása a szöveti struktúrára 1 nap
3 nap
10 nap
A fixálás jelentősége –Helico FISH túlfixált
megfelelően fixált
Az előkezelés jelentősége –hőkezelés (HER2 FISH)
„ Gjedrum és mtsai: J. Mol. Diagnostics, 6:42-51, 2004 „ Real-time quantitative PCR of Microdissected Paraffin-Embedded Breast Carcinoma „
Az előkezelés jelentősége –enzimes emésztés (HER2 FISH) alulemésztett
túlemésztett
A fixálási idő hatása az izolált DNS minőségére
3 nap
1 nap
10 nap
A fixálási idő hatása az izolált RNS minőségére
3 nap
1 nap
10 nap
A fóliázott mintákból izolált DNS fragmentációja máj
Fóliázás:
Nap:
0.
3.
vese 1 6.
0.
4.
7.
vese 2 10.
0.
3.
6.
vese 3 0.
4.
7.
gyomorák 10.
0.
3.
6.
−80Co 1000 bp 500 bp
FFP
1000 bp 500 bp
Nap:
0.
3. máj
6.
0.
4. 7. 10. vese 1
0.
3. 6. vese 2
0.
4. 7. 10. vese 3
0. 3. 6. gyomorák
FFP 1000 bp 500 bp
Izolálás (Qiagen) : QiAamp DNA FFPE Tissue Kit ~0,5 μg DNS/minta, 1.2%-os gél
Nap:
0.
3. 6. vese 2
0.
4. 7. vese 3
10.
0. 3. 6. gyomorák
MOLECULARIS PATHOLOGIA
MINTA TRANSZPORT • DNS izolálás: rövid szekvenciák: 500 big: erre alkalmas az FFPE anyag. Mutációs analízis, PCR amplifikáció vagy szekvenálás • egyébként : EDTA-s vér vagy fagyasztott szövet vagy aspirációs cytologia DNS lysis pufferban. Tárolás 4 C, - 20 C vagy - 80 C !! IDŐHATÁR!! • VÉSZHELYZET: 4 C-n (jégen) küldeni vagy fiz. sóban nedvesített gézben a molekuláris pathologia laborba ! PATHOLOGIA !
• KONZULTÁLNI A LABORRAL !! (előtte. . . ) • Mol. pathologia és ElMI !! Pl. vese diagnosztika !
MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA
CÉLJA Diagnosztikai és terápiás kérdések eldöntése Hematológia: pl. Philadelphia kromoszóma (CML) Lágyrész tumorok TERÁPIÁS CÉLPONTOK MEGHATÁROZÁSA Emlő cc. : HER-2 ⇒ HERCEPTIN kezelés? Tüdő/colon cc.: k-ras mutáció ⇒ EGFR gátlók b-raf n-ras EGFR mutáció Melanoma: b-raf Fertőző ágensek kimutatása, tipizálása: pl. HPV, Cytomegalovírus, Chlamydia pn., TBC, Helicobacter pylori – clarythromycin rezisztencia meghatározás
MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA
CÉLJA • Felvetett diagnózis megerősítése, genotypus pontosítása, polymorphysmus vizsgálata pl. CML ( Philadelphia chr.), lymphoma tipizálás, Wilson kór, Haemochromatosis dg. • MRD: Minimal Residual Disease !! Pl. Emlőrák csontvelő, haematológiai betegségek - csontvelő
MOLECULARIS PATHOLOGIA ALAPJAI
• Tumor Diagnosztika • Fertőző ágensek diagnosztikája • Genetikai betegségek diagnosztikája
DAGANAT
A RÁK is egyfajta GENETIKAI betegség!! Egy vagy több „beteg” gén hatása következtében alakul ki !!
DAGANAT
Korai diagnózis, screening Pontosabb diagnosztika, Differenciáldiagnosztika, tipizálás, Prognosis, kezelés PREDIKTÍV PATHOLOGIA HOGYAN ???
1. Tüdőrák célterápiás érzékenységének meghatározása EGFR exon 19-21 mutáció vizsgálat K-RAS exon 2, codon 12/13 mutáció vizsgálat EML4-ALK fúziós gén vizsgálat EGFR, MET kópiaszám vizsgálat (FISH) 2.Vastagbélrák célterápiás érzékenységének vizsgálata K-RAS és B-RAF mutáció vizsgálata EGFR exon-2-7 mutáció vizsgálata EGFR kópiaszám meghatározás(FISH) MSI státusz meghatározás: MLH1 és MSH2 inaktiválódás kimutatása (IHC) EGFR, MET kópiaszám vizsgálat (FISH) 3. Emlőrák célterápiás érzékenységének meghatározása HER-2 kópiaszám meghatározás (FISH) HER-2 ec-domain deléció vizsgálata p95 4. Malignus melanóma célterápiás érzékenységének meghatározása B-RAF mutáció vizsgálata N-RAS mutáció vizsgálata (codon 61) KIT mutáció vizsgálata (exonok) EGFR, MET kópiaszám vizsgálat (FISH) 5. Vesefejlődési rendellenességek genetikai hátterének tisztázása - Wilms tumor dg. WT1 mutáció analízis 6. HP antibiotikus rezisztencia vizsgálat FISH 7. HPV kimutatás (PCR) 8. Hematológiai diagnosztika: pl. Philadelphia chr. 9-22 transzlok. BCL-ABL fúziós gén Polycythemia vera: JAK2 pontmutációk Primer myelofibrosis: JAK2 v. MPL mutációk anaplasticus nagy B sejtes lymphoma: ALK átrendeződés mantle cell lmyphoma: Cyclin D1-IgH fúziós gén 9. Lágyrész daganatok diagnosztikája: Ewing sarcoma: FL1-EWS fúziós gén Liposarcoma: CHOP/TLS fúziós gén Clear cell src: EWS-ATF1 fúziós gén
CML - GLEEVEC terápia
Philadelphia-Chromosome
MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA
•
MÓDSZEREI GENOMIKA, PROTEOMIKA, METABOLOMIKA !! (Chip technológia )
• CYTOGENETIKA !! • DNS: génkópiaszám (HER-2-ErbB2, n-myc), mutáció detektálás (mucoviscidózis, k-RAS, EGFR ), LOH, génátrendeződés, fúziós gének (bcr-abl) kimutatása • RNS: jelenleg igen ritka, de később: Expressziós profil meghatározása !!! Dg. !! • FEHÉRJE: ELISA, WESTERN-blot, immunh. !
DNS CHIP – globális gén expressziós profil
Sorlie et al., PNAS 98, 10869-10874, 2001
Az invazív ductalis carcinoma genetikai altípusai • Normál emlő-szerű • Luminális (A/B) ER+ • Bazális típus ER-/PgR-/HER2„Triple negatív” DE EGFR+ • Her2+ (amplifikált) emlőrák EGFR+
Targeted Therapy – CÉLZOTT TH. DEFINICIÓ: •
Olyan gyógyszerek, hatóanyagok, antitestek, melyek jelátviteli útvonalakat, folyamatokat, illetve élettani működéseket céloznak, melyek a daganatos sejtekben egyedi, specifikus módon alul vagy túlműködnek: – – – – –
Növekedési faktorok Receptorok Gének Angiogenesis Tumor pH
DE : Ezek az útvonalak nem annyira „ egyediek”
HCC PATHOGENESIS
Thorgeirsson, S.S. and J.W. Grisham, Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Nat Genet, 2002. 31(4): p. 339-46.
Llovet J.M., Bruix J. Hepatology 2008.48:1312-27
Llovet ASCO 2007
Phase III SHARP Trial
Survival Probability
Overall survival (Intention-to-treat) 1.00 Sorafenib Median: 46.3 weeks (95% CI: 40.9, 57.9)
0.75
Placebo Median: 34.4 weeks (95% CI: 29.4, 39.4) 0.50
0.25 Hazard ratio (S/P): 0.69 (95% CI: 0.55, 0.88) P=0.00058* 0
0
Patients at risk Sorafenib: 299 Placebo: 303
8
16
24
32
40
48
56
64
72
274 276
241 224
205 179
161 126
108 78
67 47
38 25
12 7
0 2
*O’Brien-Fleming threshold for statistical significance was P=0.0077.
80 Weeks 0 0
Llovet ASCO 2007
Phase III SHARP Trial Time to progression (Independent central review) Probability of Progression
1.00
0.75
Sorafenib Median: 24.0 weeks (95% CI: 18.0, 30.0)
0.50
Placebo Median: 12.3 weeks (95% CI: 11.7, 17.1)
0.25
Hazard ratio (S/P): 0.58 (95% CI: 0.44, 0.74) P=0.000007 0
0
Patients at risk Sorafenib: 299 Placebo: 303
6
12
18
24
30
36
42
48
196 192
126 101
80 57
50 31
28 12
14 8
8 2
2 1
54 Weeks 0 0
Llovet ASCO 2007
ErbB Family and Ligands EGF TGF-α Amphiregulin β-cellulin HB-EGF Epiregulin
No Known Ligands
Heregulins
HB-EGF Heregulins β-cellulin
Extracellular
Tyrosine Kinase Domain
Intracellular ErbB-1 HER1 EGFR
ErbB-2 HER2 neu
ErbB-3 HER3
ErbB-4 HER4
EGFR(1)
AKT
Tímár és Ostoros, L.A.M., 2007 Horn et al., J. Clin. Oncol., 27:4262, 2009
Aktiváló Ras Mutációk GTP Hydrolysis
p21ras
12&13
59&61
**
***
GTP Exchange
**
GTP/GDP Binding
Switch Region
GTP
GDP Structures from Sprang S.R., Annu. Rev. Biochem 1997. 66:639-78
*
K-Ras mutációanalízis • • • •
Anyag: műtéti rezekátum, biopszia Friss HE festett metszet TU-sejt arány meghatározása Makrodisszekció (tisztaság, keresztkontamináció elkerülése!) • DNS izolálás • RFLP; szekvenálás
K-ras mutáció meghatározás 2-es exon 12-es kodon PCR-RFLP
M
+
-
M
RFMD (Restriction Fragment Microfluidic based Detection) The flurescence labelled and microfluidic based detection is a sensitiv technology to detect the results of restriction fragments
The system produces rapid, reproducible, and reliable separation of nucleic acid samples. Run time: 40 min/11 samples
Sensitivity of the PCR (RFMD) method
Dilution range was generated from K Ras mutant (H358) and wild type( LCLC) cell line to define the sensitivity of this PCR RFLP method.We were able to detect 2% mutant DNA with Experion electrophoresis system
EGF
Receptor L domén
EGFR Furin-like domén
Receptor L domén Extracelluláris domén Transzmembrán régió Intracelluláris domén G719C Katalitikus kináz domén
delE746-A750 del747-T751insS del747-P753insS
e19
L858R
790M e20
L861Q
e21
Tirozin foszforilációs hely (Y1068)
Query: 266
tgcaactcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacaca 325 |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 2603 tgcagctcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacaca 2662 Query: 326
aagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaagggcatga 385 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 2663 aagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaagggcatga 2722
481bp
STAT3
AKT MAPK
Exon 18-21 NM_005228.3 2312-2793
EGFR-HRM exon 18. 19, 20, 21 szekvenálás
EGFR2/HER2 jelátviteli pálya (fiziológiás körülmények között)
Herceptin
PTEN
Disease-Free Survival Romond H et al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer NEJM 2005; 353:1673-1684
ACÆTH 87%
85%
ACÆT 75%
%
67% N Events ACÆT 1679 261 ACÆTH 1672 134
HR=0.48, 2P=3x10-12
Years From Randomization
B31/N9831
MOLECULARIS PATHOLOGIA
HER-2 – emlőrák
HER2 amplifikáció
normál
HER2 expression in breast cancer
3+ CB11
Amp HER2/CEP17
n-myc gene-amplification - Schwab et al. : THE LANCET Oncology, 4:472, 2003
Neuroblastoma - n-myc gene-amplification
Neuroblastoma - n-myc Gene-amplification - FISH
MOLEKULÁRIS PATHOLOGIA
FISH - húgyhólyagrák
egészséges
Húgyhólyag rák
MOLECULARIS PATHOLOGIA ALAPJAI
• Tumor Diagnosztika • Fertőző ágensek diagnosztikája • Genetikai betegségek diagnosztikája
TMA transcription-mediated amplification NASBA nucleic acid sequence-based amplification
Hybrid Capture Assay (HPV, HBV, CMV) A sejtből izolált DNS-t specifikus egyszálú RNS próbával hibridizáltatjuk. A jellegzetes struktúrájú DNS/RNS hibridet felismeri a a plate-re kötött antitest. Egy másodlagos antitesttel hívjuk elő a reakciót (kemiluminescens leolvasás) Érzékenysége: HPV – 1000 kópia
DNS RNS próba
antitest
másodlagos antitest
MOLECULARIS PATHOLOGIA
HPV genotypizálás
HPV és a fejnyaki rákok hazánkban Lokalizáció
Méhnyak Penis Szájüreg Gége Nyelőcső Cardia Tüdő
Szentirmay et al. Canc Met Rev 2005
HPV előfordulási gyakoriság (%)
64.5 52.4 48.5 35.7 33.3 37.0 16.0
HELICOBACTER PYLORI KIMUTATÁS Microhullám Helico -FISH
HELICOBACTER PYLORI KIMUTATÁS Microhullám Helico, Rezisztencia -FISH
HELICOBACTER PYLORI KIMUTATÁS Microhullám Helico, Rezisztencia -FISH
3 years old female Heart TX : dilatative cardiomyopathy
Clinical diagnosis:
Pathology:
Pneumonia Lung fibrosis CMV infection – sepsis Arrhytmia Respiratory insuffitiency
Heart TX status post Lung fibrosis Pneumonia ARDS
49508/10 bjk. LUNG TX „Semi-sterile” samples : 1. Heart 2. Lung 3. Brain 4. Spleen 5. Liver 6. Adreanl gland 7. Kidney PK- positive control (sequenced verified CMV DNA) NK- negative control
„ Non sterile” samples 8. Lung 9. Liver 10. Adrenal gland 11. Spleen 12. Kidney
MOLECULARIS PATHOLOGIA ALAPJAI
• Tumor Diagnosztika • Fertőző ágensek diagnosztikája • Genetikai betegségek diagnosztikája
„Egygénes” betegségek és kimutatásuk molekuláris biológiai módszerekkel
26 éves nő • • • • •
8 éve szed fogamzásgátlót Bizonytalan hasi panaszok Májenzym-emelkedés Hasi UH + CT: májban körülírt terime Műtét: májresectio
• Szövettani vizsgálat
DG: Focalis nodularis hyperplasia • Differenciál diagnosis: – HCC – HCA – CCC – CCA – Metastasis
