Molekuláris pathologia alkalmazása a mindennapi pathologiai diagnosztikában Tóth Erika, Csernák Erzsébet, Gallai Mónika
Mit?
Országos Onkológiai Intézet
Hogyan?
Miért?
The field of molecular diagnostics is growing, adapting, changing constantly, and beginning to permeate virtually every area of medicine.
(MB Rita Molecular diagnostics Hematology 2003)
Molekuláris biológiai alapfogalmak 1.
DNS szerkezete
Tm= 4(G:C) + 2(A:T)
Molekuláris biológiai alapfogalmak 2.
DNS replikáció
Molekuláris biológiai alapfogalmak 3. Fehérje szintézis
Centralis dogma
Molekuláris biológiai alapfogalmak 4.
Fehérje szintézis
Kód táblázat
Szekvenálás
Mit Molekuláris célpontok a diagnosztikában I. Fehérjék II. DNS, RNS 1.Génátrendeződések, transzlokációk fiziológiás pathologiás 2.Mutációk (SNP-szinonim, non-szinonim; non-sens; missens) 3.Kromoszóma régió többlet, inzerció, amplifikáció 4.Kromoszóma régió vesztés, deléció III. Kórokozók (fehérje, RNS, DNS alapján)
Mit
Fehérjék Sejtfelszíni Intracytoplasmaticus Nuclearis
Hogyan
Miért
Immunhisztokémia
Daganatok sejteredete Differenciáltság Prognózis Terápiás célpont
Génátrendeződések, transzlokációk Mit
- fiziológiás (IgH, TCR): poliklonális, monoklonális
-patológiás: jelen van, nincs jelen Qualitatív Chimera gének
Quantitatív protoonkogének
bcr-abl t(9;22) ALK t(2;5)
c-myc t(8;14) bcl-2 t(18;14)
Hogyan PCR
Génátrendeződés, transzlokációk
hagyományos valós idejű
Kariotipizálás (1000kb-tól) Cytogenetika Interfázis cytogenetika, FISH (1-100kb-ig) CISH fúziós szignál FISH split szignál FISH
IgH génátrendeződés VH
D
JH
C
5’
3’
5’
3’ FR1
FR2 CDR1
FR3 CDR2
FR4 CDR3
IgH gén somaticus hypermutatio 5’
3’
5’
3’
5’
3’ CDR1
CDR2
CDR3
Intraclonalis divergencia
IgH génátrendeződés (FR3A/LJH) folliculáris lymphomákban Hagyományos PCR módszert követő agaróz gélelektroforézis
100bp
Kapilláris elektroforézis
IgH génátrendeződés, RT-PCR, poliklonális FL
CD10
IgH génátrendeződés, RT-PCR, monoklonális FL
Molekuláris vizsgálat indikációi lymphomákban: Diagnosztikus (neoplasticus/reaktív-IgH, TCR) Klasszifikáció (specifikus transzlokáció kimutatása- BCL2, BCL1, c-myc, ALK) Prognózis (IGH szomatikus hypermutáció-CLL, transzformációra való hajlam-API2/MALT1, IGH/BCL10) Beteg követés (IGH, BCL2)
IgH és TCR génátrendeződés vizsgálatának buktatói Álpozitivitás: Kontamináció Pseudoklonalitás (kis minta) Helicobacter gastritis Hepatitis C fertőzés Sjögren syndroma Rheumatoid arthritis tumor reaktív immunválasz Álnegativitás preanalítikai tényezők (degradáció, fixálás) egyetlen V-régió konszenzus primer használata nagyszámú reaktív sejt a mintában részleges IgH átrendeződés szomatikus hypermutáció IgH gén deletio (1/10 lymphoma)
FISH módszerek Fusion-Signal FISH
Hogyan
LNA-FISH e-FISH
Split-Signal FISH COBRA-FISH ACM-FISH
cat-FISH
PNA-FISH
Comet-FISH CB-FISH
arm-FISH
DBD-FISH CO-FISH
D-FISH
CARD-FISH
cryo-FISH
Fiber-FISH COMBO-FISH Halo-FISH
COD-FISH M-FISH
Hogyan
FISH módszerek, fúziós próba
Töréspont
„A” gén „B” gén
Fúziós próba hátránya: - alternatív partnerhez való fúziót nem mutatja ki - magas álpozitivitás (5-10%) a véletlen ko-lokalizáció miatt
Burkitt lymphoma, c-myc-IgH t(8;14) reciprok transzlokáció Fúziós szignál próba
FISH módszerek, split (hasadó) próba Töréspont
„A” gén
Split próba előnye: - detekció független a partner géntől - nincs ko-lokalizációs hiba - könnyű értékelni
Burkitt lymphoma, c-myc transzlokáció Split szignál próba
Dako DuoCISH
Automated Dual Color CISH Visualization
AP
HRP
AP
Hybridisatio Texas Red és FITC jelölésű próbákkal (Hagyományos FISH)
HRP
Inkubáció CISH antitest keverékkel
Hátrány: kék és lila jel elkülönítése nehéz Előny: mindenütt elérhető, ahol van jó immunhisztokémia érdekelt asszisztens és pathologus technikai háttér
Inkubáció piros majd kék chromogen szubsztrát oldattal
Miért
Köpenysejtes lymphoma Cyclin D1-IgH transzlokáció t(11;14) IgH Split próba
Dako DuoCISH
Automated Dual Color CISH Visualization
Cyclin D1
DLBCL GC fenotípussal, atípusos Burkitt-szerű megjelenéssel
CD10 Ki-67 c-myc split próba, transzlokáció nincs
Real-time PCR módszer Bcl-2 (14;18) transzlokáció kimutatása Exon1
Exon 2
Exon 3
IgH
Bcl-2 exon 3 primer
primer Fluorescein- Probe
Amplicon
LC Red - Próba Translocation specific probe detector
anchor próba
Olvadáspont analízis: Hőmérsékletet fokozatosan 0.1 ºC-kal emeljük az amplifikációs ciklus végén
PCR reakció szenzitivitásának meghatározása DOHH2 sejtvonal hígítási sorral
Olvadáspont analízis valós idejű PCR reakció után
Miért
Minimális reziduális betegség kimutatása
Gyógyszerek tumorellenes hatásának mérése Csontvelői infiltráció kimutatása Betegkövetés Relapsus korai kiszűrése
Normál egyénekben detektált transzlokációk: t(14;18) BCL-2-IGH Follicularis lymphoma t(9;22) BCR-ABL1 Ph+ ALL, CML t(2;5) NPM1-ALK ALCL
Mit
RNS alapú vizsgálatok Fúziós gének kimutatása lágyrész daganatokban
Hogyan RT PCR mRNS
cDNS
PCR Amplifikáció
Fúziós partner
Tumor típus
Fli1 (11q24) 85-95 % Erg (21q22)
PNET / Ewing sarcoma Askin tumor
5-10 % WT1 (11q13) EWS
>80 %
22q12
ATF1 (12q13) 85-100 % CHN (16p11) 75 %
TLS 16q11
CHOP (12q13) 5+95 %
DSRCT
Világossejtes sarcoma Extrasceletalis myxoid chondosarcoma Myxoid / kereksejtes liposarcoma
Specifikus molekuláris eltérésekre, transzlokációkra jellemző fehérje expressziók •FLI1- EWS/FLI1 PNET/ Ewing sc •ALK- ALCL, inflammatoricus myofibroblastos tumor •Cyclin D1- IGH/BCL1 köpenysejtes lymphoma •CD10, BCL6- germinalis centrum eredetű DLBCL •MUM1, FOXP1, BCL2- nem germinalis centrum eredetű DLBCL •ZAP70- SHM negatív CLL •BCL10- IGH/BCL10, API2/MALT1 gyomor MALT lymphoma
Mit
Kromoszóma régió többlet „gains”
N-myc amplifikáció….neuroblastoma EGFR amplifikáció….. tüdőrák, vastagbél ca HER-2 amplifikáció…..emlőrák Cyclin D1 amplifikáció…fej-nyaki laphámrákok
Hogyan
FISH módszer, centromerikus próba
Adenoid cysticus ca 2 kópia EGFR
Valós idejű PCR Abszolút quantifikáció 1-, 13- és 25-szörös N-myc amplifikációt tartalamzó IMR 32 neuroblastoma sejtvonal segítségével.
25
13
1 copies
Túlélési valószínűség
N-myc status
Nem amplifikált
Amplifikált P= 0.192
Túlélés (hónapok)
N-myc amplifikáció és szövettani megjelenés közötti öszefüggés 30 kópia MYCN
•Differenciálatlan tumor •Magas MKI •Prominens nucleolusok
Mit
Kromoszóma régió vesztés, „silencing”
EGFR deletio….tűdőrák 3p, 5q ,18q allélvesztés….fej.nyaki laphámrák P16 metiláció (silencing)…fej-nyaki laphámrákok MMR metiláció…vastagbélrák, nem herediter
Mit
Mutációk
K-ras…. Vastagbélrák B-raf…..vastagbélrák, melanoma, pajzsmirigy EGFR….tüdőrák P53 …….fej-nyaki laphámrákok, Li-Fraumeni syndroma BRCA1/BRCA2…..emlőrák APC….FAP, Turcot syndr (CNS tumor+colon ca) MMR…HNPCC C-kit….GIST PDGFR….GIST
BRAF: 7q34 protoonkogén, serin-threonin kináz mutáció: 89%, exon 15(V600E): szubsztrát-kötő helyet védi 11%, exon 11 (G loop): ATP-kötődés mediálása Membrane
RAS
P
RAF
P
P Cytosol
V600E is approximately 480 fold more active than wtB-RAF
P
P
ERK
V600EB-RAF
A mitogén-aktiválta-protein-kináz (MAPK) kaszkád egyik génje. Specifikus mutációi önmagukban is génaktivációt idéznek elő. Növekedési faktor-szignál nélkül is sejtproliferációt indukál. ACA GTG AAA wt Differenciációt gátolja. ACA GAG AAA mut
MEK
P
P
Nucleus Nuclear substrates
Val Glu
enhanced signal and cellular responses
DNS minta
Az amplifikációs ciklus befejeztével 0.1 fokonként emeljük a hőmérsékletet a sensor próba leolvadásáig
Mutáció kimutatása Real-time PCR-t követő olvadáspont analízissel
A BRAF V600E mutáció kimutatásának jelentősége Diagnosztikai BRAF negatív
BRAF pozitív
Spitz naevus (van Dijk, 2005) Világossejtes sarcoma Endometrium komplex hyperplasia HNPCC Follicularis pajzsmirigy ca Low grade serosus ovarium ca
Spitzoid melanoma Melanoma Endometrium carcinoma Sporadikus MSI-H rák Papilláris ca follicularis var. High grade serosus ovárium ca
Prognosztikai A BRAF+ vastagbélrák kórlefolyása kedvezőtlen Terápiás Nexavar
Mutáns BRAF solaris melanomában
Vad típusú BRAF vulva melanomában
A KRAS (vagy BRAF) mutáció gátolja a cetuximab EGFR gátló hatását
AntiEGFR mab
EGFR
Aktivált állapot
EGFR-től független szignálút aktiváció G12D G12V V600E G13D P G13C P RAFP KRAS
gyakoriság 54 %
gyakoriság 11 %
P
MEK
P
P
ERK
P
Blokkolt anti-EGFR hatás
Primer tumor
Máj áttét
42 éves ffi.
- Jobb colonfél ca. + cseplesz áttét. - Anti-EGFR kezelés után rebiopsia.
KRAS G12V Wt kontroll
- Májáttétek a fenti kezelés alatt. - „Non-responder”, 2 éven belül meghalt
EGFR IH
Mit
Kórokozók
EBV….lymphomák, nasopharyngealis carcinoma HPV…cervix és fej-nyaki laphámrákok HIV….AIDS Mycobactérium…tuberculosis
Hogyan
ISH PCR
Angioimmunoblastos T-sejtes lymphoma, EBV
Miért
CD21 EBER-EBV encoded RNA ISH
CD4 CD10
CD20
Recurralo juvenilis juvenilis laryngealis laryngealis papillomatosis papillomatosis HPV HPV 6-11 6-11 Recurralo
Előnyök, hátrányok FISH
PCR alapú módszer
Anyag minősége
Friss, paraffinos
Friss, paraffinos
Időigény
2 nap
2-4 nap
Szubmikroszkópos eltérések kimutatása
igen
igen
Numerikus eltérések
igen
nem
Heterogén töréspont
igen
Kisebb találati arány
Több partner gén a transzlokációban
igen
nem
Pontmutációk
nem
igen
Érzékenység % tumorsejt
5-10%
0,001-1%
Futó vizsgálatok listája •FISH/CISH IGH/BCL-2 dual fusion, IGH split, MALT1 split, C-MYC split, bcl-6 split N-myc dual color EGFR dual color •IgH, TCR génátrendeződés •EBV kimutatás (whole genom) •Mutációk: BRAF KRAS EGFR C-kit •Microsatellita instabilitás •HPV tipizálás
Molekuláris pathologia Információ, amihez a hagyományos pathologiai feldolgozás során nem jutunk hozzá Sok lehetőséget rejt magában….de csak a puzzle egy darabja A többi adattal együtt kell értékelni az adott összefüggéseket (klinikum, morfológia, immunhisztokémia) figyelembe véve Pozitív eredmény….nem mindig neoplasticus Negatív eredmény….nem mindig nem neoplasticus Racionálisabb, biológiai alapú diagnózis, célzott terápiák
