Oxigén polarográfia
2[LJpQIHMOGp p
DPLQH
YR
D
PpUpVpU ]yW
HOV IRWRV]LQWHWLNX V]iPR
PyGV]HU
UHDNFLy DP GROJR]WD
L
PLQ
pY
felfedeztek
(J\V]HU&VpJ ! ]pOHVN|U&
alkalmazhatósága miatt leginkább a polarográfiás módszer terjedt el a fotoszintetikus oxigén produkció mérésére. A rutinmérésekben alkalmazott oxigén polarográf, az ún. Clark elektród, ami egy bipoláris elektrokémiai oxigén szenzor. A rendszer két elektródból, Pt katód és $J$J& "
D#%$&
LOOHWY ')(+*
|VV]HN|W
NH,
.& -
HOHNWUROLWEy -
iOO .0/
Np1
HOHNWU 2354%6 ]|WWL
polarizációs feszültség 0.6 - 0.7 V. A folyadék vagy gáz fázisú mintából a Pt katódhoz diffundáló O2 redukálódik. Az anódon az ezüst oxidálódik és AgCl válik ki. Az elektród IRO\PDW 784
VRUi9:4
HOHWNH] iUD;
HJ\HQH <
DUiQ\R <>=
NDW 23789
UHGXNi -1
R[LJp9
PHQQ\LVpJpYHO
(1. ábra).
O2 M em brán K ató d (P t) − 2E +E 2H −
H 2O 2+ 2 e
−
H 2O 2+ 2 O H
K C l híd
−
2+
K C l oldat
-
+
0 .6 - 0 .7 V
4e
+++++
A+ nó d− (A g ) 4A g + 4e
4A g F
−
4A g + 4 C l
4A g C l
1. ábra. Az oxigén polarográf elektród folyamatai
A fotoszintézisben alkalmazott oxigén elektródoknak két típusa van, a Clark és a Joiot elektród. A Clark elektród esetén az elektródokat egy olyan membrán fedi le, ami permeábilis az oxigén számára, de nem ereszti át a vizet és az ionokat. A
3?
HOHNWU @ACB
membrán alatt tömény KCl elektrolit köti össze az Ag anóddal (2. ábra).
LVPpUHW& p D
D
M in ta Pt
2. ábra. A Clark-típusú oxigén elektród szerkezete.
A kicsiny katódfelület, a zárt mintatartó és a minta keverése biztosítja, hogy a minta WpUIRJDWiEDG
DH
R[LJpJ G % I 8 K G
FHQWUiFL L
iOODQGy M
DP NOQP
NDW LRK8G
W|UWpQ R[LJpQIRJ\DV]Wi S
QHP
befolyásol. Így az elektród által mért oxigén mennyisége a mintában található oxigén parciális nyomásával arányos. Az elektródból kapott jel könnyen kalibrálható mintát nem tartalmazó, OHYHJYHOWHOtWHTUT
ROGDWEDV
PpUTXW HOOH Y
|VV]HKDVRQOtWYD Z
DP [)Y HKHWY \
WHV] [
D]
R[LJpQ
koncentráció (parciális nyomás) kvantitatív maghatározását. Mivel az oxigén folyadékokban YDO ^X_ OGKDWyViJ `
HUVHa
IJ bdc
KPpUVpNOHWWO e
NYDQWLWDWtf
PpUpVHNKHg
HOHQJHGKHWHWOHa
elektród termosztálása, és a kalibrálás során az oxigén
ROGpNRQ\Vi b
KPpUVpNOHh
NRUUHNFLyE c
DJ o
KRJp o c
YpWHOH > i j
PHPEUiQQD k
IHGHU h h
NO|QE|] NHPLNiOLiNDW e HOVVRUEDqsr
HOHNWU l n m a
IRO\DPDWR t
HOQ\H e
R[LJpQIHMOHV]WpVKH u
IJJpVpQHN
PLQWiKR g
V]NVpJH t
D]
OHKHW
DNFHSWRURNDW
adni anélkül, hogy azok az elektródfolyamatokat befolyásolnák. Egy tipikus oxigénmérési kísérletnél a fotoszintetizáló mintát (alga, izolált tilakoid PHPEUiQ vxw
V]NVpJH y
DNFHSWRUUD z
HJ\| { } { w
PLQWDWDUWyE w
KHO\H]]N ~
(] {
N|YHWHd
pKiQ\
percig sötétadaptáljuk, és mérjük az ún. alapvonalat. Intakt fotoszintetikus rendszerek esetén D
DODSYRQD z
PHUHGHNVpJ
QHJDWtY
DP w
V|WpWEH
OHMiWV]
UHVSLUiFL
VRUi
W|UWpQ
oxigénfelvételt tükrözi. Izolált tilakoid membránokban, respiráció hiányában, az alapvonal PHUHGHNVpJ OYEH}
OO
HWW
HOWpUpV
KPpUVpNOH
YiOWR]iV
YDJ
D
HOHNWU
LQVWDELOLWiVD
okozhat). Az alapvonal felvétele után a mintát megvilágítjuk és az egyensúlyi állapot beállása után meghatározzuk a fényindukált és a sötétben mért jel meredekségének különbségét (3. iEUD
(
D
pUWp
PHJIHOHO NDOLEUiOi
XWi
PLQW
R[LJp
IHMOHV]WpVpQH
VHEHVVpJp
DGMD
Ennek tradicionálisan használt mértékegysége a µM O2 / mg Chl / h.
3iEUD2[LJp
IHMOGpV
$QQD KiWUiQ\R © N|YHWQ ®
HOOHQpUH
WXODMGRQViJ D¨
VHEHVVp
KRJ L©
&ODU
YDQ ª $ ¨
R[LJpQNRQFHQWUiFL ¡
PpUpV
&ODUNWtSXV
HOHNWU ¡¢d
HOHNWUyGR¦ LGEH U ¯ ®
HOHNWUyGGDO
YDQWLWDWt£¥¤ [LJpQPpUpV¦§¦ HV ¨
IHG PHPEUi«
YiOWR]iViW
PLD¦|¦¬
WLSLNXVD«°«
UHQGV]H
pKiQ\V]R
FVD Wt ¨
OHKHWYp ODVVD«
NpW
WXGMD
PiVRGSHUFHV
feloldással. Emellett, a Pt elektród kicsi felülete miatt az érzékenység is kicsi. Ezen hátrányok NLNV]|E|OpVpU ±
IHMOHV]WHWWps
J\RU ©
p©
QDJ\pU]pNHQ\VpJ& ²
~Q ³ LPSXO]X ´
HOHNWUyGRNDW ³ (QQHN
HOV IRUPiMiµ
Pierre Joliot konstruálta a 70-es évek elején. A Joliot elektród esetén a Pt katód
IHOOHW ¶
NE ¸º¹
QDJ·
FP ¸
iWPpUM& N|UODS »
D¼
$½
D¾%¿À
SHGL ½
HJÁ
Â
FÃ
iWPpUM& J\&U& Ä
$
minta közvetlenül a Pt katódon helyezkedik el, így az oxigénnek nem kell a membránon átdiffundálni (4. ábra).
Jo lio t e lek tró d F ény
-
4e KCl
Ag + 0.6 -
Pt
- 0.7 V
m em b rán -
4e
4. ábra. A Joliot-típusú oxigén elektród felépítése.
(]HÅ
HOUHQGH]p Æ
R[LJpQIHMOGp Æ
OHKHWY Ç
NLQHWLNiMiQDÎ
WHV] È
QpKiQ Ï
NL Æ
50-100 µOÊ
WpUIRJDWÉ
PLQWiEy ËÍÌ |UWpQ
µs-os felbontású követését. Illetve, folyamatos fény
helyett rövid (1-2 µs) fényimpulzus alkalmazását. A Joliot elektród eredeti elrendezésében szintén tartalmaz membránt, ami a Pt katódra rétegzett mintát választja el a KCl-t tartalmazó SXIIHUWO Ð
LOOHWY ÑÓÒ+Ô
WRYiÕÕÖÅ%×8Ø YDQ Ð
pÆ
D] Ì
HOKHW Ò
H]]H Ë
NRQWDNWXVEDÅ
PHPEUiÅ
J\&U& IRUPiEDÅÚØ
OHY
HOKDJ\iViYDO Ð HV] È
N|UO Û
Ag anódtól. A Joliot elektród érzékenysége
DPLNRÙ
(QQp Ë
DÔ
LÆ
DÔ
Ag anód a Pt katóddal egy síkban
HOUHQGH]pVQp ˺Ò
PLQW Ò
PLQGNpÌ
HOHNWUyGRW
lefedi és a KCl-t közvetlenül a mintát hígító puffer tartalmazza. A Joliot elektród alkalmazása WHWW Ñ
OHKHWY ÇÒ QQDÎ
R[LJpQIHMOGp Ü
H Ü
IHOIHGH]pVpW Ð SHULyGXVÝ
KRJÏ
FVLOODStWRÞUÞ
IpQ\LPSXO]XVRNND Ë>Ì |UWpQ PHJYLOiJtWi Æ RV]FLOOiFLyÞ
PXWDÞ
ß
iEUD ß
HVHWpÅ
D]
Ezen mérések vezettek
el a 4 pozitív töltés szekvenciális tárolására szolgáló vízbontó rendszer ma elfogadott modelljének kifejlesztéséhez (6. ábra). A flash-indukált oxigénfejlesztés oszcillációjának leírására bevezetett ún. Joliot-Kok PRGH àUàâá
Yt]ERQW ãåä%æ PSOHçéèêäë
O|QE|] R[LGiFLy ì
iOODSRWiW íïî
iOODSRWRN í
posztulálja. Ezek
közül az S0, S1, S2, és S3 stabil állapotok, amelyek közötti átmenetek (Si → Si+1) fényindukáltak. Az S4 állapot az S3 → S0 átalakulás rövid élettartamú átmeneti állapota.
150
Oxigén jel
100 50 0 -50 -100 0
5
10
15
20
Flash-szám
Flash oxigén yield
250
S0=24.5 %, Miss=14 %, Dh=3 %
200 150 100 50 0 0
5
10
15
20
Flash-szám
5. ábra. Flash-indukált oxigén jel és oszcillációs szekvencia, Joliot-típusú elektróddal mérve. +
2H 2 O
4H + O 2
6ð
hν
6ñ
hν
6ó
6ò
e e
hν
hν
e
6ô
e
R C II 6. ábra. Az oxigén fejlesztés Joliot-Kok modellje. S0,…,S4 jelölik a vízbontó rendszer oxidációs állapotait.
Mivel az O2 molekula az S3→S4→S0 átmenet során szabadul fel és a maximális R[LJpõ
IHMOGp öQ÷
ø
IODVùûú
Wiõ
ILJ\HOKHW PHJ ü
H]pUý
V|WpWDGDSWi þÿý
túlnyomó része (75%) az S1 állapotban van. Az 1. illetve 2. NLVPHQQ\LVpJ&
R[LJpõ
D]ý
PXWDWMD ü
KRJ
D
62
PLQWi
IODVùåú
Wiõ
HVHWpõ
÷
FHQWUXPRN
PpUKHW ]pUy ü
LOOHWYH
és S3 állapotok sötétadaptált mintákban
nincsenek jelen. Mivel a fejlesztett oxigén mennyisége a 4. flash után is magas, ezért sötétadaptált mintákban S0 állapot is jelen van (25%). Az oszcillációs mintázat csillapodásának értelmezéséhez három fajta átmenetet kell figyelembe venni az S állapotok között (7. ábra).
100 % Sh
80 60 40 20 0 80
97 % Sh + 3 % Dh
Relativ oxigén fejlesztés
60 40 20 0 60 85 % Sh + 15 % Miss 40 20 0 60 82 % Sh + 15 % Miss + 3 % Dh 40 20 0 0
3
6
9
12
15
18
21
Flash-szám 7. ábra. Az oxigén szekvencia csillapodási paraméterei: single hit (Sh), double hit (Dh) és Miss. Ezek: •
az egyszeres találat ( single hit, β
ü
DPLNR
HJ
IRW 8õ
HOQ\HOpVpý
N|YHWHõ:÷
UHQGV]HU
eggyel magasabb oxidációs állapotba kerül (Si → Si +1). Tipikus értéke 80-85%.
•
a kétszeres találat ( double hit, γ NHWWYH
•
PDJDVD
iOODSRWE
a tévesztés ( miss, α
NHU
DPLNR
DPLNR
HJ
IRW
HOQ\HOpVp
N|YHWH
UHQGV]HU
Si → Si + 2). Tipikus értéke 2-3%.
IRW
HOQ\HOpVp
H
N|YHWH
W|UWpQL
[LGiFLyV
állapot válozás ( Si → Si ). Tipikus értéke 10-15%. A
fenti
modell
alapján
a
flash-indukált
oxigén
szekvencia
a
Joliot-Kok-féle
mátrixformalizmussal írható le: S(i+1) = KS(i) , Ahol S(i) az i-edik fényimpulzus után kialakult S állapot elosztás, K pedig a miss (α), single hit (β) és double hit (γ) tartalmazó átmeneti mátrix.
S0
i
i
Si =
K=
S1
i
S2
i
S3
(
PRGH
IHOWpWHOH]L
KRJ
D
iWPHQH
α
0
γ
β
β
α
0
γ
γ
β
α
0
0
γ
β
α
YDOyV]tQ&VpJH
pUWpNH
D
J\H
iWPHQHWUH
azonosak. A IODVKR[LJp •
"$#&%
$
PpUpVH
OODSRWR
'('*)
DONDOPD]iV
]GH
+-,
! HKHWVpJHL
HORV]WiViQD
'/.10
"
D
iWPHQH
+2,
YDOyV]tQ&VpJ
354
PHJKDWiUR]iVD
.
Ebben az esetben megmérjük az adott minta oxigén-fejlesztésének oszcillációs PLQWi]DWiW
6
(]
7
8
N|YHWH
HJ
9
::;8
OHJNLVH
<
pJ\]HWH
8
HOYp
P&N|G
minimalizációs
eljárással megkeressük a mérési eredményeket legkisebb eltéréssel leíró S0, S1, S2, S3, α, β, γ paramétereket. •
Az S állapotok stabilitásának vizsgálata.
Sötétben Az S2 és S3 állapotok szekvenciálisan visszaalakulnak a stabil S1 állapotba ( S3
: 62 :61
). Az S2 lecsengési kinetikájának vizsgálatára a sötétadaptált mintát 1
IODVKH
=
HOYLOiJtWMXN
C
@
N|YHWH
PLQWi
F
>
DP
?/@
FHQWUXP
A BDC
DJ
E
UpV]p
H
NO|QE|]
F
D
G
62
állapotba konvertálja. Ezt B
KRVV]~ViJ
I
V|WpWDGDSWiOiVQD
HWM
JB
DOi
>
PDMG
megmérjük a flash-indukált oszcillációs mintázatot. Ennek a fentiekben leírt DQDOt]LVpE
=
PHJKDWiUR]]
KB
D
sötétperiódus alatt az S2E = NO|QE|] V|Wp
F
61
SHULyGXVRNND
Az S3 iOODSRFO= HFVHQJpVpQHBPI
GML
=
iOODSRW
HORV]OiViW
>
DPLE
=
DGyGL
B
D
G
DGRWW
-be konvertálódott centrumok mennyisége. A mérést
HOYpJH]Y
L]VJiODW
nem egy, hanem két HOIODVKHF
A B
@/N
N
IHOYHKHW D
C
VHWp
DONDOPD]
KCB
D D
G
G
62
G
HO]K|
G
63
állapot lecsengési görbéje.
KDVRQO
Q
P
QRA C
KCB
MiU
HO
>
GH
állapot kialakítására.
Mutációk kémiai, biokémiai kezelések által az S átmenetekre gyakorolt hatások
vizsgálata. Az oszcillációs mintázat fentebb leírt analízisével fontos információkat kaphatunk a Yt]ERQW
S
T!U
V
PSOH
YY
/HJMHOHQWVH
P&N|GpVp
DONDOPD]iV
W
EHIRO\iVRO
Z\[ HUOHWH]
S
HJ\H
WpQ\H]
^
SURWHL
_
T
X
DWiVPHFKDQL]PXViUyO
]
Y
DOHJ\VpJHLQH
LRNpPLDL
kezelésekkel vagy genetikai módszerekkel való eltávolításának, a Mn komplex környezetében
található
aminósavak
PXWDJHQH]LVVH
irányított
`
[ |UWpQ
megváltoztatásának, ill. kémiai ágensek által kifejtett gátló hatások mechanizmusának vizsgálata.
További oxigén-meghatározási módszerek:
ESR oximetria
Ez a technika azon alapul, hogy a molekuláris oxigén paramágneses. Ennek következtében az O2 p ^
HJ
a
_cb
PHJIHOHOH
iODV]WR
[[ spinpróba kölcsönhatásának eredményeként megváltozik a
spinpróba vonalszélessége, és ESR jelének intenzitása. Alacsony mikrohullám intenzitások HVHWp
_
QHPWHOtWpV
Z
N|UOPpQ\HN
dfe
jel intenzitása csökken. Az ESR
ViYV]pOHVVp R[LPHWUL
e
g _
PHJQ
LJH
h
p
^
pU]pNHQ\
h
tJ
a
p
^
D
i
HOV GHULYiOWNpQ
PHJIHOHO
[
GHWHNWiOW
spinpróba esetén
alkalmas sejteken belüli oxigén koncentráció mérésére. Hátránya ugyanakkor az, hogy igen N|OWVpJH
j
(6
k
PpUP&V]HU
lnm JpQ\HO oqp
rts
OHJJ\DNUDEED
DV]Qi
uvl spinpróbák szénszármazékok
(pl. korom, speciális tustinta), illetve litiumftalocianin kristályok. Ezen szilárd részecskék az oxigén parciális nyomását mérik.
Tömegspektográfia 18
0 izotóppal jelölt víz alkalmazása esetén a fejlesztett oxigén detektálható tömegspektográfia
alkalmazásával. Ebben az esetben a fotoszintetikus YiNX
választja el a tömegspektrométer KRJ
x
DONDOPD]iViYD
R[LJp
~
HOHNWUyGRNND
Irodalmak:
HJ\pUWHOP&H
QH
y
DOD
w-w(w DUWRw-w
HONO|QtWKHW
WULYLiOLV+iWUiQ\
PLQWi
HJ
GHWHNWiO
Yt]E
LJH
w
GUiJ
p
x
z
+2
R[LJpQ UpV]pWO
O2E
NRPSOLNi
w
iWHUHV]W PHPEUiQ
{n|
PyGV]H
}
IHMOG R[LJpQ
HOQ\H
P&V]HULJpQ\
DP
D]
