A „menü”
Ovuláció diagnosztika szukában
A szuka szaporodás endokrinológiája röviden Vaginoszkópia és a hüvelycitológia diagnosztikai jelentősége Kiegészítő vizsgálatok: progeszteron quantitatív és semi-quantitatív (P4) tesztek és LH teszt Klinikai alkalmazás lehetőségei
DR. Szász Ferenc PhD. Dipl ECAR ANI-REP Állatorvosi Rendelő Budapest
[email protected] +36-20-3122-440 VET-MED-LABOR Webinar előadások 2015
Ivarérés (Pubertás)
1. A szuka szaporodás endokrinológiája
Reproduktív képesség kialakulásának folyamata Kezdete: hypothalamikus neuronok képesek elegendő GnRH-t termelni a gametogenezis beinditásához. (GnRH neuronok fejlődését meghatározza: testméret,-tömeg küszöbérték, környezeti hatás, genetikai háttér) Nőstény reprodukciós ciklikusság↔ hím folyamatos nemi aktivitás
Nő(stény) vagy Hím?„Defeminizáció” Alfa-foetoprot. GnRH surge centrum E2
Hypothalamus♀ GnRH tonic centrum
≠
GnRH surge centre
Hypothalamus ♂T→E2 GnRH tonic centrum T Testosteron (T)
Oestradiol (E2)
ovarium
Endokrin különbség
Alfa-foetoprotein
testis
Hímben nincs LH csúcs, (GnRH surge center hiány!) 2-6 órás állandó apró hullámok (GnRH tonic centrum) (GnRH→LH →T állandó pulzáló ritmus) Nőstény: GnRH → LH és oestradiol csúcsok kb. 20 naponta (fajtól függ!!)
1
Reprodukciós hormonok 1.
2.
3.
4.
5.
Hormonok funkciói -GnRH: gonadotrop hormon leadás serkentése -FSH: folliculogenezis (emelkedő frequencia -3 héttel előtte) -LH: ovuláció (indukció)
Amino-sav eredetűek; dopamine, catecholamin, thyroid hormonok Kis molekulájú neuropeptidek; GnRH, TRH, somatostatin, vasopression Nagy molekulájú fehérjék; LH, FSH, insulin, parathyroid hormon Szteroid hormonok; oestrogen, progesterone, testosterone, cortisol Vitamin derivátumok; retinoidok
-Ösztrogén: nemi szervek ivarzási tünetei, tűrési reflex (P4-együtt), LH csúcs indukció, (ellés) -Progeszteron (CL): preovulációs P4, méh előkészítése a vemhességre (proliferativ→secretios, myometrium immotilitás, leukocyta migráció gátlása), cervix zárás, vemhesség fenntartása, emlőtelep fejlődése
End♀krin szabályozás
A szuka szaporodásbiológiája
Hypothalamus GnRH
+
+ E2
Hypophysis Elülső lebeny FSH+LH P4 -
F
F
ovariumok CL CL
E2
PGf2 Méh+endometrium
Cervix
P4 Vagina
Mono-oestrusos faj, mérsékelt szezonalitás Ivarérés 7-12 hónap 4-12 (18) havonta ivari ciklusok Tüzelés 18-21 nap (9 nap prooe, 9 nap oe) Preovulációs P4 Spontán leváló petesejt(ovuláció)! Vemhes- nem vemhes szinte nincs hormonális különbség
Oestrus Anoestrus
Metoestrus
Metoestrus
Anoestrus Oestrus
Tüzelés eleje (proestrus) Folliculogenezis E2↑↑↑
Véres ivarzási nyák Tüszőérés Oestrogen hatás(péra, hüvely, méh) Vaginal cytológia (3080% cornificatio) Türési reflex indul az LH csúcs körüli időben (átlag: 1 nap post LH) (3 nap pre-LH vagy 5 nap post-LH)
FSH szint ↑ LH fokozott pulzáció
Oestrus tünetek: E2↓+ P4↑→ poz. Feedback HT+HP→FSH+LH
P. Concannon nyomán
P. Concannon nyomán
2
Proestrus
Oestrus eleje – LH csúcs a „0” nap Ösztrogén szint csúcson, majd csökken 9-11. napon „LHcsúcs” (24h át) LH-teszt P4-szint emelkedés, mérés P4~ 2ng/ml
Érett petesejtek vannak 13-16. napos tüzelés P4: 7-10ng/ml (12ng/ml) Post LH: 4.-7. nap csúcs fertilitás) (post ov. Élettart. 7-9 nap) Gyors fertilitás csökkenés (cervixzár, ova degeneráció)
Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 20 18 16 14 12 10 P4 Oestrogen LH
8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
•
• •
Zigóta barázdálódása petevezetőben 32-64 sejtes blastocysták a méhbe érkeznek (~16. nap az LH csúcs után) P4~10-25ng/ml Cervix záródik (spermium nem juthat be)
ng/ml
12 10 P4 Oestrogen LH
8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
OVULÁCIÓ
Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 20 18 16 14 12 10 P4 Oestrogen LH
8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
•
•
•
14
OVULÁCIÓ
•
Megtermékenyülésbarázdálódás
16
Fertilizációs periódus
ng/ml
11-13. napon P4~5ng/ml Ovuláció: LH csúcs után (36-48 h) Éretlen, primer petesejtek válnak le Érés 36-48 óra
18
ng/ml
Ovuláció
Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 20
Spermium élettartam 4-7 nap Uterinális mirigyekben tárolódnak (reservoar) Alomszám↔spermium szám (250-850M)
OVULÁCIÓ
Metoestrus Cytológiai oestrus vége Kevés sejt (parabasalis , basalis, nyálkáskenet, fvs) Vemhes-nem vemhes: nincs jelentős endokrin különbség Vemhesség: CL dependens P4-szint magas (15-5070ng/ml) P4 átmeneti csökken (25nap) → Prolactin emelkedik Vemhesség: Relaxin 28 naptól
3
Metoestrus Két szakasz (szövettani): progresszív (LHcsúcs-20 nap)és regresszív (P4↓.70nap) Teljes hossza:90nap!! Endometrium desquamatio kezdődik 90. napon és 21 napig tart. Teljes endometrium regeneráció 150nap!!! („rövid- interoestrus” periodus→ infertilitás)
Miért ajánlott a ciklus diagnosztika?
-
Meddőségi ok lehet a rossz időpont (75%) A fogamzó képes periódus eltérhet Egyedenként Fajtánként Egyednél is a ciklusok között Hormonális változásra (pajzsmirigy, fogamzásgátlás) AI: Hűtött-mélyhűtött spermával Vemhesség-ellés ideje kiszámítható Elektív császármetszés Ellés indukció („Hypoluteoid” vemhesség)
Kórelőzmény ? Napja tüzel (hol fedeztet?) Utolsó tüzelés ideje, hossza, fedeztetés? Korábbi diagnosztika? Fedeztetés? AI? Vemhesség? Álvemhesség? UH a vemhesség alatt? Magzatfelszívódás vetélés? Ellési problémák?
2. Ovuláció diagnosztika
Ovuláció diagnosztika Az első vizsgálat időpontját a kórelőzmény adja meg.
-kórelőzmény -viselkedés megfigyelése 3. -hüvelykenet vizsgálata (cytológia) 4. -hüvelytükrözés (vaginoszkopia) 5. -hormonszint mérés (progesteron, LH) (hüvelyellenállás mérés) 1. 2.
Sorozatvizsgálat!!! 2-3 naponta ismételni! A tünetek, adatok szintézise vezet a diagnózishoz! Első vizit a tüzelés 4-5.napján!
Viselkedési változások Gyakori, kevés vizeletürítés Kanok keresése (szökős) Farok , péra mozgatása Hüvelyvizsgálat tűrése (oestrus kezdete) Pozitív tűrés Kanok elutasítása (oestrus vége) (Ösztrogén, és P4 hatások)
4
Vaginoszkópia Hüvelytükörrel (endoszkóp) a szuka hüvelynyálkahártya jellemzőinek vizsgálata Tapadósság 2. Váladékkal fedettség(váladék minősége) 3. Redőzöttség 1.
Proestrus
Vaginoscopia: proestrus Csúszós, könnyű bevezetni a tükröt Duzzadt, csillogó, ödémás nyálkahártya Sima, (nincs ránc) véres váladékkal fedett Jelentős mennyiségű véres ivarzási váladék (Ha nem engedi: nagyon korai stádium) (VIDEO)
Vaginoscopia: oestrus Engedi a tükrözést Tapadós, száraz, fénytelen nyálkahártya Kevés vizezett véres (vagy színtelen) ivarzási váladék Haránt irányú ráncok a nyh.-án. (video)
Oestrus
Vaginoscopia: metoestrus-anoestrus Ellenkezik a tükrözésnél Csúszós hüvely Hosszanti, jellegtelen redők Nem duzzadt, fénytelen, kevés víztiszta nyák (Video)
5
Metoestrus-anoestrus KÉP
Hüvelycitológia Vizsgálni (300-400x nagyítás): Sejtek száma Sejttípusok aránya Elrendeződésük Kornifikáció foka (30-100%) Nyálkával való fedettség Natív, Harris-Shorr-, Diff-Quick-festés
Hüvelycitológia A nyálkahártya felületéről leváló sejtek összetételének vizsgálata (ösztrogén hatás→ proliferátio) Sejttípusok: Basalis,(ritka) Parabasalis sejtek (proe, metoe) Intermedialis sejtek Részlegesen elszarusodott sejtek Teljesen elszarusodott Vörösvértestek (fehérvérsejtek) (baktériumok)
Cytológiai proestrus Gyakran nyálkás-véres, vizes fényű kenet(makroszkópos) Kevés sejt, zömében parabasalis és intermediális sejtek, sok vvt, néhány részlegesen kornifikálódott sejt. Kornifikáció 30-50%
Cytológiai oestrus Tapadós, grízes felületű kenet (makroszkópos) Sok sejt, gyakran csoportokban, rögökben, 80-90%-ban teljesen kornifikált sejtek, felpöndörödve, halpikkelyszerűen Száraz, nyálka nélküli kenet, vvt. kevés v. nincs
6
Metoestrus (cytologiai oestrus vége) Sejtszegény kenet, parabasalis és intermedialis sejtek arányának újbóli növekedése Kornifikálódott sejtek eltűnnek Metoestrális nyák a sejtcsoportok között Fehérvérsejtek előfordulása
Metoestrus
Natív-kenetek KÉP
Harris-Shorr-festés menete Fixálás Fixálóspray (Merck) 70% alk. 10x be 50% alk. 10x be Desztvíz 10x be 1. Festés Harris-f hematoxilin 2min. Desztvíz 2x be Ammónia-alkohol (97 rész 70%alk+3 rész 25%ammonia oldat)1 perc Desztvíz 1x 70% alk. 1x 95% alk. 1x
2. Festés Shorr-festék oldat 2min. 95% alk. 1x be Abszolút alk (100%) 1x be Xilol néhány perc
Harris-Shorr-festés értékelése Differenciáló festés! Basofil-kék: nem kornifikálódott sejtek Acidofil-basofil (barna-kék) szegéllyel: részlegesen kornif. Acidofil (barna): teljesen kornifikálódott sejt
7
Harris-Shorr-féle festés
Diff-Quick-festés Láng alatti kenet fixálás Diff-quick fixáló oldat (5sec.) Diff.quick eosinofil componens (5sec) Diff-quick basofil componens (3-5sec) Dest víz öblítés Kenet szárítása levegőn
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Diff-quick festés
Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 20 18 16 14 ng/ml
12 10 P4 Oestrogen LH
8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
OVULÁCIÓ
Hormon vizsgálatok
Quantitatív és semi-quantitatív progeszteron (P4) tesztek és LH teszt
Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 20 18 16 14 12 ng/ml
Kiegészítő hormonvizsgálatok
Vérszérum P4szintjének vizsgálata (BVT-teszt VIRBAC, Quanticheck SZIEÁOTK) LH-szint vizsgálata szérumból (Witness LH-teszt, PFIZER)
10 P4 Oestrogen LH
8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
OVULÁCIÓ
8
Quanticheck P4 teszt (SZIE-ÁOTK) Kompetitív ELISA-teszt Mindig felrakunk standard P4-oldatot is (0, 1, 2, 5, 10, és 20 ng/ml) 20ul/ minta 2 sorban P4-antibody-val jelölt ELISA mikroplate Standard P4-ek és minta P4-ek versengése az ismert, jelölt P4vel (komplement) az inkubáció alatt (60’) szobahőn. Nem kötődött P4 lemosása Torma-peroxidáz enzim reakciója (komplement hasítása)→kék szín (10’) Fordított arányosság a minta P4-szintje és a kék szín intenzítása között (Leolvasás javasolt ha szemmel bíráljuk) Kénsavval leállítás ELISA reader-rel (fotométer) vizsgált 450nM-en. Extinkciokból (OD) PC- kalibrálja a P4-szintet ng/ml-ben.
Quanticheck értékelése (korr:0,99) 262
Proge szte ron O D kutya 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 ts rs0,50 ms 0,00 rt 0 t
Quantichek: előnyök-hátrányok Előnyök Pontos adat (0-10 ng/ml) Mindig aktuális standard sorhoz hasonlít Két párhuzamos sor átlagát számítjuk Gazdaságos (ha 2-3 minta/ teszt)2800HUF 10-20 ng/ml között is használható (kórképek, gravid) Semiquantitativ tesztnek is jó Kevés mennyiségű vér is elég (1ml→2x20ul)
Hátrányok Komolyabb beruházás (ELISA-reader, autom. Pipetta, hegy, softwear) Labortechnikai háttér és gyakorlat (pipettázás) Munka és időigényes Hőmérsékletre érzékeny Kevés mintánál nem gazdaságos
5
10
15
20
BVT- teszt (VIRBAC) Semiquantitatív teszt Vérplazmából és szérumból is lehet „Szendvics-ELISA” teszt Szobahőn, inkubációs idő kb. 15’ Kék szín intenzítás elbírálása mellékelt színskála alapján (0-1.5, 1.5-2.5, 2.5-8, 8<)
9
BVT-teszt:előnyök-hátrányok Előnyök Egyszerű és gyors teszt Kevés mintánál jól használható Nem igényel műszeres beruházást Átlagos praxis számára kielégítő LH-teszthez jól kombinálható (alacsony tartományban pontos)
Witness LH-teszt (PFIZER)
Hátrányok Az ovuláció időpontja nem prognosztizálható pontosan (2.5-8ng/ml!) Napi több minta esetén nem gazdaságos (2750/teszt/minta) Magas P4 szintnél nem pontos (AI, gravidhypoluteoid, Meddőség, abnormális ciklusoknál nem elég pontos Nagyobb mennyiségű minta kell (3-4ml vér)
WITNESS LH – Eredmény értékelése
LH szint általában alacsony (1 ng/ml alatt) LH csúcs (7-50ng/ml) csak 24h át ovuláció 2 nap múlva Fertilis periódus 4-7nap Ovuláció diagnosztikával együtt Szérumból (friss, a fagyasztott kétes) P4: 2-2.9ng/ml amikor várható Napi 1-2 minta 3 napon át Pozitiv és kétes vagy negatív
Witness LH: semi-quantitative és tesztvonal színét kell hasonlítani a kontrollhoz NEGATIV ( LH < 1 ng/ml)
POSITIV (LH ≥ 1 ng/ml)
WITNESS LH – Interpretation
LH-teszt: előnyök és hátrányok
WITNESS LH használata ovuláció diagnosztikára ( túl a 4-5 proestrus napon vagy több mint 50% cornificatio kenet)
Különösen jól használható, ha fogamzási zavar áll fenn
LH és P4 teszt az első napon Ha LH teszt pozitív (i.e. LH ≥ 1 ng/ml)
+
+
-
Alapszint feletti LH
LH szint = alapszint
LH positív =LH surge (D0) előkészíteni a fedeztetést kontroll P4 72h múlva
Folytatni az LH & P4 tesztet a positiv LH-ig
Előnyök Kulcsfontosságú info Nagyon pontos ovulációdiagnosztika Egyszerű, gyors teszt Könnyű értékelés Meddőségi, mélyhűtőtt AI-nál extra jó lehet
Hátrányok Gyakori mintavétel kell→nem gyakorlatias Ovuláció diagnosztika is kell (P4, cytológia) Sok mérés-drága „Ovuláció diagnosztika haladóknak”
10
Mintavételi hibák és rossz módszerek Kenetvétel, : tűfogó+vatta, dorsalis hüvelyfal Kenetkészítés: hengergetése a tamponnak Ugyanolyan napszakban vegyünk vért Haemolízist kerüljük Éhgyomor,ha lehet (lipaémia nem jó) Egy ciklus-Egy labor Csak vér-nem ér diagnózist Nem jó az üvegcső v. zselés alvadássegítő PP cső /fecsi, eppendorf, golyócskás alvadásserkentő cső Centrifugálj ha később vizsgálsz!! Hőhatás fontos (ELISA P4 eredmények nem korrelálnak a ciklussal!?)
Klinikai alkalmazás lehetőségei
Fedeztetés időpontjának meghatározása
Fedeztetés/AI optimális időpontja (P4-szintek)
Tüzelés 18-21 nap (9 nap pro-oe, 9 nap oe) 9-11. napon „LH-csúcs” (24h át) P4~ 2ng/ml 12-13. napon Ovuláció: LH csúcs után (36-48h) P4~5ng/ml Éretlen, primer petesejtek válnak le 14-16. naposan: érett petesejtek (post ov. Élettart. 7-9 nap) P4: 7-10ng/ml (12ng/ml) Spermium élettartam 4-7 nap
P4 érték AI időpontja (> >12 ng/ml(7. nap) azonnal (korán ovuláló) <5 ng/ml további minták 5-6 ng/ml 1.5-2.5 nap belül 6-12 ng/ml másnap >12 ng/ml azonnal
Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején
20 18
•
16 14
ng/ml
12 10 P4 Oestrogen LH
8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
Termékenyítésre optimális időszak jellemzői Tüzelés napjai
Friss/ hűtött sperma (vagin) 11-14 nap
Mélyhűtött sperma (uterinalis) 14-17 nap
Hüvelytükrözés
oestrus
Hüvelykenet vizsgálata
oestrus elejeoestrus (cornif. 75-90%) 6,5-9,0-(12)
oestrus-oestrus vége Oestrus (cornif. 95%) 12-20ng/ml
Tüszők eltűnése után 4-5 nap
Tüszők után 6-8 nap
Progeszteron-szint (ng/ml) Ultrahang vizsgálat
Fertilitás csökkenés Fogamzás csökken: Ha vaginAI/fedeztetés: Pre-LH 2-3 nap vagy Post-LH 8-9-10.nap •
• • • •
Intrauterin AI!! Spermium élettartam 4-7 nap Uterinális mirigyekben tárolódnak (reservoar) Alomszám↔spermium szám (250-850M)
11
Fertilizációs periódus határai
Diagnosztikai hibák
Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején
Csak vérvizsgálatot kérni! 9-10 nap körül az első vizsgálat Egy vizsgálat - nem vizsgálat Cikluson belül minden alkalommal más klinika/labor Mértékegység: ng/ml (nmol/ml=3.2xng/ml) Legjobb minősítés a vemhesülés!
20 18 16 14 ng/ml
12 10 P4 Oestrogen LH
8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
OVULÁCIÓ
Petesejt élettartam,cervix
Spermium élettartam
Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Pro-oestrus (BVT, LH)
Klinikai alkalmazás lehetőségei II.
1.
Infertilitás: split / elhúzódó ciklusok
1.- Genitáliák vizsg. (vaginoszkópia, citológia) - intenzív véres váladék, vvt sok, gyenge kornifikáció, nincs „ciklusdinamika”
Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok
2.- P4-szint (LH is) -ciklusbeli aszinkron (P4~kenet) - „késői ovulációs” típus , anovulációs ciklus (ovulált:P4> 6,5ng/ml)
Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok, Oestrus (BVT,LH) „Korai és késői ovulációs” típus Különböző ovulációs típusú szukák progeszteron-szintjének alakulása a tüzelés alatt 16 14
P4 (ng/ml)
12 10
P4/korai
8
P4/standard
6
P4/késői
4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok
12
Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok, Anoestrus (BVT) Hosszú interoestrus periódus vagy split tüzelések
Vizsgálatok 1.-Genitáliák vizsg. (vaginoszkópia, citológia)? 2.-P4: magas P4-szint (> 2ng/ml) ⇒ovarium (lutein) cysták, neoplasma (granulosa thecasejt)⇒ luteolizis/ sebészi, hyperthyreosis? - P4< 2ng/ml⇒ T4 vizsg. (TRH stimuláció) (+) Hypothyreoid (-) ? Ivarzás indukció
Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Metoestrus
Meddőségi vizsgálatok Metoestrus (BVT) Hypoluteoidismus Alacsony vemhességi P4 szint, (reszorpció, abortusz) Ok: primer ovarialis probléma (CL-insuff.) Német juhász , rottweiler, Újfunlandi, berni pásztor Minimum P4 nem ismert (abortusz P4<2ng/ml 48h) Progeszteron adagolás,(2mg/ttkg) ha P4<10ng/ml
Hypoluteoidismus (resorptio fetus)
1. Vemhesség 6. hetétől gyakran alacsony P4-szint ⇒véres hüvelyváladék ⇒ abortusz (Ovarid tbl) 2. Infertilis szukáknál: P4 mérés metoestrus 10. napján ( P4<10ng/ml, ⇒resorpció veszély) P4 adagolás, (Utrogestan tbl , Provera vagy Ovarid tbl.) UH vemhesség vizsgálat 21. napon 55. napig a fedeztetéstől folytatni a P4 kiegészítést
P4: 7,76ng/ml gr:25 nap
P4:8,31ng/ml gr:30 nap
Ivaros státusz vizsgálata nőstényben (LH-teszt) Hypothalamus GnRH
Klinikai alkalmazás lehetőségei III.
Hypohysis FSH & LH
Diagnosztika, indukciók Oestrogen Progesteron
Növekvő LH koncentráció a vérben Ovaries
Oestrogen Progesteron
13
Ellés indukció (BVT,LH,ALIZIN) Indikációk: Elhúzódó vemhesség (>65nap) Fájásgyengeség kockázata (4év<primipara) Óriás fajták „single puppy syndrome” Önmagában az aglepristone nem alkalmas, uterotonikum is kell! (PGF2 v. Oxytocin, 68% v. 82%)
Ellés indukció Ovuláció utáni 58-60. nap (ovuláció diagnosztika kell!) Aglepristone 15mg/ttkg (egy kezelés SC.), majd 24 óra múlva oxytocin inj. (0,15IU/ttkg kétóránként) Magzatszám ismerete (Rtg vizsgálat!) Progeszteron-szint mérés (BVT), P4≤2ng/ml nem érdemes elkezdeni (spontán ellés indul) Kórházi körülmények, az indukció előtt pár nappal hospitalizálni a beteget (no stress)
Közép és nagytestű egyedeknél ellés 24 óra múlva, kistestű fajtáknál 24órán belül
14
