A modern endokrin diagnosztika alapjai és perspektívái Kovács L. Gábor Pécsi Tudományegyetem ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézete és ETK Diagnosztikai és Menedzsment Intézete
Az elmúlt 50 év endokrin Nobel díjasai 1958: F Sanger 1966: CB Huggins 1971: EW Sutherland 1977: RS Yalow, RL Guillemin, AV Schally 1984: GJF Köhler 1992: EH Fisher, EG Krebs 1994: AG Gilman, M Rodbell 1998: RF Furchgott 2003: P Agre R MacKinnon
• • • •
Az inzulin szerkezete Prosztata rák hormonkezelése Hormonhatás mechanizmusa RIA, releasing hormonok
• • • • •
Monoclonalis antitestek Proteinkinázok G proteinek NO vízcsatornák
Hypothalamus: •GHRH, CRH, TRH, GnRH •Szomatosztatin •ADH
Hypophysis: •GH •Prolactin •ACTH, MSH •TSH •FSH & LH Oxytocin •ADH
Pancreas: •Insulin •Glucagon
Petefészek: •Ösztrogének •Progeszteron
Hormontermelés: ”klasszikus” mirigyek Tobozmirigy: •Melatonin
Pajzsmirigy: •T3, T4 •Calcitonin
Mellékpajzsmirigy •Parathyroid h.
Mellékvesekéreg: •Cortisol •Aldoszteron •Androgének
Mellékvese velı: •Catecholaminok
Kevésbé hagyományos hormonok Endothelium: •Endothelin •NO •Prosztanoidok,...
Immunrendszer:
Cardiocyta: •ANP
•Citokinek
Thrombocyta: •Növekedési faktorok
Placenta: •Mindenfajta hormon
Adipocyta: •Leptin
Vese: •Erythropoietin •RAS
GIT: •Gastrin •Cholecystokinin •Secretin,...
Gonadok: •Inhibin •Activin
AZ ELİADÁS VÁZLATA 1. HORMONRECEPTOROK 2. SZABAD HORMON KONCEPCIÓ 3. NEUROPEPTIDEK
4. POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSULÁSOK 5. FOETALIS mRNS AZ ANYAI VÉRBEN 6. A VIZSGÁLÓELJÁRÁSOK FEJLİDÉSE
1. Szemléleti áttörés: a hormon-receptorok felfedezése • Szerkezet és funkció közötti kölcsönhatás megértése. • Receptorokra ható gyógyszerek felfedezése. – Emlı cc. stratifikáció – Graves’ betegség diagnosisa – Prostata cc. – Carcinoid (somatostatin)
GENOMIKUS – NEM GENOMIKUS RECEPTOROK
Újfajta hormon-receptorok • Diabetes – incretin hormonok: a postpradialis insulinszekréció szabályozói – glucagon-like peptid (GLP1) – glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) – GLP1 és DPP-4 receptorok.
• Kamrai hypertrophia – cardiotrophin-1 (CT-1; az IL-6 család tagja) – IL-6 receptor (IL-6R)
• Kisspeptin (metastin, KISS1): melanoma metastasis suppressor gén – GPR54 receptor – neuroendokrin kontroll, pubertás
2. Szemléleti áttörés: A szabad hormon koncepció • Az intracelluláris (hatékony) hormonkoncentráció a szabad szinttel arányos, nem pedig a kötöttel. • Az albuminhoz kötött tesztoszteron fél életideje 1 mp, az SHBG-hez kötve 20 mp.
• A szöveti mikrocirkuláció képes elısegíteni a szabad hormon felszabadulást a kötésbıl („bioavailable hormone”).
Transzport proteinek Peptid hormonokat szállító fehérjék: CRH-BP, IGFBP-1-6, albumin (calcitonin, PTH, ACTH) Szteroid hormonokat szállító fehérjék: CBG, SHBG, D-vitamin-BG Pajzsmirigy hormonokat szállító fehérjék: TBG, albumin, transthyretin (prealbumin)
Rheuma faktor (Rf) Humán IgG Fc fragmense ellen képzıdnek (IgM) Elıfordulásuk: 1. normál populációban (idısebb kor): 5-10 %, 2. autoimmun betegekben gyakrabban 3. rheumatoid arthritis: elsı év: 40-60 %; késıbb: 80 % Úgy viselkednek, mint a heterophil antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötıdnek.
Állati fehérje ellenes humán antitestek (HAAAs) 1. Izotípus: IgG, IgM, IgA, IgE. 2. Állati fehérjével történı expozíció igazolható, és az állatfaj azonos a tesztben alkalmazott állati immunglobulinnal (antimouse: HAMA, anti-rat: HARA, etc..) 3. Szérumkoncentráció: g/L is lehet! 4. Évekig a keringésben maradnak. 5. Elıfordulásuk: 80 % is lehet.
Szabad hormon koncentráció: teljesen független a kötıfehérjéktıl? Bias of fT4 (MEIA)
A
80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% -10% 15 -20%
20
25
30
35
40
45
50
55
50
55
C
Bias of fT3 (MEIA)
Albumin (g/L)
175% 125% 75% 25% -25%
15
20
25
30
35
40
45
Albumin (g/L)
Toldy, Lıcsei, Szabolcs, Bezzegh, Kovács: Clinica Chimica Acta, 2005
IGF-1 és a kötıfehérjék: BP1-6 α-subunit
α-subunit
BP IGF-1 1-2
+ BP IGF-1 4-6
IGF-1 BP3
IGF-1
β-subunit
BP3
IGF-1
β-subunit
+ IGF-1
Az összes keringı IGF-1 mennyiségének: < 5% szabad - szövetspecifikus enzimek, - pH viszonyok - farmakonok
A szövetenként eltérı lehet a hatásmód és hatáserısség!
Az interakciót okozó antitestek kiszőrése Blokkoló ágens használata borjú v. murin immunglobulin, nem specifikus egér antitest (MAK33): interferencia elimináló fehérjék biotinizált egyszárú antitest használata
A minta elıkezelése: PEG, alkohol, ammónium szulfát, protein A kromatográfia, ultrafiltráció, gél diffúziós kromatográfia detergens, hıkezelése, hígítása
Visszanyerés mérése Az antitest közvetlen mérése, pl. TgAb
Analitikai probléma: a rutinban alkalmazott immunoassay módszerek jelentıs eltérése Monomer PRL szint: 270 mU/L + 93 % macroprolactin
Roche Elecsys Abbott Imx ABBOTT AxSYM J & J Amerlite Bayer Immuno-1 Wallac DELFIA DPC Immulite Roche Enzymun J & J Vitros ECI Roche Cobas Core Bayer (Chiron Centaur)
PRL mU/L
Beckman Access Fahie-Wilson, 2000.
0
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Saját tapasztalatunk 214 macroprolactinaemiás eset közül 37 beteg (~17%) fölöslegesen részesült bromocriptin terápiában
A klinikus korlátlan bizalma és a laboratórium hallatlan felelıssége Total β-HCG mérés 58 technikailag hibás fölémérés heterophil antitest jelenléte miatt, amit a referencia laboratórium utólag tisztázott (Cole, 2004): • Curettage (85 %) • Curettage + MTX kezelés (70 %) • Laparoscopia (45 %) • Hysterectomia (11 %) • Bilateralis salpingo-oophorectomia (6 %)
3. Szemléleti áttörés: A neuropeptidek felfedezése • Neurovascularis kapcsolat a hypothalamus és a hypophysis között (Harris, Szentágothai, Halász, Flerkó) • Az idegrendszer részt vesz a gonadotropin szekrécióban (Sawyer) • Releasing hormok (Guillemin és Schally) • Idegrendszerre gyakorolt neuropeptid hatások (De Wied, Lissák, Endrıczi, Telegdy)
†Lissák Kálmán
Telegdy Gyula
†Bohus Béla
AZ ENDOKRIN MUNKACSOPORT NAGY GENERÁCIÓJA
David De Wied
A NEURO-ENDOKRIN-IMMUN SZABÁLYOZÁS ZAVARAI • • • •
Biológiai ritmusok Alvás és immunrendszer Vasopressin az agyban Gyulladásos mediátorok és a hormonelválasztás • T-helper sejtek és a glucocorticoid érzékenység
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK HATÁSAI A MAGASABB IDEGTEVÉKENYSÉGRE
12
7
10
6
8
5
6
4
4
3
2
2 1
0 1
2
3 CONTROL
4 AVP
5 OXT
Schulz, Kovács és Telegdy, 1974 Kovács, Telegdy és Lissák, 1976
6
0 CONTROL
AVP
OXT
Kovács, Vécsei és Telegdy, 1978 Kovács és Telegdy, 1987
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN
A HATÁS •AGYI HELYEI •INTERAKCIÓI
Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979 Kovács és Versteeg, 1993 Kovács és De Wied, 1994
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN
A HATÁS •AGYI HELYEI •INTERAKCIÓI
Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979 Kovács és Versteeg, 1993 Kovács és De Wied, 1994
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN
A HATÁS •AGYI HELYEI •INTERAKCIÓI
Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979 Kovács és Versteeg, 1993 Kovács és De Wied, 1994
HUMAN FAMILIALIS DIABETES INSIPIDUS: MUTÁCIÓ A PROHORMON GÉNEN
•TG MUTÁCIÓ (20. KROMOSZÓMA; 2110. NUKLEOTID; 116. CODON), •CG CSERE NP85, •AUTOSOMALIS DOMINÁNS ÖRÖKLÉSMENET, •ENDOPLASMATIKUS RETICULUM, •LASSÚ, KÉSLELTETETT NEURODEGENERÁCIÓ. •(Bruins, Kovács et al. 2006)
Az agy-vér gát átjárhatóvá tehetı „KLASSZIKUS” RECEPTOROK: V1a, (V1b), OXT
(Vaccari és mtsai, 1998)
[pGlu4,Cyt6]AVP-(4-8) [pGlu4,Cyt6]AVP-(4-9) „SAJÁT” RECEPTOR KLÓNOZVA (Xiong és mtsai, 1999; Nakayama és mtsai, 2000)
abszorpció-mediált endocitosis
Arg-His-Pro-[pGlu4,Cyt6]AVP-(4-9) (Tanabe és mtsai, 1999)
A neuropeptidek felfedezésének gyakorlati jelentısége • Az endokrin integráció elveinek megismerése. • Endokrin betegségek patomechanizmusának megértése (pl. perifériás mirigyek tercier zavarai). • Új terápia, pl. LHRH analógok daganatokban. • Új funkcionális tesztek. • Az idegrendszer mőködésének módosítása.
4. SZEMLÉLETI ÁTTÖRÉS: POSZTTRANSZLÁCIÓS MODIFIKÁCIÓK
•FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK HOZZÁADÁSA •EGYÉB FEHÉRJÉK HOZZÁADÁSA •AMINÓSAVAK KÉMIAI SZERKEZTÉNEK MÓDOSÍTÁSA •SZERKEZETI VÁLTOZÁSOK
4. SZEMLÉLETI ÁTTÖRÉS POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSULÁSOK: A BIOLÓGIAI FÉL-ÉLETIDİ SZABÁLYOZÁSA
SZIALIZÁCIÓ
TERHESSÉG – FOKOZOTT SZIALIZÁCIÓ LASSABB TBG CLEARENCE – EMELKEDETT TBG
5. Szemléleti áttörés Foetalis mRNS, DNS az anyai vérben
kivon RNS, DNS
Magzati nem meghatározása Calbindin-D9k mRNA Növekedési hormon; insulin-szerő növekedési faktor-1 Veleszületett betegségek diagnosztikája
6. A VIZSGÁLÓELJÁRÁSOK FEJLİDÉSE • Specifikusabb
A cél: klinikai
• Szenzitívebb • Szélesebb méréstartomány • Rövid analízis idı • Automatizálható • Környezetkímélı
A cél: analitikai
1890
TITRIMETRIA FOTOMETRIA
1940
mmol/l
NEPHELOMETRIA KROMATOGRÁFIA
umol/l
FLUORIMETRIA ATOMABSZORBCIÓ 1960
RIA
nmol/l
EIA FIA 1980
BIOLUMINESCENCIA
pmol/l
LIA 2000
PCR
fmol/l
A modern immunoassay specificitása • Néhány ng/L mennyiségő anyagot felismer olyan környezetben, ahol az anyagkoncentráció 1011 ng/L. • Az arány pontosan olyan, mintha egyetlen embert kellene azonosítani a világ teljes népességében.
Biomarkerek… C4 komplement C8 komplement C1q komplement
Albumin
komplement faktor B
C9 komplement Cöruloplazmin Prealbumin
H-faktor
Haptoglobin
10% 10%
Lipoprotein
1%
Össz IgA
BIOMARKEREK
Össz IgM α-1-Antitripszin Össz IgG
Fibrinogén α-2-Makroglobulin
Transzferrin C3 komplement
Apolipoprotein B
Apolipoprotein A-1 α-1 savas Glycoprotein
Az analitikai forradalom: tömegspektrometria • Kis molekulák jövıbeli vizsgáló módszere. • A kereszt-reakciók kiküszöbölve. • Gyors, nem igényel minta elıkezelést, nincs reagens költség. • A berendezés drága, különleges felkészültséget igényel.
A point-of-care (POCT) és a point-of-surgery (POST) hormonmérés • Sürgıs:
• Intraoperativ:
Terhességi próba LH: ovulatio ellenırzés β-HCG Cortisol
PTH Cortisol Insulin ACTH Gastrin
Molekuláris endokrin diagnosztika • Multiple endokrin • ENDOKRIN MICROARRAY neoplasia (BIOCHIP) • Congenitalis adrenalis – Kezdetleges hyperplasia – Drága • Tg mRNA: differenciált sejtes pajzsmirigyrák • Kallikrein mRNA: számos daganat • Oestrogen receptor polimorfizmus
„Személyre szabott” és „designer” hormonkezelés egészséges emberben? • Korábban: a hormonkezelés a hormonhiány pótlására szolgált. • „Személyre szabott” (genotípus-specifikus) kezelés: – Glucagon-like peptid-1 (II. típusú diabetes) – Ghrelin (anorexia) – Szövetspecifikus hormonok • Kozmetikai endokrinológia. • Gének modifikációja?
• Öregedés: • www letöltés 2008: • 2.2 millió GH, • 1.2 millió DEA az öregedés ellen
A HORMONDIAGNOSZTIKA JÖVİJE Az endokrin kézikönyveket át kell írni: – Peptid és szteroid hormonok hatásmechanizmusa közötti különbségek eltőnıben – Kötıfehérjék új szerepben
Új endokrin szervek, hormonok: – Kisspeptin (pubertás), – Thyrostimulin (pm. aktivátor)
Egy gén – több hormon: POMC
Új molekuláris módszerek: • Szelektív knock-out egyes agyterületek peptid receptoraiban • Az adaptáció funkcionális genomikája • Transcriptomika • Proteomika • Metabolomika • Glikomika • Lipidomika • Farmakogenomika • Fiziomika
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEMI KONZORCIUM „A HUMORÁLIS ADAPTÁCIÓ ZAVARAINAK JELENTİSÉGE KLINIKAI KÓRKÉPEKBEN” • A reproduktív rendszer szabályozási zavarai. • Immuno-neuroendocrin adaptáció vizsgálata kritikus állapotban lévı betegekben. • Összefüggés vizsgálata a metabolikus szindróma biokémiai és a viscerális zsírsejtek élettani jellemzıi között. • A könny összetételének változása endokrin ophthalmopathiában.
• PTE ÁOK Anatómiai Intézet • PTE ÁOK Gyermekgyógyászati Klinika • PTE ÁOK I.sz. Belgyógyászati Klinika • PTE ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet • PTE ÁOK Szemészeti Klinika • PTE ÁOK Szülészeti és Nıgyógyászati Klinika • PTE ETK Ápolás és Betegellátás Intézete • PTE ETK Diagnosztikai és Menedzsment Intézet
