OPTIMASI PRODUKSI DAN KARAKTERISTIK BIOKIMIA POLIFENOL OKSIDASE DARI ISOLAT TERPILIH FUNGI ENDOFIT KULIT BUAH KAKAO (Theobroma cacao L.) OPTIMIZATION OF PRODUCTION AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTIC OF POLYPHENOL OXIDASE FROM SELECTED ENDOPHYTIC FUNGI IN POD HUSK OF CACAO (Theobroma cacao L.)
SARTINI P0700306002
PROGRAM PASCASARJANA FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2011
OPTIMASI PRODUKSI DAN KARAKTERISTIK BIOKIMIA POLIFENOL OKSIDASE DARI ISOLAT TERPILIH FUNGI ENDOFIT KULIT BUAH KAKAO (Theobroma cacao L.)
Disertasi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Doktor
Program Studi
Ilmu Kimia
Disusun dan Diajukan oleh
SARTINI
Kepada
PROGRAM PASCASARJANA FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2011
PERNYATAAN KEASLIAN DISERTASI
Yang bertanda tangan di bawah ini : Nama
: Sartini
No.Pokok
: P0700306002
Program Studi
: Ilmu Kimia
Menyatakan bahwa disertasi yang saya tulis ini benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambilalihan tulisan atau pemikiran orang lain. Apabila di kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa sebagian atau keseluruhan disertasi ini hasil karya orang lain, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.
Makassar, Oktober 2011
Yang menyatakan,
Sartini
PRAKATA Bismillahi rahmanirrahim Puji syukur ke hadirat
Allah Subhana Wataala dipanjatkan atas
segala rakhmat dan hidayah Nya sehingga disertasi ini dapat diselesaikan. Banyak kendala yang dihadapi
oleh penulis, baik dalam pelaksanaan
penelitian maupun dalam penyusunan disertasi ini, namun berkat bantuan berbagai pihak, maka kendala-kendala tersebut dapat diatasi. Pertama-tama penulis khaturkan terima kasih dan penghargaan kepada bapak Prof.Dr. H. Abd.Rauf Patong sebagai promotor, bapak Prof.Dr.Ir.Tjodi Harlim dan bapak Dr.Pirman, MS sebagai ko promotor yang dengan ikhlas telah meluangkan waktunya untuk membimbing penulis dari awal penelitian hingga penyusunan disertasi ini, melalui beliau-beliau penulis banyak belajar mengenai teknologi dan biokimia enzim. Penulis juga tak lupa mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada : 1. Rektor dan Wakil Rektor bidang akademik Universitas Hasanuddin yang telah memberikan kesempatan untuk mengikuti pendidikan S3 di Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin. 2. Ditjen Dikti Kementerian Pendidikan Nasional atas bantuan beasiswa BPPS untuk pendidikan dan dana penelitian dari program riset untuk mahasiswa S3.
3. Direktur dan Wakil Direktur Pascasarjana, Dekan FMIPA, Ketua dan Sekrertaris Program S3 Ilmu Kimia FMIPA UNHAS, beserta seluruh staf yang telah memberikan fasilitas studi dan berbagai kemudahan dalam pelayanan administrasi selama penulis mengikuti pendidikan 4. Dekan Fakultas Farmasi UNHAS, Prof.Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. yang telah memberikan izin kepada penulis untuk mengikuti pendidikan S3. 5. Bapak Prof.Dr. H. M. Noor Jalaluddin, Prof.Dr. H. Syahrul, M.Agr. dan ibu Prof.Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. selaku penilai internal, serta Dr.rer.nat. Muharram, MSc selaku penilai eksternal, terima kasih atas segala saran perbaikan sejak seminar proposal hingga selesainya disertasi ini. 6. Teman-teman sejawat di Fakultas Farmasi UNHAS dan teman-teman S3 Kimia UNHAS angkatan 2006 yang telah memberikan dorongan moril, sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan S3 ini 7. Kamaluddin Djafar, SSi., Apt., Ika Malikha, SPt., Hasliah, SSi., Dewi, Mahdalia,SSi., Bety,
dan Lukman, SSi., terima kasih atas bantuannya
dalam pelaksanaan penelitian penulis. Kepada suami dan anak-anak tercinta: Prof.Dr.H.M.Natsir Djide, MS, Apt., Nina Pratiwi,SKM., Nana Juniarti, Nani Apriani, dan Nano Gustavo terima kasih yang tak terhingga atas pengertian, dukungan dan doanya sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan S3 ini. Demikian pula buat Ibunda tercinta, Hj. St. Aisjah Djohansjah atas segala kasih sayang dan doanya dan
untuk ayahanda Djohansjah (almarhum) terkirim doa semoga segala curahan kasih sayang dan nasehatnya semasa hidup mendapat balasan pahala dari Allah SWT. Akhirnya, penulis menyadari bahwa disertasi ini jauh dari sempurna, tetapi semoga dapat memberikan manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan. Amin
Makassar, Oktober 2011 Sartini
ABSTRAK SARTINI. Optimasi Produksi dan Karakteristik Biokimia Polifenol Oksidase dari Isolat Terpilih Fungi Endofit Kulit Buah Kakao (Theobroma cacao L.) (dibimbing oleh Abd. Rauf Patong, Tjodi Harlim, dan Pirman) Penelitian ini bertujuan untuk: (1) mengetahui bahwa di antara fungi endofit dari kulit buah kakao yang diisolasi ada yang mampu menghasilkan polifenol oksidase, (2) menentukan komposisi media fermentasi yang optimum memproduksi polifenol oksidase dari fungi endofit terpilih, (3) menentukan karakteristik biokimia dari polifenol oksidase yang dihasilkan dari fungi endofit terpilih Tahap-tahap penelitian meliputi: (1) isolasi fungi endofit dari kulit buah kakao, (2) seleksi fungi endofit penghasil polifenol oksidase, (3) optimasi produksi polifenol oksidase melalui variasi konsentrasi ekstrak khamir, dekstrosa, asam gallat, dan tembaga sulfat dalam media fermentasi, (4) pemurnian enzim melalui fraksinasi dengan amonium sulfat, dialisis, kromatografi filtrasi gel, analisis elektroforesis SDS-PAGE, dan (5) uji karakeristik biokimia polifenol oksidase yang dihasilkan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa: (1) fungi endofit dari kulit buah kakao yang mampu menghasilkan polifenol oksidase adalah Tricothecium sp., (2) Optimasi produksi polifenol oksidase diperoleh pada komposisi media fermentasi: ekstrak khamir 1 %, KH2PO4 0,1 %, MgSO4.7H2O 0,05 %, CuSO4.5H20 0,1 mM, asam gallat 2 mM dengan aktivitas spesifik 3725,1 U/mg, (3) karakteristik biokimia polifenol oksidase yang diperoleh termasuk kategori tirosinase dan lakkase. Aktivitas enzim dihambat oleh asam askorbat, natrium metabisulfit, dan dinatrium EDTA . Suhu optimum 30 oC dan pH optimum 7. Nilai Km dan Vmax terhadap substrat katekol 0,625 mM dan Vmax 2083 U/mL.
ABSTRACT
SARTINI. Optimization of Production and Biochemical Characteristic of Polyphenol Oxidase from Selected Endophytic fungi in Pod Husk of Cacao (Theobroma cacao L.) (supervised by Abd. Rauf Patong, Tjodi Harlim, and Pirman) The research aimed to: (1) know that among the endophytic fungi of cacao pod husk isolated, some were able to produce polyphenol oxidase, (2) determine the optimum fermentation medium composition to produce polyphenol oxidase from selected endophytic fungus, (3) to determine biochemical characteristic of the polyphenol oxidase. The research stages include.: (1) isolation and identification of endophytic fungi from cacao pod husk, (2) selection of polyphenol oxidase producing endophytic fungi, (3) production optimization of polyphenol oxidase through concentration variation of yeast extract, dextrose, cupri sulphate, and gallic acid in the fermentation medium, (4) enzyme purification through fractionation with ammonium sulphate, dialysis, gel filtration chromatography, SDS-PAGE electrophoresis analysis, and (5) biochemical characteristic test The result of the research reveals that: (1) Endophytic fungi of the cacao pod husk can produce the polyphenol oxidase is Trichothecium sp. (2) Fermentation medium compositions which optimally produce polyphenol oxidase are: 1 % yeast extract, 0.1 % KH2PO4, 0.05 % MgSO4.7H2O, 0.1 mM CuSO4.5H2O, 2 mM gallic acid with specific activity 3725.1 U/mg. (3) Biochemical characteristics of the polyphenol oxidase are laccase and tyrosinase category. Optimum temperature and pH are 30 oC and 7.0. The enzymes was inhibited by ascorbic acid, sodium metabisulphite, and disodium EDTA. Value of Km and Vmax against catechol as substrate are 0.625 mM and 2083 U/mL.
DAFTAR ISI
Halaman PRAKATA
iv
ABSTRAK
vii
ABSTRACT
viii
DAFTAR ISI
ix
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
xv
I.
PENDAHULUAN A. Latar Belakang
1
B. Rumusan Masalah
4
C. Tujuan Penelitian
4
D. Manfaat Penelitian
5
II. TINJAUAN PUSTAKA A. Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.)
6
1. Uraian umum
6
2. Buah kakao
7
3. Kandungan bioaktif tanaman kakao
8
B. Fungi Endoft 1. Uraian umum
11
2. Metabolit yang dihasilkan oleh fungi endofit
13
3. Teknik isolasi fungi endofit
16
C. Polifenol Oksidase 1. Uraian umum
17
2. Sumber-sumber polifenol oksidase
21
3. Aplikasi polifenol oksidase
25
4. Mekanisme katalitik polifenol oksidase
26
5. Metode pengujian aktivitas polifenol oksidase
28
6. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas polifenol oksidase
30
7. Metode skrining polifenol oksidase dari mikroba
31
8. Metode produksi polifenol oksidase dari mikroba
33
9. Metode purifikasi polifenol oksidase
35
10. Karakteristik biokimia polifenol oksidase dari mikroba
38
D. Kerangka Pikir
40
E. Hipotesis
44
F. Definisi Operasional
44
III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Lokasi Penelitian
45
B. Bahan dan Alat .
45
C. Prosedur Kerja
46
1. Isolasi fungi endofit dari buah kakao
46
2. Identifikasi fungi endofit kulit buah kakao
47
3. Seleksi fungi endofit penghasil enzim polifenol oksidase
47
4. Optimasi produksi polifenol oksidase melalui variasi
47
konsentrasi ekstrak khamir, Dekstrosa, CuSO4.5H2O, Asam gallat 5. Ekstraksi enzim kasar
49
6. Uji Aktivitas Polifenol Oksidase
50
7. Pemurnian polifenol oksidase
51
8. Karakteristik Biokimia dari Polifenol oksidase
53
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Isolasi Fungi Endofit dari Kulit Buah Kakao
56
B. Identifikasi Fungi Endofit Kulit Buah Kakao
57
C. Seleksi Fungi Endofit Penghasil Polifenol Oksidase
59
D. Produksi Polifenol Oksidase dari Isolat Fungi Endofit Terpilih 1. Penentuan waktu fermentasi produksi polifenol oksidase
61
2. Efek ekstrak khamir terhadap produksi polifenol oksidase
62
3. Efek asam gallat terhadap produksi polifenol oksidase
64
4. Efek dekstrosa terhadap produksi polifenol oksidase.. 5. Efek CuSO4 terhadap produksi polifenol oksidase
.
65 67
E. Pemurnian Polifenol Oksidase 1. Fraksinasi dengan amonium sulfat
70
2. Dialisis
72
3. Fraksinasi dengan kromatografi filtrasi gel
73
4. Analisis elektroforesis
75
F. Karakteristik Biokimia Polifenol Oksidase dari Isolat Fungi endofit Kakao Terpilih 1. Kespesifikan substrat
77
2. Analisis kinetika polifenol oksidase
78
3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas polifenol oksidase
80
4. Pengaruh pH terhadap aktivitas polifenol oksidase
81
5. Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas polifenol oksidase
82
V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan
85
B. Saran-saran
86
DAFTAR PUSTAKA
87
LAMPIRAN
94
DAFTAR TABEL Nomor
halaman
1. Beberapa karakteristik biokimia enzim polifenol oksidase dari
Beberapa tanaman. ……………………………………..
24
2. Karakteristik polifenol oksidase dari beberapa fungi ………..
39
3.
Pengaruh waktu fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase
62
4.
Pengaruh ekstrak khamir dalam media fermentasi terhadap Aktivitas polifenol oksidase ……………………………………
63
5. Pengaruh konsentrasi asam gallat dalam media fermentasi Terhadap aktivitas polifenol oksidase ……………………….
65
6. Pengaruh konsentrasi dekstrosa dalam media fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase …………………………
67
7. Pengaruh konsentrasi CuSO4 dalam media fermentasi Terhadap aktivitas polifenol oksidase ………………………..
68
8. Aktivitas enzim dan kadar protein dari hasil pemekatan enzim polifenol oksidase dengan berbagai tingkat kejenuhan amonium sulfat ……………………………….
70
9. Hasil fraksinasi dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan
Matriks sephadex G-100, eluen dapar fosfat 50 mM pH 6,5 , kecepatan elusi 2,5 mL/30 menit ………………...
73
10. Pola tingkat kemurnian polifenol oksidase dari isolat fungi endofit Trichothecium sp ………………………… …… .
75
11. Kespesifikan substrat dari polifenol oksidase fungi endofit Tricothecium sp ………………………………………….
77
12. Data hasil perhitungan aktivitas polifenol oksidase pada Konsentrasi substrat katekol yang berbeda ………………….
79
13. Aktivitas polifenol oksidase pada berbagai suhu …………
80
14. . Aktivitas polifenol oksidase pada berbagai pH ……………..
82
15. Pengaruh penambahan inhibitor terhadap aktivitas polifenol oksidase …………………………………………………….
83
DAFTAR GAMBAR
Nomor
Halaman
1. Penampang membujur buah kakao …………………………..
8
2. Beberapa senyawa polifenol dari Theobroma cacao L. ……..
9
3. Beberapa struktur metabolit sekunder yang dihasilkan dari fungi endofit ………………………………………………………
15
4. Skema kedudukan Cu pada laccase dari fungi ………………….
17
5. Sruktur x-ray bentuk teroksidasi kateol oksidase dari Ipomea batatas ....................................................................
18
6. Beberapa substrat untuk tirosinase ……………………………
19
7. Beberapa substrat untuk Lakkase ……………………………..
20
8. Perbedaan reaksi yang dikatalisis katekolase dan Lakkase…
21
9. Mekanisme katekol oksidase dari Ipomea batatas yang diusulkan berdasarkan data spektroskopik dan data biokimia …………
27
10. Diagram alir kerangka pikir …………………………………………
43
11. Fungi endofit yang tumbuh di sekitar potongan kulit buah kakao setelah masa Inkubasi 5 hari pada media PDA...................
56
12. Bentuk makroskopik dan mikroskopik isolat fungi endofit dari kulit buah kakao ..........................................................
58
13. Hasil uji kualitatif adanya polifenol oksidase yang diproduksi Oleh isolat fungi endofit kulit buah kakao ................................
60
14. Pengaruh waktu fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase ................................................................
61
15. Pengaruh konsentrasi ekstrak khamir dalam media fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase .................................
63
16. Pengaruh konsentrasi asam gallat terhadap produksi polifenol oksidase .......................................................................
65
17. Pengaruh konsentrasi dekstrosa terhadap aktivitas polifenol oksidase ........................................................................
66
18.
19.
20.
21.
Pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap aktivitas polifenol Oksidase ....................................................................
68
Pengaruh tingkat kejenuhan amonium sulfat (0 s/d 80 %) terhadap aktivitas polifenol oksidase dan kadar protein
71
Pengaruh tingkat kejenuhan amonium sulfat (0 s/d 90 %) terhadap aktivitas polifenol oksidase dan kadar protein
71
Profil elusi polifenol oksidase dari isolat fungi endofit Trichothecium sp) kulit buah kakao pada sephadex G-100 eluen dapar fosfat 50 mM pH 6,5, kecepatan elusi 2,5 mL/30 menit
74
22. Profil hasil elektroforesis SDS-PAGE polifenol oksidase dari isolat fungi endofit Trichothecium sp………………
76
23. Aktivitas polifenol oksidase dari isolat fungi endofit Trichothecium sp dengan berbagai substrat fenolik…..
78
24. Aktivitas polifenol oksidase dari fungi endofit pada berbagai suhu ………………………………………………………..
80
26. Aktivitas polifenol oksidase dari fungi endofit pada berbagai pH
81
27. Efek inhibitor terhadap aktivitas polifenol oksidase yang diperoleh dari fungi endofit kulit buah kakao ………
83
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor
halaman
1. Skema isolasi fungi endofit dari kulit buah kakao
94
2. Skema seleksi fungi endofit penghasil polifenol oksidase
95
3. Skema Penentuan waktu fermentasi untuk produksi polifenol oksidase
96
4. Skema optimalisasi produksi enzim melalui variasi konsentrasi ekstrak khamir, asam gallat, dekstrosa, CuSO4
97
5. Skema purifikasi dan karakteristik biokimia polifenol oksidase
98
6. Hasil Identifikasi dari Isolat fungi endofit dari kulit buah kakao
99
7. Contoh perhitungan aktivitas polifenol oksidase dengan metode kronometri (spekrofotometri tidak langsung)
100
8. Perhitungan kadar protein dari polifenol oksidase menggunakan metode Lowry dengan standar Bovine Serum Albumin (BSA)
102
9. Tabel kejenuhan amonium sulfat pada suhu 4 OC (Bollag and Edelstein, 1991)
104
10. Komposisi gel pemisah dan gel penahan dengan SDS-PAGE yang digunakan
105
11. Komposisi pengecatan perak (silver staining)
106
12. Perhitungan bobot molekul polifenol oksidase dari fungi endofit kulit buah kakao.
107
