AKTIVITAS POLIFENOL OKSIDASE SELAMA FERMENTASI HUBUNGANNYA DENGAN KOMPONEN BIJI KAKAO (Theobroma cacao, L.) Polyphenol Oxidase Activity During Fermentation In Relation To Cocoa Bean Component (Theobroma Cacao, L.) Wiwit Widiarti Staf Pengajar Fakultas Pertanian Universitas Muhammadiyah Jember
ABSTRACT The objective of this experiment was to obtain the polyphenol oxidase activity during fermentation in relation to cocoa bean component. The quality of cocoa bean depenon bitter taste, astringent, sour ratio as proportionally. The cause bitter taste is polyphenol, astringent taste is tannin and sour taste is organic acid and colour changes of cocoa bean from white to light brown. The experiment used Edel cocoa from Kedaton plantation, PTPN XII Kebun Renteng Jember and it carried out descriptively. The experiment has done on October 2001 to July 2002. The result of the experiment showed that during fermentation polyphenol oxidase activity, polyphenol, tannin and non tannin component were decreased, but color of cocoa bean was increased. All of component were decreased after 12 hours fermentation. There were significant correlation between polyphenol oxidase activity with all component during fermentation . Correlation between polyphenol oxidase activity with polyphenol component (R2=0.96), R2 =0.95 to tannin component and with non tannin component (R2=0.97) during fermentation. Correlation between polyphenol oxidase activity with colored changes of cocoa bean (R2=0.90). Key Words : Polyphenol oxidase activity, Cocoa bean component, fermentation.
I. PENDAHULUAN Produksi kakao di Indonesia dari tahun 1982-1986 mengalami peningkatan (22,05% per tahun). Jika dibandingkan dengan Malaysia, Indonesia masih kalah jauh khususnya dalam hal kualitas. Kakao merupakan salah satu tanaman perkebunan yang produknya disukai masyarakat karena mempunyai flavour yang khas dan banyak digunakan sebagai zat pewarna, pemberi aroma dan flavour dalam industri makanan. Aroma dan citarasa kakao akan terbentuk dengan baik apabila dilakukan fermentasi dengan benar.
1
Biji kakao terdiri dari pulp, testa dan kotiledon. Belitz dan Grosch (1999) mengemukakan bahwa kotiledon kakao mengandung 1,2% theobromin dan 0,2% kafein. Polifenol yang disimpan di dalam pigmen sel mencapai 13% pada jaringan. Terdapat tiga kelompok fenol yaitu leukoantosianin (58%), katekin (37%) dan antosianin (4%). Selanjutnya dikemukakan pula bahwa polifenol merupakan senyawa yang sangat pahit dan akan teroksidasi oleh polifenol oksidase membentuk quinon. Polifenol dan flavonoid menyusun 12-18% dari berat kering biji merupakan penentu flavour, khususnya rasa pahit dan sepat serta warna dari produk kakao . Rasa sepat dan rasa pahit sangat dipengaruhi oleh beberapa kandungan di dalam biji kakao, diantaranya rasa sepat oleh kandungan tannin terutama antosianin sedangkan rasa pahit oleh kandungan polifenol. Tingginya kedua kandungan tersebut mengakibatkan meningkatnya rasa sepat dan pahit. Proses fermentasi diharapkan dapat menurunkan kandungan tannin dan polifenol, sehingga diharapkan dapat menurunkan rasa sepat dan pahit. Selama fermentasi juga terjadi perkembangan precursor flavor dan aroma oleh aktivitas mikroorganisma. Menurut Hansen et al (1998), beberapa enzim yang merupakan kunci penting di dalam pembentukan flavor dan menurunkan pigmen selama fermentasi kakao adalah endoprotease, amino peptidase, karboksi peptidase dan polifenol oksidase. Semua aktivitas enzim selama fermentasi meningkat, kecuali polifenol oksidase. Polifenol oksidase terdapat di dalam embrio biji terutama di plasenta (Vaughn et al. 1988) dan substrat fenol terdapat pada vakuola, sehingga pencoklatan enzimatis hanya terjadi jika jaringan pembatasnya rusak (Chevalier, 1999). Polifenol oksidase adalah enzim yang berperanan untuk pertumbuhan precursor flavour mulai pada fase fermentasi sampai fase pengeringan (Wong et al, 1990). Aerasi yang tinggi meningkatkan penyusutan jaringan biji pada kotiledon yang terbuka. Oksidasi enzimatis dihambat oleh berkurangnya kadar air. Menurut Alamsyah (1991), selama fermentasi terjadi penurunan total polifenol yang akan berpengaruh terhadap penurunan rasa pahit dan rasa sepat, karena terjadinya difusi senyawa polifenol keluar dari keping biji. Bonvehi dan Coll (1997) menyatakan bahwa kandungan polifenol menurun selama fermentasi dan
2
stabil setelah 5-6 hari. Degradasi polifenol lebih cepat berlangsung jika sering dilakukan pengadukan (Alamsyah, 1991). Aktivitas polifenol oksidase yang rendah menyebabkan warna kakao yang dihasilkan menjadi pucat serta rasa pahit dan rasa sepat yang khas dari kakao kurang menonjol, demikian pula sebaliknya . Fermentasi merupakan suatu proses penguraian gula menjadi alcohol dan CO2 yang disebabkan oleh sel-sel khamir pada kondisi anaerob (Said, 1987). Selanjutnya Nasution (1976) mengemukakan bahwa tujuan utama dari fermentasi kakao adalah untuk mematikan biji sehingga perubahan-perubahan penting di dalam biji mudah terjadi. Perubahan tersebut antara lain perubahan warna keping biji, meningkatnya aroma, cita rasa dan memperbaiki konsistensi keping biji. Warna dan rasa kakao tersebut selain dipengaruhi oleh aktivitas polifenol oksidase juga dipengaruhi oleh waktu fermentasi. Waktu fermentasi yang kurang dapat menghasilkan biji yang bermutu rendah. Hal ini dapat ditunjukkan oleh biji slaty (gepeng) dengan rasa sangat pahit (bitternes) dan sangat sepat (astringency). Rendahnya mutu tersebut mengakibatkan kakao Indonesia hanya dipakai sebagai campuran bahan makanan coklat maksimal 10% (Duncan dan Veldman, 1993). Selain itu juga fermentasi yang kurang sempurna menyebabkan rasa asam, pahit dan sepat yang tertinggal di dalam biji dan rasa ini tidak akan hilang walau biji kakao difermentasi selama 7 hari (Yusianto, 1998). Aktivitas polifenol oksidase pada biji kakao akan menurun selama proses fermentasi. Hansen et al. (1998) menyatakan bahwa aktivitas polifenol oksidase sekitar 4,51 x 10 3 unit dan bertambahnya waktu fermentasi sampai hari keempat akan menurunkan aktivitas sampai 0,24 x 10 3 unit dan diduga akan berpengaruh terhadap penurunan kandungan polifenol dan tannin dari biji kakao. Keseimbangan antara kandungan polifenol, tannin dan asam organik sangat mempengaruhi kualitas kakao. Selain itu juga warna coklat dari kakao sangat mempengaruhi kualitas. Salah satu penyebab warna coklat yaitu adanya tannin di dalam cairan sel yang bereaksi dengan O2. Sempurnanya oksidasi tannin dari biji kakao ditandai dengan meratanya warna coklat dari biji yang diolah dan sara sepat yang berkurang. Bonvehi dan Coll (1997) menyatakan bahwa citarasa sepat dan pahit juga disebabkan oleh jenis kakao pada waktu fermentasi.
3
Fermentasi yang kurang sempurna akan meningkatkan rasa pahit dan sepat, sehingga sangat mempengaruhi kualitas kakao. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk : (1) Mengetahui aktivitas polifenol oksidase pada biji kakao selama fermentasi, (2) Mengetahui perubahan kandungan polifenol, tannin dan warna (komponen) di dalam biji kakao selama fermentasi dan (3) Mengetahui hubungan antara aktivitas polifenol oksidase dengan komponen biji kakao selama fermentasi.
II METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian. Penelitian dilaksanakan selama 10 bulan, yaitu dari awal Oktober 2001 sampai akhir Juli 2002, yang terdiri dari dua tahap yaitu tahap pencarian aktivitas polifenol oksidase dan tahap analisis kandungan polifenol, tannin, dan warna biji kakao. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Pusat Penelitian Biologi Molekul Universitas Jember.
Bahan dan Alat Penelitian. Bahan dasar yang digunakan adalah biji kakao (Theobroma cacao, L.) jenis Edel yang berasal dari Kebun Kedaton bagian dari PTP Nusantara XII Kebun Renteng Jember. Bahan kimia yang dipergunakan antara lain EDTA, PVP, Tris HCl, β-ME, DIECA, pirokatekol, PMSF, KH2PO4, CuSO4 yang diperoleh dari perusahaan bahan kimia Sigma St.Louis; Mo (USA) dan E-Merck (Germany), (NH4)2SO4, BSA, Bradford, methanol 70%, RFC, Na2CO3 5%, katekol gelatin dan 12 N HCl/L methanol. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer dengan perekam merk Hitachi, sentrifugal merk Surval Rc 5B plus, kolom spadek, oven, stumper dan mortar, timbangan dan elektrik motor grinding.
Pelaksanaan Penelitian. Penelitian dilakukan secara deskriptif dan pengamatan selama fermentasi dilakukan setiap 12 jam. Fermentasi dilakukan setelah biji kakao basah terkumpul menggunakan kotak fermentasi besar berkapasitas satu ton dengan ukuran 2x1 meter dan tinggi 0,8 meter selama 60 jam. Ekstraksi enzim dilakukan dengan cara : Buah kakao jenis Edel dibuka dan secepatnya dipisahkan antara pulp dan kotiledon. Kotiledon kakao ditimbang
4
sebanyak 5 gram, dibungkus aluminium foil dan dimasukkan ke dalam N2 cair sekitar 10 menit. Perlakuan ekstraksi berlangsung di bawah suhu 4o C. Ekstraksi dilakukan sesuai dengan metode Fritz et al. (1996) dalam Wong et al. (1990) dengan modifikasi. Kotiledon kakao diambil dari N2 cair dan dihaluskan dengan penambahan N2 cair. Setelah halus selanjutnya suhu perlahan-lahan dinaikkan dan ditambah 2% PVP dan buffer ekstraksi sebanyak 35 mL yang mengandung campuran 40 mM Tris HCl pH 7,3, 5 mM EDTA, 15 mM β-ME, 100 mM DIECA dan 1.74 mg PMSF/g biji. Sampel disentrifugse selama 20 menit dengan kecepatan 12 000 rpm dan diuji supernatannya. Selanjutnya dilakukan presipitasi enzim sebagai berikut: Supernatan dipresipitasi menggunakan (NH4)2SO4 30-80% dan selanjutnya dilakukan filtrasi (desalting) dengan menggunakan gel sephadek G-25 (Volume 5 ml) yang sebelumnya diequilibrasi dengan buffer Tris HCl 20 mM pH 7,3 sebanyak 25 mL. Aktivitas
polifenol
oksidase
diuji
dengan
menggunakan
metode
spektrofotometri berdasarkan Kims (1987) yang dimodifikasi dari Mc. Cord dan Kilara (1983) dalam Wong et al. (1990). Campuran uji mengandung 2 ml 0.5 M KH2PO4 pH 5.6 ditambah 0.5 mL 10 mM pirokatekol dan 50 μL 5 mM CuSO4. Supernatan diambil sebanyak 20 μL dan dilakukan uji enzim dengan menambahkan larutan uji di atas. Aktivitas polifenol oksidase diuji dengan spektrofotometer pada absorbansi 400 nm dan dihitung dari kurva linier yang terbentuk. 1 Unit aktivitas enzim = Δ Absorbansi x 0.02 menit x 0.001 Total protein terlarut ditentukan dengan menggunakan metode Bradford dengan BSA sebagai standar. Prosedur analisis : (1) Pembuatan reagen Bradford CBB G-250 sebanyak 100 mg dilarutkan dalam etanol 95% dan ditambah asam phosfat 85%. Setelah larutditambahkan akuades sampai volume satu liter. (2) lima belas mikro liter sample protein ditambah 1 mL reagent Bradford dan divortek, kemudian dibiarkan selama 5 menit dan diamati pada absorbansi 595 nm. Kandungan total polifenol, tanin dan non tanin didapat dengan membuat kurva standar terlebih dahulu. Untuk membuat kurva standart polifenol menggunakan metoda Mariago (1973) dalam Bonvehi dan Coll (1997) yang telah
5
dimodifikasi. Prosedur analisis : Larutan standart mengandung katekol dengan konsentrasi 5, 25, 50, 100 dan 150 mg/L. Masing-masing tabung ditambah 1 mL 70% methanol 0.5 mL 1N RFC dan 6.5 mL akuades. Larutan didiamkan selama 5 menit, ditambah satu mililiter 5% Na2CO3, didiamkan kembali selama satu jam sebelum diukur pada absorbansi 760 nm.
Penentuan Kandungan Polifenol. Kandungan total polifenol ditentukan dengan menggunakan metode sebagaimana halnya penentuan kurva standar. Prosedur analisis sebagai berikut : Satu gram sample diekstrak dengan 10 mL 70% methanol dan disentrifuse dengan kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Filtrat yang didapat ditera dengan akuades sampai 100 mL untuk selanjutnya diambil 1 mL dan ditambah 1 mL 70 % methanol, 0,5 mL 1N RFC dan 6,5 mL akuades. Larutan didiamkan selama 5 menit sebelum ditambah 1 mL 5% Na2CO3 dan divortek. Filtrat diukur pada absorbansi 760 nm yang sebelumnya didiamkan terlebih dahulu selama satu jam.
Penentuan Kandungan Non Tanin. Penentuan non tannin dengan menggunakan metode yang sama dengan total polifenol. Prosedur analisis sebagai berikut : Satu gram sample diekstrak dengan 10 mL 70% methanol dan disentrifuse dengan kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Filtrat yang didapat ditera dengan akuades sampai 100 mL dan diambil 2 mL serta ditambahkan 1 mL 1% NaCl dalam gelatin 1%. Larutan selanjutnya divortek dan disentrifuse dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya diambil 1 mL dan ditambah 1 mL 70 % methanol, 1 mL 1N RFC dan 6,5 mL akuades. Larutan didiamkan selama 5 menit sebelum ditambah 1 mL 5% Na2CO3 dan divortek. Filtrat diukur pada absorbansi 760 nm yang sebelumnya didiamkan terlebih dahulu selama satu jam. Sedangkan kandungan tannin ditentukan dari selisih absorbansi antara total polifenol dengan non tannin yang diukur pada absorbansi 760 nm. Warna ditentukan dengan cara : Nol koma dua gram kotiledon biji kakao dihaluskan. Ekstraktan diagitasi dengan 5 mL 12 N HCl/CH3OH selama 45 menit dan disaring dengan kertas Whatman. Sebanyak 0,4 mL filtrate ditera dengan 2,5 mL 12 N HCl/CH3COOH. Larutan diukur pada absorbansi 460 dan 525 nm.
6
III. HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas Polifenol Oksidase Kotiledon Kakao Selama Fermentasi. Aktivitas Polifenol Oksidase kotiledon kakao selama fermentasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer setelah mengalami ekstraksi dan presipitasi, sehingga diperoleh data seperti terlihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Aktivitas Polifenol Oksidase pada Biji Kakao Selama Fermentasi Aktivitas (Unit / mg protein) Fermentasi Rerata 1 2 3 (jam) 0 314.59 316.78 314.40 316.59 ± 4.77 12 156.58 154.58 152.58 154.58 ± 4.99 24 74.27 72.67 71.06 72.67 ± 4.00 36 72.45 70.95 73.95 72.45 ± 3.74 48 36.50 34.48 32.46 34.48 ± 5.03 60 26.19 28.73 31.27 28.73 ± 6.32 Pengamatan terhadap rerata aktivitas polifenol oksidase kotiledon kakao menunjukkan bahwa dengan bertambahnya waktu fermentasi mengalami penurunan, demikian juga halnya dengan total protein yang dikandung di dalam kotiledon kakao. Aktivitas polifenol oksidase pada jam 0 (sebelum fermentasi) mempunyai aktivitas tertinggi yaitu sebesar 316.59 ± 4.77 unit/mg protein dan setelah fermentasi selama 12 jam menurun aktivitasnya menjadi 154.58 ± 4.99 unit/mg protein. Pada fermentasi 24 dan 36 jam perubahan yang terjadi hampir konstan. Penurunan terus menerus dari aktivitas polifenol oksidase dan total protein selama fermentasi menunjukkan terjadi degradasi dan denaturasi protein. Aktivitas polifenol oksidase yang terjadi di luar biji terus menerus mengalami penurunan karena terjadi difusi dari polifenol dan dengan meningkatnya suhu selama fermentasi akan memudahkan enzim dan substrat bercampur membentuk quinon. Selanjutnya quinon berpolimerisasi membentuk warna coklat, sehingga aktivitas polifenol oksidase menurun dan reaksi akan berjalan cepat bila ada udara (Lee et al. 1991 dan Villenueve et al. 1985).
Hubungan Aktivitas Polifenol Oksidase dengan Komponen Biji Kakao
7
Hubungan antara aktivitas polifenol oksidase dengan kandungan polifenol, non tannin dan tannin kotiledon kakao (komponen biji) selama fermentasi dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Hubungan Aktifitas Polifenol Oksidase dengan Kandungan Polifenol, Tanin dan Non Tanin Kotiledon Kakao Selama Fermentasi Rerata Aktivitas Rerata Kandungan (mg / g biji) (unit/mg protein)
Polifenol
Tanin
Non Tanin
316.59
33.29
14.11
19.17
154.58
25.23
10.23
15.00
72.67
18.68
6.63
12.05
72.45
15.26
5.79
9.47
34.48
10.62
4.10
6.52
28.73
5.56
1.50
4.06
Tabel 2 menunjukkan bahwa dengan menurunnya aktivitas polifenol oksidase selama fermentasi baik kandungan polifenol, non tannin maupun tannin mengalami penurunan. Pada awal fermentasi dimana aktivitas polifenol oksidase masih tinggi ternyata kandungan polifenol, non tannin, dan tannin tinggi pula masing-masing sebesar 33.29 mg/g biji, 19.17 mg/g biji dan 14.11 mg/g biji. Setelah fermentasi selama 12 jam, baik kandungan polifenol, tannin maupun non tannin mulai mengalami penurunan yaitu untuk kandungan polifenol menjadi 25.23 mg/g biji, tannin 10.23 mg/g biji, dan kandungan non tannin sebesar 15 mg/g biji. Kandungan polifenol kakao sebelum fermentasi masih tinggi karena biji belum mengalami perombakan atau difusi dan tingginya kandungan total fenol menunjukkan rasa sepat dan pahit yang tinggi. Penurunan masing-masing kandungan polifenol tersebut disebabkan oleh terjadinya diffuse polifenol yang keluar melalui kulit biji. Bonvehi dan Coll (1997) menyatakan bahwa baik kandungan polifenol, tannin maupun non tannin selama fermentasi mengalami penurunan dan stabil pada fermentasi 5-6 hari. Diantara komponen polifenol dan flavonoid dari kakao, tannin merupakan kelompok flavan-3 ol dan antosianin memegang peranan penting terhadap rasa sepat dan mempengaruhi daya cerna dan daya larut kakao. Selama proses fermentasi kakao, flavan-3 ol dan tannin
8
merupakan kunci pokok untuk oksidasi biokikiawi yaitu meningkatkan polimerisasi dan berikatan dengan protein, sehingga menurunkan daya larut dan rasa sepat serta mempengaruhi flavor kakao. Secara kuadratik (R2) aktivitas polifenol oksidase berhubungan dengan kandungan polifenol, tannin maupun non tannin masing-masing sebesar 0.96, 0.97 dan 0.95.
Hubungan Aktivitas Polifenol Oksidase dengan Warna Kotiledon Kakao Penurunan aktivitas polifenol oksidase selama fermentasi meningkatkan warna dari kotiledon kakao dengan R2 secara kuadratik sebesar 0.91. Hubungan antara Aktivitas Polifenol Oksidase dengan perubahan warna biji kakao dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Hubungan Aktivitas Polifenol Oksidase dengan Warna Biji Kakao Aktivitas Polifenol Oksidase Perubahan Warna Biji Kakao (Unit / mg protein) 316.59 1.05 154.58 1.27 72.67 1.17 72.45 1.48 34.48 1.81 28.73 2.00 Penurunan aktivitas polifenol oksidase meningkatkan warna dari kakao. Hal ini disebabkan oleh terjadinya difusi dari polifenol yang keluar melalui testa dan berakibat selain menurunkan rasa sepat juga menimbulkan warna yang khas dari kakao. Proses difusi polifenol menyebabkan masuknya oksigen sehingga mengaktifkan polifenol oksidase yang akan mengubah substrat epikatekin menjadi quinon sehingga terjadi polimerisasi (Wong et al. 1990).
IV KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan a. Aktivitas polifenol oksidase mulai menurun setelah fermentasi 12 jam. b. Kandungan polifenol, tannin, dan non tannin selama fermentasi menurun, tetapi warna biji kakao meningkat.
9
c. Terdapat hubungan kuadratik (R2) yang erat antara aktivitas polifenol oksidase dengan kandungan polifenol, tannin dan non tannin masingmasing sebesar 0.96, 0.97 dan 0.95, sedangkan warna kakao sebesar 0.91.
Saran Perlu dilakukan penelitian terhadap kandungan theobromin dan kafein yang sangat berpengaruh terhadap kualitas kakao terutama rasa pahit dari kakao Edel.
DAFTAR PUSTAKA Alamsyah T.S., 1991. Peranan Fermentasi dalam Pengolahan Biji Kakao Kering. Warta Balai Penelitian Perkebunan. Jember : 1 (2). Belitz and Grosch, 1999. Food Chemistry. New York. Bonvehi J.S and F.V. Coll, 1997. Evaluation of Bitternes and Astringency of Polyphenolic Compounds in Cocoa Powder. Food Chemistry 60. Chevalier T., David de Rigal, Didier Mbeguie-Mbeguie, Frederic Gauillard, Florence Richard-Forget and Bernard R.Fils-Lycaon, 1999. Molecular Cloning and Characterization of Apricot Fruit Polyphenol Oxidase. Plant Physiologi 119. Duncan dan Veldsman, 1993. A European Chocolate Manufacturers Experience of Fermented Sulawesi Cocoa. Paper Presented at International Conference on Cocoa Economy. Bali. Indonesia. Hansen C.E., Olmo M, dan Burri, 1998. Enzyme Activity in Cocoa Bean During Fermentation. J. Sci Food Agric. 77 : 273-281. Lee P.P, Lee, and Karim, 1991. Biochemical Studies of Cocoa Beans Polyphenol Oxidase. J. Sci. Food Agric. 55. Mayer, A..M. dan Harel, 1978. Polyphenol Oxidase in Plant. Phytochem 18. Nasution, Z., W. Ciptadi, dan B.S. Laksmi, 1976. Pengolahan Coklat. Departemen Teknologi Fateta IPB. Bogor. Sa’id, E.G., 1987. Penerapan Teknologi Fermentasi. Mediyatama Sarana Perkasa. Jakarta. Siregar, T.H.S., Slamet, dan Laeli, 1992. Cokelat. Pembudidayaan, Pengolahan dan Pemasaran. Penebar Swadaya. Jakarta.
10
Villeneuve, F., Cros, dan Macheic, 1985. Effect of Fermentation on The Activity of Peroxidases and Polyphenol Oxidases from Cocoa Seeds. Coffee Cacao 29 : 113. Vaughn, K.C., 1988. Polyphenol Oxidase: The Cloroplast Oxidase with no Establised Function. Physiol Plant 72 : 659-665. Wong, M.K., Dimick, and Hammerstedt, 1990. Extration and High Performance Liquid Chromatographic Enrichment of Polyphenol Oxidase from Theobroma cacao Seeds. J. Of Food Science 55 : 1108-1111. Yusianto, 1998. Analisis Hubungan Antara Komponen Cita Rasa Biji Kakao. Pelita Perkebunan 14 (2).
11
