OPTIMASI KONSTRUKSI ANTIGEN MTB72F UNTUK MENGHASILKAN KANDIDAT VAKSIN TUBERCULOSIS

1409: Yunita Sabrina dkk.

KO-116

OPTIMASI KONSTRUKSI ANTIGEN MTB72F UNTUK MENGHASILKAN KANDIDAT VAKSIN TUBERCULOSIS Yunita Sabrina1,∗ , Dewi Suryani1 , Sulaiman N. Depamede2 , dan Muhamad Ali2 2

1 Fakultas Kedokteran, Fakultas Peternakan Universitas Mataram Jl. Majapahit no. 62 Mataram Tel. (0370) 640874 ∗

e-Mail: [email protected]

Disajikan 29-30 Nop 2012

ABSTRAK Di Indonesia, 70% tuberkulosis (TB) terjadi pada usia produktif yang menyebabkan beban sosial dan ekonomi yang sangat besar. Penanganan TB semakin dipersulit dengan munculnya strain M. tuberculosis yang resisten terhadap obat-obat TB. Dengan adanya kondisi ini, maka diperlukan upaya pengembangan vaksin yang efektif dan memberikan proteksi terhadap TB aktif pada usia produktif. Antigen Mtb72f merupakan antigen permukaan dari M. tuberculosis yang mampu menginduksi CD4 limfosit T untuk memproduksi Interleukin-2 yang memiliki peran sentral dalam memicu kekebalan terhadap TB. Mtb72f merupakan kandidat vaksin TB yang dapat digunakan sebagai booster untuk meningkatkan kekebalan yang telah diberikan oleh vaksin BCG sebelumnya. Mtb72f terdiri dari 3 fragment yaitu Mtb32c, Mtb39, dan Mtb32N, sehingga mempersulit pembentukan konstruksi DNA karena diperlukannya beberapa kali proses sub cloning dengan menggunakan enzim retriksi yang sangat menyita waktu. Konstruksi pETMtb72f dengan metode sub kloning sudah berhasil dilakukan, tetapi karena dengan metode tersebut terdapat penambahan basa karena adanya enzim retriksi sehingga konstruksi dan ekspresi dari Mtb72f tersebut dirasa perlu untuk dioptimalisasi. Pada penelitian ini dilakukan optimalisasi konstruksi Mtb72f yang akan digunakan sebagai bahan pembut vaksin TB.Konstruksi Mtb72f dilakukan dengan metode overlapping PCR dengan ketiga fragment sebagai templat, produk overlapping PCR tersebut kemudian diligasi dan ditransformasi ke E. coli. Dari hasil sekuen menunjukkan bahwa pada konstruksi Mtb72f tersebut tidak terdapat mutasi dan tanpa adanya penambahan basa. Kata Kunci: Tuberkulosis, vaksin, sub-cloning, overlapping PCR

I.

PENDAHULUAN

Tuberkulosis (TB) yang disebabkan oleh bakteri M. tuberculosis merupakan salah satu penyakit infeksi yang menjadi masalah kesehatan utama di seluruh dunia khususnya di negara berkembang. TB menduduki peringkat kedua, setelah HIV, sebagai penyebab morbiditas dan mortalitas akibat penyakit infeksi. Secara global, pada tahun 2011 terdapat 8.7 juta kasus baru serta 1.4 juta kematian akibat TB.[1] Di Indonesia, angka kematian akibat TB adalah 27 per 100.000 penduduk dan terdapat 450.000 kasus TB baru setiap tahunnya. Hal ini menjadikan Indonesia sebagai negara ke-4 dengan jumlah penderita TB terbanyak di dunia.[2] Lebih lanjut lagi, TB menjadi salah satu penyebab terhambatnyapertumbuhan ekonomi di negara yang tergolong high burden country, termasuk Indonesia. Hal ini disebabkan karena 75% pasien TB adalah kelompok usia yang paling produktif secara ekonomis (15-50 tahun). Di samping itu, sekitar US$ 104 juta dikucurkan

setiap tahunnya untuk penanggulangan masalah TB di Indonesia.[3] Dengan meningkatnya resistensi terhadap obat TB, pengembangan vaksin yang lebih efektif diyakini dapat menghentikan atau mengurangi epidemi TB.[4] Beberapa kriteria vaksin yang dibutuhkan untuk TB adalah dapat memberikan kekebalan yang lebih baik dari BCG, cepat memberikan respon perlindungan terhadap TB, dapat mengurangi kesakitan pada penderita TB dan dapat mencegah terjadinya reaktivasi TB.[5] Saat ini Bacillus Calmette-Guerin (BCG) merupakan satu-satunya vaksin yang tersedia untuk profilaksis TB. Kelebihan vaksin ini adalah relatif aman dan memiliki efikasi untuk mencegah TB berat pada anak.[6] Di beberapa uji klinis, efikasi BCG untuk mencegah TB aktif pada usia dewasa ternyata sangat rendah dan proteksi terendah justru terjadi pada negara dengan insiden TB yang tinggi. Lebih jauh kekurangan BCG adalah dapat menyebabkan terjadinya infeksi bila diberikan pada inProsiding InSINas 2012

1409: Yunita Sabrina dkk.

KO-117

dividu yang memiliki kelainan sistem immunologis.[7] Beberapa antigen dari M. tuberculosis diteliti sebagai kandidat vaksin TB. Mtb72f merupakan salah satu kandidat vaksin TB sebagai booster untuk meningkatkan kekebalan yang telah diberikan oleh vaksin BCG sebelumnya.[8] Mtb72f terdiri dari 3 fragment yaitu Mtb32c, Mtb39, dan Mtb32N, sehingga mempersulit pembentukan konstruksi DNA karena diperlukannya beberapa kali proses sub cloning dengan menggunakan enzim retriksi yang sangat menyita waktu. Konstruksi Mtb72f dengan metode sub kloning juga memiliki kelemahan yaitu terdapat penambahan basa karena adanya sekuen enzim retriksi.

G AMBAR 1: Konstruksi MTB72f yang sudah dihasilkan dengan metode subkloning

@@@ Saat ini terdapat beberapa metode untuk mengkloning konstruksi dari beberapa fragmen DNA seperti overlap extention PCR,[9] Ligation Independent cloning,[10] recombinase dependent cloning (LIC).[11] Dengan metode di atas konstruksi DNA dari beberapa fragmen dapat dilakukan tanpa perlu sub cloning menggunakan retriksi enzim yang sangat menyita waktu. Overlapping PCR yang dilakukan pada penelitian ini juga dapat digunakan untuk membentuk konstruksi DNA dari beberapa fragmen walaupun setelah itu fragmen tersebut masih harus diligasi ke vektor untuk kemudian ditransformasi. Metode ini sederhana, efisien dan juga dapat diaplikasikan untuk sampel yang sulit seperti Mtb yang kaya akan G-C sekuen.

II.

METODOLOGI

A. Amplifikasi Gen Penyandi Antigen Mtb72f Ketiga fragmen Mtb (Mtb32C, Mtb39, Mtb32N) diamplifikasi menggunakan template pETMtb72f yang sudah berhasil dibuat sebelumnya. Amplifikasi tersebut dilakukan dengan menggunakan primer yang sudah didesain mengandung 15 basa yang komplementer dengan fragmen berikutnya dan plasmid.Primer yang digunakan pada penelitian ini ditampilkan pada TABEL 1. Fragmen Mtb32C diamplifikasi menggunakan primer InMtb32cF dan InMtb32cR, fragmen Mtb32N diamplifikasi menggunakan primer InMtb32nF dan InMtb32nR.Sedangkan untuk fragmen Mtb39 diamplifikasi menggunakan primer primer InMtb39F dan InMtb39R.

TABEL 1: Primer yang digunakan pada penelitian ini

Primers Mtb32cF InMtb32cR InMtb39F InMtb39R InMtb32nF Mtb32nR

Sequence (5’ → 3’) caattacatatgcatcaccatcaccatcacacggccgcgtccggataacttc acgccccgaaatccacggccgggggtccctcggc gagggacccccggccgtggatttcggggcgttaccac acaaggccggcggggcgccggccgccggagaatg tctccggcggccggcgccccgccggccttgtcgca ctaatcgatatcctaggacgcggccgtgttcatac

Reaksi amplifikasi dilakukan dengan menggunakan enzim Pfu Turbo polymerase dengan program PCR: 3 menit pada suhu 94 ◦ C; 25 siklus pada suhu 94 ◦ C selama 30 detik, 65 ◦ C selama 30 detik, 72 ◦ C selama 60 detik; 72 ◦ C selama 7 menit yang diakhiri dengan 4 ◦ C sampai sampel diangkat untuk elektrophoresis. Ketiga fragmen Mtb tersebut kemudian diisolasi dari gel agarose menggunakan Qiaquick isolation kit. Isolasi dari gel agarose ini dimaksudkan untuk memperoleh gen target murni tanpa tercampur dengan sisa-sisa reaksi (dNTPs mix, primer maupun bahan-bahan lainnya). B.

Konstruksi Mtb72f menggunakan metode overlapping PCR Ketiga fragmen Mtb yang sudah dipurifikasi kemudian dijadikan templat untuk overlapping PCR. PCR Overlapping yang dilakukan terdiri dari dua step PCR. Reaksi overlapping dilakukan dengan menggunakan enzim taq DNA polymerase dengan kondisi PCR dapat dilihat pada G AMBAR 2. C.

Ligasi dan transformasi Produk overlapping PCR yang dihasilkan kemudian diligasi dengan plasmid pGEMT. Hasil ligasi tersebut ditransformasikan ke E. coli DH5 dan dikultur pada media LB selama 60 menit pada suhu 37 ◦ C dengan goyangan. Setelah itu, biakan tersebut disentrifuse dengan kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 ◦ C untuk mendapatkan pelet. Pelet tersebut selanjutnya dikultur pada media LB padat yang mengandung 25 mg/ml antibiotik ampisilin pada suhu 37 ◦ C selama 12 jam. D.

Skrining dan uji plasmid rekombinan pGEMtMtb72f White blue skrining terhadap koloni E. coli DH5α yang mengandung plasmid rekombinan (pGEMtMtb72f) kemudian dilanjutkan dengan PCR koloni. Koloni yang diambil adalah koloni yang berwarna putih. Campuran reaksi pada PCR koloni adalah sebagai berikut: 0,2 mM dNTP; 0,5 U Ex Taq dan bufernya; 0,5 mM primer dan 1 µl sampel (koloni yang telah diencerkan dalam air). Program PCR yang digunakan Prosiding InSINas 2012

1409: Yunita Sabrina dkk.

KO-118

nasi premature dari extensi polymerase.[14] Dibutuhkan tambahan buffer khusus untuk membantu mempermudah proses amplifikasi dengan penambahan DMSO hingga 10% untuk menstabilkan reaksi. Dengan menggunakan kondisi yang sudah dioptimalisasi ini ketiga fragmen berhasil diamplifikasi dengan baik (G AM BAR 3 .). Ukuran dari Mtb32C, Mtb39, and Mtb32N adalah 396, 1173, 585 bp.

G AMBAR 3: Gambaran agarose gel hasil purifikasi produk amplifikasi fragment (A) Mtb39, (B) Mtb32C dan (C) Mtb32N G AMBAR 2: Kondisi Overlapping PCR yang terdiri dari dua step. A: PCR pertama, B: PCR kedua

adalah 3 menit pada 94 ◦ C, 25 siklus untuk suhu 94 ◦ C selama 30 detik, 65 ◦ C selama 30 detik dan 2 menit pada suhu 72 ◦ C, diakhiri dengan 72 ◦ C selama 7 menit dan 4 ◦ C sampai sampel diangkat. Adanya pita DNA dari gambar hasil elektroforesis dengan ukuran ban yang sesuai merupakan indikasi bahwa klon yang diamplifikasi mengandung plasmid rekombinan. Koloni yang mengandung plasmid rekombinan dengan gen target akan dikultur pada media LB pada suhu 37 ◦ C selama 12 jam dengan goyangan untuk isolasi plasmid rekombinan. Isolasi plasmid akan dilakukan dengan teknik standar.[12]

B.

Overlapping PCR ketiga fragmen Overlapping PCR dilakukan dengan menggunakan ketiga fragmen Mtb sebagai template dengan konsentrasi yang sama. Kondisi optimal dari overlapping PCR diperoleh dengan meningkatkan suhu annealing hingga 69 ◦ C pada PCR pertama dan diturunkan menjadi 67 ◦ C pada PCR kedua. Hal ini dilakukan untuk mencegah annealing primer yang tidak spesifik dikarenakan banyaknya kemiripan sekuen pada ketiga fragmen. Campuran reaksi juga ditambahkan DMSO% untuk menstabilkan reaksi PCR. Hasil overlapping ketiga fragmen ditunjukkan pada G AMBAR 4.

E.

Sequencing Untuk memastikan bahwa pada gen target tidak terdapat mutasi gen, akan dilakukan sequencing setelah dilakukan amplifikasi dengan Kit Bigdye.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.

Amplifikasi fragmen Mtb32C, Mtb39 dan Mtb32N Pada awalnya terdapat kesulitan untuk mengamplifikasi ketiga fragmen Mtb tersebut yang disebabkan karena gen Mycobacterium tuberculosis kaya akan G dan C sekuen.[13] Banyaknya sekuen G dan C akan mempersulit amplifikasi karena terbentuknya struktur sekunder yang disebabkan karena adanya termi-

G AMBAR 4: Gambaran agarose gel produk overlapping PCR dengan template ketiga fragmen Mtb

Prosiding InSINas 2012

1409: Yunita Sabrina dkk. Skrining dan uji plasmid rekombinan pGEMtMtb72f Hasil overlapping tersebut kemudian dipurifikasi dan dilanjutkan dengan subkloning ke pGEMt-Easy (Promega, US). Setelah dilakukan penghitungan konsentrasi akhir terhadap produk PCR setelah purifikasiproses reaksi ligasi dilakukan dengan enzim T4 DNA Ligase (Fermentas). Hasil ligase kemudian ditransformasi ke E. coli DH5alpha competent cell.Gambaran blue-white koloni ditampilkan pada G AMBAR 5.

KO-119

C.

G AMBAR 7: Gambaran agarose gel produk konfirmasi PCR untuk melihat ketiga fragmen yang ada pada konstruksi MTB72f. (A) Mtb32C, (B) Mtb32N, (C) Mtb 39, (D) 3 fragment

dan konstruksi yang terbentuk in frame sehingga dapat diekspresikan.

IV.

G AMBAR 5: Koloni hasil transformasi ke DH5alpha

KESIMPULAN

Dengan menggunakan metode overlapping PCR makaoptimalisasi konstruksi Mtb72f yang akan digunakan sebagai bahan baku vaksin TB dapat dilakukan dengan cepat dan efisien. Dari hasil sekuen menunjukkan bahwa pada konstruksi Mtb72f tersebut tidak terdapat mutasi dan tanpa adanya penambahan basa.

DAFTAR PUSTAKA Koloni-koloni bakteri berwarna putih yang diduga membawa plasmid rekombinan pGEMt-Mtb72f selanjutnya dijadikan sebagai template untuk PCR. Hasil PCR tersebut ditampilkan pada G AMBAR 6.

G AMBAR 6: Gambaran agarose gel produk koloni PCR dengan menggunakan primer Mtb32CF dan Mtb32NR

Untuk mengkonfirmasi apakah didalam klon yang positif mengadung insert tersebut benar-benar memiliki ketiga fragmen Mtb maka dilakukan PCR konfirmasi. Dari hasil PCR tersebut dikonfirmasi adanya ketiga fragmen Mtb pada klon yang positif mengandung insert (G AMBAR 7). Koloni yang positif kemudian dikultur untuk selanjutnya dilakukan purifikasi plasmid dengan nucleospin plasmid kit. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni pembawa plasmid rekombinan tersebut memiliki gen target tanpa mutasi, maka dilakukan sekuensing. Dari hasil sekuensing dipastikan tidak terdapat point mutasi

[1] World Health Oorganization, (2012), Global Tuberculosis Report 2012. Geneva: WHO Press. [2] World Health Organization,(2012), Tuberculosis Control In South-East Asia Region 2012. Geneva: WHO Press. [3] World Health Organization,(2011), Tuberculosis Profile: Indonesia. Geneva: WHO Press. [4] Delogu G, Fadda G.,(2009),The quest for a new vaccine against tuberculosis. J. Infect. Developing Countries. 3;5-15. [5] Parida S, and Kaufmann S.,(2010), Novel tuberculosis vaccines on the horizon. Curr.Opin.In Immunol. 22;1-11. [6] Rodrigues LC, Diwan VK, Wheeler JG, (1993), Protective effect of BCG against tuberculous meningitis and miliary tuberculosis: a meta-analysis. Int J Epidemiol.22(6):1154-8. [7] Jouanguy, EF., Altare, S., Lamhamedi, P.,(1996), Interferon gamma receptor deficiency in an infant with fatal bacilli Calmette-Guerin infection. N. Engl. J. Med 335;1956 [8] Skeiky Y, Alderson M, Ovendale P, Guderian J, Brandt L, Dillon D, Campos-Neto A, Lobet Y, Dalemans W, Orne I, Reed S.,(2004), Differential Immun Responses and Protective Efficacy Induced by Components of a Tuberculosis Polyprotein Vaccine, Mtb72F, Delivered as Naked DNA or Recombinant Protein. J. Immunol. 172;7618-7628. Prosiding InSINas 2012

KO-120

1409: Yunita Sabrina dkk.

[9] Zuo, P., and B.M. Rabie, (2009), One-step DNA fragment assembly and circularization for gene cloning. Curr.Issues Mol. Biol. 12:11-16. [10] Cheo, D.L., S.A. Titus, D.R. Byrd, J.L. Hartley, G.F. Temple, and M.A. Brasch, (2004), Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14:2111-2120 [11] Weeks, S.D., M. Drinker, and P.J. Loll., (2007), Ligation independent cloning vectors for expression of SUMO fusions. Protein Expr. Purif. 53:40-50. [12] Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T.,(2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. [13] Dale JW, and Patki. (1990), Mycobacterial gene expression and regulation. In: McFadden J (Ed) Molecular Biology of the Mycobacteria. Surrey University Press, London, United Kingdom. [14] Sahdev S, Saini S, Tiwari P, Saxena S, Singh Saini K., (2007), Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21(4):303-7.

Prosiding InSINas 2012