i'enel,llan don Pengembangan Aphkas; 'SalOp don Radiasi. '999
OPTIMALISASI PENYEDIAAN REAGEN RIA UNTUK DETEKSI IN VITRO HORMON PROGESTERON H.M. Socwarsono*. Adria P,M. Hasibuan*. dan Y. Saepudin** .Pusat Aplikasi Isotop clanRadiasi. Batan ..Balai Pellelitian Temak -Ciawi. Bogor
ABSTRAK OPTIMALISASI PENYEDIAAN REAGEN RIA UNTUK DETEKSI IN VITRO HORMON PROGESTERON. Optimalisasi kualitas penyediaall antisera progesteron yang telah dibuat oleh PAIR-BAT AN (Lab.Biologi) daD reagen petlUlljatlg laiIUlya (tracer, sistem separasi dextran-charcoal, bufer), dan honnon standar progesterotl telah ditetapkan dengan basil yang optimal dan telah memetluhi persyaratan reagen RIA. Hasil titer aIltisera terbaik 30-40 % Bo ditetapkaIl pada petlgenceranantisera progesteron 1/1000, total radioaktivitas 3H-prog. 15000 -20000 Cpm/1OOui masih sensitif, standar referensi hormon progesteron terbaik berasaJ dari serumprogesteron yang disuplai oleh IAEA, dan sistem separasi dextran-charcoal yang menghasilkan NSB relatif kecil (25%) yaitu stok larutan CD yang dietlcerkan PBSG 1:5 atau 1:10, dan perlakuan RIA mengikuti prosedur yang telah
baku.
ABSTRACT OPTIMALIZA nON OF RIA REAGENTS PREPARED FOR IN VITRO DETEcnON OF PROGESfERON HORMONR Optimalizationof the quality ofprogesteronaJltiseraproducedby P~!R.,BATAN (Biology lab.) and the suporting reagents(e.g. tracer, separationsystem dextran-coatedcharcoal: buffer), and progesteronstaIldard referellCeS have beetl performedand resulting the optimal working r~ the reagentsof radioinununoassay (RIA). The best of ~~ra ti~~ wereshowedin 30-40%tracerbinding (0/9Bo) with the dilution of 10-3,the total mdioactivity of 3H-prog.used15000-20000Cpm/IOOulto be still sensitive,the dosesresponsed curve of serum-progesteron staJldardsupplied by the lAEA was the best,and the optimum absorbedof dextrancoatedcharcoalin the dilutin of 1:5or 1:10to give 2-50/9 NSB.
PENDAHULUAN MetQde imunologik atau immunoas.\'ay merupakan metode terpilih untuk deteksi dan penetapan zat bioaktif klmsusnya honnon yang konsentrasinya sangat kecil (nukro-pikogram) dalaln cairan tubulI (plasma daral.. serum, urin). Metode ini memiliki sensitivitas, spesifisitas, dan ketelitian yang tinggi selain perlakuamlya relatif mudall dan cepat (1). Ketepatall hasil immunoassay ditentukan selain oleh kualitas reagen unUllologik. ditentukan pula oleh pelaksanayang terlalill dan peralatall yang terkalibrnsi (nukro pipet dan alat pencacah). Reagen imunologik yang perIn dialtalisis ialall alltibodi d.:1Jl senyawa bertallda rndioisotop. Antibodi progesteron dibuat dengall pen}1JJltikkan berulang antigen progesteron yang diemulsikall d.:1lamadjuvan pada hewan percobaandomba. Perlakuan ununisasi tersebut mengltasilkan antibodi datal" serum (antisennn) yang bersifat poliklonal (2,3). Spesifisitas aluisennn (kemampuan untuk bcrikatan dengan antigen spesifik) tidak selalu mutJak tetapi kemungkin.1ndapal berikatan pula dengan molekul antigen yang stmktur kimianya hampir s.'Una.Sensitivilas antibodi berkaitan dengan kekekalan ikatannya dengan alltigen spesifik disebul avidit.1S.Antisera yang memiliki aviditas tulggi akan menjadikall immunoasso:y d.:1lam ltal ini radioimmunoassay (RIA) sallgat sensitif. Produksi antisern sangat ditentukaJl oleh im\ffiogenitas alltigen dan sensitivitas hewan percobaan (respon unun). Produksi antisera dengan tiler tinggi sangat
diharapkall karel1a dengan pengenceran antiserum yang tinggi dapat mengurangi reaksi non spesifik (NSB) dan pemakaiannya dalam RIA sangatefisien. Senyawa berlanda radioisotop (3H- atau 1251-) llarus memiliki aktivitas spesifik linggi (SA=jumlah atom persatuan massa) selungga dalam penggunaannya sangat efisien dan memberikan basil RIA yang baik. Reagen RlA-progesteron (3H-Prog.) selain anlibodi daD antigen berlanda sebagai reagen Ulama, diperlukan pula standar progesteron (non radioaktif) daD emulsi clwcoal-dextran untuk separasi ikatan anligenanubodi dari antigen bebas(4). Dengan tersedianya reagen imunologik untuk deteksi dan penetapan progesteron yang dibuat sendiri di laboratoriwn sangat menunjang program produksi dan reproduksi ten1ak (sapi) di Indonesia dan dapat menghematbiaya pembelian kit RIA dari luar negeri.
BAHAN DAN METODE Antibodi. Antibodi progesteron dibuat dengan teknik imunisasi berulang pada he\van percobaan~mba jantan dan betina, umur 3-5 bulan, bobot tubuh sekitar 25 kg. Oua ekor domba jant
CarboxyMethyl)Oxime -BSA (P-CMO-BSA)dan 0,5 mg II a.-Hydroxy Progcsteron Hcmisuccinate -BSA (11a.HPHs-BSA) yang diemulsikan daIam adjuvan (v/v = I : I). Suntikan uIang (booster) secar:.;subkutan (sc) dosis 359
Peneli/ian don Pengembangan Aplikasi Is%p
don Radia..7, 1999
sarna seperti imunisasi diberikaIl dengan interval 21 lwi setelah serum dipallen, sebanyak 5 kali ulangan. Anaiisis serum dilakukan terlIadap peningkatan respon imun dan titer antisera setelah booster IV menggunakan metode RIA (reaksi *Ag<-->Ab). Titer antisera tertinggi (Bo = 50 % ikatml) digunakatl wltuk pembuatan kwva standar. Untuk menilai sensitivitas, dibuat perbandingan berbagai sumber antigen progesteron stand.1ryaitu progesteron kristal (Sigma) p<1d.1 konsentrasi 0, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0 ngiml ; progesteron susu (IAEA) : 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 nmol/L dan progesteron serum (IAEA) : 0, 0,3, 1,6,6,4, 15,9,30,8, 63,6 nmol/L.
Senyawa bertanda 3H-prog. (tracer). Senyawa progesteron bertanda radioisotop digunakan (1,2,6,73H)Progesteron(AInersham),kemasan250 ~Ci, dengan aktivitas spesifIk (SA) 96,0 Ci/nmol. Untuk keperluan RIA, tracer diencerkan sehingga aktivitasnya menjadi 10.000-20.000 cpm per 100~l. Smnpeldilarutkan dalam sintilator (PPO + POPO+ TOLUEN) dan dicacalldengan Liquid SqintilationCounter(LSC). Sistem separasi. Sistem separnsi dalmn penelitianini digUIlakmIClwcoal-Dextratl (12.5 g Norit A + 1.25 g Dextran T-70 + 500 tnI PHS). pemakaian diencerkandenganPBSG. Optimalisasipetnisa11al1 ikatan kompleks Ag.Ab datI Ag bebas dilakukan percobaan berbagaipengenceran C/D.
BASIL DAN PEMBAHASAN Respon imun. Pengamak1ll respon imW1 dilakukan dengan analisis serum domba yang dipanen setiap bulan &'lmpai bulan kelinla setelall sW1tikanprimer dan sW1tikan booster. Respon imW1 ditW1jllkkan dengaIl peningkatan persentase ikatan komplek progesteron bertanda tritiwn (3H-Progesteron) + antiserum (domba), reaksi tersebut merupak.'ln prinsip metode Radioimmwloassay (RIA). Peningkatan ikatan komplek * Ag.Ab setelall suntikall booster sangat laIubat. seharusnya respon imwl sekunder tersebut lebih cepat karella Ig.G (ganunaglobulin) dalaIu serum melungkat daD Ig.M menunm (4). Oasis penyuntikan imW1isasi yang paling baik berki&'lf antara 1-2 mg (5) titer antisera akan tinggi daD peningkatanI1ya cepat. Oalam pembuataIl antibodi pada percobaan ini, imW1isasi daD booster llanya disuntikkan sebanyak 0,5 mg selungga hasilnya seperti taIUpak pada GaIubar I, Lampiran I. Selain dosis antigen, respon imW1 dipengarulli pula oleh sifat genetik hewan percobaan. Titer antisera tinggi berhubungan deng.1ll rute daD interval penyuntikan, waktu pallen senun, bobot molekul antigen (10-20 molekul steroid per molekul protein) daD SUSW1an kimianya (5). Titer antisera. Titer ditunjukkan dengcm berbagai reaksi pengenceran antisem dengan sejumlah mdioaktivitas senyawa bertandt'l mdioisotop yang diinkubasi dengan volume, bufer, suhu, dt'ln waktu tertentu (6). Pengenceran ~jsem yang berikatan dengan 50%
360
senyawa bertaJlda radioisotop (antigen spesiflk) didifinisikan sebagaititer antisera. Pengenceranantisera tersebutdigunakan sebagaivolume antisera untuk RIA karena akan membentukkurva standar dengan tingkat pengukuranlebih presisi (koefisian variasi) relatif kecil kurangdari 10% (lillat Lampiran2). Titer dapatditetapkanpula lebih besardari 50 0/0, misalnya 80 % tetapi sudut kurva (slope) akan lebih lancip, akibatyna rentang pengukuran lebih sempit, dan konsentrasi hormon yang dapat diukur relatif kecil, sehingganilai kesalahan(error) akan lebih besardari 10 % bahkandi atas 30 %. Antiserahormonprogesteroyang telahdihasilkan bersifat heterogenmengandungsejumlah imunoglobulin dengan konsentrasi berbeda, dengan afinitas dan spesifisitasyang berbeda pula. Afinitas kosnstan untuk seluruh antiserayang dillasilkan merupakan nlai rerata yang dipengaruhioleh lingkungan imunoglobulin dengan konstanta (K [Ab]) yang besar terutmna apabila digunakansistemseparasidextran-coatedcharcoal(DCC) (5). Selam imunoglobulin dengankonstantabesar maka antisera tersebuttidak selaIu memiliki spesifisitas dan afinitas tinggi. Untuk meningkatkan spesifisitas daD afinitas dilakukan optimalisasi daya ikat CD terhadap komponenbebassenyawabertandaradioisotopyang tidak terpakai daIam reaksi. Pad-']percobaan ini telah dapat ditetapkaJlkepekatanlarutan CD daIam bufer PES yaitu I : 5 (v/v) dan menghasilkannon spesifik ikatan (NSB) sebesar2-5 %. Komponen reagen RIA progesteron yang dioptilnaikan,yaitu senyawaprogesteronbertandatritium : (1,2,6,7.3H )Progesterondibeli dari Amersham.Aktifitas spesiflk tracer (SA = radioaktifitas per satuan massa) tercatat 96,0 Ci/lmnol perlu diencerkan untuk mendapatkanllasil penetapan RIA yang baik. Tidak selamanya baIlwa SA yang tinggi akan selaIu mengllaSilkanRIA terbaik, hill ini tergantungpadajenis hormon yang ditetapkan. Pada dasamyajurnlah tracer (dalam satuan massa)hams lebih rendah dari jumlah konsentrnsiterendahhonnonyang akan ditetapkandalam sampelbiologis (7). Analisis antisera progesteron dan pembuatan kurva standar, digunakan total rndioaktifitas 3RProgesteron sebesar15.000-20.000 Cpm. Kurva standar. Pembuatan kurva standar progesterondari tiga sumber referensi standar, yaitu larutan progesteronkristal (Sigma), progesteron serum (IAEA) dan progesteronsusu(IAEA) denganprinsip RIA yang biasanyadilakukanbersama-sarna denganpenetapan progesterondalam serumpasien. Hal ini ditujukan untuk perbandingansensitivitaskurva (dosis deteksi minimum daDrnaksimum). Pada Tabel I disajikan sumber standar referensi dari variasi dosis, sedang Tabel 2 menunjukkan respon terl1c'ldap dosis yang bersangkutanyang perhitungannya adalahcacahikatall / cacall total radioaktivitas X 100 % (BIT X 100%). Pada percobaan ini penggunaatl titer dengan pengencerallantisera 11a.-HPHs-BSA(1/1000) dengan titer 30 % < 40 %, temyata persentaseikatan komplek padastandarDol (% Bo). Ketiga sumberstandarreferensi Imsilnyatidak Salna,yaitu progesteron-kristal= 19,57%,
Pene/i/iandon Pengenlbangan Ap/ikasils%p danRadiasi. 1999
progesteron-senun(IAEA) = 26,95 %, datI progesteronsusu(IAEA) = 21,79 % (Tabel2). Hal tersebutdisebabkan oleh faktor pengencer, misalnya kristal progesteron diencerkan dengan biller PBSG, progesteron lAEA diencerkandenganserumdan sususapi. Persentase ikat.1D padaDol konsentrasi(Bo) kurang dari ketentuanlninimal, yaitu 30 % tetapi sensitivitasmasihtampak dapatdililk1t dari kelniringankurva (slope)(lil1atLampiran 3 daD4 ). Perbandingantingkat ketelitian (presisi) ketiga kurva standar di1akukan perhitungan dan gambaran imprecission profile yang diperlil1atkanseperti contoh gambar (Lampiran 5). Pada gambar tersebutditunjukkan error acak nilai penetapan1laTgadari berbagai sumber error se1lingganilai dari llaTga tertentu pada sejuinlah sampelbervariasi.(CV = SD/X rata-rataX 100%) (8). Reaksi in vitro imwIologik dalaln RIA akan mengl1asilkansejumlah error relatif besar, disebabkan oleh berbagai faktor, yaitu volume kerja yang kecil (mikroliter), konsentrasi honnon yang ditetapkan kecil (nano-pikro gr/lnI), faktor lingkwlgan (suhu, biller, dan bahan kilnia) dan sistempencacal1al1 radioaktivitas.~ dalam RIA pada dasanlya berasaldari 2 swnber, yaitu error non-statistical (experimentalerror atau systemical error) daD statistical error (8), sellingga faktor error tersebut perlu dikendalikail agar 11asilnya dapat dipertanggung -jawabkan.
KESIMPULAN Antisera honnon progesteron telall dapat dihasilkan di laboratorium Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi,Bataomeskipuntitemya belumtinggi tetapisudah memenuhipersyaratansebagaireagenRIA (titer 30-40 % Bo padapengenceran A/S = 10.3). Hasil optilnalisasi reagen selain antisera,juga total radioaktivitas 3H-Progesteron 15000-20000 Cprn/l00uI masih sensitif, sistem separasidextran-coated charcoalterbaik (12,5g Norit A + 1,25 g DextranT-70 + 500 ml PHS)perlu diencerkandenganPBSG 1 : 5 atau I : 10 WltukmendapatkanNSB = 2-5 % (substitusierror). Perbandingan ketiga k.lfVa standar dari tiga sumberreferensi(kristal progesteron,serwnprogesterOl1, daJlsusuprogesteron)yang lnasihlayak digwtakanuntuk penetapatlunknown daialn RIA ialall stalldar referensi serum progesteronIABA, tetapi kurva ini belum diuji "imprecissionprofile"" nya. Antisera progesteronsangattidak stabil (cepat terdegradasi) apabila disimpan pada subu 4°C yang seharusnyadisiInpc'1n pada SuilU-20°C atau -70°C pada suhuini akan stabilsaInpai6 bulan.
nutrisi ternak rurninansia oleh karena itu kami kelompok penelitian RIA-Biologi mengucapkan terima kasih atas dukungan terhadapprogram dan dananya. Kepada lab. RIA BPT -Ciawi, kami ucapkan terirna kclSih alas pemberian fasilitas yang diperlukan untuk mendukung penelitian ini. Akhirnya ucapan disampaikan kepada star dan teknisi pelaksana, Sdr.Arief Djanakum, Sdri. Setyowati, Sdri. Sri Utami dan Sdr. Ode Irwanto yang penuh tanggungjawab membantu penelitian ini.
DAFTARPUSTAKA 1. SOEWARSONO,M., Produksi reagenradioimmunoassay T3 dan T4, dan Aplikasinya, Presentasi Ilmiah 3 Desember1990(Peneliti), PAIR-BATAN (1990). 2. THORELL, J.I., and LARSON, S.M., Radioinunnuassayand Related Teclmiques(Methodology and Clinical Applications) tile C.V. Mosby Company, SaintLouis (1978) 11. 3. EDWARS, R., Iffilnunoassay, An Introduction, Williem Heinemann Medical Books, London (1985)55. 4. ROITT, I., Essential lnununology. Blackwell Scient. Publ., Oxford -Lo ndon-EdinburghMelbourne (1973) p.
5. ABRAHAM, G.E., Radioimmunoassayof Steroid in Biological Materials, in Radioimmunoassayand Related Procedures in Medicine, Proc.Symp., Istambul 10-14 September 1973, vol. II, IAEA, Vienna(1974)3. 6. lAEA, Reproductive Endrocrinology in Animals: Honnones Laboratory Training Manual in Radioimmunoassay, in Animal Reproduction, FAO/IAEA, Tech. Rept. Series No.233, lAEA., Vienna (1984)71. 7. BHADARKAR, S.D., and PILLAI, RadioimmWloassay, A Laboratory BARG., Bombay (1982) 8.
M.R.A., Manual,
8. DUDLEY, R.A., Data Processing in Radioimmunoassay: Off Line Programs for the HP-41C Calculator,lAEA-TECDOC. 346, lAEA., VielUla(1985)31.
UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ilU tidak akan terlakS<1Da taIlpa bantu.1D dana milurnal yang dialokasikan oleh kelompok penelitian
361
Pene/i/iandon Pengembangan Ap/ikasi lso/ap donRadiasi. /999
Tabel Tiga swnberstandarreferensidatIdosisnya REFERENSI
A
al Pro IAEA) Pro~. usu AEA)
0 0 0
c~
B~
D
~
1.QQ
~
~
1~()
1,25
F
E
5.00
~
?:z,QQ
10,0
~ ~
8,00
H
SATUAN
16,0
ngiml nmol/L nmol/L
40.0 63,6
20.0
Tabel2. Respondosiskurva standar(% Bm REFERENSI Pro IAEA) Pro~. usu AEA)
c
D
Gf!;!:2
F
A
B
l2d1
!.;!2!
~ ~
~ ~
~ ~
21,79
16,97
~ ~
15,21
12,35
8,90
7,80
~
~
E
H 4,67
~
6,10
6U
'~~IC:~.:-:,~::.::;:;:.::, .::;':'::~:i:;;:.i:~::."-:;":,:/) "'"'"
, c..,--:::;:,:':~
50 ., ,...
;~:;:
.;:i:;~~:;:
i,::~ "
-':. 10
..:..:. oil:::.::,,:
",:);:;:::.)
",.;;..;.. :,::;~.,;;:,}:
'"
':::ij:i:I:;t:~ ;. ~;::::.t;:;: ,::.';i:;f~;t:i: c...,.'::,::~:i;:rl: C'C.,..
:...,,':::,
'.'
~ ; ,,"
l
:!""
~:§:e.(!i}J1.~
~;
2t1
0
2
3
!.
blSlan
Gambar 1. Penlngkatan respon Imun sefe'ah suntlkan booster
362
m ;:::;;::;:;::;;: :. :~j';.~!j~:;:: ~
1 .. ;~rIASh-'"
.~
::Y#3lo.ttIO)",!.A "ilA ..ljrtlJ- i.(~
. ~
Peneliliandon Pengembangan Aplikasi lsalop danRadias;.1999
t.n
U:;.;~~:~~if.:{;~~;f-::.;:~;r
."'.:
so ..
::;:~.:
~O
:.
""C, .., '-'.
,'".'
:.:
..
0.:
;.., :.: ",..
::;:::i;;:1~:!~:1:;:i:';~1:;~.i~~
.""'" "'.' ,:.".:,...'
c
.:... ...:,.;...:
~
~':~:~::
~JO
~
20
10
0
0
,1
[/
II
}tCC
! 5",1)
f 3:10
.
Y1~r.o
p."genc.tan
Gambar 2. Tltrasl Antlsera-Progesteron
2n 18
15 14
1Z
5 ~ 10 :£
~ 8 : '.:: :~1:::::. ., .,
5 A "'i .,
::".1::~;:~';:i:1
;::::)!~;!l'i,'t...
2rfi~lii~.;:,
;. ;: f :::;~;'-'"' ;."..;;::..,;c .::.; O,:;::.: ::: :.;;.
.;. O;::'..,.".
0 0
2
6
8
to
t1
"
'6~/"'l,
ko"I.~rasl
Gambar 3. Kurva Standar Kristat progesteron
363
~ .1
Peneliliandan Pengembangan Aplikasi lsotop donRadios;. /999
Gambar 4. Kurva Standar Progemeron Serum dan Susu (rAEA)
~J)
:.;:;~:;;i:::;::~;:;.,~::::::~;i:; ';.,:::.: ~ '.,;"" ::;':
25
-:]0 ~
~
x
~ :>
u
aI
c 'it
1~
';";i.
5 (I u
k 1~:i;~J;j.;~~~J;~E~~~~i~ ~ 10
C'
::.;:.;~:,,:,.:;::;~:;=:::
~
'>
I)
I
2
3
5
ttX
Gambar 6. Imprecision
364
Profile Hon-Countlng CV of X VS In X
6
Pene/iliandan Pengembangan Aplikasi lsotop don Radiasi,1999
DISKUSI SUPRIY A TI K.
H.M. SOEWARSONO
1. Apakall dari ltasil penelitian yang bapak lakukan dilakukan uji reaksi silang (cross reaksi) terhadap honnonsteroidlain? 2. Bagairnana antibodi yang dilmsilkan dilakukan terltadap sample, contoh misalnya : siklus estrus domba/sapiresponsinya? 3. S!!m!! : Selama ini tracer yang digunakanadalah 1251 dan Tritium (3H) berasaldari luar (import)untukRIA. Kami mengltarapkanBatall dapat memproduksinya untuk menaJlggulangi tracer-tracertersebut.
1. Kami belurn melakukan uji "reaksi silang" dengan hormon steroid lainnya-/mis estrogen, cartial, dlI. Tetapi mendapat asumsi kami reaksi silang sangat kecil kurang dari 2%. 2. Dengan kurva-standard terutalna (standar serum prog. lAEA) sudah dapat digwlakan Wltuk pengukumD prog. sampel yang aplikasinya belum dilakukan. 3. Justru, karena Batan belum dapat memproduksi 1251 sehingga labeling dari 1251belum dapat dilakukan. J25I masih lmrus diimport yang saat saat ini harganya sangat maIml (tidak mWlgkin dapat dibeli dengan dana penelitian).
365
