Onderzoek naar het effect van ultrageluid op de groei van algen en biofilm

Onderzoek naar het effect van ultrageluid op de groei van algen en biofilm.

Het effect van ultrageluid op de groei van Nannochloropsis salina in kweekcilinders en de aangroei van bacteriële biofilm in leidingen.

HZ UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27 mei, 2013 Geschreven door: T.A.D. Steenbakker

Het effect van ultrageluid op de groei van algen en biofilm Auteur: T. Steenbakker Versie: 1 Studie: Aquatische Ecotechnologie Onderwijs instelling : HZ University of Applied Sciences Organisatie: HZ University of applied sciences Inhoudelijk begeleider: P.Vader Stagedocent: M.Michels Datum: 27‐05‐2013 Plaats: Vlissingen T.A.D. Steenbakker I

Voorwoord Dit rapport is geschreven naar aanleiding van mijn afstudeeronderzoek over het effect van ultrageluid op de groei van de algensoort Nannochloropsis salina en de aangroei van biofilm in leidingen. Het onderzoek vond plaats onder de werkzaamheden van de onderzoeksgroep Water Technology van de Delta Academy aan de HZ University of Applied Sciences in Vlissingen. Ik wil in dit rapport een zo goed mogelijk beeld geven van mijn resultaten en conclusies omtrent mijn onderzoek. Dit rapport is bestemd voor de betrokkenen van het onderzoek, dat houdt in dat het bestemd is voor alle betrokkenen van het RAAK‐project Ultrasone Desinfectie. Daarnaast is dit afstudeerrapport bestemd voor de HZ University of Applied Sciences. Mijn grote dank gaat uit naar allen die mij geholpen en geadviseerd hebben. Mijn dank uit naar Hans Cappon, die deze afstudeeropdracht voor mij ter beschikking heeft gesteld, ook naar Paul Vader en Michiel Michels, mijn inhoudelijk begeleider en stagedocent. Daarnaast gaat mijn dank ook ten zeerste uit naar Jan Rijstenbil van AE3 consultancy voor al het goede advies, en naar Jan Pleijte, die mij geholpen heeft met alle technische zaken omtrent het onderzoek. Als laatste bedank ik het NIOZ voor de provisie van de algen die benodigd waren voor mijn onderzoek. T.A.D. Steenbakker II

Samenvatting Het gebruik van ultrageluid als methode voor de desinfectie van water is reeds veel onderzocht. Ultrageluid kan simpelweg beschreven worden als geluid dat zich buiten het hoorbare geluidsspectrum van de mens bevindt. Ultrageluid beweegt zich voort in golven welke getransporteerd kunnen worden door vrijwel alle materialen, zoals vaste, vloeibare, en gasvormige stoffen. Ultrageluid kent vele applicaties binnen allerlei technieken en gebieden. Zo wordt ultrageluid gebruikt bij het maken van echo’s in ziekenhuizen, maar wordt het ook gebruikt bij het bepalen van holten of gaten in bijvoorbeeld cement van gebouwen of constructies. Daarnaast wordt het ook toegepast voor biologische doeleinden. Hiertoe behoort onder andere de desinfectie van water. Bij de desinfectie van water speelt de bestrijding van bacteriën en algen een belangrijke rol. Algen kunnen schadelijk zijn voor de gezondheid van mens (wanneer giftig), alsmede pathogene bacteriën. Bacteriën en algen kunnen ook leidingen verstoppen door de vorming van een biofilm waardoor de schoonmaakkosten vaak hoog zijn. De bestrijding van bacteriën en algen kan ook bewerkstelligd worden door het toepassen van chemische middelen, zoals chloor. Het toepassen van chemische middelen is echter slecht voor het milieu en voor de gezondheid. Daarom is het interessant om onderzoek te doen naar alternatieven, waarvan ultrageluid er een van is. Bij het gebruik van ultrageluid worden er geen chemische middelen toegepast en het is een energie zuinige methode wanneer het wordt toegepast met een laag vermogen. Met de voorgaande informatie in gedachten zijn er twee experimenten uitgevoerd. Eén experiment is uitgevoerd waarbij het effect van ultrageluid op de groei van de algensoort Nannochloropsis salina in algenkweekcilinders is bepaald, en een tweede experiment waarbij het effect van ultrageluid op de aangroei van bacteriële biofilm in leidingen is bepaald. Het eerste experiment is uitgevoerd door twee kweken van N.salina op te zetten in cilinders gevuld met 40 liter grondwater medium. De inhoud van de cilinders werd vervolgens door elk een aparte leiding gepompt, aan een van de leidingen was een ultrasoon sonde bevestigd. Op deze manier kon er een goede vergelijking worden gemaakt tussen de ontwikkeling van de twee kweken, dit werd gedaan door middel van het bepalen van de algenconcentratie met behulp van het Bürker‐Türk telraam. Het tweede experiment is uitgevoerd door grondwater door vier leidingen te pompen. Aan het grondwater werden nutriënten toegevoegd om de groei van bacteriën en de aangroei van biofilm goed te laten verlopen. Aan twee van de vier leidingen werden ultrasone sondes bevestigd, aan de andere twee leidingen niet. Op deze manier kon er vergeleken worden of er verschil was in de aangroei van biofilm tussen de leidingen met en zonder ultrageluid, dit werd gedaan door het meten van de lichtdoorlaatbaarheid van de leidingen. De lichtdoorlaatbaarheid neemt af naarmate er meer biofilm aan de leidingen groeit. Uit het eerste experiment is gebleken dat de groei van N.salina niet of nauwelijks geremd wordt door het toepassen van ultrageluid. Alleen in de beginfase van de groei is er een negatief effect zichtbaar. In ieder geval wordt de groei van deze algensoort ook niet gestimuleerd door het toepassen van ultrageluid. Uit het tweede experiment is gebleken dat het toepassen van ultrageluid preventief werkt. In de blanco leidingen was een duidelijke aangroei te zien, terwijl dit in de leidingen met ultrageluid niet zo was. Het toepassen van ultrageluid kan dus als effectief worden beschouwd voor de voorkoming van aangroei van bacteriële biofilm. In dit geval zou dit dus een milieuvriendelijke, duurzame oplossing zijn. T.A.D. Steenbakker III

Summary The use of ultrasound as a method for the disinfection of water has already been investigated a lot. Ultrasound can simply be defined as sound that is pitched above human hearing. Ultrasound moves in sound waves which can be transported through many materials, like solid, fluid and gaseous substances. Ultrasound has many utilities within several techniques. Ultrasound is used for the making of echo’s in hospitals, but it is also used for the localization of holes and cavities in buildings. Besides those, ultrasound is also used for biological purposes, like the disinfection of water. When it comes to the disinfection of water, the removal of bacteria and algae play very important roles. Algae and pathogenic bacteria can be harmful for the well‐being of humans. Algae and bacteria can also clog pipes through the development of a biofilm, because of this the cleaning costs can be very high. To remove bacteria and algae, chemical substances like chlorine can be used. However, the use of chemicals is harmful for the environment and for human health. Therefore it is very interesting to investigate alternatives like ultrasound. With the use of ultrasound, no chemical substances are used and when ultrasound is applied with low power it is also energy efficient. With the above information in mind, two experiments are done. One experiment examines the effect of ultrasound on the growth of the algae Nannochloropsis salina in culture cylinders, and the other experiment examines the effect of ultrasound on the growth of bacterial biofilm in pipes. The first experiment is done by creating two cultures of N.salina in cylinders filled with 40 liters of groundwater culture medium. Each of the cylinders contents were pumped through a pipe. One of the pipes contained an ultrasonic probe. In this way a good comparison could be made between the development of the cultures. This was done by the determination of the cell concentration of each culture, using the Bürker‐Türk counting chamber. The second experiment is done by pumping groundwater through 4 pipes. Nutrients were added to the groundwater to make the bacterial biofilm grow. Ultrasonic probes were installed at two of the four pipes. In this way a good comparison could be made between the growth of biofilm in pipes with ultrasonic probes and without ultrasonic probes. This was done by measuring the luminous transmittance of the pipes. The luminous transmittance declines as the biofilm growths. The first experiment showed that the growth of N.salina is not, or almost not, affected by ultrasound. Only at the first growing phase a small negative effect of the ultrasound is visible. At least the growth of this algae is not stimulated by the ultrasound. The second experiment showed that the use of ultrasound works preventive. Biofilm didn’t grow In the pipes with ultrasound. This while the pipes without ultrasound did show a growth of biofilm. The use of ultrasound can thus be seen as an effective method to prevent the growth of biofilm in pipes. So in this case it would be an environmental friendly and durable solution.

T.A.D. Steenbakker IV

Inhoudsopgave Voorwoord .................................................................................................................................................... II Samenvatting ............................................................................................................................................... III Summary ...................................................................................................................................................... IV 1.

Inleiding ................................................................................................................................................. 1 1.1

Ultrageluid en cavitatie ................................................................................................................. 1

1.2

De toepassingen van ultrageluid ................................................................................................... 2

1.3

Algen en ultrageluid ...................................................................................................................... 2

1.3.1

De problemen met algen .......................................................................................................... 2

1.3.2

De effecten van ultrageluid op algen ........................................................................................ 3

1.3.3

Eigenschappen van de geteste algensoort ............................................................................... 4

1.4 1.4.1

De problemen met biofilm ........................................................................................................ 5

1.4.2

De effecten van ultrageluid op biofilm ..................................................................................... 5

1.5

2.

3.

Probleem en doel ..................................................................................................................... 6

1.5.2

Hoofdvragen ............................................................................................................................. 6

1.5.3

Deelvragen Experiment algen en ultrageluid ........................................................................... 7

1.5.4

Deelvragen Experiment biofilm en ultrageluid ......................................................................... 7

Materiaal en methode .......................................................................................................................... 8 2.1

Experiment N.salina en ultrageluid .............................................................................................. 8

2.2

Experiment bacteriële biofilm en ultrageluid ............................................................................. 11

Resultaten ........................................................................................................................................... 16 Resultaten experiment N.Salina en ultrageluid .......................................................................... 16

3.1.1

Het eerste experiment ............................................................................................................ 16

3.1.2

Het tweede experiment .......................................................................................................... 17

3.2

5.

Probleem en doelstelling .............................................................................................................. 6

1.5.1

3.1

4.

Biofilm en ultrasoon geluid ........................................................................................................... 5

Resultaten experiment bacteriële biofilm en ultrageluid ........................................................... 18

Conclusie en discussie ......................................................................................................................... 21 4.1

Algen en ultrageluid .................................................................................................................... 21

4.2

Bacteriële biofilm en ultrageluid ................................................................................................. 21

Aanbevelingen .................................................................................................................................... 23 5.1

Aanbevelingen N.salina en ultrageluid ....................................................................................... 23 T.A.D. Steenbakker V

5.2

Aanbevelingen bacteriële biofilm en ultrageluid ........................................................................ 23

Verklarende woordenlijst ........................................................................................................................... 25 Bibliografie .................................................................................................................................................. 26 Appendix 1: Overige data ........................................................................................................................... 27 Appendix 2: Statistiek ................................................................................................................................. 32 Appendix 3: Specificaties ultrasoon sondes................................................................................................ 43 Appendix 4: Grondwater ............................................................................................................................. 44 Appendix 5: Kweek van algen ..................................................................................................................... 45 Appendix 6: Bürker‐Türk handleiding ......................................................................................................... 50 Appendix 7: voedingsstoffen biofilm .......................................................................................................... 52 Inhoudsopgave CD‐rom .............................................................................................................................. 54

T.A.D. Steenbakker VI

1. Inleiding Het gebruik van ultrageluid als methode voor de desinfectie van water is reeds veel onderzocht. Dit hoofdstuk geeft een beeld van de belangrijkste ontwikkelingen binnen deze onderzoeken. Daarnaast zal ook een toelichting gegeven worden over het verrichte onderzoek zoals het beschreven zal worden in dit rapport. Het onderzoek vond plaats op de HZ University of Applied Sciences, als deel van de activiteiten van de onderzoeksgroep Water Technology van de Delta Academy. Deze onderzoeksgroep heeft verschillende onderzoeksprojecten. Een van die projecten is het project Ultrasone Desinfectie, dat wordt gesubsidieerd door de RAAK‐subsidieregeling van de Stichting Innovatieve Alliantie (SIA).

1.1 Ultrageluid en cavitatie Ultrageluid kan simpelweg beschreven worden als geluid dat zich buiten het hoorbare geluidsspectrum van de mens bevindt met een frequentie hoger dan 20KHz (Figuur 1).

Figuur 1 Schematische weergave van de frequenties van verschillende typen geluid. Ultrageluid treedt op bij een frequentie boven de 20kHz, oftewel boven de frequenties van akoestisch geluid. Akoestisch geluid is geluid dat nog wel hoorbaar is voor de mens.

Ultrageluid beweegt zich voort in golven welke getransporteerd kunnen worden door vrijwel alle materialen zoals door vaste, vloeibare, en gasvormige stoffen. Dit kan zolang de stoffen elastisch eigenschappen bevatten. Door de transmissie ontstaan er geluidscirkels die uitzetten (expansie) of samentrekken (compressie) zoals getoond wordt in Figuur 2. De cirkels die samentrekken duwen moleculen samen, de cirkels die uitzetten kunnen ervoor zorgen dat er bubbels of holten ontstaan. Het ontstaan van de bubbels of holten die gevormd zijn tijdens de expansie wordt cavitatie genoemd. Cavitatie treedt in water op bij ultrageluid opgewekt met een vermogen hoger dan 0.33 W/cm2 (Adewuyi, 2001). Er zijn twee soorten cavitatie. Non‐inertiële cavitatie (stabiele cavitatie) en inertiële cavitatie (instabiele cavitatie) (Leighton, 2007). Bij non‐inertiële cavitatie krimpen en groeien de bubbels ongeveer evenveel gedurende de compressie en expansie cyclus en blijven ze dus stabiel. Bij inertiële cavitaitie nemen de bubbels na de vorming steeds in omvang toe tot het punt dat ze instorten; een bubbel kan dan de energie die gegeven wordt door het ultrageluid niet meer absorberen (Figuur 2). Het moment van het instorten van de bubbels is erg implosief, hierbij ontstaan extreem hoge temperaturen en druk. De hitte die hierbij vrijkomt wordt echter meteen opgenomen door de vloeistof en verandert dus weinig aan de vloeistof zelf, daarom wordt cavitatie ook wel ‘koud koken’ genoemd (Castro, 2007). Gedurende het moment van imploderen ontstaan echter wel reactieve radicalen, die verschillende reacties in gang kunnen zetten (Adewuyi, 2001).

T.A.D. Steenbakker 1

Figuur 2 Schematische weergave van de ultrasone geluidsgolven en de bubbels die daarbij ontstaan (in een vloeistof). Door de energie die het ultrasoon geluid transporteert neemt de bubbel steeds toe in omvang totdat deze implodeert. Hierbij ontstaan extreem hoge temperaturen en druk (Purcell, 2009).

1.2 De toepassingen van ultrageluid Ultrageluid kent vele applicaties binnen allerlei technieken en gebieden. Zo wordt ultrageluid gebruikt bij het maken van echo’s in ziekenhuizen, maar wordt het ook gebruikt bij het bepalen van holten of gaten in bijvoorbeeld cement van gebouwen of constructies (Castro, 2007). Daarnaast wordt het ook toegepast voor biologische doeleinden. Hiertoe behoort onder andere de desinfectie van water. De behandeling van afvalwater en ballastwater, de bestrijding van verschillende soorten bacteriën en de controle van algengroei zijn voorbeelden waarbij ultrageluid steeds meer toegepast wordt (Vader, 2012). Ultrageluid kan echter op verschillende manieren toegepast worden. Wanneer ultrageluid toegepast wordt boven de cavitatie grens zal dit meer effect op levende organismen hebben dan wanneer ultrageluid toegepast wordt onder die grens. Bij cavitatie ontstaan er immers bubbels in de vloeistof die de micro‐organismen sterk kunnen verstoren. Toch zeker wanneer de cavitatie instabiel is en uiteindelijk voor implosies van de ontstane bubbels zorgt, zal dit veel effect hebben op levende cellen.

1.3 Algen en ultrageluid 1.3.1 De problemen met algen Algen zijn fotosynthetische organismen. Algen hebben een groot aanpassingsvermogen gezien ze overal ter wereld voorkomen in zowel zoet‐ als zoutwater als in sneeuw en ijs. Algen komen voor in allerlei vormen en maten. Ze komen voor als eencellige organismen, maar ook als meercellige organismen en in kolonies. De cyanobacteriën behoren tot de kleinere algensoorten, ze worden ook wel blauwalgen genoemd en zijn in feite bacteriën met bladgroen. Cyanobacteriën zijn prokaryoot. De meer ontwikkelde algensoorten zijn eukaryoot, zoals bijvoorbeeld diatomeeën en groen algen (Purcell, 2009). Algen in natuurlijke systemen kunnen schadelijke effecten op mensen en andere organismen hebben, dit is vooral wanneer ze zich in grote aantallen in een watersysteem bevinden. Dit wordt algenbloei genoemd. De vaak snelle toename van de algenbloei wordt voornamelijk veroorzaakt door eutrofiëring. Doordat de algen het water troebel maken wordt licht tegengehouden waardoor het licht niet meer ver T.A.D. Steenbakker 2

genoeg doordringt voor een succesvolle groei van andere waterplanten en wieren. Als de algen afsterven kan het water tijdelijk zuurstofloos worden. Veel vissen en andere dieren die in het water leven sterven dan. Ook kunnen bepaalde algensoorten, zoals de blauwalgen, giftige stoffen afgeven. Blauwalgen planten zich bij warm weer heel snel voort, wanneer er zich veel nutriënten in het water bevinden. Er kunnen dan dikke drijvende lagen ontstaan. Sommige soorten produceren toxinen, die schadelijk zijn voor mens en dier. Naast de gezondheidsrisico’s die een algenbloei met zich mee kan brengen, kunnen algen ook filters en leidingen blokkeren. De meest logische methode om een algenbloei te voorkomen in natuurlijke watersystemen is het tegengaan van de eutrofiëring, ofwel de toevoer van nutriënten in een watersysteem. Het is echter aangetoond dat dit erg lastig te controleren is, de nutriënten die uiteindelijk in een watersysteem terecht komen kunnen diverse bronnen hebben welke soms lastig te traceren zijn (Purcell, 2009). Het gebruik van ultrageluid kan voor natuurlijke watersystemen een oplossing bieden tegen algenbloei (U.S. ARMY CORPS OF ENGINEERS, 2012). Wanneer algen leidingen blokkeren, ontstaat er de behoefte om chemische middelen te gebruiken om een algenbloei te voorkomen of algen uit leidingen te verwijderen. Dit is echter erg milieuonvriendelijk en bovendien erg schadelijk voor natuurlijke watersystemen en voor de gezondheid van de mens. Het is een uitdaging om een methode te vinden die milieuvriendelijk is. Een milieuvriendelijke methode kenmerkt zich door een laag energieverbruik, een reductie van kosten en de voorkoming van het gebruik van chemische middelen. Eén van die methoden is het gebruik van ultrageluid (Purcell, 2009).

1.3.2 De effecten van ultrageluid op algen Ultrageluid kan verschillende effecten op algen hebben. Over het algemeen wordt aangenomen dat wanneer er ultrageluid gebruikt wordt waarbij geen cavitatie optreedt de algen gestrest worden. Hierbij worden waarschijnlijk waarschuwingsstoffen afgegeven door de algen wat (waarschijnlijk) leidt tot geprogrammeerde celdood (Wu, 2011). Het meeste effect wordt toch waargenomen wanneer ultrageluid gebruikt wordt waarbij wel cavitatie optreedt. Echter, het effect is niet hetzelfde bij elke algensoort. Uit onderzoek is gebleken dat blauwalgen, de algen die gas vacuolen bevatten, vooral verstoord worden doordat de vacuole kapot gaat door cavitatie, hierbij kunnen ook andere celorganellen beschadigd worden. Het is echter ook bekend dat gasvacuolen weer opgebouwd kunnen worden door deze algen, dus het zou enkel een tijdelijk effect hebben (Purcell, 2009). Het is ook geobserveerd dat wanneer blauwalgen in ketens voorkomen ze wél een goede reductie in cel aantallen weergeven wanneer ze worden blootgesteld aan ultrageluid. De hypothese hierbij is dat de filamenten, de draadvormige hardere structuur van een keten, kapot gaan waarbij de celwanden van de blauwalgen breken. Hierdoor gaat de cel inhoud verloren. Eencellige blauwalgen, en groenalgen, hebben een flexibele celwand die niet gebroken lijkt te worden door het ultrageluid (Purcell, 2009). Diatomeeën en algenketens hebben een hardere structuur die wél gebroken wordt door het ultrageluid. Eencellige blauwalgen en groenalgen worden wel beschadigd door het ultrageluid, maar kunnen dus ook weer herstellen (Purcell, 2009). Dit zal waarschijnlijk ook het geval geweest zijn bij het gebruik van ultrageluid zonder cavitatie (Wu, 2011). Of ultrageluid effectief is voor de verwijdering van algen ligt dus puur aan de eigenschappen van de desbetreffende algensoort en van de eigenschappen van het type ultrageluid dat gebruikt wordt. Figuur 3 geeft een alg weer met een vacuole. T.A.D. Steenbakker 3

Figuur 3 Schematische weergave van een algen cel met een vacuole, (10voorBiologie.nl).

1.3.3 Eigenschappen van de geteste algensoort In een voorgaand onderzoek is de algensoort Tetraselmis suecica gebruikt. Dit is een algensoort die in een bepaalde levensfase aan de wanden van de testcilinders plakt. Tijdens dit onderzoek leek de alg niet goed te groeien, wat waarschijnlijk te wijten was aan de pomp, maar door de plakkende fase van de alg kan dit tevens een valse of niet nauwkeurige waarneming geweest zijn. Daarom gaat bij dit onderzoek de voorkeur uit naar een minder fragiele alg waarvan bekend is dat deze geen vastzittende groeifase heeft en ook niet de neiging heeft wandgroei te vertonen, zodat goed het effect van ultrageluid op de groei kan worden bepaald (J. Rijstenbil, pers.comm). Het experiment toonde wel aan dat Tetraselmis suecica minder aan de wanden plakte met het gebruik van ultrageluid, de reden hiervoor is echter nog niet gevonden (E.Koper, pers comm). Nannochloropsis salina (Figuur 4) is een zoutwater alg die tot de groen/bruine algen behoort, tot de klasse Eustigmatophyten (kakerlakenparade.de). Het zijn kleine ronde groene algen van ongeveer 2‐5µm (deepblue‐marine.de). Deze soort is erg in trek als een voedingsbron in de aquacultuur, omdat de alg hoge vetwaarden heeft (bijvoorbeeld voor de kweek van Artemia). De alg is erg goed bestand tegen afschuifkrachten die veroorzaakt worden door pompen. De algen komen voor als eencellige organismen in de vrije waterkolom, ze plakken zelden aan de bodem of aan de wanden van een tank. Het is een sterke, dominerende alg die vaak andere algen wegconcurreert in natuurlijke watersystemen, (Graham & Wilcox, 2000).

Figuur 4 Weergave van Nannochloropsis salina. De schaal rechtsonder duidt 20µm aan (deepblue‐marine.de).


1.4 Biofilm en ultrasoon geluid 1.4.1 De problemen met biofilm Biofilm is een zelf organiserende samenleving van micro‐organismen op een oppervlak. Biofilms worden gevormd zodra bacteriën zich vasthechten aan het betreffende oppervlak. De bacteriën hechten zich door een slijmerige en kleverige substantie af te scheiden (Figuur 5). Vervolgens groeit de kolonie en wordt de biofilm bij elkaar gehouden door de slijmerige substantie. Vervolgens kan de biofilm zich verspreiden doordat bacteriën uit de kolonie los laten zodat ze ergens anders een nieuw biofilm kunnen vormen (mpkb.org). Door de vorming van biofilm kunnen leidingen verstopt raken. Over het algemeen wordt de vorming van biofilm ook hier goed bestreden door het gebruik van chemische middelen. Het gebruik van ultrageluid zou een milieuvriendelijker alternatief kunnen zijn. Wanneer het gebruik van ultrageluid een effectieve methode zou zijn, dan wordt onder andere het gebruik van chemische middelen beperkt en worden de schoonmaakkosten of de schoonmaakarbeid van kunstmatige systemen gereduceerd. Hier is echter geen wetenschappelijke informatie over, de informatie komt meer vanuit bedrijven die ultrageluid getest hebben om te kijken of ultrageluid effectief biofilm kon verwijderen (G.Hutchinson, 2008). Bovendien wordt de kans op verspreiding van ziekten door biofilm (in het geval wanneer daar zich schadelijke, ziekteverwekkende bacteriën in bevinden) verkleind.

Figuur 5 Schematische weergave van de groei en de verspreiding van een biofilm (mpkb.org).

1.4.2 De effecten van ultrageluid op biofilm Onderzoek heeft reeds aangetoond dat ultrageluid een negatief effect op de vorming van biofilm kan hebben (G.Hutchinson, 2008). Hierbij werd verondersteld dat wanneer de bacteriën mee trillen (resonantie) met de trillingen die veroorzaakt worden door het ultrageluid, ze dit ervaren alsof ze zich in turbulent water bevinden. Hierdoor produceren bacteriën geen slijmlaag om zich vast te hechten en zo wordt de vorming van biofilm sterk vertraagd (G.Hutchinson, 2008).


In een ander onderzoek is gebleken dat ultrageluid juist de groei van biofilm zou stimuleren omdat het transport van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen toe wordt verhoogd, en zo ook de afvoer van afvalstoffen van biofilm. Hierdoor wordt de groei van biofilm gestimuleerd in plaats van geremd (Pitt, 2003). Dit onderzoek vond plaats bij een laag vermogen en bij een lage frequentie, onderzoeken met een hoger vermogen en een hogere frequentie tonen juist wel een verwijdering van bacteriën (Pitt, 2003). Over het algemeen kan dus gezegd worden dat de groei van biofilm onder invloed van ultrageluid vooral afhankelijk is van de eigenschappen van het type ultrageluid dat gebruikt wordt. Ook de eigenschappen van de bacteriën bepalen de invloed van ultrasoon aangezien niet alle soorten bacteriën hier gevoelig voor zijn (Blume, 2004). Over het algemeen behoren bacteriën tot de meest ongevoelige soorten eencellige micro‐organismen voor ultrageluid. Voorgaande experimenten toonden weinig effecten van ultrageluid op biofilm in leidingen, in ieder geval was er geen afbraak van de biofilm (Tang, 2012).

1.5 Probleem en doelstelling 1.5.1 Probleem en doel De bestrijding van een (al dan niet giftige) algenbloei is een wereldwijde kwestie, zowel in natuurlijke systemen als in kunstmatige systemen. Ook de bestrijding van de vorming van biofilm in kunstmatige systemen zonder chemische middelen te gebruiken is van groot belang. Bij de ontwikkelingen van nieuwe bestrijdingsmethoden speelt duurzaamheid een belangrijke rol. Het gebruik van ultrageluid laat hierbij goede vooruitzichten zien. Het doel is om te bepalen wat het effect van ultrageluid is op de groei van algen in een kunstmatig systeem en op de aangroei van biofilm in leidingen. Het gaat hierbij dan om laag energetisch ultrageluid, onder de cavitatie grens. Het is namelijk zo dat het gebruik van ultrageluid boven de cavitatie grens, meer energie kost dan wanneer ultrageluid gebruikt wordt beneden de grens. Daarom is het juist interessant om onderzoek te doen naar de effecten op levende micro‐organismen wanneer ultrageluid gebruikt wordt waarbij geen cavitatie optreedt. Want wanneer blijkt dat ook dit type ultrageluid geschikt kan zijn voor de bestrijding van micro‐organismen, dan zou dit een energiezuinige en milieubewuste toepassing zijn (U.S. ARMY CORPS OF ENGINEERS, 2012) (Rajasekhar, 2012).

1.5.2 Hoofdvragen -

Wat is het effect van ultrageluid op de groei van Nannochloropsis salina? Wat is het effect van ultrageluid op de aangroei van bacteriële biofilm in leidingen?


1.5.3 Deelvragen Experiment algen en ultrageluid -

Wat is de beste methode om Nannochloropsis salina te kweken in grote cilinders om een optimale groei te kunnen waarborgen? Zijn er duidelijke verschillen te zien tussen de kweek zonder ultrageluid en de kweek met ultrageluid? Is het gebruik van ultrageluid een effectieve methode om de groei van algen te stoppen of te vertragen?

1.5.4 Deelvragen Experiment biofilm en ultrageluid -

Wat is de beste methode om biofilm te kweken in leidingen om een optimale groei te kunnen waarborgen? Op welke manier is de mate van aangroei van een biofilm te meten en te monitoren? Zijn er duidelijke verschillen te zien tussen de kweek zonder ultrageluid en de kweek met ultrageluid? Is het gebruik van ultrageluid een effectieve methode om de groei van biofilm in leidingen te stoppen of te remmen?


2. Materiaal en methode Voor beide onderzoeken zijn ultrasoon sondes gebruikt, de specificaties hiervan zijn te vinden in appendix 3. De sondes die gebruikt zijn, zijn afkomstig van Van Antwerpen Milieutechniek.

2.1 Experiment N.salina en ultrageluid Effect van ultrageluid op de groei van Nannochloropsis salina. Voordat het experiment uitgevoerd kon worden moest er een kweek opgezet worden van Nannochloropsis salina. Van deze algensoort kon een startcultuur (20 ml) verkregen worden bij het NIOZ (M.Grego). Voor de algenkweek werd grondwater (waarden grondwater te zien in appendix 4) gebruikt dat kon worden afgetapt in het Sealab. Het verdere protocol voor de algenkweek is te vinden in appendix 5. Tijdens de start van een algenkweek bevinden de algen zich in de lag‐fase, hierna gaan ze groeien en bevinden ze zich in de log‐fase. Dit is een exponentiële fase waarin de algen het meest actief zijn en er de meeste celdelingen plaatsvinden. De algen werden opgekweekt in schone cilinders die gevuld waren met 40L grondwatermedium, dat van te voren geautoclaveerd (gesteriliseerd) was. Rond de cilinders werden waterdichte LED‐strips gewikkeld en achter de cilinders werden nog twee tl‐balken geplaatst voor een goede belichting en optimale groei van de algen, resulterend in een lichtintensiteit van 7,8‐8,4 (µmol/sec/m2, range 0‐200). Dit werd gemeten met een lichtintensiteitsmeter in een lege cilinder. Op beide cilinders werd beluchting aangesloten, zodat de algen geen tekort aan koolstofdioxide (CO2) konden hebben. De cilinders werden naast elkaar in een aquarium geplaats, dat deels gevuld was met water. Dit water werd op een temperatuur gehouden van 20°C. Hierdoor werd het water in de cilinders op een constante temperatuur gehouden. Gedurende de gehele periode werd er een startcultuur in stand gehouden in erlenmeyers van 100 ml en 3l, dit zodat er altijd een voorraad was van Nannochloropsis salina. In elke cilinder werd vervolgens een pomp geplaats (5L/min) die de vloeistof door elk een aparte leiding pompte. Aan elke slang was ook een kraantje bevestigd zodat er vloeistof uit de cilinders gehaald kon worden zonder dat de cilinders opengemaakt moesten worden, dit maakte de kans op besmetting met zoöplankton of andere algensoorten erg klein. Aan één van de leidingen was een ultrasoon sonde (Van Antwerpen Milieutechniek) bevestigd. Figuur 6 toont de schematische weergave van de opstelling. Figuur 7 toont een foto van de opstelling van het experiment.


Figuur 6 Schematische weergave van de opstelling van het eerste experiment. De algen worden omhoog gepompt door een pomp, waarna ze vervolgens door een leiding worden gepompt en uiteindelijk weer eindigen in de cilinders. Aan de rechterkant van de leiding is een ultrasoon sonde bevestigd. De blanco opstelling is hetzelfde, maar dan zonder de sonde. Rond de cilinders zijn LED‐strips gewikkeld.

Figuur 7 Foto van de opstelling, zoals die opgesteld was tijdens het experiment.


Om de algengroei te monitoren werd elke dag uit elke cilinder een beetje alg (±100ml) afgetapt met behulp van de kraantjes. Dit werd gedaan nadat de kraantjes eerst goed werden doorgespoeld met vloeistof uit de cilinders om algen die gezonken waren in de slangen uit te spoelen. Op deze manier kon er een homogeen monster worden genomen om de algenconcentraties in de cilinders te bepalen. De concentraties werden bepaald met behulp van het Bürker‐Türk telraam (zie appendix 6). De tellingen werden per monster twee keer gedaan, om eventuele telfouten uit te sluiten en de metingen statistisch te kunnen onderbouwen. Alle gegevens die verzameld werden tijdens de tellingen waren ingevoerd en verwerkt met Microsoft Excel 2010. Naast het verloop van de cel aantallen werd ook de specifieke groeisnelheid bepaald. Dit werd gedaan voor de eerste fase voor beide culturen, op het moment dat deze zich in de exponentiële fase bevonden. De specifieke groeisnelheid (µ (d‐1) )toont de groeisnelheid over een bepaald tijdstip (∆t). Hiervoor werd de volgende formule gebruikt: ln

ln

Voor het toepassen van deze formule en voor het verwerken van het verloop van de celconcentratie werd het gemiddelde genomen van de twee tellingen voor elk van de beide culturen. Om de kweken in de cilinders in de log‐fase te houden werden er na verloop van tijd regelmatig algen geoogst en werd er nieuw groeimedium toegevoegd, deze oogstfractie betrof 10% (4L) per keer. In tabel 1 zijn de momenten te zien waarop er is geoogst en de duur tot de volgende oogst. Het experiment is twee keer uitgevoerd, zodat de resultaten die geboekt werden betrouwbaarder waren. Het eerste experiment vond plaats van 12‐4‐2013 tot 24‐4‐2013. Het tweede experiment vond plaats van 3‐5‐2013 tot 15‐5‐ 2013. Het benodigde materiaal voor dit experiment is te zien in appendix 1. Tabel 1 Datum oogst voor elk experiment en de duur tot de volgende oogst.

Datum oogst Eerste experiment 15‐4‐2013 16‐4‐2013 17‐4‐2013 18‐4‐2013 19‐4‐2013 22‐4‐2013 23‐4‐2013 Tweede experiment 7‐5‐2013 8‐5‐2013 9‐5‐2013 10‐5‐2013 13‐5‐2013 14‐5‐2013

Duur tot volgende oogst Eerste oogst: na 3 dagen 1 dag 1 dag 1 dag 1 dag 3 dagen 1 dag Eerste oogst: na 4 dagen 1 dag 1 dag 1 dag 3 dagen 1 dag T.A.D. Steenbakker 10

De significantie van de resultaten was getest door het uitvoeren van verschillende testen. Tijdens het testen van de significantie is aangenomen dat alle condities hetzelfde waren voor beide culturen: -

Een (independent samples) t‐test: Dit werd gedaan voor de complete reeksen om te kijken of de reeksen blanco en ultrageluid significant verschilden. Een (independent samples) t‐test voor elke datum: Dit werd gedaan om te kijken op welke momenten de reeksen significant verschilden. Een (oneway) anova test: Dit werd gedaan voor beide reeksen om te kijken of de reeksen zelf significant verschilden in de loop der tijd.

2.2 Experiment bacteriële biofilm en ultrageluid Het effect van ultrageluid op de aangroei van bacteriële biofilm in leidingen. Voordat het experiment uitgevoerd kon worden moest de opstelling zoals die gebruikt was in voorgaande experimenten (Figuur 8) eerst omgebouwd worden (Tang, 2012). Het systeem werd omgebouwd door J.Pleijte, die het oorspronkelijke systeem ook heeft gebouwd.

Figuur 8 Foto van de vorige proefopstelling waarbij alle leidingen nog gekoppeld zijn en gevoed worden door één tank.

Het systeem werd zo omgebouwd dat er twee gesloten systemen ontstonden: twee leidingen zonder ultrageluid en twee leidingen waaraan ultrasone sondes bevestigd waren. Hierdoor waren de leidingen met het ultrageluid gescheiden van de buizen zonder ultrageluid, zoals tijdens de voorgaande experimenten wel het geval was. Op deze manier werd er voor gezorgd dat de bacteriën van de twee verschillende behandelingen niet meer gemengd werden. Voor het experiment werd grondwater T.A.D. Steenbakker 11

gebruikt dat afgetapt kon worden in het Sealab (appendix 4). Een schematische weergave van de nieuwe opstelling wordt weergegeven in Figuur 9 en Figuur 10 toont een foto van de opstelling. Alle leidingen werden tijdens het experiment lichtdicht afgedekt zodat de groei van algen in het systeem werd tegengehouden, en waardoor er een bacteriële aangroei gestimuleerd zou worden. Ook was het systeem niet luchtdicht of steriel, waardoor er automatisch bacteriën in het systeem zouden gaan groeien. Om de bacteriën optimaal te kunnen laten groeien werden er verschillende voedingsstoffen (appendix 7)aan het water in de tanks toegevoegd volgens het protocol van J.Rijstenbil, AE3 consultancy. Het protocol voor de toevoeging van de juiste hoeveelheid voedingsstoffen is te vinden in appendix 7.

Figuur 9 Schematische weergave van de nieuwe proefopstelling, bestaande uit twee aparte systemen. Eén systeem bevat ultrasone sondes, het andere systeem niet. Elk systeem wordt gevoed door een tank. In deze tanks bevinden zich ook de pompen. Het medium zal toegebracht worden in de tanks door middel van een doseerpomp. De leidingen worden tijdens het experiment afgedekt, ook het gedeelte waar de stromingsmeters zich bevinden. Elke leiding kan onderling afgekoppeld worden door middel van een kraan.

Figuur 10 Foto van de opstelling van het experiment.


De aangroei van de biofilm werd gemonitord door middel van het meten van de lichtdoorlaatbaarheid van de leidingen. De lichtintensiteit zal afnemen naarmate de biofilm dikker wordt, op deze manier kon de groei ervan gemonitord worden. Dit werd gedaan door: -

-

Eerst de lichttransmissie te meten van helder kraanwater in een schone, afgedekte ‘dummy’‐ leiding. Deze waarde gaf de maximale waarde aan die gemeten kon worden. Daarna de lichttransmissie te meten van de vloeistof in de tanks door vloeistof vanuit de tanks in een schone, afgedekte ‘dummy’‐leiding (Figuur 11) te brengen en hierdoor de transmissie te meten. Deze meting werd twee keer gedaan. Daarna de lichttransmissie te meten door de test‐leidingen (Figuur 12). Deze meting werd twee keer gedaan. Wanneer de transmissie van de test leidingen afgehaald werd van de transmissie door de dummy leiding kon zo de lichtabsorptie door de biofilm berekend worden.

Figuur 11 Foto’s van de meting van de lichttransmissie door de dummy‐buis (links). Tijdens de meting (rechts) werd de buis volledig afgedekt

Figuur 12 Foto's van de lichttransmissie metingen door de leidingen.


De lichtintensiteit werd gemeten door het gebruik van een intensiteitsmeter (meet in µmol/sec/m2, range 0‐20.000) en door het gebruik van een Power‐LED lamp. De Power‐LED die gebruikt was had een stralingshoek van maar 3°, hierdoor was de verspreiding van het licht in de leidingen minimaal en werd het licht direct op de lichtintensiteitsmeter geschenen. Op drie plaatsen werden gaten in een speciaal daarvoor gemaakte afdekking gemaakt aan beide kanten van de leidingen die werden gebruikt voor de lichtmetingen. Tussen de gaten zat een ruimte van 20 cm (Figuur 13). De metingen vonden om de twee dagen plaats. Tijdens elke meting werden in totaal 12 punten gemeten, drie punten voor elke leiding. Per punt werd de meting twee keer gedaan. De meetpunten kregen de volgende benamingen (Tabel 2): Tabel 2 Benaming van de meetpunten voor iedere buis.

Blanco buis 1 B1,1 B1,2 B1,3

Blanco buis 2 B2,1 B2,2 B2,3

Ultrasoon buis 1 US1,1 US1,2 US1,3

Ultrasoon buis 2 US2,1 US2,2 US2,3

Voor de verwerking van de resultaten werd het gemiddelde genomen van alle punten samen. Dit wil zeggen dat alle metingen van de blanco leidingen werden gemiddeld per datum en alle metingen van de leidingen met ultrasoon werden gemiddeld per datum. Daarnaast werden de metingen ook gemiddeld per punt. Zo bestaat de waarde voor B:1 uit het gemiddelde van de waarden die gemeten zijn bij de punten B1,1 en B2,1 (Figuur 13).

Figuur 13 Weergave van de meetpunten van de leidingen. Er zijn twee Blanco (B) leidingen en twee leidingen met Ultrasoon (US). De punten betreffen het gemiddelde van de twee leidingen. Bijvoorbeeld, de waarde voor B:1 bestaat uit het gemiddelde van punt 1 van de ene blanco buis en punt 1 van de andere blanco buis. Zo ook voor de buizen met ultrasoon.


Voor het verwerken van de resultaten werd de wet van Lambert‐Beer toegepast. Wanneer er een lichtmeting gedaan word door één van de punten dan vind er lichttransmissie plaats door de lamp en lichtabsorptie door de aangroei en de leiding: IUIT = IIN * e‐Kx ‐ ‐

‐ ‐

IIN Is de maximale waarde die gemeten kan worden (Dummy buis met kraanwater). Dit is een vaste waarde: 042(µmol/sec/m2) IUIT Is de waarde die gemeten wordt door de testleidingen en door de dummy buis met vloeistof uit de vaten. Deze waarde is variabel en is afhankelijk van de aangroei en de bacteriën in de vrije waterkolom. K is de lichtuitdovings‐coëfficiënt en is evenredig met de biomassa in/aan de buis. Deze dient berekend te worden. X is het lichtpad, ofwel de diameter van de buizen. Dit is een vaste waarde: 0.049m

De lichtuitdoving die veroorzaakt wordt door de aangroei en de bacteriën in de vrije waterkolom (K(m‐1)) kon berekend worden door: K(m‐1)= ‐( ln(IUIT/IIN)/x) Voor het bepalen van het verschil tussen de lichtuitdoving die veroorzaakt wordt door de biofilm aangroei en bacteriën in de vrije waterkolom kan het volgende gedaan worden: ‐ ‐ ‐

Berekenen van de K van de aangroei en de bacteriën in de vrije waterkolom samen (meting door de leidingen): KT Berekenen van de K van enkel de bacteriën in de vrije waterkolom (meting door de dummy buis): KW De K die evenredig is met de biofilm aangroei is dan: KB=KT ‐KW

Naast de lichttransmissie metingen werden er in de tanks ook whatman‐filters (Glass microfibre filters; Cat.no.1822‐047) geplaatst. Dit werd gedaan door de filters aan een haak met een gewicht te plaatsen op de bodem van de tanks. Hierdoor kon er gekeken worden of er ook een verschil in aangroei van de bacteriën was zonder dat ze direct werden blootgesteld aan ultrageluid, zoals in de leidingen het geval was. Al het benodigde materiaal voor dit experiment is te vinden in appendix 1. De significantie van de resultaten was getest door het uitvoeren van verschillende testen. Tijdens het testen van de significantie is aangenomen dat alle condities hetzelfde waren voor alle vier de leidingen: -

Voor elke datum een (Independent samples) t‐test: om te zien vanaf wanneer de blanco reeks en de reeks met ultrageluid significant gingen verschillen. Voor de complete reeks blanco een (oneway) Anova test: om te kijken of de reeks zelf significant verschilde in de loop der tijd. Voor de complete reeks ultrageluid een (oneway) Anova test: om te kijken of de reeks zelf significant verschilde in de loop der tijd.


3. Resultaten In dit hoofdstuk worden de belangrijkste resultaten die geboekt zijn met de experimenten gepresenteerd. Overige resultaten van de experimenten zijn te vinden in Error! Reference source not found..

3.1 Resultaten experiment N.Salina en ultrageluid 3.1.1 Het eerste experiment Celconcentratie (cellen/ml) x 100000

700 600 500 Aantal cellen Blanco Aantal cellen Ultrageluid

400 300 200 100 0 11‐apr

16‐apr

21‐apr

26‐apr

Datum

Figuur 14 Het aantal algencellen per ml voor beide culturen. De eerste oogst vond plaats op 15‐4‐2013.

In Figuur 14 is te zien dat de celconcentratie van de blanco algencultuur sneller oploopt dan die van de cultuur met ultrageluid. De eerst oogst vond plaats op 15‐4‐2013. Vanaf dat punt is er een duidelijk verschil te zien tussen het verloop van de blanco cultuur en de cultuur met ultrageluid, de blanco cultuur komt dan direct in de log‐fase. Aangezien de blanco algenkweek, na deze oogst en toevoegen van nieuw medium, wel sterk groeit en de algenkweek met ultrageluid niet, kan er gezegd worden dat er op dat moment een effect zichtbaar is van het ultrageluid op de groei van de cultuur. De blanco algenkweek lijkt daarna op de maximale cel‐concentratie te zitten aangezien deze kweek de rest van de tijd rond deze piekwaarde (60‐miljoen cellen per ml) blijft schommelen. De cultuur met ultrageluid komt ook in de log‐fase, maar wat later, pas rond 19‐4‐2013. Wel is de groeisnelheid van de cultuur met ultrageluid iets hoger tijdens de eerste 3 dagen, voor de eerste oogst. Het verschil in groeisnelheid tussen de culturen is te zien in tabel 3. Uiteindelijk komen beide culturen op dezelfde celconcentratie uit, zo rond de 60 miljoen cellen per ml. In Figuur 15 is te zien dat er een kleurverschil was tussen de kweken, dit was voornamelijk in het begin van de kweek. Naarmate de cel concentraties toenamen, was dit verschil minder goed zichtbaar.


Figuur 15 Foto van het kleurverschil tussen beide kweken in het begin. Links is de kweek met ultrageluid, rechts is de blanco kweek.

3.1.2 Het tweede experiment 700

Celconcentratie (cellen/ml) x 100000

600 500 Aantal cellen Blanco Aantal cellen Ultrageluid

400 300 200 100 0 1‐mei

6‐mei

Datum

11‐mei

16‐mei

Figuur 16 Het aantal algencellen per ml voor beide culturen. De eerste oogst vond plaats op 7‐5‐2013.

In Figuur 16 is te zien dat de celconcentratie van de blanco algencultuur sneller oploopt dan die van de cultuur met ultrageluid. De eerste oogst vond plaats op 7‐5‐2013. Beide culturen komen direct in de log‐ fase, maar deze fase is bij de blanco cultuur sterker. De groeisnelheden voor de eerste dagen, voor de eerste oogst, zijn te zien in tabel 3. Aan het einde van het experiment is te zien dat de celconcentratie van de algenkweek met ultrageluid iets lager ligt ten opzichte van de celconcentratie van de blanco algenkweek. Bij het eerst experiment was dit niet zo. Ook ligt aan het eind van het experiment het cel aantal van de blanco algenkweek wat lager ten opzichte van het vorige experiment. De maximale waarde ligt wederom rond de 60 miljoen cellen per ml. In Figuur 17 is te zien dat er een kleurverschil was tussen de kweken, dit was voornamelijk in het begin van de kweek. Naarmate de cel concentraties toenamen, was dit verschil minder goed zichtbaar. Echter was het verschil nog steeds wel te zien aan het einde van het experiment. Voor beide experimenten is aangetoond dat de celconcentraties op bepaalde momenten significant verschilden. De totale reeksen onderling verschillen niet significant (appendix 2). T.A.D. Steenbakker 17

Figuur 17 Foto van het kleurverschil tussen beide kweken in het begin. Links is de kweek met ultrageluid, rechts is de blanco kweek. Tabel 3 De specifieke groeisnelheid voor de eerste dagen van de algenkweken, tot de eerste oogst. Weergegeven voor beide experimenten.

Blanco Ultragluid

Groeisnelheid eerste experiment 0,01093 0,075838

Groeisnelheid tweede experiment 0,48 0,39

3.2 Resultaten experiment bacteriële biofilm en ultrageluid De proefopzet van het experiment is halverwege aangepast. De reden hiervoor is dat tijdens de eerste weken de biofilm aan de leidingen niet goed leek te groeien. Hierdoor was het noodzakelijk enkele aanpassingen te maken aan het experiment om een goede groei te kunnen waarborgen. Hieronder worden de details besproken. De resultaten zullen behandelt worden per fase. De beginfase van het experiment (van 5‐4‐2013 tot 19‐4‐2013): ‐

‐

‐ ‐

Toevoeging van de voedingstoffen gebeurde door het aansluiten van voedingspompen. De praktijk wees echter uit dat de dosering van die voedingspompen onregelmatig was of soms niet overeenkwam met de berekening van de dosering. Er werd per tank 100 liter water gebruikt voor een constante en ononderbroken waterstroom. Op deze manier doseerden de uitstroomslangen het water direct in het water van de tanks, zonder dat het eerst door de lucht getransporteerd werd. Het water werd niet ververst zodat er zo min mogelijk variatie zou zijn in de samenstelling van de bacteriële cultuur. Op deze manier werd er een constant klimaat gewaarborgd. Op de tanks zat geen beluchting om een explosieve groei van vrije‐bacteriën in de tanks te voorkomen.


Naarmate het experiment vorderde bleek dat de aangroei aan de leidingen moeilijk op gang kwam, daarom werden de volgende aanpassingen gemaakt om de aangroei aan de leidingen te stimuleren (van 22‐4‐2013 tot 3‐5‐2013): ‐ ‐

Er werd beluchting aangesloten op de tanks om de groei van bacteriën te stimuleren. Om de wand‐bacteriën in het voordeel te brengen werd daarom het water in de tanks om de twee dagen ververst. Het systeem werd ververst door de tanks leeg te maken. De leidingen bleven hierbij volstaan met water, omdat het leeghalen van de leidingen een negatief effect zou kunnen hebben op de stabiliteit van de biofilmbacteriën. In elke tank werd nu 50L gedaan in plaats van 100L zodat de verblijftijd van het water in de tanks verkort werd en de biofilmbacteriën dus een betere kans kregen om te groeien. De voedingspompen werden afgesloten en de voedingstoffen werden nu handmatig toegevoegd aan het water waarmee ververst werd.

‐ ‐

8 7

Kb (m‐1)

6 5 Blanco Ultrageluid

4 3 2 1 0 1‐apr

6‐apr

11‐apr

16‐apr 21‐apr Datum

26‐apr

1‐mei

6‐mei

Figuur 18 Weergave van het verloop van de lichtuitdovingscoëfficiënt van de blanco aangroei en de aangroei met Ultrageluid. De kleurverloop van de achtergrond geeft de verschillende fasen van het experiment weer. De eerste fase loopt van 5‐4‐2013 tot 19‐4‐2013, de tweede fase loopt van 22‐4‐2013 tot 3‐5‐2013. De onverklaarbare uitschieter op 19‐4 van de blanco is uit het verloop gelaten.

In Figuur 18 Is er een duidelijk verschil zichtbaar tussen de aangroei in de blanco buizen en de aangroei in de buizen met ultrageluid. Vanaf 22 april is er gestart met het verversen van het water uit de tanks. De lichtuitdoving door de aangroei neemt toe in de blanco buizen en blijft constant in de buizen met ultrageluid, wat resulteert in een duidelijk verschil aan het einde van de tweede fase van het experiment. Figuur 19 toont het verloop van de lichtuitdovingscoëfficiënt van de bacteriën in de vrije waterkolom, die gemeten zijn met de Dummy leidingen. Hier is duidelijk te zien dat de bacteriën in de vrije water kolom met ultrageluid sterk toenemen wanneer er niet ververst wordt ten opzichte van de blanco bacteriën. T.A.D. Steenbakker 19

12 10

Kw (m‐1)

8 Blanco Dummy Ultrageluid Dummy

6 4 2 0 1‐apr

6‐apr

11‐apr

16‐apr 21‐apr Datum

26‐apr

1‐mei

6‐mei

Figuur 19 De lichtuitdovingscoëfficient voor de bacteriën in de vrije waterkolom die gemeten zijn in de Dummy leidingen. De kleurverloop van de achtergrond geeft de verschillende fasen van het experiment weer. De eerste fase loopt van 5‐4‐2013 tot 19‐4‐2013, de tweede fase loopt van 22‐4‐2013 tot 3‐5‐2013.

In Figuur 20 is te zien dat er een duidelijk verschil zichtbaar was tussen de aangroei in de blanco leidingen en de aangroei in de leidingen met ultrageluid. Alle waarden voor de lichtuitdovingscoëfficiënt zijn significant verschillend na de eerste meting (appendix 2).

Figuur 20 Verschil in aangroei van biofilm in de stromingsmeters. In de Blanco buis is er een duidelijke aangroei, terwijl de buis met ultrageluid helemaal helder is.


4. Conclusie en discussie 4.1 Algen en ultrageluid Ultrageluid heeft weinig effect op de groei van Nannochloropsis salina. In het begin is er een duidelijk verschil in de groei van de kweken. Tijdens beide experimenten is goed zichtbaar dat de blanco cultuur eerder en/of sterker in de log‐fase komt dan de cultuur met ultrageluid. Waarschijnlijk heeft het ultrageluid voornamelijk een effect op delende cellen, delende cellen zijn gevoeliger voor stressfactoren dan niet‐delende cellen (M.Michels, pers. Comm). De cellen kunnen waarschijnlijk wel delen wanneer ze niet worden blootgesteld aan ultrageluid, dus wanneer ze zich in de cilinders bevinden (M.Michels, pers.Comm). Dit zou het verschil in groeisnelheid verklaren, want het is niet zo dat de cultuur met ultrageluid niet in de log‐fase komt, dit is alleen later of minder sterk. Aan het einde van de experimenten is dan ook goed zichtbaar dat beide culturen eindigen rond ongeveer dezelfde celconcentratie. In het begin van beide experimenten is er een kleurverschil zichtbaar tussen de kweken wat tevens duidt op een verschil in cel aantallen. De algen leken in de blanco leiding wel iets meer te plakken (of neer te dalen) dan in de leiding met ultrageluid. Dit werd ook waargenomen tijdens het voorgaande experiment met Tetraselmis suecica (E.Koper, pers comm). Nannochloropsis salina is echter geen plakkende alg. Tijdens beide experimenten is ervoor gezorgd dat de kweken optimaal konden groeien, er werden regelmatig algen geoogst en er werd regelmatig nieuw groeimedium toegevoegd. Dit kan echter wel de wisselende groeicurven verklaren. Bij het toevoegen van nieuw medium worden de culturen namelijk wat verdund. Wanneer er dan de dag daarna weer een telling plaats vind kan de concentratie lager zijn ten opzichte van de vorige dag, omdat de cultuur nog wat moet doorgroeien. Tijdens beide experimenten is er geen besmetting waargenomen door zoöplankton, welke de groei geremd zouden kunnen hebben. Ook is er vastgesteld dat de pompen geen effect hadden op de algenconcentratie, gezien de maximale waarden van de kweek in erlenmeyers zich tevens rond de 60 miljoen cellen per ml bevinden. Er is geen te citeren wetenschappelijke literatuur met vergelijkbare proeven, want er is in het algemeen nog erg weinig onderzoek gedaan naar de toepassingen van ultrageluid zonder cavitatie. Er is enkel informatie afkomstig vanuit bedrijven die dit type ultrageluid getest hebben als mogelijke toepassing voor de bestrijding van een algengroei (G.Hutchinson, 2008).

4.2 Bacteriële biofilm en ultrageluid Tijdens het experiment zijn er aanpassingen gemaakt om de aangroei te stimuleren, zoals eerder vermeld. Hierdoor valt het experiment onder te verdelen in twee fasen. Tijdens de eerste fase is de aangroei van biofilm in de leidingen met ultrageluid al lager dan in de blanco leidigen. Aan het einde van de tweede fase lijkt de aangroei van de biofilm met ultrageluid toe te nemen ten opzichte van de blanco leidingen. Deze toename van de lichtuitdoving‐ coëfficiënt wordt echter niet veroorzaakt door de aangroei van biofilm maar door de toename van bacteriën in de vrije waterkolom: het water in de tanks die zijn aangesloten op de leidingen met ultrageluid werd troebeler, dit komt waarschijnlijk doordat de bacteriën in de vrije waterkolom alle voedingsstoffen opnemen die in de tanks gedoseerd worden. Het water in de tanks die zijn aangesloten op de blanco leidingen werd echter helderder in plaats van T.A.D. Steenbakker 21

troebeler, de reden hiervoor is niet bekend. Ook hier is te zien dat de hoogte van de lichtuitdoving‐ coëfficiënt voornamelijk bepaald werd door bacteriën in de vrije waterkolom, aangezien deze afnam naarmate het water in de blanco tanks helderder werd. Het effect van de aanpassingen aan het experiment zijn duidelijk zichtbaar. Zodra het regulier verversen van het water in de tanks is gestart, lijkt de biofilm in de blanco leidingen goed te groeien, de lichtuitdovingscoëfficiënt neemt vanaf dat punt alleen maar toe. Tevens bleef het water in de tanks helder (bij elke meting getest met de dummy leiding), waardoor er kan worden aangenomen dat de lichtuitdovingscoëfficiënt vanaf dan bepaald wordt door de aangroei van biofilm in de leidingen. De voedingstoffen worden vanaf dat punt waarschijnlijk opgenomen door de biofilm. In de leidingen met ultrageluid wordt echter geen groei waargenomen, aangezien de lichtuitdovingscoëfficiënt hier laag blijft. Ook in deze tank bleef het water helder met het regulier verversen van water. Het gebruik van ultrageluid om de aangroei van bacteriële biofilm in leidingen te voorkomen is effectief. Naast dat dit duidelijk terugkomt in de resultaten van de lichtmetingen, is dit ook visueel vastgesteld (zie de foto’s in appendix 1). Er is echter wel een aanwijzing dat wanneer ultrageluid toegediend wordt wanneer er al biofilm gegroeid is, het juist de groei stimuleert omdat het de toevoer van voedingstoffen en de afvoer van afvalstoffen vergroot (Pitt, 2003). Daarom is het gebruik van ultrageluid om de aangroei van bacteriële biofilm in leidingen te voorkomen alleen effectief wanneer het preventief en permanent wordt toegediend. Of het ultrageluid de bacteriën afdoodt is niet vastgesteld. Dit is waarschijnlijk niet het geval aangezien tijdens de eerste fase van het experiment de bacteriën in de vrije waterkolom wel toenamen. Als ultrageluid de bacteriën zou afdoden, dan zou dit niet het geval zijn geweest en dan zou het water helder zijn gebleven. Daarom wordt aangenomen dat ultrageluid vooral effect heeft op de plakkende fase van de bacteriën, deze fase wordt verstoord door het ultrageluid waardoor ze zich niet kunnen vasthechten aan de wanden van de leidingen. Dit is ook waargenomen in de tanks. In de tank met ultrageluid was er vrijwel geen biofilm aan de wand waargenomen, terwijl dit in de blanco tank wel het geval was. De uitvoering van het experiment verliep zonder fouten. Tijdens het experiment is ervoor gezorgd dat de biofilm goed kon groeien door middel van het toedienen van voedingstoffen (zie appendix 7) en de latere aanpassingen aan het experiment. Het toedienen van voedingstoffen door het gebruik van voedingspompjes wordt nu echter als onbetrouwbaar gezien. De voedingspompjes zijn meerdere malen getest, uit deze testen bleek dat de capaciteit van de pompjes kan veranderen naarmate ze langer in gebruik zijn. De plastic leidingen worden minder elastisch, waardoor de pompen minder goed werken. Dit is ook de reden voor de omschakeling naar het direct toedienen van de voedingstoffen in de tanks, zonder het gebruik van pompjes. Voor een vervolgend experiment wordt aanbevolen om het experiment op te stellen zoals het is opgesteld in de tweede fase van dit experiment. Er is geen te citeren wetenschappelijke literatuur met vergelijkbare proeven, want er is in het algemeen nog erg weinig onderzoek gedaan naar de toepassingen van ultrageluid zonder cavitatie. Er is enkel informatie afkomstig vanuit bedrijven die dit type ultrageluid getest hebben als mogelijke toepassing voor de voorkoming van aangroei van biofilm (G.Hutchinson, 2008).


5. Aanbevelingen Naar aanleiding van de resultaten die gepresenteerd worden in Hoofdstuk 3 en de Discussies en conclusies die gegeven zijn in Hoofdstuk 4 kunnen nu aanbevelingen gegeven worden. Deze worden gegeven per experiment.

5.1 Aanbevelingen N.salina en ultrageluid Naar aanleiding van dit experiment kan gesteld worden dat het gebruik van laag energetisch ultrageluid weinig tot geen effect heeft op de groei van N.salina. Daarom wordt het afgeraden om ultrageluid met een laag vermogen hiervoor te gebruiken. Enkel in de beginfase van de groei is er een negatief effect zichtbaar op de groei, maar de cultuur groeit uiteindelijk toch door. Aanbevelingen voor vervolgonderzoek omtrent de opstelling en uitvoering van het experiment: ‐

‐ ‐

‐

‐

Het gebruik van een niet plakkende alg, zoals Nannochloropsis salina, is effectief. Gebleken is dat een algensoort als deze geen effect ondervind van de pomp die gebruikt is (met een capaciteit van 5L/min). Met het gebruik van een algensoort als N.salina kan er daarom een overstap gemaakt worden naar een pomp van 10L/min, voor een betere doorstroming door de leidingen. Verder werkt de opstelling van dit experiment prima en deze kan zo behouden worden. De kraantjes voor het aftappen van algen zijn erg handig. Het wordt wel aanbevolen om het experiment nogmaals uit te voeren, om aan te tonen dat het ultrageluid alleen een effect heeft in het begin van de groeifase van de algen. Het is dan wel beter om het experiment in triplo uit te voeren. Omdat het ultrageluid een effect lijkt te hebben op de groeisnelheid en mogelijk alleen op de delende cellen, zou het zinnig zijn om een experiment uit te voeren, waarbij de ultrageluidsonde niet in een aparte buis wordt geplaatst, maar in de kweekcilinder. In die situatie worden de cellen continu blootgesteld aan ultrageluid, wat zou kunnen leiden tot een instorting van de kweek, als blijkt dat delende cellen gevoeliger zijn voor ultrageluid.

5.2 Aanbevelingen bacteriële biofilm en ultrageluid Naar aanleiding van dit experiment kan gesteld worden dat het gebruik van laagvermogen ultrageluid effectief is voor de remming van bacteriële aangroei in leidingen. Daarom wordt aanbevolen ultrageluid preventief toe te passen om leidingen schoon te houden. Aanbevelingen voor vervolgonderzoek omtrent de opstelling en uitvoering van het experiment: ‐

‐

De omgebouwde opstelling zoals die gebruikt is in dit experiment werkt prima, maar de aanpassingen die gemaakt zijn tijdens het experiment dienen wel in acht te worden genomen (zie hoofdstuk 2 en hoofdstuk 4). Het experiment dient nog eens herhaald te worden met de bovengenoemde aanpassingen. Uit dit onderzoek is gebleken dat het gebruik van ultrageluid preventief werkt. Daarom kan tijdens vervolg onderzoek ook gekeken worden of ultrageluid de groei van biofilm remt wanneer


‐

het niet preventief wordt toegepast maar wanneer er al biofilm gegroeid is. Uit onderzoek is gebleken dat het dan juist stimulerend zou werken (Pitt, 2003). Er zijn verschillende mogelijkheden voor een vervolgonderzoek. Wanneer de aangroei nogmaals getest wordt, dan dient er met regelmaat water ververst te worden om de biofilmbacteriën in het voordeel te brengen. Echter, wanneer gewenst is het effect van ultrageluid op bacteriën in de vrije waterkolom te onderzoeken, dan dient het water niet ververst te worden. Bacteriën in de vrije waterkolom worden tijdens het verversen grotendeels verwijdert.


Verklarende woordenlijst ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Cavitatie: Het ontstaan van de bubbels in de vloeistof die gevormd worden door de ultrasone golven. Treedt in water op bij ultrasoon opgewekt met een vermogen hoger dan 0.33 W/cm2. Eukaryoot: Cellen waarin een celkern aanwezig is. Ook de aanwezigheid van andere celorganellen is kenmerkend voor een eukaryote soort . Eutrofiëring : verrijking van nutriënten of voedingsstoffen. Filamenten: De ketenvormige of draadvormige structuur van een algenketen. Prokaryoot: Cellen waarin geen celkern aanwezig is en waarbij het DNA vrij in het cytoplasma van de cel aanwezig is. Vaak ontbreken ook andere celorganellen. Reactieve radicalen: moleculen, ionen of atomen die een vrij elektron hebben waardoor ze uiterst reactief zijn. Resonantie: Wanneer voorwerpen, in dit geval bacteriën of algen, met de toegebrachte ultrasone trillingen gaan meetrillen. Op dit moment vind de trilling weerklank.


Bibliografie 10voorBiologie.nl. (sd). Vacuolen. Opgehaald van 10voorBiologie: http://www.10voorbiologie.nl/index.php?cat=9&id=258&par=262&sub=272 Adewuyi, Y. G. (2001). Sonochemistry: Environmental Science and Engineering Applications. Ind. Eng. Chem. Res., 40, 4681‐4715. Blume, T. (2004). Improved wastewater disinfection by ultrasonic pre‐treatment. Ultrasonics Sonochemistry(11), 333–336. Castro, M. L. (2007). Ultrasound‐assisted preparation of liquid samples. Talanta(72), 321–334. deepblue‐marine.de. (sd). Breeding information Nannochloropsis salina. Opgeroepen op February 2013, van deepblue‐marine.de: http://deepblue‐marine.de/produkte/pflege‐zucht/e_kult_nan4.htm G.Hutchinson. (2008). Sound Water Practices Ultrasonic Technology Controls Algae and Biofilm. Algae Control US. Graham, L. E., & Wilcox, L. W. (2000). Algae. Prentice‐Hall, Inc. kakerlakenparade.de. (sd). Nannochloropsis Salina. Opgeroepen op February 2013, van kakerlakenparade.de: http://www.kakerlakenparade.de/nannochloropsis.html Leighton, T. G. (2007). What is ultrasound? Progress in Biophysics and Molecular Biology(93), 3–83. mpkb.org. (sd). Biofilm bacteria. Opgeroepen op February 2013, van The Marshall Protocol Knowledge Base: http://mpkb.org/home/pathogenesis/microbiota/biofilm Pitt, W. G. (2003). ULTRASOUND INCREASES THE RATE OF BACTERIAL CELL GROWTH. Biotechnol Prog.(19(3)), 1038–1044. Purcell, D. (2009). Control of Algal Growth in Reservoirs with Ultrasound. Cranfield University. Rajasekhar, P. (2012). A review of the use of sonication to control cyanobacterial blooms. water research(46), 4319‐4329. SIA. (sd). Project: Ultrasone desinfectie. Opgeroepen op February 2013, van innovatie‐alliantie: http://www.innovatie‐alliantie.nl/projectenbank/raak‐project/977.html Tang, X. (2012). Prevention of biofouling using ultrasound. Delta Academy. U.S. ARMY CORPS OF ENGINEERS. (2012). Ultrasound. Vader, P. (2012). Use of ultrasound in manipulation of micro‐organisms. Hz University of Applied Sciences. Wu, X. (2011). The effects of ultrasound on cyanobacteria. Harmful algae(10), 738–743. T.A.D. Steenbakker 26

Appendix 1: Overige data N.salina en ultrageluid Tabel 4 Materialen lijst voor het eerste experiment. Er wordt onderscheid gemaakt tussen materialen die benodigd zijn voor de start van de algenkweek en /of materialen die benodigd zijn tijdens het experiment zelf.

Activiteit Start algenkweek Start algenkweek Start algenkweek Start algenkweek Start algenkweek Start algenkweek Start algenkweek Start algenkweek, Experiment Start algenkweek, Experiment Start algenkweek, Experiment Start algenkweek, Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment

Benodigdheden 20ml van Nannochloropsis Salina 5 Erlenmeyers 100 ml 3 Erlenmeyers 1L 3 Erlenmeyers 3L Gaswasfles Steriele pipetten Beluchting (van het Sealab) Kweekmedia (Appendix 1) Whatman luchtfilters Autoclaaf Watten 10 Erlenmeyers 5L 2 cilinders 70L 2 pompen 5L/min 1 luchtpomp, bijbehorende luchtslangen 1 ultrasoon apparaat Slangen Microscoop Bürker‐Türk telraam (Appendix 2)


Biofilm en ultrageluid Tabel 5 Materialenlijst voor het tweede experiment.

Experiment biofilm Omgebouwde opstelling leidingen Afdekkingen voor de leidingen 2 tonnen voor het grondwater 2 pompen Voedingsstoffen (Appendix 3) 2 ultrasone apparaten (al in opstelling bevestigd) 2 voederpompen (enkel in eerste fase) Slangen / buizen Autoclaaf Lichtintensiteitsmeter Power‐LED lamp Afdekkingen voor lichtmetingen Whatman‐filters Haken voor bevestiging Whatman‐filters Gewichtjes voor bevestiging Whatman‐filters 8 7 6

R² = 0.8727

Kb (m)

5 4

Blanco

3

Ultrageluid R² = 0.0058

2 1 0 1‐apr

6‐apr

11‐apr

16‐apr

21‐apr

26‐apr

1‐mei

6‐mei

Datum

Figuur 21 Het verloop van de lichtuitdovingscoëfficiënt voor de aangroei van biofilm met een lineaire lijn.


8 7

Kb(m‐1)

6 5 4

B:1

3

B:2

2

B:3

1 0 1‐apr

6‐apr

11‐apr

16‐apr

21‐apr

26‐apr

1‐mei

6‐mei

Datum

Figuur 22 De lichtuitdoving‐coëfficiënt van de blanco leidingen. Het gemiddelde is weergegeven per punt.

6 5

Kb(m‐1)

4 3

US:1

2

US:2 US:3

1 0 1‐apr ‐1

6‐apr

11‐apr

16‐apr

21‐apr

26‐apr

1‐mei

6‐mei

Datum

Figuur 23 De lichtuitdoving‐coëfficiënt voor de leidingen met ultrageluid. Het gemiddelde is weergegeven per punt.


Gemiddelde aangroei in een week 0.0250 Aangroei (g)

0.0200 0.0150 Blanco

0.0100

Ultrageluid

0.0050 0.0000 1

2

3

Meting

Figuur 24 De gemiddelde aangroei per week van de Whatman‐filters. Er is op drie tijdstippen gemeten gedurende het experiment.

Figuur 25 Het verschil in aangroei in de leidingen. Links de aangroei in een blanco leiding, rechts de leiding met het ultrageluid.


Figuur 26 Het verschil in aangroei tussen een blanco leiding (links) en een leiding met ultrageluid (rechts).

Details stroming leidingen: ‐ ‐ ‐ ‐

Capaciteit pompen is 40L/min Diameter leidingen is 4,9cm De stroomsnelheid is 35,4cm/sec Debiet is 666,7 cm3/sec


Appendix 2: Statistiek N.salina en ultrageluid Met gebruik van invoegtoepassing Merlin. voor Microsoft Excel Independent t‐test complete reeksen Tweede experiment blanco ultrageluid 5720000 5620000 20700000 18100000 39300000 26300000 50800000 35700000 48450000 35200000 57250000 40050000 60150000 45050000 52900000 41200000 49750000 43450000 mean 42780000 32296667 95% CI 13941429 10152494 P 18,01%

Eerste Experiment blanco ultrageluid 19500000 20550000 20150000 25800000 18450000 26800000 57500000 26850000 43350000 32450000 56600000 27550000 61150000 42600000 52600000 51900000 63000000 58750000 mean 43588889 34805556 95% CI 14611945 10154721 P 27,18%

Oneway anova testen complete reeksen Eeste experiment 3‐5‐2013 3‐5‐2013 6‐5‐2013 6‐5‐2013 7‐5‐2013 7‐5‐2013 8‐5‐2013 8‐5‐2013 9‐5‐2013 9‐5‐2013 10‐5‐2013 10‐5‐2013 13‐5‐2013 13‐5‐2013 14‐5‐2013 14‐5‐2013 15‐5‐2013 15‐5‐2013 anova p

Tweede experiment

5610000 5830000 21200000 20200000 40200000 38400000 50200000 51400000 47300000 49600000 54600000 59900000 57200000 63100000 53000000 52800000 47800000 51700000 0,00%

3‐5‐2013 3‐5‐2013 6‐5‐2013 6‐5‐2013 7‐5‐2013 7‐5‐2013 8‐5‐2013 8‐5‐2013 9‐5‐2013 9‐5‐2013 10‐5‐2013 10‐5‐2013 13‐5‐2013 13‐5‐2013 14‐5‐2013 14‐5‐2013 15‐5‐2013 15‐5‐2013 anova p

5460000 5780000 18000000 18200000 25100000 27500000 36100000 35300000 37200000 33200000 41500000 38600000 47000000 43100000 42600000 39800000 45600000 41300000 0,00%


Independent t‐testen per datum Eerste experiment Tweede experiment 3‐5‐2013 3‐5‐2013 6‐5‐2013 6‐5‐2013 7‐5‐2013 7‐5‐2013 8‐5‐2013 8‐5‐2013 9‐5‐2013 9‐5‐2013 10‐5‐2013 10‐5‐2013 13‐5‐2013 13‐5‐2013 14‐5‐2013 14‐5‐2013 15‐5‐2013 15‐5‐2013

5610000 5830000 21200000 20200000 40200000 38400000 50200000 51400000 47300000 49600000 54600000 59900000 57200000 63100000 53000000 52800000 47800000 51700000

5460000 5780000 18000000 18200000 25100000 27500000 36100000 35300000 37200000 33200000 41500000 38600000 47000000 43100000 42600000 39800000 45600000 41300000

P t‐test 65,78% geen verschil 12‐4‐2013 12‐4‐2013 3,64% verschil 15‐4‐2013 15‐4‐2013 1,31% verschil 16‐4‐2013 16‐4‐2013 0,23% verschil 17‐4‐2013 17‐4‐2013 2,90% verschil 18‐4‐2013 18‐4‐2013 2,95% verschil 19‐4‐2013 19‐4‐2013 5,07% geen verschil 22‐4‐2013 22‐4‐2013 1,41% verschil 23‐4‐2013 23‐4‐2013 16,22% geen verschil 24‐4‐2013 24‐4‐2013

19700000 19300000 20300000 20000000 17100000 19800000 54500000 60500000 45400000 41300000 58200000 55000000 55800000 66500000 54800000 50400000 65200000 60800000

19200000 21900000 25200000 26400000 27000000 26600000 28800000 24900000 32000000 32900000 26400000 28700000 40200000 45000000 53500000 50300000 58200000 59300000

P t‐test 52,21% geen verschil 1,18% verschil 2,57% verschil 1,34% verschil 3,51% verschil 0,46% verschil 8,71% geen verschil 82,10% geen verschil 20,18% geen verschil


Biofilm en ultrageluid Met gebruik van SPSS T‐Test 5‐4‐2013 Independent Samples Test t-test for Equality of Means Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference

Interval of the Difference Lower

Equal variances assumed

,130

,51124

,32538

-,16355

Equal variances not assumed

,131

,51124

,32538

-,16593

VAR

Independent Samples Test t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference Upper Equal variances assumed

1,18603


1,18840

VAR

T‐Test 8‐4‐2013 Independent Samples Test t-test for Equality of Means Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

1,53997

,22382

1,07580


,000

1,53997

,22382

1,07353

VAR2


2,00415


2,00642

VAR2



Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,017

,79878

,31072

,15438


,017

,79878

,31072

,15432

VAR3


1,44317


1,44323

VAR3


Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

1,25658

,27483

,68662


,000

1,25658

,27483

,67808

VAR4


1,82654


1,83509

VAR4



Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

1,67736

,26126

1,13554


,000

1,67736

,26126

1,12586

VAR5


2,21918


2,22887

VAR5


Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

3,36079

,24398

2,85480


,000

3,36079

,24398

2,85452

VAR6


3,86678


3,86706

VAR6



Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

-1,91356

,24942

-2,43084


,000

-1,91356

,24942

-2,43085

VAR7


-1,39628


-1,39627

VAR7


Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

1,57296

,31063

,92875


,000

1,57296

,31063

,92685

VAR8


2,21717


2,21908

VAR8



Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

2,34190

,35372

1,60833


,000

2,34190

,35372

1,60274

VAR9


3,07546


3,08105

VAR9


Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

2,96990

,35495

2,23378


,000

2,96990

,35495

2,22998

VAR10


3,70603


3,70983

VAR10



Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

4,04138

,30551

3,40779


,000

4,04138

,30551

3,40673

VAR11


4,67498


4,67604

VAR11


Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

3,34213

,26712

2,78816


,000

3,34213

,26712

2,78650

VAR12


3,89609


3,89775

VAR12



Mean Difference

Std. Error

95% Confidence

Difference



,000

2,85586

,21493

2,41013


,000

2,85586

,21493

2,40959

VAR13


3,30160


3,30214

VAR13

Oneway Anova: Reeks blanco

Test of Homogeneity of Variances KbBlanco Levene Statistic ,790

df1

df2 12

Sig. 143

,660

ANOVA KbBlanco Sum of Squares Between Groups Within Groups Total

df

Mean Square

256,167

12

21,347

75,738

143

,530

331,905

155

F 40,305

Sig. ,000


Means Plots

Oneway Anova: Reeks ultrageluid Test of Homogeneity of Variances KbUS Levene Statistic 1,840

df1

df2 12

Sig. 143

,047

ANOVA KbUS Sum of Squares

df

Mean Square

Between Groups

62,964

12

5,247

Within Groups

66,363

143

,464

129,326

155

Total

F 11,306

Sig. ,000


Means Plots


Appendix 3: Specificaties ultrasoon sondes Specificaties ultasoon sonde met toebehoren , geleverd door Van Antwerpen Milieu Techniek B.V. De ultrasoon sonde met toebehoren kent 4 verschillende jumperinstellingen met een verschil in ingangsvermogen / aansluitwaarde. Voor deze experimenten zijn de sondes ingesteld op de tweede stand: J1; 17 Watt J2; 30 Watt J3; 31 Watt J4; 30 Watt Voltage 220 V, Frequentiebereik: 35‐52 kHz, Tijdscontinue signaal. T.A.D. Steenbakker 43

Appendix 4: Grondwater Locatie Datum bemonstering Laboratorium Diepte (m) Saliniteit (g/l) pH Hardheid (oD) mg/l Bicarbonaat(HCO3) Chloride(Cl) Ammonium(NH4) Nitraat(NO3) Nitriet(NO2) N‐totaal Ortho‐fosfaat(PO4) P‐totaal Sulfaat(SO4) Kalium(K) Magnesium(Mg) Calcium(Ca) Natrium(Na) Aluminium(Al) Borium(B) Ijzer(Fe) Koper(Cu) Mangaan(Mn) Molybdeen(Mo) Silicium(Si) Zink(Zn) Verhoudingen Na:K Mg:Ca N:P Ervaringen Algen Schelpdieren Wormen Vis Kreeftachtigen Toelichting ++

SEA‐Lab Vlissingen jul‐09 Aqualab Zuid 28,8 29,7 7,03

442 16500 11 <10,0 <0,010 0,65 2060 310 1000 460 8900 0,38 17 0,003 0,28 0,02 28,7 2,2 16,7 ++ ++ ++ ++ Geen problemen met kweek en opkweek van organismen zolang het water goed ontijzerd is, het water wordt ook gebruk voor de HZ vis aquaria Groeisnelheid vergelijkbaar met zeewater


Appendix 5: Kweek van algen Kweek van algen In het begin van de algenkweek zullen de algen opgekweekt worden in erlenmeyers van 500 ml. Daarna in erlenmeyers van een liter en vervolgens in erlenmeyers van 5 liter. Wanneer er uiteindelijk voldoende alg beschikbaar is, dan zal de overstap gemaakt worden naar de kweek in cilinders met een volume van 40 liter. Dit volume wordt gesteriliseerd met behulp van de autoclaaf, als ook de kleine volumes in het begin van de algenkweek. Figuur 28 toont de eerste fase van de algenkweek. De algen worden belucht. Om besmetting (van bijvoorbeeld zoöplankton) te voorkomen word er een luchtfilter tussen de luchtslangen geplaatst. Er wordt ook een gaswasfles gevuld met water tussen de luchtslangen geplaatst om verdamping in de erlenmeyers te voorkomen.

Figuur 27 Opstelling voor de eerste fase van de algenkweek.

Voor het kweken van Nannochloropsis Salina worden grondwater en Walne oplossingen gebruikt. Hierin zitten alle benodigde nutriënten, elementen en vitaminen die de algen nodig hebben om goed te kunnen groeien. Voor een succesvolle algenkweek dienen er een aantal stappen ondernomen te worden: 1. Maken en van het kweek medium. 2. Autoclaaf, steriliseren van volumes en benodigde materialen. 3. Enten van de algen. T.A.D. Steenbakker 45

1.

Maken kweekmedium

Het kweekmedium bestaat uit geautoclaveerd grondwater met de bijbehorende Walne oplossingen: Het zoutwatermedium beter bekend als Walne medium (Laing, 1991) bestaat uit vooraf gemaakte standaardoplossingen. In dit geval oplossingen A en C. Voor het maken van standaardoplossing A (1liter) moet de oplossing verhit worden tot 100 graden celcius. Voor standaardoplossing C (200ml) is het zwenken van de oplossing voldoende. Voor het maken van standaardoplossing C dient er nog een tweede standaardoplossing, oplossing E gemaakt te worden. De samenstelling en toevoeging van de oplossingen wordt in tabel 1 t/m 3 weergegeven. Voor het toevoegen van de oplossingen aan het grondwater gaat men als volgt te werk:   

De erlenmeyer vullen met grondwater uit het Sealab. De standaardoplossing A (1,0ml/l) toevoegen aan het grondwater met een pipet. Dit gebeurt voor het autoclaveren. De standaardoplossing C (0,1ml/l) toevoegen aan het grondwater na het autoclaveren.

Tabel 1. De stoffen en concentraties voor oplossing A Oplossing

Locatie in opslag Concentratie Stof

A

1,33 g/l FeCl3, 6H2O

D39B

0,4 g/l MnCl2, 4H2O

C12

33,6 g/l H3BO3

A71

45,0 g/l EDTA

D16

20,0 g/l NaH2PO4, 2H2O

C70

100,0 g/l NaNO3

L020 Ox3‐8a

1,0 ml Solution B

Van deze oplossing 1 ml toevoegen aan grondwater doe dit voor het autoclaveren. T.A.D. Steenbakker 46

Tabel 2. De stoffen en concentraties voor oplossing C Oplossing

Concentratie Stof

Locatie in opslag

C

0,2 g/200ml Vitamine B1

L018 koelkast 7 ‐3D

25,0 ml Solution E

Van deze oplossing 0,1ml/l toevoegen aan geautoclaveerd grondwater Tabel 3. De stof en concentratie voor oplossing E Oplossing E

Concentratie Stof

Locatie in opslag

0,1 g/250ml Vitamine B12

L018 koelkast 1 – A3C

Van deze oplossing 25 ml toevoegen aan oplossing C 2.

Autoclaaf

Voordat aan het kweekmedium de algen toegevoegd kunnen worden moet al het glaswerk en het kweekmedium geautoclaveerd worden. Dit wordt gedaan met behulp van een autoclaaf. 2.1 Voorbereiding Benodigdheden zout water:     

Aluminiumfolie Watten Erlenmeyer Walne medium A Pasteurpipet

Protocol Zout water: 1. 2. 3.

Voeg 1,0 ml/l Walne medium A toe aan de erlenmeyer. Doe dit met een pasteurpipet. Maak van een pluk watten een stop en doe deze in de erlenmeyer. Doe over de buitenkant van de watten aluminiumfolie.

2.2 Autoclaveren Benodigdheden:  

Autoclaaf Erlenmeyers of reageerbuizen zoals beschreven in 2.1 voorbereiding


Protocol: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

Doe de kleine volumes in de kleine mand en de grote volumes in de grote mand. Let op dat de kleine volumes niet boven de mand uit komen. Let op dat alle volumes stevig en stabiel staan en niet kunnen bewegen. Dit doe je door aluminium bakjes/schotjes tussen de volumes te plaatsen Controleer of het waterniveau in de autoclaaf 1 cm voorbij de bodem met gaten staat. Vul dit anders aan met gedestilleerd water. Zorg dat de hendel beneden de autoclaaf altijd dicht staat. Plaats eerst de kleine mand in de autoclaaf en vervolgens de grote mand. Doe de klep dicht Doe hendel B en D omhoog en zet hendel D in de daarvoor bestemde uitsparing op de deksel Doe hendel B naar beneden met je rug naar de autoclaaf Draai daarna hendel C een kwart slag voor hendel B Draai de zwarte schroef A op de autoclaaf een open totdat je het water ziet stromen. Draai dan de zwarte schroef A een halve slag terug. Draai vervolgens de zwarte knop G op de kast tot aan I. Controleer of er bij E een temperatuur ingesteld staat van 121 graden Draai dan de timer schakelaar F op 20 minuten. Druk dan de groene knop H in. Het duurt ongeveer 2 uur tot de autoclaaf klaar is Als de autoclaaf klaar is wacht dan tot de tempratuur gedaald is tot 60°C. Ga met je rug naar de autoclaaf staan. Pas op!, bij het openen komt hete stoom vrij. Draag daarom een labjas Maak nu de hendel C open Doe daarna hendel B omhoog en haal hendel D uit de uitsparing Doe hendel B en D omlaag Draai zwarte schroef A dicht Haal de manden nu uit de autoclaaf. Doe dit met de hittebestendig handschoenen aan want dit is heet. Laat de erlenmeyers afkoelen.

3. Enten Algen In dit hoofdstuk staat beschreven hoe je de algen moet over enten en hoe je een nieuwe cultuur opstart. Voordat je hieraan kan beginnen moet je de volumes waarin je de algen gaat over enten autoclaveren. Doe dit zoals het beschreven staat in hoofdstuk 2 Autoclaaf. T.A.D. Steenbakker 48

3.1 Voorbereiding Zoutwater Benodigdheden Zoutwater:     

Afgekoelde geautoclaveerde volumes met Walne oplossing A. Walne medium C. Brander. Steriele pipet. Pipetteerballon.

Protocol Zoutwater: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Zet de brander aan. Zuig 0,1ml/l Walne medium C op met een steriel pipet. Haal de watten uit de erlenmeyer en houd deze vast. Haal de hals van de erlenmeyer door de brander. Voeg het Walne medium C toe. Haal de hals van het volume door de brander en doe onmiddellijk de watten weer op de fles. Doe de brander uit. Zwenk de fles rustig om alles goed te laten mengen. Deze hoeft niet geautoclaveerd te worden omdat dit vitamines zijn en hier leeft niets in.

3.2 Algen enten Benodigdheden:      

Voorbereide erlenmeyers (3.1) Steriele pipetten Pipetteer ballon Brander Nannochloropsis Salina. Dettol.

Protocol: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Zorg dat het oppervlak waar je op werkt schoon is en gedesinfecteerd is met dettol. Zorg dat je alle benodigdheden binnen handbereik hebt. Zet de brander aan. Zorg dat de vlam blauw en ruisend is. Open de voorbereide erlenmeyer. Houd de pluk watten en aluminiumfolie of dop vast of leg deze op een ondergrond waarvan je zeker weet dat deze zo steriel mogelijk is. Haal de hals door de brander. Open de buis of erlenmeyer met algen en haal de hals door de brander. Maak de steriele pipet open. Zuig voldoende algen suspensie op uit erlenmeyer of buis zodat je een 1 op 10 verdunning kan maken in je nieuwe erlenmeyer. Haal de hals van de erlenmeyer of buis waar de algensuspensie uit komt door de brander. doe de watten en aluminiumfolie of dop weer op buis of erlenmeyer. Open een reageerbuis of erlenmeyer die je eerder voorbereid hebt en haal de bovenkant door de brander. Doe de opgezogen algensuspensie in de buis of erlenmeyer. Doe de dop of watten en aluminiumfolie weer op de erlenmeyer.


Appendix 6: Bürker‐Türk handleiding Bürker‐Türk handleiding, tellen algen.

Figuur 28, Bürker‐Türk schematisch

Figuur 29, De zwarte cellen worden wel geteld en de witte cellen niet


Stappen: -

Maak de telkamer schoon met aceton en een zachte doek en plaats het dekglaasje in het midden. Druk (draai) de klemmen aan totdat Newton ringen (olievlekkringen) zichtbaar zijn. Zorg dat het monster met de algencellen gehomogeniseerd is (goed schudden). Haal wat water met algencellen uit het te tellen monster. Hou de pipet loodrecht op de Bürker‐Türk tegen de rand van het dekglaasje aan en vul de telkamers. Zorg dat het water alleen in de telkamers komt en niet in de gootjes er naast. Tel de cellen bij een vergroting van 400x. Tel de cellen in 25 grote vakken. Tel de cellen zoals aangegeven in figuur 20. De cellen op de linker en boven rand worden wel meegeteld, de cellen op de rechter en onder rand niet. Doe het getelde aantal maal 10.000, dit geeft het aantal cellen per ml. Wanneer de algen lastig te tellen zijn door grote hoeveelheden, dan kunnen de algen eerst 10x verdund worden met grondwater. Daarna kunnen er 25 vakken geteld worden. Dit aantal wordt dan vermenigvuldigd met 100.000 voor de exacte algenconcentratie per ml.


Appendix 7: voedingsstoffen biofilm Het medium voor de groei van biofilm Het groeimedium dat gebruikt wordt voor de kweek van biofilm tijdens de eerste fase zal als volgt gemaakt worden: Er worden drie stockoplossingen gemaakt die geautoclaveerd worden. De stockoplossingen worden niet gemengd, ze worden ieder apart bewaard: 1. 10 gram/L glucose + 1 gram/L gistextract; 2. 20 gram/L pepton 3. 0,87 gram/L Na2HPO4.2H2O

De bovenstaande oplossingen zijn opgesteld met behulp van een rekenmodel dat J.Rijstenbil gemaakt heeft. Het groeimedium wordt gemaakt door de stockoplossing 1:10000 te verdunnen met het grondwater. Oftewel wordt er per 10L grondwater, 1ml van elke stockoplossing toegevoegd. Wanneer dit niet voldoende blijkt te zijn voor een goede groei van de biofilm kan de concentratie van de stockoplossingen in het groeimedium verhoogd worden. De dosering zal dan 0,03ml/h per stockoplossing zijn, hiervoor worden voederpompen gebruikt. Tabel 1 toont de berekening van de benodigde hoeveelheden van elke stockoplossing. Tabel 1 Weergave van de berekening van de benodigde hoeveelheden per stockoplossing. Wanneer de dosis verhoogd moet worden, dan kan dit eenvoudig berekend worden met behulp van het bijbehorende Excel‐ model.

Volume (L) tanks

50

Dosering tank 1

0,03

ml/l/h

1,5 ml/h

Dosering tank 2 Totaal per dag Doseringen ml per week tank 1 Doseringen ml per week tank 2 2 tanks totaal per week

0,03

ml/l/h

1,5 ml/h

72 ml/dag

ml/dag 36 /tank ml/dag 36 /tank

na 1 week

na 2 252 weken

na 3 504 weken

na 4 na 5 756 weken 1008 weken 1260

na 1 week

na 2 252 weken

na 3 504 weken

na 4 na 5 756 weken 1008 weken 1260

504

1008

1512

2016

2520


Tijdens de tweede fase van het experiment zullen de stoffen direct aan de vaten toegevoegd worden zonder ze eerst op te lossen en te autoclaveren: 1,575579 gram glucose in grondwater per vat per keer verversen 3,151158 gram pepton in grondwater per vat per keer verversen 0,015756 gram gistextract in grondwater per vat per keer verversen 0,13716 gram natriumfosfaat in vat per keer verversen Deze waarden zijn wederom berekend met behulp van het rekenmodel dat is opgesteld door J.Rijstenbil. De waarden zijn opgesteld aan de hand van biomassa toename per dag per m2. Dit is afgeleid van de toename aan gewicht van de Whatman filters en bedraagt 2,5g/m2. T.A.D. Steenbakker 53

Inhoudsopgave CD‐rom -

Mapje met alle resultaten (Excel, SPSS, invoegtoepassing Merlin. Voor Microsoft Excel: Eerst het bestand Merlin.xlam openen, daarna Excel bestand.) Rapport definitief PVA Project planning Portfolio compleet Twee Memo’s van belangrijke besprekingen. HBO kb toestemmingsformulier.


Onderzoek naar het effect van ultrageluid op de groei van algen en biofilm

Recommend Documents