Olomouc Pavlína GINTEROVÁ Zdenka BARTOŠOVÁ Vítězslav MAIER Petr BEDNÁŘ VÝUKOVÁ SKRIPTA CVIČENÍ Z APLIKOVANÉ ANALYTICKÉ CHEMIE

Olomouc 2012

Pavlína GINTEROVÁ Zdenka BARTOŠOVÁ Vítězslav MAIER Petr BEDNÁŘ

VÝUKOVÁ SKRIPTA CVIČENÍ Z APLIKOVANÉ ANALYTICKÉ CHEMIE

Předmluva Předkládaný výukový materiál je určen především studentům navštěvujícím předmět ACH/APCHC Cvičení z aplikované analytické chemie, který je vyučován na Katedře analytické chemie, Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. Výukový materiál obsahuje celkem 11 návodů k laboratorním úlohám týkajících se analýzy reálných vzorků pocházejících z různých oblastí, kterými jsou například potravinářství, metalurgie a životní prostředí. Každý návod obsahuje teoretickou část sloužící k základnímu pochopení problematiky a část praktickou, která je potřebná pro samotné vykonání úkolu, spolu s otázkami sloužícími k prozkoušení studentů před laboratorním cvičením a doporučenou literaturu. Výukový materiál vznikl za finanční podpory Fondu rozvoje vysokých škol v rámci řešení projektu č. 2118/2012 „Tvorba výukových skript sloužících k inovaci předmětu Cvičení z aplikované analytické chemie“.

OBSAH STANOVENÍ KONZERVAČNÍCH LÁTEK V NÁPOJÍCH POMOCÍ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE ................... 3 STANOVENÍ KONZERVAČNÍCH LÁTEK POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY ................................................. 6 IDENTIFIKACE NEZNÁMÉHO POLYMERU........................................................................................................... 10 ZÁKLADNÍ ROZBOR VÁPENCE ............................................................................................................................ 18 URČENÍ ZÁKLADNÍCH PARAMETRŮ PŮDY ........................................................................................................ 25 STANOVENÍ MĚDI A NIKLU V OCELI ................................................................................................................... 39 STANOVENÍ KADMIA V MÁKU ............................................................................................................................ 42 FOTOMETRICKÉ STANOVENÍ MANGANU V NEŽELEZNÉ SLITINĚ ..................................................................... 44 STANOVENÍ TRIAZINOVÝCH PESTICIDŮ V PŮDĚ POMOCÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE............................. 47 ANALÝZA MASTNÝCH KYSELIN V PŘÍRODNÍCH TUCÍCH ................................................................................. 51 STANOVENÍ LAKTALBUMINU V MLÉCE POMOCÍ GELOVÉ ELEKTROFORÉZY .................................................. 55

Stanovení konzervačních látek v nápojích pomocí kapalinové chromatografie Teoretická část Konzervační látky jsou významnými potravinovými aditivy, jejichž úkolem je prodloužit trvanlivost potravin tím, že je chrání před znehodnocením bakteriálního a plísňového původu. Používání příliš vysokého množství aditiv s sebou nese jistá rizika: u některých citlivých jedinců se mohou projevit nepříznivé vedlejší účinky, např. alergie nebo dermatitidy. Proto je třeba kontrolovat, zda jejich obsah nepřesahuje nejvyšší povolené množství (NPM), které je u většiny přídatných látek dáno legislativou. Pro některé přídatné látky není konkrétní hodnota NPM stanovena, v takových případech se při výrobě potravin použití aditiv omezuje na nezbytně nutné množství. Mezi běžně používané konzervanty patří kyselina benzoová a sorbová, popř. jejich soli. Kyselina benzoová (E210) a některé benzoáty se používají jako antimykotické činidlo. Aktivní formou je nedisociovaná kyselina, která je přibližně stokrát účinnějsí než anion. Většina kvasinek a plísní je inhibována nedisociovanou kyselinou o koncentraci 500 – 1000 mg/kg . Kyselina sorbová (E200) a její soli (E201-203) jsou účinnými inhibitory řady plísní, kvasinek a některých bakterií. Aktivní formou je nedisociovaná kyselina, která je zhruba 10 – 600 krát účinnější než anion. Používá se podle druhu potraviny v množství 200 – 2000 mg/kg. NPM kyseliny benzoové pro ochucené nealkoholické nápoje a nápojové koncentráty pro přípravu těchto nápojů (po naředění podle návodu výrobce) je 150 mg/l, NPM kyseliny sorbové je 300 mg/l. Používá-li výrobce ke konzervaci kombinaci obou kyselin, pak NPM pro kyselinu benzoovou je 150 mg/l a pro kyselinu sorbovou 250 mg/l. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se stala pro tato stanovení rutinní analytickou metodou. HPLC je separační analytická metoda, využívající rozdílné distribuce složek analytu mezi stacionární a mobilní fázi (v HPLC je mobilní fáze kapalina). Vzorek je dávkován do proudu mobilní fáze, v koloně je separován na jednotlivé složky, které vstupují do detektoru (nejčastěji spektrofotometrického v ultrafialové a viditelné oblasti spektra). Záznam z detektoru (tzv. chromatogram) umožní vyhodnocení analýzy. Nejčastěji se dnes pracuje v systému obrácených (reverzních) fází, kde chemicky vázané alkylové řetězce (nejčastěji C18H37) na silikagelu slouží jako stacionární fáze (nepolární) a voda s přídavkem organických rozpouštědel (methanol, acetonitril atd.) jako fáze mobilní (polární). Níže prezentovaná metoda je použitelná pro kyseliny sorbovou, benzoovou a jejich sodné, draselné a vápenaté soli a dále pro estery a soli kyseliny p-hydroxybenzoové. Praktická část 1. Úkol Stanovit obsah konzervačních látek v předloženém nápoji pomocí HPLC. 2. Pomůcky a přístroje • HPLC chromatograf sestávající z pumpy, dávkovacího ventilu (dávkovací smyčka 20 µl) a UV detektoru s proměnnou vlnovou délkou; vyhodnocovací zařízení – počítač; analytická kolona Spherisorb-5-ODS 4,6×250 mm, zrnění sorbentu 5 µm s předkolonkou 4,6×50 mm, ultrazvuková lázeň, analytické váhy

3

• odměrné baňky, lodičky, injekční mikrostříkačka Hamilton (100 µl), odměrné válce, skleněné pipety, pipetovací balónek, pomůcky potřebné k sestavení filtrační aparatury, skládaný filtr se střední velikostí pórů, mikrofiltr s membránou o porozitě 0,45 µm, injekční stříkačka, rukavice, ochranné brýle 3. Chemikálie • deionizovaná, resp. redestilovaná voda, methanol (pro HPLC), roztok podle Carreze I: 150 g/l K4Fe(CN)6 . 3H2O, roztok podle Carreze II: 300 g/l ZnSO4 . 7H2O, zásobní roztok acetátového pufru (0,2 M CH3COONa . 3H2O; 0,2 M CH3COOH), pracovní roztok acetátového pufru (10 × ředěný zásobní pufr deionizovanou vodou), mobilní fáze – methanol/pracovní roztok pufru (30/70; v/v), kyselina sorbová (p.a.), kyselina benzoová (p.a.), vzorek nápoje. 4. Pracovní postup • Příprava vzorku o do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 20 ml předem odplyněného (ultrazvuková lázeň) vzorku a přidá se cca 60 ml extrakční směsi (MeOH/H2O, 30/70, v/v) o odměrná baňka se ponechá 10 minut v ultrazvukové lázni při teplotě 70°C o obsah odměrné baňky se vyčeří přidáním 1 ml roztoku podle Carreze I, po promíchání se přidá roztok podle Carreze II a po opětovném promíchání a ochlazení směsi na laboratorní teplotu se baňka doplní extrakční směsí po rysku (u čirých roztoků lze tuto operaci vynechat) o následně se obsah odm. baňky přefiltruje přes skládaný filtr, přičemž první podíl filtrátu (cca 20 ml) se vylije o několik mililitrů filtrátu se dále přefiltruje přes membránový mikrofiltr a podrobí chromatografické analýze • Příprava standardních roztoků kyseliny benzoové a sorbové o konc. 100 mg/l o standardní roztoky se připraví rozpuštěním navážky standardu v extrakční směsi o do odm. baňky (100 ml) se převede 10 mg standardu kyseliny benzoové, po rozpuštění navážky se baňka doplní extrakční směsí po rysku o stejným způsobem se připraví standardní roztok kyseliny sorbové o připravené standardní roztoky se použijí k přípravě sady směsných kalibračních roztoků v rozsahu koncentrací 10 – 100 mg/l (dle vlastního uvážení) • HPLC analýza o HPLC systém se promyje mobilní fází a pro analýzu se zvolí vhodná průtoková rychlost (± 1ml/min) o nastaví se vlnová délka, při které bude UV detektor zaznamenávat absorbanci eluátu (235 nm pro stanovení kyseliny benzoové a sorbové, 260 nm pro stanovení p-hydroxybenzoanů) o vzorky se do chromatografického systému dávkují pomocí mikrostříkačky Hamilton – dávkovací smyčka se přeplňuje 100 μl vzorku o provede se analýza všech kalibračních roztoků a vzorků (nástřik každého roztoku se opakuje 3×)

4

5. Vyhodnocení Identifikace stanovovaných látek se provádí porovnáváním retenčních časů, resp. přídavkem standardů ke vzorku. Kvantifikace se provádí metodou vnějšího standardu s využitím kalibrační křivky. Výsledky se porovnají s hodnotami deklarovanými výrobcem nebo hodnotami NPM, které jsou dány legislativou ČR. 6. Otázky • Uveďte a vysvětlete alespoň tři metody kvantifikace analytu. • Jakou úlohu plní v systému HPLC předkolona? 7. Literatura • • • • •

Vyhláška ministerstva zdravotnictví č. 4/2008 Sb., kterou se stanoví druhy a podmínky použití přídatných látek a extrakčních rozpouštědel při výrobě potravin. Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin 2. Tábor: Ossis, 2009. Davídek J. a kol.: Laboratorní příručka analýzy potravin. Praha: SNTL, 1977. Churáček J. a kol.: Analytická separace látek. Praha: SNTL, 1990. Churáček J., Jandera P.: Úvod do vysokoúčinné kapalinové kolonové chromatografie. Praha: SNTL, 1984.

5

Stanovení konzervačních látek pomocí kapilární elektroforézy TEORETICKÁ ČÁST Konzervační látky Konzervační látky jsou významnými potravinovými aditivy prodlužujícími trvanlivost potravin (zamezují v potravinách růst mikroorganismů). Příliš vysoké množství konzervačních látek v potravinách však může konzumentům způsobovat negativní vedlejší účinky. Z tohoto důvodu je potřeba kontrolovat, zda obsah těchto konzervačních látek není vyšší než nejvyšší povolené množství (NPM). Kyselina benzoová a sorbová patří spolu s jejich solemi mezi nejúčinnější konzervační látky. Kyselina sorbová se v potravinářství používá zejména v nápojích a sýrech, a to k zabránění rozvoje plísní, kvasinek a bakterií. Dále může být použita např. v pekařských výrobcích, margarínech, kečupech a salátech. Kyselina benzoová se v potravinářství používá např. v čokoládách, citronech, pomerančích, ovocných nápojích, sýrech, nízkotučných džemech a zmrzlinách.

Kapilární elektroforéza Stanovení konzervačních látek je možno provést pomocí kapilární elektroforézy (CE). Princip CE je založen na elektroforetické migraci iontů v elektrickém poli. Tato metoda je tedy použitelná pro analyty schopné nést náboj v důsledku jejich disociace či protonizace. Separace je uskutečněna v kapiláře – nejčastěji v křemenné. Vnitřní průměr kapiláry se pohybuje od 10 do 100 μm a její délka je v rozmezí od 30 do 100 cm. Separace analytů probíhá vložením vysokého napětí, které je používáno v rozmezí od 0 do 30 kV. Rozseparované analyty jsou poté sledovány pomocí detektoru (nejčastěji spektrofotometrického v ultrafialové a viditelné oblasti spektra), který je umístěn na opačném konci kapiláry, než je dávkován vzorek. Dávkování vzorku se provádí buď elektrokineticky, nebo tlakem (hydrodynamické dávkování). PRAKTICKÁ ČÁST Úkol: Stanovte obsah kyseliny benzoové a sorbové v neznámém vzorku. Naměřené hodnoty slovně okomentujte. Rozhodněte, zda vzorek vyhovuje či nevyhovuje předepsaným normám.

6

Pomůcky a přístroje: kapilární elektroforéza Agilent s detektorem diodového pole (DAD), počítač pro vyhodnocování analýz (software ChemStation), křemenná kapilára (50 µm vnitřní průměr), ultrazvuková lázeň, váhy, pH metr, filtrační aparatura, membránový mikrofiltr, laboratorní mixér, odměrné baňky, kádinka, střička Chemikálie: kyselina boritá, kyselina salicylová, kyselina benzoová, kyselina sorbová, hydroxid sodný, vzorek potravin, kalibrační roztoky k pH metru, destilovaná voda, deionizovaná voda, methanol Pracovní postup: Příprava základního elektrolytu: •

Do odměrné baňky (250 ml) se naváží množství kyseliny borité odpovídající koncentraci 0,05 M

•

Odměrná baňka se doplní deionizovanou vodou po rysku

•

Provede se kalibrace pH metru (podle návodu k přístroji)

•

Pomocí roztoku hydroxidu sodného se upraví pH elektrolytu na hodnotu 9,5

Příprava vzorku: •

V případě potřeby se vzorek zhomogenizuje laboratorním mixérem

•

Do kádinky (50 ml) se naváží 5 – 10 g vzorku s přesností na 0,01 g, přidá se 10 – 20 ml extrakční směsi methanolu a vody (30:70)

•

Kádinka se umístí na cca 10 minut do ultrazvukové lázně

•

Suspenze se vymyje extrakční směsí do odměrné baňky (100 ml) a doplní se základním elektrolytem na objem cca 80 ml

•

Odměrná baňka se umístí na 10 minut do ultrazvukové lázně

•

Následně se přidá 10 ml roztoku kyseliny salicylové (1 mg/ml) sloužící jako interní standard a odměrná baňka se doplní základním elektrolytem po rysku

•

Roztok se filtruje přes skládaný filtr, první podíl filtrátu se vylije

•

Několik mililitrů filtrátu se dále filtruje přes stříkačkový membránový mikrofiltr

•

Získaný filtrát se použije pro stanovení kyseliny sorbové a benzoové ve vzorku

•

Měření vzorku se provádí 3x

Příprava kalibračních roztoků: •

Připraví se základní roztoky kyseliny benzoové a sorbové, a to navážením a rozpuštěním potřebného množství v základním elektrolytu

•

Tyto základní roztoky se použijí pro přípravu sady kalibračních roztoků

•

Do odměrných baněk (10 ml) se připraví sada kalibračních roztoků v koncentračním rozsahu 1 až 50 mg/l (5 koncentračních úrovní) - rozpuštěním v základním elektrolytu

•

Do každého roztoku je potřeba přidat 1 ml roztoku kyseliny salicylové – interního standardu

•

Výsledná koncentrace kyseliny salicylové je tedy 0,1 mg/ml

•

Každý kalibrační roztok se analyzuje 2x

7

Analýza pomocí kapilární elektroforézy: •

Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení přístroje

Experimentální podmínky: Parametr

Podmínky

Separační napětí

+ 25 kV

Vlnová délka

235 nm

Dávkování

Hydrodynamicky 50 mbar/5s

Teplota

25 °C

•

Kalibrační roztoky a vzorek se podrobí analýze pomocí kapilární elektroforézy s DAD detekcí

•

Identifikace stanovovaných analytů se provede pomocí přídavku standardu kyseliny benzoové nebo sorbové do vzorku (tzv. spikování)

•

Provede se integrace píků všech získaných analýz

•

Kvantifikace se provede metodou absolutní kalibrace s využitím kalibrační křivky – do kalibračního grafu se vynáší korigované plochy píků (poměr plochy píku analytu a interního standardu)

•

Vypočte se množství kyseliny benzoové a sorbové v předloženém vzorku

Vyhodnocení: Plocha píku Kalibrační roztok 1 c = __________ Kalibrační roztok 2 c = __________ Kalibrační roztok 3 c = __________ Kalibrační roztok 4 c = __________ Kalibrační roztok 5 c = __________ Vzorek

Plocha píku

Plocha píku

Ø Plocha píku

Korigovaná plocha píku

k. benzoová k. sorbová k. salicylová k. benzoová k. sorbová k. salicylová k. benzoová k. sorbová k. salicylová k. benzoová k. sorbová k. salicylová k. benzoová k. sorbová k. salicylová k. benzoová k. sorbová k. salicylová

8

Rovnice regrese: ________________________________ Vypočtená hodnota kyseliny sorbové ve vzorku: _________________ Vypočtená hodnota kyseliny benzoové ve vzorku: _________________ Slovní vyhodnocení naměřených hodnot vybraných konzervačních látek ve vzorku: …………………………………………………………………………………………………………….………… …………………………………………………………………………………………………………………. Otázky k prozkoušení studentů: 1. Popište princip kapilární elektroforézy. 2. Vyjmenujte módy kapilární elektroforézy. 3. Popište základní rozdíly mezi plošnou a kapilární elektroforézou. 4. Je možno použít kapilární elektroforézu pro stanovení neutrálních látek? 5. Je možno stanovit během jedné elektroforetické analýzy jak kationty, tak anionty? 6. Vysvětlete princip detektoru diodového pole. 7. Vyjmenujte další možné detektory, které se používají ve spojení s kapilární elektroforézou. 8. Z jakého důvodu se do potravin přidávají konzervační látky? 9. Jaké znáte jiné typy přidaných látek (tzv. éček)? 10. Navrhněte další možnou metodu vhodnou pro stanovení kyseliny sorbové a benzoové v potravinách. 11. Z jakého důvodu je používán tzv. interní standard? Doporučená literatura: 1. Kašička V.: Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy 91, 320 – 329, (1997). 2. Landers J.P., Handbook of Capillary Electrophoresis, CRC Press, Boca Raton 1997. 3. Altria K.D., Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation, and Applications, Humana Press Inc., New Jersey 1996. 4. Landers J.P., Handbook of Capillary and Microchip Electrophoresis and Associated Microtechniques, CRC Press, Boca Raton 2008. 5. Davídek J.: Laboratorní příručka analýzy potravin, Praha, 1977. 6. Nielsen S.S.: Food Analysis, Springer, New York, 2010. 7. Ötleş S.: Handbook of food analysis instrument, CRC Press, Boca Raton, 2008. 8. Coultate T. P.: Food: The chemistry of its components, RCS Publishing, London, 2009.

9

Identifikace neznámého polymeru Teoretická část Při analýze makromolekul a v plastikářské technologii se při hodnocení kvality (v chemickém i technologickém smyslu často využívá speciálních zkoušek a testů (hodnocení elasticity, tepelné odolnosti, pevnosti atd.). Výsledky těchto zkoušek jsou užitečným pomocníkem při identifikaci neznámého polymeru nebo materiálu finálního produktu. I ve vlastní chemické analýze hrají pro rychlou orientaci důležitou roli netradiční testy, jako je chování polymeru v plameni, při pyrolýze, rozpustnost apod. Nicméně v analýze polymerů mají zásadní význam instrumentální analytické metody: infračervená (IČ) a Ramanova spektroskopie, nukleární magnetická rezonance, gelová chromatografie, plynová chromatografie pyrolytických produktů s hmotnostně spektrometrickou detekcí a další. K základní identifikaci polymeru se mimo jiných využívá následujících zkoušek: • Orientační zkoušky o V prvé řadě jde o charakterizaci polymeru na základě jeho vzhledu – konzistence, barva, čirost, opacita; lze také odhadnout, zda se jedná o elastomer, plastomer nebo reaktoplast (duromer). o Chování v plameni – vzorek na platinovém očku se umístí těsně nad plamen kahanu (nesvítivý plamen) a sleduje se: změna barvy plamene, vznik sazí (čadivost), hoření vzorku (samozhášivost) a jeho chování po vyjmutí z plamene, následně se posuzují změny ohořelého zbytku. Jde o velmi rychlou zkoušku, ale výsledky významně ovlivňují plniva, změkčovadla, pigmenty a jiné přísady, které mohou polymery obsahovat, proto je nutné analyzovat pouze čisté polymerní vzorky. Charakteristickým ukazatelem pro některé polymery je zápach, který vzniká při jejich hoření a také vzhled ohořelého zbytku. Polymery s jednoduchou strukturou bez dvojných vazeb snadno depolymerují a tají (např. PE), jejich ohořelý zbytek se od původního příliš neliší – je jen otavený a zeskelněný. Polymery s benzenovým jádrem v řetězci produkují při hoření saze, které se mohou na povrchu materiálu usazovat (např. PS). Povrch některých polymerů po depolymeraci v plameni je drsný nebo napěněný unikajícím plynem (např. PMMA). Při hoření polysacharidů vzniká žhnoucí načervenalý popel. • Dalším užitečným klasifikačním ukazatelem je testování rozpustnosti v různých rozpouštědlech. Obecně vykazují makromolekulární látky nízkou rozpustnost. Nicméně se i zde uplatňují dobře známá pravidla: podobné se rozpouští v podobném a rozpustnost daného polymeru klesá s rostoucí molekulovou hmotností. Některé polymery (např. polyvinylalkohol, polymethylenoxid nebo některé deriváty celulosy) jsou rozpustné ve vodě. V chlorovaných uhlovodících jsou rozpustné polymery nepolární povahy (např. ataktický polystyren, polyvinylchlorid, kaučuky, methakryláty, dokonce i některé ethery celulosy). • Fyzikální konstanty – z fyzikálních konstant se u polymerů nejčastěji určuje hustota a teplota tání nebo rozmezí teplot „fázového přechodu“. U nízkotajících vzorků je možné určit index lomu.

10

• Výše zmíněné zkoušky mají spíše orientační charakter a poskytují rámcovou představu o druhu polymeru, další testy umožní blíže specifikovat typ polymeru – jde především o důkazy prvků (elementární analýza) a charakteristické reakce pro důkaz některých funkčních skupin a štěpných produktů (barevné reakce). o Elementární analýza – provádí se zkouška podle Lassaigne, při níž se polymer mineralizuje tavením s kovovým sodíkem. Charakteristické prvky se dokazují ve vodném výluhu taveniny pomocí jednoduchých reakcí. Důležitým krokem je dokonalé protavení polymeru. Po filtraci se dokazuje dusík jako berlínská modř, síra jako Ag2S a halogeny jako AgX po okyselení a vyvaření. o Barevné reakce – provádí se Liebermannova a Wechslerova reakce, reakce s polyjodidem, kyselinou chromotropovou, kyselinou chloroctovou a dichloroctovou. Negativní reakci se všemi uvedenými činidly dává teflon a vysokotlaký polyethylen. Lineární polyethylen, polypropylen, polyisobutylen a polystyren se mohou při adsorpci polyjodidu velmi slabě růžově vybarvit. Polystyren může při Wechslerově reakci poskytnout nažloutlé zbarvení. Typické reakce jsou uvedeny v tabulce 2. Praktická část 1. Úkol Identifikujte neznámý polymer na základě orientačních zkoušek fyzikálních konstant, elementární analýzy, barevných reakcí, pyrolytických produktů a IČ spektrometrie. Předkládané vzorky jsou čisté monopolymery, výjimečně kopolymery a neobsahují žádná plnidla, změkčovadla, vulkanizační přísady apod. 2. Pomůcky a přístroje • mikroskop opatřený topným stolkem, předvážky, třepačka, IČ spektrometr • zkumavky, stojan na zkumavky, kádinky, kahan, platinové očko, kopist, skleněné pipety, pipetovací balónek, porcelánové misky, třecí miska s tloučkem, pomůcky potřebné k sestavení filtrační aparatury, rukavice, ochranné brýle, ochranný štít 3. Chemikálie • vzorek polymeru, destilovaná voda, KBr, CCl4, Na, acentanhydrid, konc. H2SO4, pyridin, polyjodid draselný, 5% methanolický roztok KOH, 72% H2SO4, chromotropová kyselina, chloroctová kyselina, dichloroctová kyselina, dimethylaminobenzaldehyd, acidobazický indikátor 4. Pracovní postup • Orientační zkoušky: o zaznamenají se vnější vlastnosti vzorku – barva, čirost, konzistence o testuje se chování polymeru v plameni – zbarvení plamene, čadivost, samozhášivost a zápach (identifikace zápachu se nejsnáze provádí po vyjmutí vzorku z plamene) o testuje se rozpustnost předloženého vzorku polymeru ve vodě a tetrachlormethanu – malé množství vzorku se třepe po dobu přibližně 2 hod. se 2 ml rozpouštědla, sleduje se, zda se testovaný vzorek rozpouští/nerozpouští nebo bobtná o vykazuje-li vzorek dobrou rozpustnost v CCl4, přefiltruje se a filtrát se použije k pořízení IČ spektra

11

• •

•

Fyzikální konstanty: o pod mikroskopem se určuje teplota tání nebo rozmezí teplot fázového přechodu Elementární analýza o 10 – 20 mg vzorku se mineralizuje kovovým sodíkem – mineralizace se provádí v mikrobaňce se sodíkem nabodnutým na kapiláru, je nutné chránit si obličej ochranným štítem o po protavení se horká mikrobaňka rozpraskne v porcelánové misce s 5 ml vody o po filtraci se dokazuje dusík jako berlínská modř, síra jako Ag2S a halogeny jako AgX o z výsledků elementární analýzy provedené analytickým servisem se určí sumární vzorec Barevné reakce o Liebermannova reakce Je obecná pro steroidy (cholesterol), terpeny (deriváty abietové kyseliny) a tedy i pro přírodní pryskyřice. • přibližně 0,2 g vzorku se za horka rozpustí nebo nabobtná ve 2 ml acetanhydridu • několik kapek roztoku (suspenze) se převede na porcelánovou misku a po stěně se podvrství několik kapek konc. H2SO4 • po 30 minutách se zaznamená výsledné zbarvení o Wechslerova reakce Je obecná pro chlorované deriváty – jedná se o analogii Fujiwarovy reakce na chlorované uhlovodíky. • malé množství rozetřeného vzorku se převrství 1 ml pyridinu a po 3 minutách se ke směsi přidají 2 – 3 kapky 5% roztoku KOH v methanolu • zkouška se opakuje také za horka: vzorek s pyridinem se povaří 1 min a methanolický roztok KOH se přidá k ještě horké směsi o Reakce s kyselinou chromotropovou Je typická pro polymery degradující v kyselém prostředí za vzniku formaldehydu (polyethylenglykol, polyakrylamid, polyvinylalkohol, polyvinylacetát, některé deriváty celulosy a všechny formaldehydové pryskyřice (duromery). • k malému množství vzorku se přidají 2 ml 72% H2SO4 a několik krystalků kyseliny chromotropové, reakční směs se zahřívá na vodní lázni po dobu 10 minut • výsledné zbarvení se porovná se slepým pokusem o Reakce s polyjodidem Je typická pro deriváty celulosy a polyvinylderiváty. Zbarvení rozlišuje čistě uhlovodíkové a kyslík obsahující skelety. • k rozetřenému vzorku se přidá několik kapek roztoku polyjodidu draselného, směs se naředí vodou a protřepe • reakční směs se nechá 2 minuty vybarvit • suspenze se izoluje dekantací nebo filtrací (přes skleněnou fritu) a promyje vodou • u vzorků ve vodě rozpustných (škrob, PVAl) nebo ve vodě bobtnajících (polyakrylamid, některé deriváty celulosy) se vybarvuje gelová fáze i „roztok“

12

•

•

o Reakce s kyselinou chloroctovou a dichloroctovou Reaguje PVC a další vinylové polymery, reakční mechanismus není znám. • malé množství vzorku (asi 0,1 g) se ve zkumavce zahřívá s 1 – 2 ml kys. chloroctové, nevybarví-li se tavenina po 2 minutách varu, reakce je negativní; je nutné chránit si obličej ochranným štítem • test se opakuje s kyselinou dichloroctovou Pyrolýza Produkty pyrolýzy jsou pro jednotlivé polymery typické. Jednoduché polymery s kvarterním uhlíkem se při pyrolýze degradují především na monomery (methakryláty, polyisobutylen, methylpolystyren). V jednoduchém provedení pyrolýzy se sleduje vznik původních komponent (formaldehydu, fenolů, karboxylových kyselin atd.). Jednoduchá pyrolýza se využívá především k identifikaci elastomerů (kaučuků), acidita pyrolytických produktů a časové závislosti jejich tvorby je skupinovou charakteristikou. Další možností je využití kombinace pyrolýzy a identifikačních roztoků A (dimethylaminobenzaldehyd) a B (acidobazický indikátor), které se vybarví podle obsahu těkavých produktů v elastomeru (viz tabulka 3). o asi 0,5 g vzorku se vloží do pyrolytické zkumavky o do připojené absorpční zkumavky se předloží 1,5 ml roztoku A o pyrolytická zkumavka se zahřívá mikrokahanem, po 1 – 2 min vývoje plynu se absorpční zkumavka vymění za druhou s 1,5 ml roztoku B o roztok A se převede do zkumavky, přidá se 5 ml methanolu a po 20 min se zaznamená zabarvení směsi o směs se pak zahřívá při 50°C na vodní lázni po dobu 2 – 3 min, poté se zaznamená případná barevná změna. o zbarvení roztoku B upozorňuje na typ polymeru o pyrolytickou zkumavku je nutné před pyrolýzou vyčistit vyžíháním do sucha a po zchládnutí propláchnout kyselinami HCl a H2SO4 o místo absorpčních roztoků lze zařadit různá činidla (důkaz formaldehydu, fenolů, primárních a sekundárních aminů) a zvýšit tak identifikační jistotu IČ spektrometrie o nerozpustné polymery: v třecí misce s tloučkem se rozetře na špičku špachtle vzorku s malým množstvím KBr, z takto připravené směsi se vylisuje tableta o za asistence vyučujícího se proměří IR spektrum vzorku

5. Vyhodnocení Na základě výsledků provedených zkoušek se odhadne typ polymeru. Pořízené IČ spektrum polymeru se porovná s atlasem spekter a určí se další mikrostrukturní parametry. Mimoto se také porovnají výsledky kvantitativní elementární analýzy se závěrem identifikace. 6. Otázky • Navrhněte a popište provedení důkazu N, S a halogenů. • Vysvětlete pojmy: elastomer, plastomer, termoplast, duromer (reaktoplast), popř. uveďte příklady. • Uveďte alespoň tři různé polymery a jejich typický zápach, který uvolňují při hoření.

13

7. Literatura • • • • •

Rybnikář F. a kol.: Analýza a zkoušení plastických hmot. Praha: SNTL, 1965. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně: Ústav fyziky a materiálového inženýrství [online]. [cit 4. 11. 2012]. Dostupné z: http://ufmi.ft.utb.cz/texty/kzm/KZM_05.pdf. Hummel D. O., Scholl F.: Atlas for Polymer and Plastics Analysis, Vol. 1 Polymer: Structures and Spectra. Munich, Vienna: Hanser, 1982. Nálepa K.: Stručné základy chemie a fyziky polymerů. Olomouc: rektorát Univerzity Palackého v Olomouci, 1990. Stránský Z. a kol.: Analýza organických sloučenin. Olomouc: rektorát Univerzity Palackého v Olomouci, 1981.

14

Tabulka 1: Orientační zkoušky polymerů v plameni Hoření po vyjmutí z plamene

Plamen

Vzhled ohořelého zbytku

polyetylen (PE)

+

svítivý s modrým jádrem

otavený, měkký

polypropylen (PP)

+

svítivý s modrým jádrem

otavený

polystyren (PS)

+

svítivý, čadivý (saze)

otavený, zčernalý

polyizobutylen (PIB)

+

svítivý, žlutý

mazlavý, lepkavý

polyamid (PA)

+

modrý se žlutou špičkou

otavený

polymetylmetakrylát

+

modrý se žlutou špičkou

zhnědlý, prostoupený bublinkami

polyvinylacetát (PVAc)

+

žlutý, jiskřivý

ztmavlý

polyvinylalkohol (PVAl)

+

svítivý, žlutý, čadivý

očazený, změklý

polyvinylbutyral (PVB)

+

modrý s nažloutlým okrajem

ztmavlý

polyvinylchlorid (PVC)

-

žlutý, základna zeleně lemovaná

zuhelnatělý, křehký

polyetylentereftalát (PET)

+

svítivý, čadivý

otavený, zuhelnatělý

polytetrafluoretylen (PF4)

-

žlutý, základna zelená

beze změny

epoxidové pryskyřice

+

žlutý

zuhelnatělý

silikony

+

svítivý, bílé dýmy

bílá, křehká hmota

Polymer

15

Tabulka 2: Přehled barevných reakcí Polymer PVC Pvinylidenchlorid (PVdC) PV-alkohol PV-ethery PV-acetát PV-karbazol Me-celulosa Et-celulosa Ac-celulosa PMe-akrylát PMe-methakrylát Pmethoxyethylmethakrylát P-akrylamid P-methakrylamid P-akrylonitril Alkydy Polyamid 1,6 a 6,6 Fenolformald. pryskyřice Močovinoform. pryskyřice Melaminform. pryskyřice Kumaron-indenové pryskyřice Kasein PEG P-fenylenoxid Přírodní kaučuk Chlorprenový kaučuk Chlorkaučuk PIsobutylen + isopren Polybutadien, Buna P-butadien-styren Ethylen-propylen-dien (EPDM) P-styren-akrylonitril P-butadien-akrylonitril

Liebermannova reakce hmota  m – z žlutá žh  čh mzh (sv. zelená) modrozelená žlutá  oliv. oranžová  červ. modrozelená (hnědá) čh  tm. hnědá rč (žo) (oh) červená  červenohnědá -

hnědočerná

m  šz  hčr modravá -

Wechslerova reakce za chladu za horka hnědočervená hnědá žlutá sv. žlutá žlutá žlutozelená olivově zelená -

olivová – hčr hnědočerná žlutá žlutá sv. žlutá žlutá oranžová červenohnědá sv. žlutá sv. žlutá -

Chromotropová reakce

Vybarvení polyjodidem

Chloroctová kyselina

Dichloroctová kyselina

červenohnědá červená č – sv. hnědá žlutohnědá fialová červená fialová béžová červená fialová purpurová červenofialová ? fialová fialová -

starorůžová mz  černá f  tm. h. čh  černá

modrá purpurová zel. nebo mz červenofialová

purpurová černomodrá černá zelenomodrá modrofialová

červenohnědá hf žlutá červená žlutá žlutá černá tm. hnědá žlutá žlutá hnědá tm. h  černá

sv. zelená -

modrá žlutá žlutá sv. žlutá sv. žlutá sv. žlutá červenohnědá sv. žlutá sv. žlutá

(sv. žlutá) -

černá oranžovočervená rezavá růžová růžová červenohnědá červenohnědá sv. červené žluté oranžové

Vysvětlivky: č – červená, čh – červenohnědá, čr – černá, f – fialová, h – hnědá, hčr – hnědočerná, m – modrá, mz – modrozelená, o – oranžová, p – purpurová, r – růžová, šz – šedozelená, z – zelená, ž – žlutá, žo – žlutooranžová, žh – žlutohnědá apod.; sv. m. – světle modrá, tm. h. – tmavě hnědá apod.; č – sv. hnědá: červená až světle hnědá apod., r  č: růžová přechází v červenou, (hnědá) – reakce je málo výrazná.

Tabulka 3: Identifikace elastomerů pyrolýzou Elastomer slepý pokus přírodní kaučuk (NR) přírodní + styrenbutadienový kaučuk chloroprenový kaučuk (CR) chloroprenakrylonitrilový kaučuk (NCR) styren butadienový kaučuk (SBR) polyizobutylen, butylkaučuk polyvinylchlorid (PVC)

roztok A počáteční zbarvení zbarvení po zahřátí sv. žluté sv. žluté hnědé fialové modré

roztok B zbarvení zelené zelené

olivově zelené

zelenomodré

zelené

oranžově červené

červené

zelené

oranžově červené

červené

žluté až červené

žlutozelené

zelené

zelené

žluté (plavou kapky)

světle modrozelené

zelené

žluté

žluté

červené

17

Základní rozbor vápence TEORETICKÁ ČÁST Vápenec Vápenec je usazená hornina, jejíž hlavní složkou je uhličitan vápenatý (CaCO3). Barva vápence může být od čistě bílé až po černou – záleží na příměsích. Příměsi jsou rozhodujícím činitelem pro použitelnost vápence, jeho způsob těžby a případně další úpravu. V České republice jsou vápence velice rozšířenou horninou a mají podstatný národohospodářský význam. Vápence se zužitkují např. na štěrk, dekorační a stavební kámen a k výrobě vápna a cementu. V neposlední řadě jsou používány také k různým účelům v chemickém, cukrovarském i sklářském průmyslu a v hutnictví. Podle chemického složení jsou vápence rozděleny do 8. tříd jakosti, a to především podle obsahu uhličitanu vápenatého a hořečnatého a dalších oxidů. Každá třída je určena pro různé účely použití. Vápence používané pro cukrovarnictví jsou řazeny do 3. třídy jakosti a měly by splňovat následující složení: •

Obsah uhličitanu vápenatého a hořečnatého: min. 96 % (z toho uhličitan hořečnatý min. 2 %)

•

Obsah oxidu křemičitého: max. 1,5 %

•

Obsah seskvioxidů: max. 0,8 %

Vápenec používaný v cukrovarnictví (cukrovarnických pecích) se vypaluje na vápno a vzniklé produkty, kterými jsou oxid uhličitý a vápenatý jsou dále využívány. Oxid uhličitý je používán na čeření surové cukrové šťávy a oxid vápenatý se používá na čistění a neutralizaci cukrové šťávy.

Rozklad hornin Alkalické nebo alkalicko-oxidační tavení je preferovaným způsobem rozkladu hornin a minerálů. Zásadité horniny a minerály je někdy možné rozkládat i kyselinami. Mezi zásadité minerály patří např. vápence. ČSN 72 1216 předepisuje pro chemický rozbor vápence rozklad vzorku tavením s uhličitanem sodným. Tento postup, zahrnující stanovení oxidu křemičitého odkouřením s kyselinou fluorovodíkovou, brání především ztrátám stopových prvků při jejich následujícím stanovení. Stanovení hlavních komponent vápenců a dolomitických vápenců (např. pro cukrovarnickou praxi) není zatíženo významnými chybami aplikací rozkladu kyselinou chlorovodíkovou.

18

Stanovení vápníku a hořčíku V současné době se pro stanovení vápníku a hořčíku v horninách a minerálech používá gravimetrie. Vápenatý ion se sráží jako oxalát a žíhá na vážený oxid, hořčík jako fosforečnan hořečnato-amonný a žíhá se na vážený difosforečnan dihořečnatý. V cukrovarnické praxi je však zvykem stanovovat obsah (%) uhličitanu vápenatého a hořečnatého. K tomuto stanovení se používá chelatometrická titrace. Při nízkém obsahu hořčíku (pod 4% MgCO3) je však chelatometrické stanovení nepřesné (rozdíl ve spotřebách při titraci sumy a samotného vápníku nemá být menší než l ml). Proto je v tomto případě nutné provést souběžné stanovení pomocí absorpční atomové spektrometrie.

PRAKTICKÁ ČÁST Úkol: Stanovte obsah oxidu křemičitého, seskvioxidů R2O3, uhličitanu vápenatého a hořečnatého ve vápenci určeném pro cukrovarnickou praxi. Rozhodněte, zda je předložený vzorek vápence vhodný pro cukrovarnickou praxi. 1. Stanovení oxidu křemičitého (nerozložitelného podílu) Úkol: Stanovte obsah oxidu křemičitého v předloženém vzorku vápence. Zjištěný obsah slovně okomentujte. Pomůcky a přístroje: muflová pec, vodní lázeň, váhy, vařič, sušárna, exsikátor, kahan, filtrační aparatura, porcelánová miska, porcelánový kelímek, hodinové sklo, kádinka, navažovací lodička, lžička, tyčinka, střička Chemikálie: vzorek vápence, chlorid amonný, koncentrovaná kyselina sírová, koncentrovaná kyselina chlorovodíková, 0,1 M dusičnan stříbrný, destilovaná voda Pracovní postup: •

Naváží se 2 g (s přesností na 2 mg) jemně rozetřeného vzorku vápence vysušeného při teplotě 105 až 110 °C

•

Navážený vzorek se převede na porcelánovou misku

•

Navažovací nádobka se „vypláchne“ 2-4 g chloridu amonného na porcelánovou misku

•

Vzniklá směs se promíchá tyčinkou (neměly by vzniknout hrudky)

•

Ke směsi se přidá potřebný objem destilované vody, aby došlo se vzniku husté kaše

•

Směs se opět promíchá, použitá tyčinka se opláchne destilovanou vodou

•

Porcelánová miska se přikryje hodinovým sklem, hubičkou misky se pomalu po kapkách přidává 20 ml koncentrované H2SO4 (pozor na bouřlivost rozkladu)

19

•

Následně se směs zahřívá na vodní lázni až do skončení rozkladu

•

Hodinové sklo se opláchne do misky a obsah misky se na vodní lázni odpaří do sucha

•

Porcelánová miska s odparkem se dosuší (30 minut) v sušárně vyhřáté na 120 °C

•

Po vychladnutí se odparek spláchne 5 ml koncentrované HCl a nechá se 5 minut stát

•

Poté se přidá 20 ml destilované vody, směs se dobře promíchá tyčinkou a znovu odpaří na vodní lázni

•

Vzniklý odparek se smočí (po stěnách) 5 ml HCl (1:1)

•

Po několika minutách se přidá 100 ml horké destilované vody a promíchá se použitou tyčinkou

•

Připraví se filtrační aparatura

•

Vzorek se přefiltruje (filtr – bílá páska) do čisté kádinky

•

Filtr se 3 x promyje horkou 1 % HCl – pokaždé se nechá promývací roztok odkapat

•

Následně se filtr promyje horkou destilovanou vodou až do vymizení reakce na chloridy (0,1 M AgNO3)

•

Filtr se vysuší a opatrně se zuhelní (nad kahanem) v předem vyžíhaném (1000 °C) a zváženém porcelánovém kelímku

•

Zuhelněný zbytek se žíhá 1,5 hodiny v muflové peci vyhřáté na 1000 °C

•

Po žíhání se kelímek umístí do exsikátoru a po vychladnutí se zváží

•

Vypočte se procentuelní obsah SiO2 ve vzorku

•

Pozn. filtrát ponecháme pro stanovení obsahu seskvioxidů!

Vyhodnocení: Výpočet obsahu (%) oxidu křemičitého (SiO2) v předloženém vzorku:

SiO2 (%) =

100 ⋅ (a − b) n

a – hmotnost kelímku s SiO2 (g) b – hmotnost prázdného kelímku (g) n – navážka vzorku (g) Vypočtená hodnota SiO2 (%): _______________________ Slovní vyhodnocení zjištěného obsahu oxidu křemičitého ve vzorku vápence:………………… ……………………………………………………………………………………………………………….……… …………………………………………………………………………………………………………………

20

2. Stanovení seskvioxidů Úkol: Stanovte obsah seskvioxidů v předloženém vzorku vápence. Vypočtené množství slovně zdůvodněte. Pomůcky a přístroje: muflová pec, vařič, filtrační aparatura, váhy, exsikátor, kádinka, porcelánový kelímek, střička Chemikálie: Filtrát získaný během stanovení oxidu křemičitého, koncentrovaná kyselina dusičná, 10 % roztok hydroxidu amonného, 1 % roztok dusičnanu amonného, kyselina chlorovodíková (1:1), methylová červeň, 0,1 M dusičnan stříbrný, destilovaná voda Pracovní postup: •

Filtrát získaný během stanovení oxidu křemičitého (se všemi promývacími roztoky) se zahřeje k varu

•

Přidá se několik kapek koncentrované HNO3, roztok se krátce povaří a následně se po kapkách sráží 10 % roztokem NH4OH do barevného přechodu methylové červeně

•

Poté se přidají 3 kapky NH4OH navíc

•

Kádinka s filtrátem se umístí na teplé místo a po usazení se filtruje (filtr – bílá páska)

•

Filtrát se jímá do velké čisté kádinky

•

Sraženina na filtru se 2 x promyje horkým 1 % roztokem NH4NO3

•

Kádinka pod filtrem se vymění za tu, ve které probíhalo srážení a sraženina na filtru se rozpustí v 10 až 20 ml horké HCl (1:1)

•

Filtr se důkladně promyje horkou destilovanou vodou a opakuje se srážení roztokem NH4NO3

•

Vzniklá sraženina se zachytí na stejném filtru, který byl použit při první filtraci

•

Filtrát se jímá do kádinky s prvním filtrátem

•

Filtr se promyje 1 % roztokem NH4NO3 až do vymizení reakce chloridů

•

Filtr se vloží do předem vyžíhaného a zváženého porcelánového kelímku

•

Po vysušení a zpopelnění se žíhá v muflové peci při teplotě 1100 °C po dobu 1,5 hodiny

•

Po žíhání se kelímek umístí do exsikátoru, po vychladnutí se zváží

•

Vypočte se obsah seskvioxidů v předloženém vzorku

•

Pozn. filtrát ponecháme pro stanovení obsahu vápníku a hořčíku!

Vyhodnocení: Výpočet obsahu (%) seskvioxidů (R2O3) v předloženém vzorku:

R2 O3 (%) =

100 ⋅ (a − b) n

a – hmotnost kelímku s R2O3 (g) b – hmotnost prázdného kelímku (g) n – navážka vzorku (g) Vypočtená hodnota R2O3 (%): _______________________

21

Slovní vyhodnocení zjištěného obsahu seskvioxidů ve vzorku vápence:………………… ……………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………….....………..

3. Stanovení vápníku a hořčíku Úkol: Stanovte obsah uhličitanu vápenatého a hořečnatého ve vzorku vápence. Naměřené hodnoty obsahů slovně okomentujte. Pomůcky a přístroje: digestoř, vařič, vodní lázeň, titrační aparatura, titrační baňky, porcelánová miska, odměrná baňka, ochranný štít, střička Chemikálie: Filtrát získaný během stanovení seskvioxidů, destilovaná voda, 1% roztok kyseliny chlorovodíkové, chelaton, dusičnan olovnatý, 10 % roztok hydroxidu sodného, murexid, eriochromová čerň, Schwarzenbachův pufr Pracovní postup: •

Filtrát získaný během stanovení seskvioxidů se odpaří na vodní lázni do sucha

•

Větší část amonných solí se odkouří na vařiči v porcelánové misce (Pozor: digestoř, ochranný štít)

•

Zbytek se rozpustí v 20 ml 1 % HCl a destilovanou vodou se převede do odměrné baňky (250 ml), doplní se po rysku a řádně promíchá

•

Provede se stanovení přesné koncentrace odměrného roztoku chelatonu – standardizace na dusičnan olovnatý resp. kovový zinek

•

25 ml roztoku se odpipetuje do titrační baňky, přidá se 10 ml 10 % NaOH a roztok se naředí destilovanou vodou na objem cca 50 ml

•

Přidá se murexid (stanovení vápenatých kationtů) a roztok se titruje 0,1 M odměrným roztokem chelatonu do maximální barevné změny indikátoru

•

Titrace se provede 3 x

•

Následně se odpipetuje 25 ml roztoku, přidá se 5 ml Schwarzenbachova pufru a roztok se naředí na objem cca 50 ml

•

Přidá se eriochromová čerň (stanovení sumy vápenatých a hořečnatých kationtů) a roztok se titruje odměrným roztokem chelatonu do modrého zbarvení

•

Titrace se provede 3 x

•

Vypočítá se obsah uhličitanu vápenatého a hořečnatého ve vzorku

Vyhodnocení: Výpočet přesné koncentrace odměrného roztoku chelatonu: ………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………….............. ............................................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................

22

Výpočet obsahu uhličitanu vápenatého a hořečnatého ve vzorku vápence: Titrace 1

Titrace 2

Titrace 3

Ø

Spotřeba chelatonu (ml) – murexid Spotřeba chelatonu (ml) – eriochromová čerň

100 ⋅ 10 ⋅ s1 ⋅ c n 100 ⋅ 10 ⋅ s 2 ⋅ c CaCO3 + MgCO3 (%) = n CaCO3 (%) =

s1 - průměrná spotřeba odměrného roztoku při titraci na murexid (ml) s2 – průměrná spotřeba odměrného roztoku při titraci na eriochromovou čerň (ml) n – navážka vápence (g) Pozn.: Pokud je rozdíl s2 – s1 menší než 1 ml je potřeba vzorek naředit (např. 10x), provést stanovení hořčíku pomocí atomové absorpční spektrometrie a následně přepočítat na obsah uhličitanu hořečnatého. Vypočtená hodnota obsahu (%) uhličitanu vápenatého ve vzorku:_____________________ Vypočtená hodnota obsahu (%) sumy uhličitanu vápenatého a hořečnatého ve vzorku: __________________________ Vypočtená hodnota obsahu (%) uhličitanu hořečnatého ve vzorku:______________________ Slovní vyhodnocení zjištěného obsahu uhličitanů ve vzorku vápence:……......................…………… ……………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………................………………….. Otázky k prozkoušení studentů: 1. Vysvětlete rozdíl mezi horninou a minerálem. 2. Vysvětlete pojem seskvioxid 3. V jakých odvětvích a k čemu může být používán vápenec? 4. Vyjmenujte, jaké další příměsi mohou být přítomny ve vápenci. 5. Vyjmenujte základní parametry, které mají vliv na složení vápence. 6. Vysvětlete základní princip gravimetrie. 7. Vysvětlete princip chelatometrické titrace (odměrný roztok, indikátory). 8. Vysvětlete princip atomové absorpční spektrometrie.

23

Doporučená literatura: 1. Zýka J. a kol.: Analytická příručka, 1.díl, SNTL Praha, 1988. 2. Harvey D.: Modern Analytical Chemistry, The McGraw-Hill Companies USA, 2000. 3. http://www.svcement.cz/includes/dokumenty/seminar-2011/22-uplatneni-vapencovesuroviny-z-hlediska-kvality-v-ruznych-prumyslovych-odvetvych.pdf [cit. 05-12-12] 4. Šrámek V., Kosina L.: Analytická chemie, Nakladatelství Fin, Olomouc, 1996. 5. Kouřimský J.: Užitkové horniny a minerály, Aventinum, Praha, 1999.

24

Určení základních parametrů půdy TEORETICKÁ ČÁST Samotný rozbor půdy představuje celou řadu skupin nejenom analytických stanovení. V základním rozboru jde o horninový rozbor (stanovení oxidů prvků), na nějž navazuje pedologický typový rozbor (určení podle skeletu, zrnitosti, obsahu písku, jílu, kaolinitu, montmorillonitu, atd.) a cílený rozbor (stanovení reziduí pesticidů, atd.). V zemědělsky využívaných půdách se pravidelně kontrolují parametry, které vypovídají o schopnosti půdy produkovat kulturní rostliny a o ekologicky nežádoucích změnách. Zde jde především o kontrolu obsahu živin, organické hmoty, iontovýměnné kapacity a schopnosti, acidity a o kontrolu reziduí. Podle zjištěných parametrů je možné zvolit druh plodiny, pro kterou je půda nejvhodnější, nebo např. provést vhodnou aplikaci hnojiv popř. koncentrátů obsahujících požadovanou živinu.

Odběr vzorků půdy Odběr vzorků je velice důležitým prvkem všech rozborů. Vzorky půdy se odebírají sondážními tyčemi, průměrný vzorek se skládá z minimálně 30 odběrových míst. Hloubka odběru se řídí především typem pěstovaných plodin. Plocha potřebná pro odběr vzorku je závislá na druhu půdy. Zemědělské půdy můžeme rozdělit např. na půdu ornou (v bramborářské, horské, řepařské a kukuřičné oblasti), půdu u trvalých travních porostů, půdu u chmelnic, vinic a intenzivních sadů. Odběr vzorků zemědělských půd se řídí Vyhláškou Ministerstva zemědělství č. 275/1998 Sb., o agrochemickém zkoušení zemědělských půd a zjišťování půdních vlastností lesních pozemků. Odebrané vzorky (umístěné v papírových nebo plastových obalech) se nechávají pro většinu rozborů obeschnout na vzduchu, zbaví se hrubších částí skeletu a rostlinných zbytků a následně se podrobí sítové analýze. Pro většinu stanovení se využívá tzv. jemnozemě I (propad přes síto s průměrem oka 2 mm), méně tzv. jemnozemě II (propad přes oko 0,25 mm).

25

Vybrané parametry: Výměnné pH je důležitým parametrem, který charakterizuje aciditu (kyselost) půdy, tedy např. i vliv kyselých dešťů. Výměnné pH půdy je dáno především ionty vodíku, které jsou sorbovány půdními koloidy. Tyto ionty se mohou za určitých podmínek uvolnit do půdního roztoku, čímž dojde ke zvýšení aktivní kyselosti půdy. Půdu můžeme podle kyselosti rozdělit do tří skupin: kyselá půda (pH 4,0 – 6,6), neutrální půda (pH 6,7 – 7,3) a zásaditá půda (pH 7,4 – 8,5). Kyselost půdy se snižuje především vápněním.

Přijatelný draslík Draslík nacházející se v půdě v různých sloučeninách je možno rozdělit z hlediska přístupnosti pro rostliny a druhu vazby do tří skupin. Jedná se o draslík nevýměnný, výměnný a vodorozpustný. Draselný ion patří k základním živinám rostlin. Zvyšuje asimilační potenci rostlin, odolnost proti vymrzání a chorobám, má být v rovnováze s obsahem sodíku (antagonismus). Za dostatečnou zásobu draslíku v zemědělské půdě se považuje obsah 160 – 180 mg K+ v 1 kg půdy. Stanovení je založeno na vytěsnění iontu z iontoměničového půdního komplexu směsí octanu a šťavelanu amonného a obvykle následuje stanovení draslíku plamenovou fotometrií.

Přijatelný hořčík Hořčík je v půdě obsažen jak ve velmi rozdílných koncentracích, tak i v různých formách. Průměrný obsah veškerého hořčíku se pohybuje kolem 0,6 %. Půdy mající nejvyšší obsah hořčíku jsou půdy vzniklé na dolomitu. Přijatelnost hořčíku ovlivňuje především jeho forma (výměnný – na povrchu půdních koloidů, nevýměnný – např. v minerálech) a v nemalé míře taktéž antagonistické působení jiných iontů (např. K+, Ca2+). Obsah hořčíku reguluje fotosyntetické procesy. Po eluci roztokem chloridu vápenatého se stanovuje spektrofotometricky (titanová žluť) nebo pomocí atomové absorpční spektrofotometrie (AAS).

26

Přijatelný fosfor Obsah celkového fosforu v půdě se pohybuje v rozmezí od 0,03 do 0,13 %. Nejvýznamnějším přírodním zdrojem fosforu v půdě je minerál apatit. Fosfor se v přírodě vyskytuje vždy ve svém nejvyšším oxidačním stupni. Obsah fosforu reguluje (zpomaluje) růst, urychluje nasazování plodů a zrání a podporuje kvetení. Za dostatečnou zásobu se považuje obsah 250 mg P2O5/kg, přihnojení je žádoucí při obsahu menším než 150 mg P2O5/kg. Při stanovení fosforu se půda eluuje roztokem mléčnanu vápenatého a následuje spektrofotometrické stanovení založené na tvorbě fosfomolybdenové modři.

Stanovení dusičnanů Obsah celkového dusíku v půdě má poměrně stálou hodnotu, a to z toho důvodu, že je tvořen sloučeninami chemicky i mikrobiologicky těžce rozložitelnými. Dusík jako živina je nutný pro tvorbu rostlinných bílkovin a chlorofylu, podmiňuje růst rostlin. Přijatelné formy jsou dusík amoniakový, amidový a nitrátový (s výjimkou motýlokvětých – luštěnin). Za minerální dusík se považuje sumu amonného a nitrátového dusíku, jehož obsah pro pěstování kulturních rostlin nemá být menší než 120 až 150 mg N/kg půdy. Předmětem analytické kontroly je stanovení celkového dusíku, amonného dusíku a nitrátového dusíku. Nitrátový dusík je nepříliš žádoucí komponentou, i když rostliny převádějí podstatnou část ostatních forem na dusičnan. Obsah dusičnanů v půdě se kontroluje nejčastěji spektrofotometricky (Nesslerovo činidlo, nitrace fenolů), nebo ISE elektrodou s kapalnou membránou. Elučním činidlem při stanovení dusíku je roztok síranu draselného.

Organické látky (humus) Organická složka půdy (humus) je mimořádně významná pro produkci kulturních plodin (ovlivňuje úrodnost půdy), její obsah by měl být minimálně 2,5 %, podstatná je ovšem její kvalita. Kvalita humusu se posuzuje např. podle poměru huminových kyselin (stabilnější s vyšší sorpční kapacitou) a fulvokyselin. Humus poutá vláhu v půdě, zvyšuje jímavost vody a živin, zvyšuje záhřevnost půdy, podporuje mikrobiální činnost a je zásobníkem dusíku.

27

V přírodně vyrovnaných půdách obsah organické hmoty koreluje s obsahem humusu. Organická složka půdy podstatně ovlivňuje výsledky (recovery) stanovení jednotlivých organických komponent, např. i reziduí pesticidů. Proto je stanovení organických látek mimořádně významné. Provádí se z jemnozemě II. Stanovení organických látek je založeno na totální oxidaci směsí kyseliny sírové a chromové (analogie CHSK).

PRAKTICKÁ ČÁST Úkol: Stanovte vybrané základní parametry (výměnné pH, přijatelný draslík, přijatelný hořčík, přijatelný fosfor, obsah dusičnanů, obsah organických látek) předloženého vzorku - zemědělské půdy 1. Stanovení výměnného pH a potřeby vápnění Úkol: U předloženého vzorku půdy stanovte hodnotu výměnného pH a potřeby vápnění. Naměřené výsledky slovně zdůvodněte. Pomůcky a přístroje: ultrazvuková lázeň, pH metr se skleněnou elektrodou, elektromagnetické míchadlo, elektromagnetická míchačka, váhy, kádinka, střička, navažovací lodička, pipety Chemikálie: 1 M KCl, 0,12 M NaOH, kalibrační roztoky k pH metru, destilovaná voda, reálný vzorek zemědělské půdy (jemnozem I) Pracovní postup: • Do kádinky (150 ml) se naváží 20 g vzorku (jemnozem I) •

Přidá se 50 ml 1M KCl

•

Kádinka se umístí na 2 hodiny do ultrazvukové lázně (během sonifikace se stanovují další parametry půdy)

•

Podle pokynů vedoucího cvičení se provede kalibrace pH metru

•

Po vyjmutí z ultrazvukové lázně se do kádinky vloží elektromagnetické míchadlo

•

Kádinka se umístí na elektromagnetickou míchačku, do roztoku se vloží skleněná pH elektroda (elektroda se nesmí dotýkat stěny kádinky ani elektromagnetického míchadla) připojená k pH metru

•

Po dvou minutách míchání se zaznamená naměřená hodnota pH

•

V případě, že je naměřená hodnota pH menší než 6,5, provede se titrace (sloužící pro výpočet tzv. potřeby vápnění)

•

Suspenze se titruje odměrným roztokem 0,12M NaOH (po 1 ml), a to za stálého míchání

•

Po každém přídavku (1 ml) se vyčká 1 minutu a zaznamená se naměřená hodnota pH

28

•

Titrace se ukončí po dosažení pH majícího hodnotu 7,0

•

Ze spotřeby odměrného roztoku se vypočítá tzv. potřeba vápnění (viz vyhodnocení)

Vyhodnocení: Naměřená hodnota výměnného pH1: ___________________ Výpočet potřeby vápnění: A) Počet tun (CaO/ha) = spotřeba odměrného roztoku ∙ 0,5 B) Počet tun (CaCO3/ha) = spotřeba odměrného roztoku ∙ 0,9 Vypočtená hodnota potřeby vápnění2: A) ___________________ B) ________________ Slovní

zhodnocení

zjištěných

hodnot:……………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………….……… ………………………………………………………………………………………………………. hodnota zaokrouhlená na 1 desetinné místo hodnota zaokrouhlená na 0,5 t/ha

1 2

2. Stanovení přijatelného draslíku Úkol: U předloženého vzorku půdy stanovte obsah draslíku. Zjištěnou hodnotu slovně zdůvodněte. Pomůcky a přístroje: plamenový fotometr, ultrazvuková lázeň, váhy, filtrační aparatura, Erlenmayerova baňka (100 ml), odměrné baňky, odměrný válec, navažovací lodička, střička Chemikálie: eluční roztok (octan + šťavelan amonný), zásobní roztok K+, vzorek půdy, destilovaná voda Pracovní postup: Příprava vzorku: • Do zábrusové Erlenmayerovy baňky (100 ml) se naváží 10 g vzorku půdy •

Vzorek se zalije 25 ml elučního roztoku (octan + šťavelan amonný) a následně se umístí do ultrazvukové lázně

•

Vzorek se sonifikuje (eluuje) po dobu dvou hodin (během této doby je vhodné připravit sadu kalibračních roztoků nutných pro následné stanovení K+)

•

Připraví se filtrační aparatura

•

Vzorek se vyjme z ultrazvukové lázně a po usazení se filtruje (získaný filtrát má být čirý)

•

Filtrát se dále použije k plamenově fotometrickému stanovení K+

Příprava kalibračních roztoků: • Ze zásobního roztoku K+ se do odměrných baněk odpipetuje potřebné množství odpovídající koncentraci 20, 40, 80, 120 a 160 mg K+/l, což odpovídá obsahu 50, 100, 200, 300 a 400 mg K+/kg půdy

29

•

Odměrné baňky se doplní destilovanou vodou po rysku, kalibrační roztoky se řádně protřepou a použijí se pro sestavení kalibrační křivky sloužící pro stanovení K+

Plamenová fotometrie: • Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení přístroje •

Proměří se sada kalibračních roztoků (počínaje roztokem majícím nejnižší koncentraci K+)

•

Proměří se filtrát získaný úpravou vzorku půdy

•

Sestrojí se kalibrační křivka a provede se výpočet obsahu K+ v předloženém vzorku

Vyhodnocení: Koncentrace K+ (mg/kg)

50

100

200

300

400

Reálný vzorek

Naměřená hodnota Rovnice regrese: ___________________ Vypočtená hodnota K+ (mg/kg půdy): _________________ Slovní

zhodnocení

naměřené

hodnoty

K+

ve

vzorku:……………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………..............

3. Stanovení přijatelného hořčíku Úkol: U předloženého vzorku půdy stanovte obsah hořčíku. Stanovenou hodnotu slovně zdůvodněte. Pomůcky a přístroje: atomový absorpční spektrometr, třepačka, předvážky, filtrační aparatura, Erlenmayerova baňka, odměrné baňky, navažovací lodička, lžička Chemikálie: eluční roztok CaCl2, vzorek půdy, zásobní roztok hořčíku, destilovaná voda Pracovní postup: Příprava vzorku: • Do Erlenmayerovy baňky (100 ml) se naváží 5 g půdy (na předvážkách) •

Přidá se 50 ml elučního roztoku CaCl2

•

Vzorek se umístí na 1 hodinu na třepačku popř. do ultrazvukové lázně (během této doby je vhodné připravit sadu kalibračních roztoků – viz níže)

•

Po usazení se roztok filtruje (filtr – bílá páska) – prvních cca 5 ml filtrátu se vylije

•

Získaný filtrát se použije pro stanovení hořčíku

30

Příprava kalibračních roztoků: • Zásobní roztok se 10 x zředí elučním roztokem CaCl2 do odměrné baňky o objemu 200 ml •

Ze zředěného zásobního roztoku se do odměrných baněk (100 ml) odpipetuje potřebné množství odpovídající koncentraci 0 (tzv. slepý vzorek); 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1 a 2 mg/l hořčíku, což odpovídá obsahu 0; 0,5; 1; 2; 5; 10 a 20 mg hořčíku v 1 kg půdy

•

Odměrné baňky se doplní elučním roztokem po rysku, kalibrační roztoky se řádně protřepou a použijí se pro sestavení kalibrační křivky sloužící pro stanovení hořčíku v půdě

Atomová absorpční spektrometrie: • Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení přístroje (používá se svítivý plamen acetylen-vzduch, štěrbinový hořák v poloze napříč) •

Proměří

se

sada

kalibračních

roztoků

(počínaje

roztokem

majícím

nejnižší

koncentraci hořčíku) •

Pozn. naměřená absorbance vzorku i kalibračního roztoku majícího nejvyšší koncentraci hořčíku by neměla přesáhnout hodnotu 0,6

•

Proměří se filtrát získaný úpravou vzorku půdy – pokud je hodnota absorbance vyšší než hodnota absorbance nejkoncentrovanějšího kalibračního roztoku, je potřeba filtrát naředit elučním roztokem

•

Sestrojí se kalibrační křivka a provede se výpočet obsahu hořčíku v předloženém vzorku půdy

Vyhodnocení: Koncentrace hořčíku

Naměřená

(mg/kg) 0 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0 20,0 Reálný vzorek

hodnota

Rovnice regrese: ___________________ Vypočtená hodnota hořčíku (mg/kg půdy): _________________ Slovní

vyhodnocení

naměřené

hodnoty

hořčíku

ve

vzorku:……………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………...............

31

4. Stanovení přijatelného fosforu Úkol: U předloženého vzorku půdy stanovte hodnotu přijatelného fosforu. Zjištěnou hodnotu slovně zdůvodněte. Pomůcky a přístroje: fotometr, třepačka, filtrační aparatura, vodní lázeň, předvážky, pipeta, zábrusové zkumavky, Erlenmayerova baňka, odměrná baňka, navažovací lodička, lžička, střička Chemikálie: eluční roztok, činidlo, reduktans, zásobní roztok fosforu, vzorek půdy, destilovaná voda Pracovní postup: •

Do Erlenmayerovy baňky (500 ml) se naváží 5 g půdy (na předvážkách)

•

Přidá se 250 ml elučního pracovního roztoku

•

Baňka se umístí 1,5 hodiny na třepačku popř. na 1 hodinu do ultrazvukové lázně (během této doby je vhodné připravit sadu kalibračních roztoků – viz níže)

•

Po usazení se roztok filtruje (filtr – bílá páska) – prvních cca 10 ml filtrátu se vylije

•

Ze získaného filtrátu se odpipetuje 25 ml do zábrusové zkumavky, přidá se 1 ml činidla a 1 ml reduktans

•

Roztok se řádně promíchá

•

Zkumavka se spolu se zkumavkami obsahujícími kalibrační roztoky (příprava viz níže) umístí do vroucí lázně na 30 minut (od počátku varu)

•

Po vychladnutí se roztoky použijí pro fotometrické stanovení fosforu

Příprava kalibračních roztoků: • Zásobní roztok fosforu se 100 x zředí do odměrné baňky o objemu 1000 ml •

Získaný pracovní roztok obsahuje 2,5 µg/ml fosforu

•

Z pracovního roztoku se postupně odpipetuje do zábrusových zkumavek 0 (tzv. slepý pokus), 4, 8, 12, 16 a 20 ml (pozn. standardní roztoky odpovídají koncentracím 0, 20, 40, 60, 80 a 100 mg/kg fosforu)

•

Do každé zkumavky se přidá 1 ml neředěného elučního roztoku a doplní se destilovanou vodou do objemu 25 ml

•

Následně se přidá 1 ml činidla a 1 ml reduktans

•

Zkumavky se spolu se vzorkem umístí do vroucí lázně na 30 minut (od počátku varu)

•

Po vychladnutí se standardní roztoky fotometricky proměří (naměřené hodnoty absorbance slouží k sestrojení kalibrační křivky)

32

Fotometrické stanovení: • Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení přístroje •

Stanovení se provádí při vlnové délce mající hodnotu 690 nm, a to proti slepému pokusu

•

Proměří

se

sada

kalibračních

roztoků

(počínaje

roztokem

majícím

nejnižší

koncentraci fosforu) •

Následně se proměří reálný vzorek půdy

•

Sestrojí se kalibrační křivka a provede se výpočet obsahu fosforu v předloženém vzorku půdy

Vyhodnocení: Koncentrace fosforu

Naměřená

(mg/kg) 0 20 40 60 80 100 Reálný vzorek

hodnota

Rovnice regrese: ___________________ Vypočtená hodnota fosforu (mg/kg půdy): _________________ Slovní

vyhodnocení

zjištěné

hodnoty

fosforu

ve

vzorku:……………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………..............

5. Stanovení dusičnanů Úkol: Stanovte obsah dusičnanů v předloženém vzorku zemědělské půdy. Zjištěný obsah slovně okomentujte. Pomůcky a přístroje: potenciometr s měrnou a srovnávací elektrodou, předvážky, vařič, třepačka, filtrační aparatura, Erlenmayerova baňka, odměrná baňka, pipety, navažovací lodička, lžička, střička Chemikálie: 1 % roztoku K2SO4, chloroform, základní roztok dusičnanů, vzorek půdy, destilovaná voda

33

Pracovní postup: Příprava vzorku: • Na předvážkách se naváží do Erlenmayerovy baňky (100 ml) 15 g vzorku půdy •

Přidá se 75 ml 1 % roztoku K2SO4

•

Vzniklá suspenze se umístí na 1 hodinu na lineární třepačku popř. do ultrazvukové lázně (během třepání je vhodné připravit kalibrační roztoky – viz níže)

•

Po usazení se suspenze filtruje přes skládaný filtr promytý horkou vodou (voda musí zcela odkapat!)

•

Filtrát se konzervuje několika kapkami chloroformu, v případě, že je zakalený – filtruje se znovu přes hustější filtr (modrá páska) promytý horkou vodou

•

Získaný filtrát se použije pro potenciometrické stanovení (s využitím membránové iontově selektivní elektrody) obsahu dusičnanů ve vzorku

Pozn. Selektivita iontově selektivní elektrody není pro vyšší obsah chloridů a hydrogenuhličitanů vyskytující se ve výluhu půdy dostatečná. Pokud vykazuje 1 ml výluhu zřetelný zákal nebo sraženinu s 1 ml 0,1 M AgNO3, je potřeba k výluhu přidat pevný Ag2SO4, a to dokud se tvoří sraženina AgCl. Tuto sraženinu není nutné před samotným měřením odfiltrovat. Pokud mělo výměnné pH hodnotu větší než 7,2 přidá se do výluhu před měřením 1 kapka H2SO4 (1:1).

Příprava kalibračních roztoků: • 20 ml základního roztoku dusičnanů se v odměrné baňce (100 ml) doplní 1 % roztokem K2SO4, čímž se získá pracovní roztok obsahující 20 mg N/l •

Z pracovního roztoku se pipetováním potřebných objemů připraví sada kalibračních roztoků (minimálně 5 roztoků) o obsahu 0,2 až 20 mg N/l (odpovídá 1 až 100 mg N/kg), a to tak aby co nejlépe pokrývala logaritmickou stupnici koncentrací

•

Po odpipetování vhodných objemů pracovního roztoku se odměrné baňky doplní po rysku 1 % roztokem K2SO4

•

Potenciometricky se proměří sada kalibračních roztoků a následně vzorek půdy

Potenciometrické stanovení: • Iontově selektivní elektroda (ISE) se před promytím otře filtračním papírem a odkápnutím roztoku kapalného ionexu se obnoví její povrch •

ISE a srovnávací elektroda (merkurosulfátová nebo kalomelová s můstkem naplněným nasyceným K2SO4) se ponoří do kádinky se vzorkem (popř. kalibračním roztokem)

•

Po ustálení potenciálu (cca 1 minuta) se zaznamená hodnota elektromotorického napětí (EMN)

•

Elektrody se vyjmou z roztoku, ISE se opět otře filtračním papírem a odkápnutím kapalného ionexu se obnoví povrch

•

Tímto způsobem se proměří sada kalibračních roztoků a vzorek půdy

•

Sestrojí se kalibrační křivka a vypočítá se obsah dusičnanů v předloženém vzorku půdy

34

Vyhodnocení: logaritmus koncentrace dusičnanů

Naměřená

(mg/kg)

hodnota EMN

Reálný vzorek Rovnice regrese: ___________________ Vypočtený obsah dusičnanů (mg/kg půdy): _________________ Slovní

vyhodnocení

zjištěného

obsahu

dusičnanů

ve

vzorku:……………………………………

………………………………………………………………………………………………………………..……… …………………………………………………………………………………………...............……………

6. Stanovení obsahu organických látek (humusu) Úkol: Stanovte obsah organických látek v předloženém vzorku půdy. Zjištěný obsah slovně okomentujte. Pomůcky a přístroje: váhy, sušárna, titrační aparatura, titrační baňky, pipeta, hodinové sklo, lžička Chemikálie: oxidační agens, síran železnato-amonný, ferroin, dichroman, kyselina sírová, vzorek půdy (jemnozem II), destilovaná voda Pracovní postup: •

Do titrační baňky (100 ml) se naváží 0,2 g jemnozemě II

•

Přidá se 10 ml (pomocí pipety) oxidačního agens a obsah se promíchá tak, aby půda nezůstala na stěnách baňky

•

Současně se připraví slepý pokus: Do tří titračních baněk se odměří 10 ml oxidačního agens

•

Všechny baňky se přikryjí hodinovým sklem a současně se vloží do sušárny předem vyhřáté na 125 °C na 45 minut (během této doby se připraví titrační aparatura) – nutno dodržet přesnou teplotu i čas!

•

Po vychladnutí titračních baněk se provede titrace odměrným roztokem síranu železnatoamonného na ferroin do výsledného červeno (zeleno) hnědého zbarvení

•

Výsledné zbarvení je potřeba předem testovat, nutno je okyselit i vzorek

•

Přesná koncentrace odměrného roztoku se stanoví titrací 20 ml standardního roztoku dichromanu okyseleného 2,5 ml H2SO4

35

•

Ze získaných spotřeb odměrného činidla se vypočte obsah organického uhlíku (rovnice viz vyhodnocení)

Vyhodnocení: Výpočet přesné koncentrace odměrného roztoku:………………………………………………................….. …………………………………………………………………………………………………………………….… ……………………………………………………………………………………………………........................… …………………………………………………………………………………………………………............……

Výpočet obsahu organického uhlíku (%): Slepý

Slepý

Slepý

Ø slepý

pokus 1

pokus 2

pokus 3

pokus

Vzorek

Spotřeba odměrného roztoku (ml)

cox =

(V1 − V2 ) ⋅ 10 ⋅ c ⋅ 0,03 n

V1 – průměrná hodnota spotřeby odměrného roztoku na slepý pokus (ml) V2 – spotřeba odměrného roztoku na vzorek (ml) c – přesná koncentrace odměrného roztoku (mol/l) n – navážka vzorku (g) hodnota 0,03 – faktor odpovídající předpokladu, že 1 ml standardního roztoku dichromanu odpovídá 0,3 mg organického uhlíku Pozn.: rozdíl V1 – V2 musí být v rozmezí 1 až 15 ml, v opačném případě je nutné zvolit vhodnější navážku Vypočtená hodnota cox (%)1: _______________________ Výpočet obsahu humusu (%):

humus(%) = cox ⋅ 1,724

Vypočtená hodnota humusu (%)1: ______________________ Slovní

vyhodnocení

zjištěného

obsahu

humusu

ve

vzorku:……………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………..............……. 1

Výsledky uveďte s přesností na 0,01 %.

36

Otázky k prozkoušení studentů: 1. Vyjmenujte možné typy sorpce v půdě. 2. Vysvětlete pojem huminové kyseliny. 3. Vysvětlete pojem humus. 4. Do jakých skupin je možno půdy rozdělit? 5. Vyjmenujte typy nejčastěji používaných hnojiv. 6. Popište možnosti odběru vzorků půdy pro analýzu. 7. Popište postup pro úpravu vzorků půdy před vlastní analýzou. 8. Vysvětlete rozdíl mezi jemnozemí I a jemnozemí II. 9. Vysvětlete, co charakterizuje acidita půdy. 10. Vysvětlete pojem antagonismus. 11. Popište metodu kalibrační křivky. 12. Popište základní princip potenciometrie. 13. Popište základní princip fotometrického stanovení. 14. Vysvětlete pojem iontově selektivní elektroda. 15. Vyjmenujte metody vhodné pro stanovení obsahu dusičnanů v půdě. 16. Vyjmenujte metody vhodné pro stanovení obsahu hořčíku v půdě. 17. Vyjmenujte metody vhodné pro stanovení obsahu draslíku v půdě. 18. Vyjmenujte metody vhodné ke stanovení obsahu fosforu v půdě.

37

Doporučená literatura: 1. http://www.agrokrom.cz/texty/HNOJENI/skripta_Richter/VR_vlastnosti_pudy_draslik.pdf [cit. 10-11-1012] 2. http://www.agrokrom.cz/texty/HNOJENI/skripta_Richter/VR_vlastnosti_pudy%20_horcik.pd f

[cit. 10-11-1012]

3. http://www.agrokrom.cz/texty/HNOJENI/skripta_Richter/VR_vlastnosti_pudy_fosfor.pdf [cit. 10-11-1012] 4. http://www.agrokrom.cz/texty/HNOJENI/skripta_Richter/VR_vlastnosti_pudy_dusik.pdf [cit. 10-11-1012] 5. http://www.agrokrom.cz/texty/metodiky/radce_hospodare/radce_pudni_podminky_cr.pdf [cit. 10-11-1012] 6. Patnaik P.: Handbook of Environmental Analysis: Chemical Pollutants in Air, Water, Soil, and Solid Wastes, CRC Press, Boca Raton, 2010. 7. Šťulík K. a kol.: Analytické separační metody, Karolinum Praha, 2005. 8. Zýka J. a kol.: Analytická příručka, 1.díl, SNTL Praha, 1988. 9. Harvey D.: Modern Analytical Chemistry, The McGraw-Hill Companies USA, 2000.

38

Stanovení mědi a niklu v oceli Teoretická část Elektrochemická rozpouštěcí voltametrie je metoda stopové analýzy, která je založena na předběžném zakoncentrování analytu z roztoku vzorku na pracovní elektrodě a následném rozpouštění nahromaděného analytu z povrchu elektrody zpět do roztoku. Zakoncentrování analytu na elektrodě se provádí potenciostatickou elektrolýzou nebo adsorpcí. Při stanovení anodickou rozpouštěcí (stripping) voltametrií (ASV) se analyt nahromaděný na rtuťové kapkové elektrodě rozpouští anodicky zpět do roztoku (oxidace). ASV je vhodná především pro stanovení iontů těžkých kovů. Adsorpční rozpouštěcí voltametrie (AdSV) má značný význam zejména při stanovení stopových koncentrací organických látek, které jsou schopné adsorbovat se na povrch elektrody. Vzorek oceli se mineralizuje anorganickými kyselinami a poté se nikl stanoví metodou AdSV a měď metodou ASV. Při vysokém obsahu sledované složky lze využít rovněž metodu fast scan diferenční pulzní voltamerie (FSDPV). Praktická část 1. Úkol Stanovit obsah niklu a mědi v oceli pomocí voltametrie. 2. Pomůcky a přístroje • Eco-Tribo polarograf se softwarem PolarPro 2.0 (Polaro-Sensors, Praha), vařič, dusík z tlakové láhve, analytické váhy, nasycená argentochloridová referentní elektroda, platinová pomocná elektroda, pracovní visící rtuťová kapková elektroda • polarografické nádobky, odměrné baňky, skleněné pipety, mikropipety, kádinky, pipetovací balónek, rukavice, ochranné brýle, ochranný štít 3. Chemikálie • zásobní roztok 0,01 M CuSO4, zásobní roztok 0,01 M NiSO4, HCl (1:1), HNO3 (1:1), 70% HClO4, triethanolamin, dimethylglyoxim (DH2), amoniakální pufr (0,1 M NH4OH + 0,1 M NH4Cl), uhličitano-vinanový pufr (0,8 M K2CO3 + 0,4 M NaKC4H4O6 + 0,2 M HCl), redestilovaná voda, vzorek oceli 4. Pracovní postup • Příprava vzorku o ve větší kádince (o objemu přibližně 250 ml) přikryté hodinovým sklem se za přídavku 20 – 25 ml zředěné HCl (1:1) rozpustí přesně zvážené množství vzorku (přibližně 0,2 g) o po rozpuštění vzorku se přidá 5 ml zředěné HNO3 (1:1) a 2 ml 70% HClO4 na rozrušení karbidů o obsah kádinky se nechá na vodní nebo pískové lázni opatrně odpařit do sucha o odparek se rozpustí v 10 ml HCl (1:1), vznikne-li sraženina, izoluje se filtrací a roztok se v odměrné baňce doplní vodou na definovaný objem (50 ml) Bezpečnostní upozornění: Koncentrované roztoky kyseliny chloristé se při styku s org. látkami za horka explozivně rozkládají. Odpařování se provádí v zavřené digestoři, při práci se používá ochranný štít.

39

• Stanovení niklu o do polarografické nádobky se odpipetuje 1,0 ml vzorku (max. 10 μg Ni), 0,5 ml triethanolaminu, 10 ml 0,1 M amoniakálního pufru, 0,2 ml 0,025% alkoholického  DH2 o obsah polarografické nádobky se doplní vodou do objemu 20 ml o nádobka se umístí do stojánku polarografu a připravený roztok se probublá inertním plynem (5 – 10 min) o stanovení se provádí na počítačově řízeném Eko-Tribo polarografu v pracovním režimu DP-stripping-HDME o parametry měření se nastaví podle obrázku 1 o kvantitativní stanovení se provádí metodou standardního přídavku, vyhodnocení je součástí softwarového vybavení přístroje o před vlastním měřením se zaznamená vlna slepého vzorku

Obrázek 1: Nastavení parametrů pro stanovení niklu v oceli adsorptivní rozpouštěcí voltametrií. • Stanovení mědi o stanovení se provádí v prostředí uhličitanu za přítomnosti vinanu sodno-draselného, který brání srážení některých kovů o do polarografické nádobky se odpipetuje 1 ml vzorku a 10 ml uhličitano-vinanového pufru o obsah polarografické nádobky se doplní vodou do objemu 20 ml o po důkladném probublání se provede měření v pracovním režimu DP-stripping-HDME o parametry měření se nastaví podle obrázku 2 o kvantitativní stanovení se provádí metodou standardního přídavku, vyhodnocení je součástí softwarového vybavení přístroje o před vlastním měřením se zaznamená vlna slepého vzorku

40

Obrázek 2: Nastavení parametrů pro stanovení mědi v oceli anodickou rozpouštěcí voltametrií. 5. Vyhodnocení Kvantifikace analytů se provádí metodou standardního přídavku, přičemž samotné vyhodnocení je součástí softwarového vybavení pro Eco-Tribo polarograf. 6. Otázky • Jaké konkrétní chemické individuum se při stanovení niklu adsorbuje na rtuťovou kapkovou elektrodu? • Jakou úlohu v tříelektrodovém zapojení plní pomocná elektroda? 7. Doporučená literatura • • •

Wang J.: Analytical Electrochemistry. New York: Wiley-VCH, 2001. Barek J., Opekar F., Štulík K.: Elektroanalytická chemie. Praha: UK – Karolinum, 2005. Zýka J. a kol.: Analytická příručka, 1. díl. Praha: SNTL, 1988.

41

Stanovení kadmia v máku Teoretická část Anodická rozpouštěcí (stripping) voltametrie (ASV) je metoda stopové analýzy, která je založena na předběžném nahromadění analyzovaného kovového iontu redukcí na povrchu rtuťové kapkové elektrody a následné oxidaci vyloučeného kovu anodickou polarizací elektrody. Oxidace kovu se sleduje metodou DPV. Metody elektrochemické rozpouštěcí voltametrie dosahují nízkých detekčních limitů a jsou často srovnávány s metodou atomové absorpční spektrometrie. Organické složky máku se rozloží „suchou“ mineralizací při kontrolovaném teplotním režimu. Po převedení popela do roztoku se provede stanovení kadmia anodickou rozpouštěcí voltametrií. Praktická část 1. Úkol Stanovit obsah kadmia anodickou stripping voltametrií na rtuťové kapkové elektrodě v máku. 2. Pomůcky a přístroje • Eco-Tribo polarograf se softwarem PolarPro 2.0 (Polaro-Sensors, Praha), sušárna, muflová pec, vařič, dusík z tlakové láhve, analytické váhy, nasycená argentochloridová referentní elektroda, platinová pomocná elektroda, pracovní visící rtuťová kapková elektroda • polarografické nádobky, odměrné baňky, skleněné pipety, mikropipety, kádinky, rukavice, ochranné brýle, ochranný štít. 3. Chemikálie • zásobní roztok 0,01 M Cd(NO3)2, konc. HCl, konc. HNO3, konc. HClO4, zředěná HNO3 (1:5), redestilovaná voda, vzorek máku 4. Pracovní postup • Příprava vzorku – mineralizace máku o čištění porcelánového kelímku: kelímek se naplní zředěnou HNO3 (1:5) a nechá stát celou noc, poté se omyje vodou a redestilovanou vodou, vysuší a v peci vyžíhá 2 hodiny při 600°C o do kelímku se přesně naváží 1 – 2 g máku, kelímek se vzorkem se vloží do sušárny, ve které se pozvolna zvyšuje teplota tak, aby během 3 hodin dosáhla 200°C o kelímek se vloží do muflové pece vyhřáté na 200°C o rychlostí 80°C za hodinu se zvyšuje teplota v muflové peci až na 450°C o kelímek se vzorkem se žíhá přes noc v muflové peci při 450°C (popel je šedobílý) o kelímek s popelem se nechá vychladnout v exsikátoru (popel je velmi jemný a lehoučký, v případě neopatrné manipulace hrozí významné ztráty) o poté se do kelímku opatrně přikápne 0,5 ml konc. HNO3 a 0,1 ml HCl o kyseliny se odkouří při 70 – 80°C na vařiči nebo v otevřené sušárně o opatrně se přidá 0,5 ml konc. HClO4 a opět se odkouří (bezpečnostní upozornění: koncentrované roztoky kyseliny chloristé se při styku s org. látkami za horka explozivně rozkládají, při práci se používá ochranný štít) o kelímek s odparkem se vloží do pece a po dobu jedné hodiny se teplota zvyšuje na 450°C o po 30 min při 450°C se kelímek vyjme (popel je bílý až mírně nažloutlý) a přidá se 0,05 ml konc. HNO3, 0,05 ml HCl a ve třech podílech redestilovaná voda (1 + 1 + 10 ml)

42

o suspendovaný obsah kelímku se kvantitativně převede do odměrné baňky (25 ml) postupným vyplachováním vodou (popř. s využitím ultrazvukové lázně) o mineralizaci je vhodné provádět paralelně ve 2 kelímcích • Stanovení kadmia o do polarografické nádobky se odpipetuje 10 ml vzorku a nádobka se umístí do stojánku polarografu o obsah nádobky se před měřením probublá inertním plynem (5 – 10 min) o stanovení se provádí na počítačově řízeném Eco-Tribo polarografu v pracovním režimu DP-stripping-HDME o parametry měření se nastaví podle obrázku 1 o kvantitativní stanovení se provádí metodou standardního přídavku, vyhodnocení je součástí softwarového vybavení přístroje

Obrázek 1: Nastavení parametrů pro stanovení kadmia v máku anodickou rozpouštěcí voltametrií. 5. Vyhodnocení Kvantifikace analytu se provádí metodou standardního přídavku, přičemž samotné vyhodnocení je součástí softwarového vybavení pro Eco-Tribo polarograf. 6. Otázky • Navrhněte jinou instrumentální metodu ke stanovení kadmia. • Zamyslete se, proč je důležité sledovat obsah kadmia v potravinách. 7. Doporučená literatura • • • •

Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin 1. Tábor: Ossis, 2009. Wang J.: Analytical Electrochemistry. New York: Wiley-VCH, 2001. Barek J., Opekar F., Štulík K.: Elektroanalytická chemie. Praha: UK – Karolinum, 2005. Zýka J. a kol.: Analytická příručka, 1. díl. Praha: SNTL, 1988.

43

Fotometrické stanovení manganu v neželezné slitině Teoretická část Mangan je stříbrobílý, lesklý, tvrdý a velmi křehký kov. Za objev manganu (1774) vděčíme švédskému chemikovi německého původu jménem C. V. Scheele, který mimo jiných prvků objevil také kyslík a dusík. Mangan je po železu druhý nejrozšířenější těžký kov na Zemi. Je známo přibližně tři sta minerálů s obsahem manganu a v přírodě často doprovází železné rudy. Velmi vzácně se vyskytuje také jako ryzí kov. V lidském organismu hraje mangan významnou roli při metabolismu sacharidů, bílkovin a tuků. Nadbytek manganu má však na lidský organismus toxický účinek, přičemž nejvyšší toxicitu vykazují sloučeniny trojmocného manganu. Největší část světové produkce manganu (více než 85 %) se spotřebuje jako legující přísada ocelí – mangan potlačuje korozi, zvyšuje tvrdost, pevnost v tahu a kujnost. Dalším významným využitím manganu je legování hliníku, bronzů a mosazí. Manganem legovaný hliník je odolnější vůči chemické korozi. Manganové bronzy (Cu + Sn + Mn) obvykle obsahují i další legury, mangan snižuje tepelnou a elektrickou vodivost, proto se tyto slitiny uplatňují při výrobě odporových vodičů a přesných měřících odporů. Některé manganové bronzy se užívají k odlévání přesných součástek pro jemnou mechaniku. Manganové mosazi (Cu + Zn + Mn) mají dobré antikorozní a mechanické vlastnosti, odolávají i mořské vodě, našly uplatnění při výrobě lodních šroubů, turbínových lopatek, součástí zbraní a armatur pro nejvyšší tlaky. Za zmínku stojí i tzv. Heuslerovy slitiny – mangan tvoří s mnoha kovy (např. Sb, Bi, Al, Sn) ferromagnetické slitiny, přestože neobsahují ferromagnetický kov. Užívají se k výrobě permanentních magnetů. Principiálně stanovení manganu v této úloze spočívá v rozpuštění vzorku slitiny v kyselině dusičné (viz reakce), převedení vzniklých manganatých iontů na fialově zbarvené MnO4- a jejich následném fotometrickém stanovení. 3 Mn + 2 NO3- + 8 H+  3 Mn2+ + 2 NO + 4 H2O Manganaté ionty lze silnými oxidačními činidly zoxidovat na intenzivně fialově zbarvené anionty MnO4-. Samotnou oxidaci lze provést například dvěma následujícími způsoby: a) Jodistan draselný KIO4 oxiduje manganaté ionty ve slabě kyselém prostředí a za zvýšené teploty přímo na MnO4- bez použití katalyzátoru. Katalyzátor zde pravděpodobně vzniká v průběhu mezireakcí. b) Peroxosíran draselný K2S2O8 oxiduje manganaté ionty v prostředí zředěné kyseliny dusičné pouze na MnO2. Je-li reakce katalyticky podpořena Ag+ proběhne oxidace až na fialově zabarvené anionty MnO4-. Fotometrické stanovení MnO4- zůstává stále jednou z nejvíce používaných metod na stanovení manganu. Roztok MnO4- vykazuje velmi charakteristickou absorpční křivku s dvěma maximy ve viditelné oblasti spektra, prvním při 526,5 nm a druhým při 546,5 nm, kromě toho má široký absorpční pás v blízké ultrafialové oblasti při 310 nm. Pracuje-li se s méně kvalitním monochromatickým zářením, splývají obě maxima v jeden pás s jedním maximem přibližně při 530 nm.

44

Praktická část 1. Úkol Stanovit obsah manganu v předložené neželezné slitině (např. mosazi) pomocí spektrofotometrie. 2. Pomůcky a přístroje • fotometr nebo spektrofotometr, analytické váhy, vařič • odměrné baňky, kádinky, hodinová skla, skleněné pipety, pipetovací balónek, pomůcky potřebné k sestavení filtrační aparatury, rukavice, ochranné brýle 3. Chemikálie • vzorek slitiny, MnSO4, KIO4, H2SO4 (1:4), HNO3 (1:1), konc. HNO3, konc. H3PO4, K2S2O8 (nebo NH4S2O8), AgNO3, destilovaná voda 4. Pracovní postup • Příprava vzorku o ve větší kádince (o objemu přibližně 400 ml) přikryté hodinovým sklem se za přídavku 10 ml zředěné HNO3 (1:1) a za mírné teploty rozpustí přesně zvážené množství vzorku (přibližně 0,5 g) o po rozpuštění vzorku se vyvaří oxidy dusíku o hodinové sklo a stěny kádinky se opláchnou malým množstvím dest. vody o k rozpuštěnému vzorku se přidá 10 – 15 ml zředěné HNO3 (1:1) o vznikne-li sraženina, je nutné ji odfiltrovat o filtrát se převede do 100 ml odměrné baňky a doplní destilovanou vodou po rysku o výše popsaným způsobem je vhodné zpracovat alespoň dvě navážky vzorku • Příprava základního roztoku Mn2+ (0,01 g/100 ml) o do 100 ml odměrné baňky se převede 0,02749 g MnSO4 (vyžíhaného při 500°C) o obsah odměrné baňky se okyselí přídavkem 1 ml zředěné H2SO4 (1:4) a po rozpuštění navážky doplní destilovanou vodou po rysku o připravený základní roztok manganatých iontů se použije k přípravě sady kalibračních roztoků s obsahem 0,06 – 1,2 mg Mn2+ (např. 0,06; 0,20; 0,40; 0,70; 0,90; 1,20 mg) • Stanovení manganu o roztok obsahující 0,06 – 1,20 mg Mn2+ (10 ml vzorku) se okyselí přídavkem 3 – 8 ml konc. HNO3 a stejným objemem konc. H3PO4 (objem zvyšujeme po 1 ml se zvyšujícím se obsahem Mn2+) o oxidaci Mn2+ lze provádět dvěma postupy: a) oxidace jodistanem draselným • ke kyselému roztoku se přidá 0,1 – 0,25 g pevného KIO4 a roztok se povaří po dobu 2 - 5 minut • po ochlazení na laboratorní teplotu se v odměrné baňce (50 ml) doplní po rysku b) oxidace peroxosíranem draselným • ke kyselému roztoku se přidá 0,5 ml 2% AgNO3 a 0,5 g pevného K2S2O8 nebo NH4S2O8 • roztok se cca 2 minuty povaří a po ochlazení doplní na definovaný objem 50 ml o stejným způsobem se zpracují vzorky slitiny a blank

45

o pro kontrolu lze s použitím některého kalibračního roztoku s vhodnou koncentrací MnO4zhotovit absorpční křivku ve viditelné oblasti spektra o stanovení se provede při vlnové délce prvního maxima 5. Vyhodnocení Kvantitativní stanovení manganu v předloženém vzorku se provádí metodou kalibrační křivky. S využitím kalibračních dat se vytvoří kalibrační závislost, zvolí se vhodný model regresní funkce a pomocí regresní rovnice se určí obsah manganu ve vzorku. 6. Otázky • Načrtněte jakékoli absorpční spektrum, uveďte jeho základní charakteristiky. • Jakou úlohu má přídavek kyseliny fosforečné? 7. Doporučená literatura • • • • •

Remy H.: Anorganická chemie - II. díl. Praha: SNTL, 1972. Vokáč A.: Analytická chemie kvalitativní. Praha: Academia, 1966. Zýka J. a kol.: Analytická příručka, 2. díl. Praha: SNTL, 1988. Holzbecher Z.: Analytická chemie. Praha: SNTL, 1974. Autor neuveden: Periodická tabulka [online]. 2009 [cit. 24. 9. 2012]. Dostupné z: http://www.prvky.com.

46

Stanovení triazinových pesticidů v půdě pomocí plynové chromatografie TEORETICKÁ ČÁST Pesticidy Pesticidy jsou chemické prostředky, které se nejčastěji používají v zemědělství, a to především na tlumení a hubení rostlinných a živočišných škůdců. Hlavním důvodem jejich používání je tedy zamezení ztrát na kulturních rostlinách, zásobách potravin i krmiv. Podle biologické účinnosti pesticidů je můžeme rozdělit např. na insekticidy, herbicidy a fungicidy. Triazinové pesticidy (herbicidy) jsou nejčastěji používanou skupinou pesticidů. Triazinové pesticidy jsou relativně stabilní látky, které jsou nebezpečné pro vodní živočichy. Vyskytují se ve formě reziduí v povrchových a podzemních vodách a také v půdě. V některých zemích (např. v Německu) je používání triazinových pesticidů zakázáno, některé další země se snaží jejich použití alespoň omezit.

Plynová chromatografie Chromatografie je separační metoda využívající dělení složek mezi dvěma fázemi - mobilní a stacionární. V případě plynové chromatografie je mobilní fází inertní (nosný) plyn. Stacionární fází je nejčastěji kapalina zakotvená na vhodném inertním nosiči nebo povrchově aktivní adsorbent. Analyty jsou v koloně děleny na základě různé schopnosti poutat se na stacionární fázi. Hlavními výhodami této metody jsou: rychlé provedení analýzy, účinná separace a malé množství vzorku potřebného k analýze. Plynová chromatografie je metoda vhodná pouze pro analýzu těkavých látek, které jsou tepelně stálé, nebo látek po derivatizaci. Derivatizace je v plynové chromatografii používána především pro zvýšení těkavosti popř. tepelné stability látek. Detektory používanými v plynové chromatografii jsou např. tepelně-vodivostní detektor, plamenověionizační detektor, detektor elektronového záchytu a hmotnostně spektrometrický detektor. Pro stanovení triazinových pesticidů v půdě bude použito spojení plynové chromatografie s NPD detektorem, což je detektor, který je citlivý na sloučeniny obsahující atomy dusíku a fosforu.

47

Úprava vzorku Izolace a prekoncentrace organických polutantů z komplikovaných matric jako je např. hlína, sediment či odpadní kal, je velmi náročná a často i zdlouhavá operace. S využitím moderních vysokoúčinných extrakčních technik je možné tento zdlouhavý krok úpravy a izolace zkrátit na desítky minut. Superkritická fluidní extrakce využívá jako extrakčního media superkritickou tekutinu oxidu uhličitého. Superkritický CO2 je nepolární sloučenina a v superkritickém stavu se současně chová jako kapalina i plyn. Kombinují se zde výhody obou skupenství, zejména solvatační vlastnosti rozpouštědel a difuzivita plynů. Pro extrakci polárních sloučenin, jimiž triazinové pesticidy jsou, je nutné přidávat modifikátor (methanol, acetonitril aj.), aby bylo možné i tyto polárnější sloučeniny extrahovat s dostatečnou účinností. Záchyt extrahovaných analytů se provádí přímo expanzí CO2 do organického rozpouštědla. Je možné použít i záchyt do filmu rozpouštědla nebo zachycení na pevném sorbetu. Tyto dvě metody záchytu jsou ale podstatně experimentálně náročnější.

PRAKTICKÁ ČÁST Úkol: V předloženém vzorku půdy stanovte obsah triazinových pesticidů Pomůcky a přístroje: plynový chromatogram s NPD detektorem, zařízení pro superkritickou fluidní extrakci, váhy, odměrné baňky, eppendorfky, lžička, střička Chemikálie: Zásobní roztok obsahující 6 triazinových pesticidů (Simazin, Atrazin, Terbutylazin, Desmetrin, Prometrin, Terbutryn), Amitriptilin – interní standard, vzorek půdy, aceton, methanol, destilovaná voda Pracovní postup: Příprava vzorku – superkritická fluidní extrakce • Do ocelové patrony se naváží 5 g vzorku půdy a přidá se 200 µl methanolu (jako modifikátoru) •

Podle pokynů vedoucího cvičení se patrona uzavře, umístí se do extraktoru a zvolí se příslušný extrakční program

Extrakční program Tlak: 20 MPa Čas: 30 minut Modifikátor: 200 µl methanolu Teplota cely: 35 °C Teplota destruktoru: 100 °C Teplota záchytu: 30 °C

48

•

Záchyt analytů se provádí do 1 ml acetonu

•

V průběhu extrakce se doplňují malá množství acetonu, aby byl ve viálce přítomen a nedocházelo ke ztrátám analytů

•

Po extrakci se provede stanovení triazinových pesticidů pomocí plynové chromatografie

Příprava kalibračních roztoků: • Ze zásobního roztoku obsahujícího 6 triazinových pesticidů (80 µg/ml) se připraví pracovní roztok mající koncentraci 1,6 µg/ml, a to odpipetováním vypočteného množství do odměrné baňky (10 ml) •

Pracovní roztok se doplní acetonem po rysku

•

Z pracovního roztoku se připraví sada kalibračních roztoků o celkovém objemu 1 ml majících následující koncentrace: 0,32; 0,64; 0,80; 0,96 a 1,28 µg/ml

•

Do všech kalibračních roztoků je potřeba přidat (pomocí injekční stříkačky Hamilton) 10 µl roztoku interního standardu Amitriptilinu o koncentraci 1 mg/ml

•

Následně se provede analýza všech kalibračních roztoků pomocí plynové chromatografie

Plynová chromatografie s NPD • Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení plynového chromatografu HP 5890 Series II s NPD detektorem Experimentální podmínky Parametr Kolona

Podmínky HP-5 (5% fenyl-95% dimethylpolysiloxan) 30 m x 0,25 mm I.D. x 0,25 µm Teplota nástřiku 250 °C Nástřik 1 µl – metoda splitless 1 min. Teplotní program 70 °C – 2 minuty 30 °C/min  180 °C – 12 minut 10 °C/min  250 °C – 5 minut Teplota detektoru 250 °C Nosný plyn Helium (4.8) 1,73 ml/min (150 kPa) Průtoky plynů pro detektor Vodík 3,7 ml/min Dusík 32 ml/min Vzduch 200 ml/min

•

Postupně se proměří všechny kalibrační roztoky a vyextrahovaný vzorek

•

Provede se integrace píků, sestrojí se kalibrační křivka a vypočítají se obsahy jednotlivých triazinových pesticidů v předloženém vzorku půdy

49

Vyhodnocení: • Pro sestrojení kalibrační křivky se použijí korigované plochy píků (plocha píku analytu/plocha píku interního standardu •

Kalibrační křivka se vytvoří v programu QC Expert, pomocí tohoto programu se dále vypočítají limity detekce a limity stanovitelnosti pro jednotlivé standardy

•

Pomocí zpětných odhadů se uvede obsah triazinových pesticidů ve vzorku

•

Pozn. u všech hodnot je potřeba uvést směrodatnou odchylku nebo interval spolehlivosti

Triazinový pesticid

Limit detekce

Limit stanovitelnosti

(dle elučního pořadí)

(LOD)

(LOQ)

Vypočtený obsah ve vzorku

Simazin Atrazin Terbutylazin Desmetrin Prometrin Terbutryn Otázky k prozkoušení studentů: 1. Vysvětlete základní princip plynové chromatografie. 2. Vyjmenujte typy detektorů používané v plynové chromatografii. 3. Navrhněte další analytickou metodu, která je vhodná pro stanovení triazinových pesticidů. 4. Vyjmenujte a popište základní retenční charakteristiky v plynové chromatografii. 5. Popište rozdíly mezi eluční a frontální metodou. 6. Popište, k čemu jsou určeny pesticidy. 7. Popište základní vlivy pesticidů na ekosystémy a lidské zdraví. 8. Napište, podle čeho je možné zařadit pesticidy do skupin. Doporučená literatura: 1. Churáček J.: Analytická separace látek, SNTL, Praha, 1990. 2. http://www.agrokrom.cz/texty/metodiky/radce_hospodare/radce_herbicidy_a_jejich_vyuziti.pdf [cit. 05-12-12] 3. Patnaik P.: Handbook of Environmental Analysis: Chemical Pollutants in Air, Water, Soil, and Solid Wastes, CRC Press, Boca Raton, 2010. 4. Šťulík K. a kol.: Analytické separační metody, Karolinum Praha, 2005.

50

Analýza mastných kyselin v přírodních tucích TEORETICKÁ ČÁST Mastné kyseliny V přírodě se vyskytuje více než 100 mastných kyselin. Mastné kyseliny (vyšší monokarboxylové kyseliny) mají většinou sudý počet uhlíků a lineární řetězec. Obvykle se vyskytují v esterifikované formě jako součást jiných lipidů (např. acylglycerolů a fosfolipidů). Mastné kyseliny se od sebe liší především délkou řetězce, množstvím dvojných vazeb a polohou vodíkových atomů kolem vazby. Podle stupně nasycenosti je možno mastné kyseliny rozdělit do dvou hlavních skupin, kterými jsou nasycené mastné kyseliny a nenasycené mastné kyseliny. Přírodní tuky jsou tvořeny především třemi mastnými kyselinami, kterými jsou kyselina olejová, linolová a palmitová. Dalšími kyselinami zastoupenými v menším množství jsou např. kyselina stearová, arachová, lignocerová, myristová a různé transmastné kyseliny.

Plynová chromatografie Chromatografie je separační metoda využívající dělení složek mezi dvěma fázemi - mobilní a stacionární. V případě plynové chromatografie je mobilní fází inertní (nosný) plyn. Stacionární fází je nejčastěji kapalina zakotvená na vhodném inertním nosiči nebo povrchově aktivní adsorbent. Analyty jsou v koloně děleny na základě různé schopnosti poutat se na stacionární fázi. Hlavními výhodami této metody jsou: rychlé provedení analýzy, účinná separace a malé množství vzorku potřebného k analýze. Plynová chromatografie je metoda vhodná pouze pro analýzu těkavých látek, které jsou tepelně stálé, nebo látek po derivatizaci. Derivatizace je v plynové chromatografii používána především pro zvýšení těkavosti popř. tepelné stability látek. Detektory používanými v plynové chromatografii jsou např. tepelně-vodivostní detektor, plamenověionizační detektor, detektor elektronového záchytu a hmotnostně spektrometrický detektor. Pro stanovení mastných kyselin v přírodních tucích bude použito spojení plynové chromatografie s hmotnostně spektrometrickým detektorem.

51

PRAKTICKÁ ČÁST Úkol: Stanovte poměr mastných kyselin v předloženém vzorku tuku. Zjištěné výsledky slovně okomentujte. Pomůcky a přístroje: Plynový chromatograf Agilent HP 6890 s hmotnostním spektrometrem Agilent 5973 N MSD, řídící a vyhodnocovací software ChemStation, váhy, vodní lázeň, zpětný chladič, filtrační aparatura, odměrná baňka, dělící nálevka, lžička, střička Chemikálie: vzorek tuku, hexan p.a., methanol p.a., 0,5 M KOH v methanolu, bezvodý Na2SO4, koncentrovaná H2SO4, nasycený vodný roztok NaCl, 0,1 % methyloranž, destilovaná voda Pracovní postup: Příprava vzorku: • Do odměrné baňky (100 ml) se naváží 0,5 g vzorku tuku (u vzorků, které obsahují vodu, se voda předem odstraní filtrací přes bezvodý Na2SO4) •

Přidá se 10 ml 0,5 M roztoku KOH v methanolu a směs se zmýdelňuje 45 minut pod zpětným chladičem na vroucí vodní lázni

•

Po ochlazení se přidají 2 kapky methyloranže a opatrně se přikapává koncentrovaná H2SO4 až do zřetelně kyselé reakce (trvalé červené zbarvení)

•

Přidají se navíc 2 kapky koncentrované H2SO4

•

Směs se znovu vaří 45 minut pod zpětným chladičem

•

Přes chladič se přidá asi 50 ml destilované vody

•

Po ochlazení se obsah baňky převede do dělící nálevky (250 ml)

•

Methylestery se vyextrahují 3 x 10 ml hexanu, k lepšímu rozdělení vrstev je možno do nálevky přidat asi 5 ml nasyceného roztoku NaCl

•

Spojené hexanové extrakty se promyjí 3 x 20 ml destilované vody a vysuší se filtrací přes bezvodý Na2SO4

•

Alikvotní podíl extraktu se ředí hexanem tak, aby výsledná koncentrace roztoku nepřekročila hodnotu 1 mg/ml (vztaženo k výchozí navážce tuku)

•

Zředěný extrakt se použije na analýzu pomocí plynové chromatografie ve spojení s hmotnostním spektrometrem

Analýza pomocí plynové chromatografie s MS detektorem • Podle pokynů vedoucího cvičení se provede nastavení přístroje

52

Experimentální podmínky: Parametr

Podmínky

Kolona

HP 5, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm

Nosný plyn

Helium (4.8), průtok 0,9 ml/min

Nastavení přístroje definováno v metodě SQUALEN.M Nástřik

1 µl; dávkovací puls 140 kPa 0,4 min., 280 °C

Teplotní program

50 °C – 2 minuty 10 °C/min  300 °C – 15 minut

MS sken

29 – 520 m/z Solvent delay: 4 min.

•

Provede se analýza vyextrahovaných analytů z předloženého vzorku

Vyhodnocení: •

Identifikace mastných kyselin se provede pomocí získaných MS spekter a pomocí standardu methylesteru kyseliny olejové

•

Poměr jednotlivých mastných kyselin se vyhodnotí metodou vnitřní normalizace

•

Molární

poměr

n-kyselin

lze

určit

vyhodnocením

iontového

chromatogramu

rekonstruovaného pro hmotu 74 m/z Vypočtený poměr jednotlivých mastných kyselin: _________________________________________________________________________ Slovní vyhodnocení zjištěného poměru mastných kyselin ve vzorku tuku:………………… ……………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………...............….. Otázky k prozkoušení studentů: 1. Vysvětlete metodu vnitřní normalizace. 2. Vysvětlete obecný princip plynové chromatografie. 3. Vyjmenujte a popište základní retenční charakteristiky v plynové chromatografii. 4. Popište základní princip hmotnostní spektrometrie. 5. Popište zásadní rozdíl v rostlinných a živočišných tucích. 6. Vyjmenujte mastné kyseliny, které jsou důležité pro naše zdraví. Proč? 7. Která mastná kyselina pomáhá snižovat hladinu celkového i „špatného cholesterolu“?

53

Doporučená literatura: 1. Šťulík K. a kol.: Analytické separační metody, Karolinum Praha, 2005. 2. Churáček J.: Analytická separace látek, SNTL, Praha, 1990. 3. http://che1.lf1.cuni.cz/html/Mastne_kyseliny_2sm.pdf [cit. 05-12-12] 4. Murray R.K.: Harperova biochemie, H & H, Clearwater, 2002. 5. Ötleş S.: Handbook of food analysis instrument, CRC Press, Boca Raton, 2008.

54

Stanovení laktalbuminu v mléce pomocí gelové elektroforézy TEORETICKÁ ČÁST Gelová elektroforéza Gelová elektroforéza patří v současné době k nejpoužívanějším separačním technikám sloužících k analýze proteinů a nukleových kyselin. Základním principem této metody je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Při separaci se navíc vedle elektroforetické pohyblivosti (mobility) uplatňuje molekulově sítový efekt (póry gelu slouží jako molekulové síto). Nejčastěji využívanými gely jsou gely agarózové a polyakrylamidové (PAGE). V případě gelu agarózového se jedná o síť tvořenou dlouhými cukernými polymery, které jsou vázány nekovalentními vodíkovými můstky a hydrofobními vazbami. V případě PAGE gelu se jedná o síť monomerů akrylamidu, která je spojena kovalentními vazbami pomocí N,N´-methylenbisakrylamidu. Velikost pórů gelu je závislá především na použité koncentraci agarózy či akrylamidu. Gelovou elektroforézu je možno rozdělit na dva hlavní typy, kterými jsou nativní gelová elektroforéza a SDS gelová elektroforéza. Nativní gelová elektroforéza probíhá bez denaturačních činidel a proteiny tedy migrují skrz gel podle jejich celkového náboje, velikosti, tvaru a velikosti pórů gelu. Při použití SDS elektroforézy dochází k denaturaci proteinů a jejich pohyblivost závisí především na molekulové hmotnosti vzniklého polypeptidového řetězce. Po rozdělení analytů pomocí gelové elektroforézy (analýza obvykle trvá několik hodin – závisí především na hodnotě vloženého proudu) je nutné provést jejich detekci. Detekci je možno uskutečnit několika způsoby - jedním z nich je použití barviva Coomassie blue, což je látka, která je schopna navázat se na proteiny. Po odbarvení gelu dojde následně k zviditelnění rozseparovaných proteinů. Proteiny v mléce Kravské mléko v současné době představuje zdroj kvalitních živočišných proteinů. Celkový obsah proteinů v kravském mléce je okolo hodnoty 3,5 %. Pokud je mléko podrobeno odtučnění nebo tepelné úpravě, obsah proteinů se zásadně nemění. Může se však měnit jejich kvalita. V kravském mléce je poměr dvou hlavních proteinů, kterými jsou kasein a laktalbumin (α -laktalbumin, β laktalbumin), 80 : 20. Tento poměr se však může výrazně lišit u dalších druhů mléka (např. u mateřského mléka je tento poměr obrácený).

55

α-laktalbumin je důležitý syrovátkový protein kravského mléka (koncentrace v mléce je cca 1 g/l). Je obsažen taktéž v mléku dalších savců. Podílí se např. na tvorbě laktózy.

PRAKTICKÁ ČÁST Úkol: Proveďte stanoveníα -laktalbuminu v předloženém vzorku mléka. Získaný výsledek slovně zdůvodněte. Pomůcky a přístroje: zařízení pro gelovou elektroforézu, váhy, elektromagnetická míchačka, elektromagnetické míchadlo, odměrné baňky, kádinky, nádoby na vybarvovací a odbarvovací roztok, navažovací lodičky, špachle, lžička, střička, rukavice Chemikálie: α-laktalbumin, 30 % akrylamid, 2 % bisakrylamid, 10 % persíran amonný, TEMED, ethanol, methanol, kyselina octová, kyselina trichloroctová, Coomassie blue, destilovaná voda, Tris, glycin, kyselina chlorovodíková Pracovní postup: Příprava elektrolytů: •

Připraví se elektrolyt, do kterého se následně vloží vytvořený gel: 0,025 M Tris + 0,192 M glycin; pH pufru = 8,3

•

Dále se připraví elektrolyt, který se přidá do gelu během jeho přípravy: 2,25 M Tris + 0,17 M HCl

Příprava gelu: •

Pozor: akrylamid je neurotoxická látka – během manipulace je potřeba pracovat v rukavicích a se zvýšenou opatrností!

•

V první řadě se pomocí připravených roztoků (viz chemikálie) připraví 8 % nativní PAGE gel

•

Postupně se do kádinky odpipetuje: 10,8 ml destilované vody, 4,8 ml pufru, 8 ml 30 % akrylamidu, 6 ml 2 % bisakrylamidu a 100 µl TEMEDu

•

Do kádinky se vloží míchadlo a kádinka se umístí na elektromagnetickou míchačku

•

Připraví se forma na gel

•

Polymerace gelu se provede přidáním 240 µL 10 % roztoku persíranu amonného

•

Roztok se promíchá a nalije do připravené formy

•

Do gelu se vloží hřebínek - v gelu se pomocí něho vytvoří jamky sloužící jako prostor pro nadávkování vzorků

•

Vyčká se na polymerizaci gelu (během této doby je vhodné provést přípravu vzorku a potřebných roztoků – viz níže)

•

Po polymerizaci gelu se vyjme hřebínek

56

Příprava vzorku a roztoků: •

Vzorek mléka není potřeba před analýzou zvlášť upravovat – je potřeba ho pouze 10 x a 100 x naředit

•

Nezředěný i zředěné vzorky mléka se následně analyzují pomocí gelové elektroforézy

•

Připraví se standardní roztok α-laktalbuminu, který poslouží k jeho identifikaci ve vzorku

•

Dále se připraví roztok barviva Coomassie blue (vybarvovací roztok): 0,23 % Coomassie blue + 3,9 % trichloroctové kyseliny + 6 % kyseliny octové a 17 % methanolu

•

Připraví se taktéž tzv. odbarvovací roztok obsahující: 18 % ethanolu + 8 % kyseliny octové

Analýza pomocí gelové elektroforézy: •

Do jamek nadávkujeme vzorky spolu se standardem α-laktalbuminu

•

Vanu naplníme elektrolytem, vložíme do ní opatrně vytvořený gel a uzavřeme ji

•

Podle pokynů vedoucího cvičení provedeme nastavení přístroje

•

Analýzu necháme běžet 2 hodiny, poté gel vložíme na 1 hodinu do připraveného vybarvujícího roztoku

•

Následně vložíme gel do odbarvovacího roztoku (2 x) – po odbarvení vyhodnotíme získaná data

Vyhodnocení: •

Vyhodnotíme skvrny náležícíα -laktalbuminu (identifikaci provedeme pomocí standarduα laktalbuminu)

•

Porovnáme odstíny nezředěného vzorku a vzorků zředěných, výsledek slovně okomentujeme

Slovní vyhodnocení získaných výsledků po analýze mléka pomocí gelové elektroforézy: ……………………………………………………………………………………………………………….……… ……………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………....................................……

57

Otázky k prozkoušení studentů: 1. Vysvětlete obecný princip gelové elektroforézy. 2. Vysvětli pojem separační technika. Uveď příklady technik, které do této skupiny můžeme zařadit. 3. Uveďte, jaká další metoda by mohla být použita pro stanovení proteinů v mléce. 4. Je gelová elektroforéza vhodná pro separaci malých molekul? Odpověď zdůvodněte. 5. Je možné použít gelovou elektroforézu pro analýzu neutrálních látek? 6. Vysvětlete pojem izoelektrický bod. 7. Uveďte typy detekcí, které je možno použít po separaci pomocí gelové elektroforézy. 8. Vysvětlete pojem 2D-gelová elektroforéza. 9. Vyjmenujte základní rozdíly mezi gelovou elektroforézou a kapilární gelovou elektroforézou. 10. Uveďte základní složky (spolu s procentuelním zastoupením), které obsahuje kravské mléko. 11. Uveďte základní složky (spolu s procentuelním zastoupením), které obsahuje mateřské mléko. 12. Vyjmenujte potraviny bohaté na obsah proteinů.

Doporučená literatura: 1. Miller F.P., a kol.: Gel electrophoresis, Alphascript publishing, Mauritius, 2010. 2. Hawcroft D.M.: Electrophoresis, The Basics, IRL Press, Oxford, 1997. 3. B.D. Hames: Gel electrophoresis of proteins, A practical approach, IRL Press, Oxford, 1990. 4. Davídek J.: Laboratorní příručka analýzy potravin, Praha, 1977. 5. Nielsen S.S.: Food Analysis, Springer, New York, 2010. 6. Ötleş S.: Handbook of food analysis instrument, CRC Press, Boca Raton, 2008. 7. Coultate T. P.: Food: The chemistry of its components, RCS Publishing, London, 2009.

58