Cvičení z forenzní chemie

První vydání

Cvičení z forenzní chemie   Vítězslav Maier Martin Švidrnoch Adam Přibylka Joanna Znaleziona

Olomouc 2014, Katedra analytické chemie

Metody odběru a zviditelnění otisků prstů

1

Metody odběru a zviditelnění otisků prstů   Identifikace krevních stop

přenesen. Pro naše účely postačí jako fólie pro přenos otisku prstu lepící páska nebo bílá samolepící fólie.. Chemické metody

Odběrem a analýzou otisků prstů se zabývá odvětví kriminalistické techniky zvané daktyloskopie. Tento obor zkoumá otisky papilárních linií článků prstů (ale také např. dlaní či jejich částí). Vedle zajišťování kriminalistických stop a jejich vyhledávání je hlavním cílem daktyloskopického zkoumání zjistit identitu osoby, která otisk zanechala. Vzhledem k tomu, že průběhy papilárních linií jsou pro každého člověka jedinečné (podobně jako DNA), lze říci, že s největší pravděpodobností neexistují dva lidé, kteří by měli všechny otisky prstů totožné. Každá papilární linie představuje vyvýšenou kožní vrstvu, do níž vede kanálek s vyústěním potních žláz. Dotykem se z papilárních linií přenesou částečky prachu a dalších nečistot společně s potem a vytvoří tak kriminalistickou stopu – daktyloskopický otisk. Díky tomu představuje daktyloskopie jednu ze základních kriminalistických metod, které jsou velmi často využívány k nalezení a identifikaci pachatele.

Pot přenesený z papilárních linií při zanechání otisku prstu obsahuje celou řadu chemických látek, které mohou interagovat s činidly. Mezi chemické látky, které se používají ke zviditelnění otisků prstů, patří zejména ninhydrin, jód, dusičnan stříbrný nebo estery kyanoakrylové kyseliny (tzv. kyanoakryláty). Jód jako takový patří spíše na pomezí fyzikálních a chemických metod, neboť princip detekce je založen na sublimaci jódu a zachytávání jeho částeček na otiscích. Ostatní metody pak využívají chemické reakce, které vedou k viditelné změně (zvýraznění, zabarvení), avšak mnohdy může dojít k poškození nebo zničení materiálu nebo předmětu, na kterém je otisk umístěn. Ninhydrinové činidlo funguje na principu reakce ninhydrinu s aminokyselinami obsaženými v potu (obr. 1), které ulpí při dotyku na předmětu.

Zviditelnění otisku prstů Existuje několik základních metod, které se v kriminalistické praxi běžně používají. Nejčastějším postupem pro zviditelnění (nalezení) otisků je použití tzv. daktyloskopických prášků. Profesionální produkty jsou značně rozdílné a závisí zejména na okolních podmínkách (teplota, vlhkost, fyzikální podklad otisku apod.) a stáří otisku. Pro účely tohoto cvičení budeme používat dva typy daktyloskopických prášků – magnetický železný prach a karbonizovaný uhlík (grafitový prášek). Pro latentní otisky prstů nebo otisky na předmětech a místech, pro které jsou práškové metody nevhodné, využijeme metody chemického zviditelnění, založené na chemické reakci mezi složkami otisku prstu (zejména potu a jeho složek) a chemickým činidlem. Práškové metody Tyto metody jsou vhodné především pro otisky zanechané na matných površích, jako je sklo, plast a jiné syntetické materiály nebo keramika. Principem této metody je adsorpce práškového materiálu na složky otisků. Daktyloskopické prášky se dají hrubě rozdělit na magnetické (např. modifikovaný nebo čistý železný prach) nebo nemagnetické (např. hliníkový prášek, měděný prášek nebo zmíněný grafit (případně jemné aktivní uhlí). Výhodou magnetických prášků je fakt, že je lze buďto přímo nanášet pomocí permanentního magnetu nebo lze přebytečný prášek magnetem zachytit a odstranit. Takto získané daktyloskopické stopy se poté buďto fotografují (v závislosti na povrchu, na němž jsou) nebo se přenášejí tzv. daktyloskopickými fóliemi a poté dále zpracovávání (fotografují, skenují apod.). Daktyloskopických fólii existuje rovněž celá řada a záleží a jejich volba závisí na konkrétním případě použití. Obecně se využívají černé nebo bíle folie na bázi želatiny, na kterou je otisk po zviditelnění

Obr. 1: reakce ninhydrinu a aminokyselinou 

2

Ninhydrin se běžně používá jako činidlo k detekci aminokyselin, působí jako oxidační činidlo a při reakci nejdříve dojde dekarboxylaci příslušné aminokyseliny (např. alaninu, kdy v obr. 1 R = CH3) a vzniklý amin pak podléhá oxidativní deaminaci. Ninhydrin se během této reakce přemění na zabarvený produkt. Reakce může probíhat jak v neutrálním (obr. 1.1) tak kyselém prostředí (obr. 1.2.), a oba produkty pak mají mírně odlišné zabarvení. Jód se používá ve formě prášku nebo jemných krystalků a obvykle je buďto uvolňován teplem přímo na místě (zahřátím speciální trubičky rukou) nebo ve vyvíjecích nádobách v laboratoři. Dusičnan stříbrný se jako činidlo využívá k detekci halogenidových iontů a jako takový může reagovat s chloridovými ionty přítomnými v potu. Vzniká bílá sraženina, které se účinkem záření (běžného polychromatického světla nebo UV záření) přeměňuje na elementární stříbro a tím se zvýrazní zabarvení otisku (černání). Estery kyseliny kyanoakrylové, které se využívají např. jako tzv. vteřinová lepidla, našly své uplatnění také ve forenzní chemii zejména při detekci tzv. latentních otisků prstů. Zahřátím kyanoakrylátů dojde k vývoji par, které se na otiscích prstů usazují ve formě polykyanoakrylát (obr. 2.). Ten je viditelný i pouhým okem, lze však využit i přídavek fluorescenčního nebo nefluorescenčního barviva, který otisk prstu ještě zvýrazní a zviditelní. Takto detekované otisky lze rovněž snadno přenést a dále zpracovávat.

Obr. 2: obecné schéma polymerace methyl kyanoakrylátu   (Nu- představuje nukleofil, v případě detekce otisků prstů např. OH-)

3

Nalezení a zviditelnění daktyloskopické stopy Úkol: Proveďte sérii postupů vedoucí ke zviditelnění otisků prstů na předložených předmětech. Pomůcky: sada jemných štětců, plastové nebo skleněné petriho misky, uzavíratelná průhledná plastová nádobka (vyvíjecí komora pro kyanoakrylátovou nebo jodovou reakci), rozprašovač, kádinky, odměrný válec, plastové nádobky, mikroskopická sklíčka, váhy  a navažovací lodičky nebo papír, sušárna, bílý papír. Chemikálie: ninhydrin, ethanol, methanol, kyselina octová, jód, kyanoakrylát (např. vteřinové lepidlo), dusičnan stříbrný, železný prach, aktivní uhlí nebo grafitový prášek, voda.   Příprava činidel: 1.) Ninhydrin – 50 mg ninhydrinu se naváží a převede do plastové nádobky a přidá se 25 ml ethanolu a 750 µl kyseliny octové (99 %). S ninhydrinem pracujeme opatrně  a v rukavicích, neboť při kontaktu s kůží dojde k podobné reakci a zabarvení jako s otisky prstů. Připravený roztok převedeme do nádobky s rozprašovačem.

2.) Dusičnan stříbrný – připravíme methanolický roztok dusičnanu stříbrného rozpuštěním 500 mg AgNO3 ve 25 ml methanolu. Roztok uchováváme v hnědých zásobních lahvičkách a chráněný před přímým světlem. Část roztoku potřebnou pro práci převedeme do nádobky s rozprašovačem.

3.) Jód a kyanoakrylát – použijeme jodový prášek nebo jemné krystalky, které umístíme přímo do vyvíjecí komory. V případě kyanoakrylátu dáme malé množství (několik kapek) vteřinového lepidla např. na kousek alobalu a ten umístíme do vyvíjecí komory. Při přípravě těchto činidel a následné práci s nimi pracujte vždy v rukavicích a v digestoři! Pozor zejména na vteřinové lepidlo, neboť i malé množství rychle zasychá a lepí většinu materiálů.

4.) Práškové materiály jako železný nebo grafitový prach používáme přímo ze zásobních lahví a v digestoři (v rukavicích a nejlépe s rouškou a v digestoři, neboť vdechovaný prach je zdraví škodlivý a dráždí).

Postup: Předložené materiály, na které byly naneseny otisky prstů (případně sami otisky prstů naneste – dle pokynů vedoucího cvičení), podrobte zkoumání pomocí uvedených činidel. Skleněné, keramické nebo plastové materiály jsou vhodné jak pro metody chemické tak i práškové, zatímco otisky prstu např. na papíru lze lépe zviditelnit pomocí chemických činidel – ninhydrinu a dusičnanu stříbrného.

Obecný postup práce je následující: V rukavicích (!!) opatrně (abyste nedošlo k poškození nebo vzniku dalších otisků) zkoumané předměty rozdělíme na plastové, kovové, skleněné nebo keramické (skupina 1), a na papírové (nebo jiné nasákavé materiály, skupina 2). Vždy je připraveno od každého materiálu více vzorků, aby mohly být vyzkoušeny všechny techniky. Otisky prstů na materiálech ze skupiny A podrobíme nejprve daktyloskopickému zkoumání pomocí prášků a zaznamenáme případné změny. Pracujeme velmi opatrně a prášek spíše „sypeme“ než natíráme štětcem. Při příliš prudkém nanášení dojde k setření otisků nebo k detekci pouze jejich částí. Stejné materiály poté vložíme do vyvíjecí komory tak, aby se jejich plochy nedotýkaly stěn nádoby. Vložíme dané činidlo a necháme cca 10-20 minut vyvíjet. Probíhá-li vyvíjení příliš pomalu a nedochází ke zviditelnění otisků, je možné nádobu mírně zahřát (cca 40 -60 °C) např. na vodní lázni. Zviditelnění otisků se projeví jako bílý povlak v případě kyanoakrylátu nebo jako hnědočervené otisky v případě jódu). Materiály ze skupiny B (především papír) položíme na pevnou podložku (např. plast nebo sklo) v digestoři a stejnoměrně aplikujeme činidla pomocí rozprašovače. Nechte činidla zaschnout, případně zkoumaný vzorek opatrně přeneste do sušárny a vysušte (při teplotě cca 80 – 120 °C). Neprojeví-li se zabarvení, je nutné sušení opakovat. V případě dusičnanu stříbrného nanášeného na bílý podklad je potřeba vzorek nechat několik minut na světle nebo použít UV lampu aby došlo k vyloučení elementárního stříbra a ztmavnutí otisku. Vyhodnocení Pokuste se nalézt nejvhodnější činidlo pro předložený materiál. Zviditelněné otisky zaznamenejte (např. fotograficky nebo skenováním přes transparentní fólii).

4

2. Činidlo na bázi 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidinu (TMB)

Orientační zkouška na přítomnost krve Orientační zkouška je nezbytnou součástí předcházejícím vlastní analýze. Je nutné potvrdit nebo vyvrátit zdali se skutečně jedná o suspektní vzorek, neboť analýza bývá mnohdy nákladná. Obvykle, pokud je to možné, se tato kvalitativní analýza provádí přímo na místě činu, aby se zamezilo záměně vzorků. Ne vždy je to však možné, např. vzhledem k množství vzorku, jeho lokalizaci (pevný povrch, látka či jiný materiál schopný sorpce činidel) apod.  Z mnoha typů kvalitativní analýzy krevních stop jsou zde uvedeny dvě nejběžnější  a nejjednodušší.

Deriváty benzidinu se peroxidem vodíku nebo jiným oxidačním činidlem oxidují na produkty modré barvy, tzv. benzidinovou modř. Reakce je katalyzována buďto enzymaticky pomocí peroxidas (POD) nebo látkami, které ve své molekule obsahují porfyrin hem s centrálním atomem železa, tedy např. krevní barvivo hemoglobin. Pro účely kvalitativní orientační analýzy používá 3,3’,5,5’-tertramethylbenzidin (TMB) v prostředí kyseliny octové nebo kyselého pufru.

1. Činidlo na bázi luminolu Luminol (neboli 5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion) je luminofor (Obr. 3), při jehož oxidaci v bazickém prostředí za katalýzy dochází k chemiluminiscenci, která je charakteristická světle modrým zabarvením. Katalýza této oxidačně-redukční reakce je zde zajištěna právě krevním barvivem - hemoglobinem, který je přítomen v krvi a krevních stopách Orientační zkouška za pomoci luminolu má však svá omezení. Kromě hemoglobinu mohou uvedenou reakci katalyzovat také ionty některých přechodných kovů, především Cu2+ a Co2+ nebo chlornanové anionty často přítomné v desinfekčních prostředcích (např. SAVO). Bazické prostředí je možno zajistit různými způsoby, optimální pH je v rozmezí 9-10. Výběr a použití pufru však závisí na celé řadě dalších faktorů, zejména nesmí žádná ze složek pufru nijak interagovat se vzorkem nebo jeho částmi. Luminol je však látka velmi špatně rozpustná ve vodných prostředích a svůj vliv zde hraje nejen pH ale i iontová síla roztoku.

Obr. 4: Struktura 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidinu

Úkol: Prokažte přítomnost krevních stop na předloženém vzorku Pomůcky: plastové nádobky, kádinky, rozprašovač, mikrozkumavky, lodičky, váhy, mikropipety. Chemikálie: peroxid vodíku (30 %, v/v), kyselina octová, 3,3’,5,5’-tertramethylbenzidin (TMB), luminol, uhličitan sodný, peroxoboritan sodný, voda, dimethylsulfoxid (DMSO). Příprava činidel a postup: 1.) Luminol Odvažte 100 mg luminolu do 50 ml kádinky a přidejte 9 ml deionizované vody. K vzniklé suspenzi přidejte 0,5 g bezvodého uhličitanu sodného (Na2CO3) a důkladně promíchejte až do rozpuštění (v případě že se všechen luminol nerozpustil, přidejte opět menší množství uhličitanu).

Obr. 3: Struktura luminolu

Do mikrozkumavky odvažte 0,5 g peroxoboritanu sodného a doplňte na objem 1 ml deionizovanou vodou a důkladně rozpusťte pomocí ultrazvukové lázně. Před použitím činidla k analýze oba roztoky slijte a aplikujte buď do roztoku, o kterém předpokládáte že obsahuje krev, nebo rozprašujte na krví znečištěný povrch (oděv, papír atd.).

5

Pozitivní zkouška se projeví viditelnou modrou fluorescencí, kterou je nutné pozorovat ve tmě. 1. TMB Na lodičce odvažte 5 mg tetramethylbenzidinu (TMB) a rozpusťte v 5 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). Připravte 50 ml základního roztoku ledové kyseliny octové o koncentraci  0,1 mol.dm-3. Poté smíchejte 1 ml TMB rozpuštěný v DMSO s 9 ml roztoku kyseliny octové  a dobře promíchejte. Před analýzou přidejte k připravené směsi 5 µl 30% peroxidu vodíku a důkladně promíchejte. Vzniklé činidlo aplikujte obdobně jako luminol (viz výše), pozitivní zkouška se projeví jasně modrým (event. zeleným) zabarvením.

Použitá literatura 1. J. Pješčák a kol. Kriminalistika, Obzor, Bratislava 1981. 2. S. Bell, Forensic Chemistry, Prentice Hall, 2nd edition, 2012 3. J. Tesař, Soudní lékařství, Avicenum Praha 1976

Doplňující otázky

1. Jakým způsobem by bylo možné odebrat otisky prstů zemřelému? 2. K identifikaci krevních skvrn se ještě používá Bertrandova zkouška. Popište princip této metody.

6

Stanovení ethanolu v biologickém materiálu

2

Stanovení ethanolu v biologickém materiálu pro forenzní účely Stanovení ethanolu (alkoholu) v biologickém materiálu se pro forenzní účely provádí dvěma různými metodami. Především jde o metodu plynové chromatografie s plamenově ionizačním detekorem (GC-FID) s využitím head space a klasickou volumetrickou metodu tzv. Widmarkova metoda (zkouška). Obě uvedené metody mají své výhody a nevýhody. Forenzně uznávaná metoda je dnes pouze plynová chromatografie s využitím head space. Policie využívá ještě i terénní stanovení hladiny alkoholu ve vydechovaném vzduchu. Přepočet na hladinu alkoholu v krvi je možný, ale předpokládá nezávislý poměr vydechovaného vzduchu a krve, což je variabilní.

Tabulka 1: Korelace hladin alkoholu v krvi s akutními klinickými projevy Hladina alkoholu v krvi Klinický stav (mg/dL) 10-50 (0,1 až 0,5 g.kg-1)

střízlivost

Normální chování. Minimální změny chování odhalitelné pouze speciálními testy.

30-120 (0,3 až 1,2 g,kg-1)

eufórie

Mírná eufórie se zvýšenými sociálním projevy, zvýšení sebevědomí. Snížení pozornosti a sebekontroly.

90-250 (0,9 až 2,5 g.kg-1)

excitace

Emoční nestabilita, ztráta kritického myšlení a kontroly, výpadky paměti. Ztráta pohybové koordinace, zvýšení reakčního času, snížení citlivosti na vnější podněty.

150-230 (1,5 až 2,3 g.kg-1)

zmatenost

Dezorientace, mentální zmatenost, nevolnost, přehnané emocionální reakce, strach, smutek, hněv. Poruchy vidění - zdvojené vidění, změna vnímání tvaru a pohybu. Snížená reakce na bolest, porušená rovnováha a koordinace, setřelá nebo nesrozumitelná řeč.

270-400 (2,7 až 4,0 g.kg-1)

stupor

Apatie, významně snížená odezva na podněty, významná ztráta svalové koordinace, neschopnost stát, inkontinence, poruchy vědomí (letargie, strnulost).

350-500 (3,5 až 5,0 g.kg-1)

Kóma

Potlačení reflexů, poruchy dýchání, aspirace.

>450-500 (>4,5 až 5,0 g.kg-1)

Smrt

Zástava dechu.

Fyzikálně-chemické vlastnosti ethanolu Ethanol je alifatický alkohol (CH3CH2OH). Je to bezbarvá kapalina, v bezvodém stavu má ostrou vůni. Ve směsi s vodou je alkoholická vůně jemnější a sladší. Teplota varu ethanolu je 78,5 °C. Hustota ethanolu při teplotě 25 °C rovna 0,789 g.cm-3.Ethanol je méně polární než voda a z tohoto důvodu prochází snadněji buněčnými membránami a difunduje to tkání. Mezní koncentrace absolutního ethanolu, která je zachytitelná lidským čichem ve vzduchu je 350 ppm. Ethanol je snadno zápalná látka a řadí se mezi hořlaviny 1. třídy. Ethanol je neomezeně mísitelný s vodou.

Účinek ethanolu na lidský organismus Na lidský organismus působí ethanol jako droga. Má tlumivý účinek na CNS (přestože v případě počáteční konzumace působí zdánlivě excitačně). Ethanol je ve velice nízké koncentraci obsažen v krvi člověka jako produkt metabolických pochodů. Fyziologická průměrná hladina ethanolu u zdravého člověka se pohybuje okolo 0,03 až 0,05 g.kg-1. Nad koncentrační hladinu 0,05 g.kg-1 už dochází k mentálnímu ovlivnění a tato hladina je tedy považována za mezní hladinu alkoholu, kdy dochází k již znatelnému zhoršení motorických funkcí. S dalším nárůstem hladiny alkoholu v krvi dochází postupně k prohlubování zhoršení motorických funkcí a koordinace pohybu, zhoršení úsudku, odstraňování zábran, dále dochází k vzrušeným emocionálmím projevům až agresivitě. Další zvyšování alkoholu v krvi má pak za následek utlumení CNS až k úpadku do bezvědomí. Letální dávka ethanolu v krvi se pohybuje v rozmezí 5 až 8 g.kg-1 pro dospělé osoby a pro děti je to hladina 3 g.kg-1. Akutní toxicita ethanolu je dále ovlivněna tolerancí na alkohol, interakcí s léčivy a drogami a také případnou hypoglykemií. Korelace mezi hladinou alkoholu v krvi a akutními klinickými projevy v případě akutní intoxikace je uvedena v tabulce 1.

Symptomy a projevy

Absorpce, distribuce a metabolismu ethanolu Absorbce, distribuce a metabolismus ethanolu je podmíněn genetickými  a environmentálním faktory. Absorbce ethanolu při perorálním podání se odehrává především  v tenkém střevu. Poměr mezi požitým a absorbovaným ethanolem (tedy rychlost absorbce) je dán celou řadou faktorů, např.: obsahem žaludku, rychlostí požití ethanolu, složením potravy, rychlostí vyprazdňování gastrointestinálního traktu. Ethanol jako malá a relativně polární molekula je distribuován rovnoměrně v závislosti na obsahu vody v jednotlivých tkáních. Distribuovaný objem ethanolu je úměrný celkovému obsahu vody v těle. Faktory ovlivňující celkové množství vody v těle ovlivňují zároveň distribuci ethanolu. Eliminace ethanolu probíhá z asi 90 % metabolickými pochody. Pouze 2 - 10% dávky ethanolu je vyloučena dechem, po-

8

tem a močí. Metabolická eliminace ethanolu je závislá na enzymatické oxidaci ethanolu v játrech (alkoholdehydrogenáza, aldehyddehydrogenáza). Rychlost eliminace je tedy závislá genetických na variantách enzymů podílejících se na oxidaci ethanolu.

Absorpce Jak bylo uvedeno GI trakt je hlavní cestou absorpce ethanolu přijatého per os. Asi 20% absorbovaného ethanolu přechází do krve pasivní difúzí přes žaludek, zbylých 80 % přechází do krevního řečiště přes duodenum a další části tenkého střeva. Inhalační cesta vstupu a vstup přes kůži nemá z hlediska absorpce a intoxikace alkoholem velký význam díky relativně vysoké polaritě ethanolu a tedy jeho velké rozpustnosti ve vodě a nízké rozpustnosti v tucích. Absorpce ethanolu v GI probíhá pouze pasivní difúzí a je tedy řízena koncentračním gradientem (podle Fickova zákona). Rychlost absorbce ethanolu z GI traktu je dána zejména následujícími faktory: a) množstvím ethanolu, který je v kontaktu s mukózním povrchem, b) časem, po který zůstává ethanol v kontaktu s žaludeční stěnou, c) množstvím krve, které protéká v místě styku alkoholu s žaludeční stěnou, d) velikostí povrchu žaludeční stěny, který je dostupný pro resorpci alkoholu. U zdravého dospělého jedince se 80 až 90 % požitého alkoholu absorbuje přes GI trakt během 30 - 60 minut.

Distribuce

Eliminace (biotransformace) ethanolu Hlavními metabolickými pochody ethanolu jsou oxidační metabolické pochody využívající enzym alkoholdehydrogenázu a enzymatický systém mikrosomální ethanol-oxidační (MEOS). Konečným produktem enzymatické oxidace ethanolu je CO2 a H2O. Hlavní metabolická cesta ethanolu je založena na jeho oxidaci alkoholdehydrogenázou. Oxidace ethanolu alkoholdehydrogenázou (ADH) probíhá v játrech za spoluúčasti kofaktoru nikotinamidadeninnikluotidu (NAD+). NAD+ v tomto případě zastává roli akceptoru protonů během oxidace ethanolu na acetaldehyd. ADH je obsažen v cytosolu jaterních buněk. Tato metabolická dráha ethanolu je nasycena při relativně nízké koncentraci ethanolu. Enzymy podílející se na enzymatické oxidaci ethanolu vykazující významný polymorfismus (ADH, aldehydehydrogenáza (ALDH) a CYP2E1. Enzym ALDH, který je dále zodpovědný za oxidaci acetaldehydu existuje v několika formách. Nejvýznamnější jsou dva: ALDH1 - enzym obsažený v cytosolu všech buněk včetně m o z k o v ý c h  s omezenou katalytickou aktivitou a ALDH2 - mitochondriální enzym přítomný v játrech a žaludku. ALDH2 vykazuje vysokou katalytickou aktivitu pro oxidaci acetaldehydu. ALDH2 je primární enzym zodpovědný za in vivo oxidaci acetaldehydu. Asijská populace má geneticky podmíněný deficit ALDH2 enzymu, který vede ke zvýšené citlivosti na acetaldehyd vzniklý oxidací ethanolu. U této populace tak dochází ke zvýšené akumulaci acetaldehydu spojené se zvýšením tepové srdeční frekvence, intenzivní zrudnutí obličeje, zvýšené pocení a erythém.

Widmarkova metoda Ethanol je mísitelný s vodou v jakémkoli poměru. Z tohoto důvodu se do jednotlivých tkání ethanol dostává tím více, čím je obsah vody v dané tkáni vyšší. VD ethanolu je závislý na pohl a v í , v ě k u  a množství tuku v těle (obezita). Například ženy mají VD ethanolu mírně nižší než muži, protože ženské tělo obsahuje přirozeně méně vody a více tuku na jednotku hmotnosti. Distribuční objem ethanolu pro dospělou zdravou ženu se pohybuje v rozmezí 0,54 až 0,71 L.kg-1, zatímco pro dospělého zdravého muže je VD ethanolu v rozmezí 0,63 až 0,76 L.kg-1.

Vazba ethanolu na proteiny Ethanol se neváže na proteiny krevní plazmy či tkání. Distribuční objem úzce koreluje s množstvím vody v těle. Ethanol rovněž neinterferuje při vazbě jiných sloučenin na proteiny plazmy.

Widmarkova metoda je stále rozšířenou analytickou metodou poměrně velmi přesnou  a spolehlivou. Její výhodou je vysoká citlivost a poměrná jednoduchost, která ji řadí mezi rutinní laboratorní úkony. Je využívána i jako princip při dechové zkoušce v detekčních trubičkách, které stanovují orientačně požitý alkohol na základě změny barvy detekční trubičky. Pro provedení Widmarkovy zkoušky se odebírá asi 5 až 8 mililitrů krve. Při odběru se k dezinfekci nesmí užívat alkoholu ani jiných těkavých látek, neboť by došlo ke zkreslení výsledků. Princip Widmarkovy metody spočívá v oddestilování etanolu obsaženého v krvi a jeho oxidaci známým nadbytkem dichromanu draselného v kyselině sírové. Přebytek dichromanu se stanoví jodometrickou titrací. Nevýhodou této zkoušky je její nespecifičnost, protože při Widmarkově metodě jsou mezi redukujícími látkami chovajícími se stejně jako etanol i jiné těkavé redukující látky, jako např. acetaldehyd, isopropanol apod.

9

Rovnice reakcí vystihující půběh Widmarkovi metody: K2Cr2O7 + 3 CH3CH2OH + 8 H2SO4 -> 2 Cr2(SO4)3 + 2 K2SO4 + 3 CH3COOH + 11 H2O K2Cr2O7 + 6 KI + 7 H2SO4 -> Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 3 I2 + 7 H2O 2 Na2S2O3 + I2 -> 2 NaI + Na2S4O6

Stanovení ethanolu v biologickém materiálu Widmarkovou metodou Úkol: Stanovte obsah ethanolu v předloženém biologickém materiálu (krev či moč). Pomůcky: Widmarkovy baňky, odměrná baňka na 500 mL, staniolové mističky, odměrný válec, byreta, kádinky, sušárna, analytické váhy, automatické pipety a špičky, centrifuga.

Plynová chromatografie s plamenovým ionizačním detektorem (GC-FID)    Ethanol (stejně jako jiné těkavé látky) je z vyšetřované krve v uzavřené vialce za teploty okolo 60°C odpařen do prostoru nad tekutinou. Takto vzniklý plynný vzorek je dávkován do kolony plynového chromatografu - jedná se o techniku „ head space“ (obr. 1). Na výsledném záznamu analýzy je pak retenční vzdálenost (retenční čas) mírou kvality jednotlivých rozdělených složek směsi, plocha píku je mírou kvantity. Stanovení se provádí metodou vnitřního standardu. Za konstantních podmínek analýzy je retenční čas alkoholu, stejně jako jiných těkavých látek, jež mohou být obsaženy ve vyšetřovaném vzorku, vždy stejný.

Obr. 2: Widmarkova titrační baňka

Potřebné roztoky a činidla: 1) roztok 5% KI, 2) roztok 0,25% dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové (odpovídá 0,01 M roztoku), 3) roztok 1% škrobu, 4) 10% roztok kyseliny chlorovodíkové, 5) 50 mM thiosíran sodný ve vodě, 6) 5 mM thiosíran sodný ve vodě. Uvedené roztoky a činidla jsou již předem připraveny.

Obr. 1: Schematické znázornění statické head space analýzy

Pracovní postup: 1. Stanovení přesné koncentrace odměrného roztoku 0,25% dichromanu draselného Do titrační baňky se odpipetuje 10 mL zásobního roztoku dichromanu draselného a přidá se 30 mL 5% roztoku jodidu draselného a 10 mL 10% roztoku kyseliny chlorovodíkové. Směs se důkladně promíchá a titruje se 50 mM roztokem thiosíranu sodného do žlutého zbarvení. Poté se přidá 1 mL 1% roztoku škorobového mazu a titruje se dále do trvale slabě modrého zbarvení. Ze spotřeby 5% roztoku jodidu draselného se vypočítá přesná koncentrace roztoku dichromanu draselného.

10

2. Příprava biologického materiálu k analýze a) Krev - zkumavka s předloženou krví se 5 minut centrifuguje při 3000 ot/min. Po centrifugaci se odbírá k jedné titraci 100 !L séra. b) Moč se pipetuje přímo bez předchozí centrifugace. 3. Vlastní stanovení ethanolu a) Do 2 Widmarkových baněk se odměří přesně 1 mL 0,25% roztoku dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové. b) 2 staniolové mističky se zváží na analytických vahách, zapíše se jejich hmotnost. Do zvážených staniolových mističek se odpipetuje 100 !L zkoumaného biologického materiálu a slepý vzorek (100 !L roztoku dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové). Diferenčně se mističky zváží a odečte se navážka. c) Misky s odpipetovaným biologickým materiálem se vloží do držáčku Widmarkových baněk. d) Baňky se uzavřou na 2 hodiny do sušárny vytemperované na 60 °C. Po dvou hodinách se baňky vytáhnou a nechají zchladit na laboratorní teplotu. e) Staniolové mističky se opatrně z Widmarkových baněk vyjmou a obsah Widmarkových baněk se zředí 25 mL deionizované vody a promíchá. Přidá se 1 mL roztoku 5% KI. Roztok zežloutne. Dále se přidají 3 kapky roztoku škorobového mazu. Roztok zmodrá  a promíchá se. f) Roztoky ve Widmarkových baňkách se titrují 5 mM roztokem thiosíranu sodného do trvalého odbarvené. Odečte se přesně spotřeba v mL. Výpočet množství ethanolu v biologickém materiálu c = 100 . 1,13 . (Vb-Va)/m . x

c…stanovovaná koncentrace ethanolu v g/kg Vb…spotřeba thiosíranu sodného při slepém pokusu Va…spotřeba tiosíranu sodného při titraci vzorku m…navážka vzorku v mg X…faktor zohledňující typ biologického materiálu V případě stanovené alkoholu z krevního séra je nutné celý výsledek vydělit ještě číslem 1,2. Výsledná koncentrace alkoholu pak odpovídá obsahu ethanolu v plné krvi.

Stanovení ethanolu metodou plynové chromatografie Úkol: Stanovte obsah ethanolu v předloženém biologickém materiálu (krev či moč). Pomůcky: skleněné vialky, gumové zátky, pertle, pertlovací kleště, automatické pipety a špičky, centrifuga. 1. Příprava biologického materiálu k analýze a) Krev - zkumavka s předloženou krví se 5 minut centrifuguje při 3000 ot/min. Po centrifugaci se odbírá k jedné titraci 100 uL séra. b) Moč se pipetuje přímo bez předchozí centrifugace. 2. Vlastní analýza a) Do standardizovaných skleněných vialek se nepipetuje 0,5 ml biologického materiálu (séra, moči) a 0,5 ml vnitřního standardu – 0,4 ‰ (v/v) roztoku terciárního buthanolu. b) Vialka se uzavře gumovou zátkou a zapertluje pod dohledem vedoucího cvičení. Zapertlované vialka se vloží na termostatu plynového chromatografu. c) Stejným způsobem se připraví řada kalibračních roztoků se známým obsahem ethanolu o koncentraci 0,05 až 4,0 promile vždy se stejnou koncentrací vnitřního standardu. d) Spolu s vedoucím cvičení se provede nastavení parametrů GC-FID analýzy a spustí se analýza. 3. Vyhodnocení Odečtou se plochy píků odpovídající vnitřnímu standardu a píku ethanolu v kalibračních standardech a biologických vzorcích. Zkonstruuje se kalibrační křivka a vypočítá se koncentrace ethanolu v analyzovaném biologickém vzorku. Získaný výsledek se násobí přepočítávacími faktory zohledňujícími typ biologického materiálu: sérum = 0,7937  moč = 0,9852 Použitá literatura:   1. B. Levine, Principles of Forensic Toxicology, AACC Press; Fourth edition (2013).  2. A. Negrusz, G. Cooper, Clarke's Analytical Forensic Toxicology, Pharmaceutical Press; 2 edition (2013).

11

Doplňující otázky: 1. Napište rovnice reakcí vyjadřující metabolismu ethanolu a ethylenglykolu. 2. Popište stručně princip plamenového ionizačního detektoru (FID), který se v plynové chromatografii využívá k detekci organických látek. 3. Jaký je princip detekčních zařízení pro orientační stanovení ethanolu v dechu při zkoušce řidičů na přítomnost alkoholu?

Příprava roztoků: 1. Roztok 5% jodidu draselného  25 g KI se rozpustí ve 475 mL deionizované vody. Roztok je potřeba uchovávat v temné lahvi. 2. Roztoku 0,25% dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové  1,25 g dichromanu draselného se rozpustní v mírně zahřáté deionizované vodě o objemu cca 15 mL a kvantitativně se převede do odměrné baňky na 500 mL. Roztok se doplní po značku koncentrovanou kyselinou sírovou. Dichroman draselný nesmí vykrystalizovat. Vzniklý roztok je potřeba uchovávat v temné lahvi a připravovat maximálně 2 dny před vlastním cvičením. 3. Roztok 1% škrobového mazu  1 g škrobu se smíchá v kádince s několika mL deionizované vody za vzniku kaše. Kaše se přelije 120 mL vařící deionizované vody a povaří se 15 min. Poté se nechá odpařit na výsledný objem 100 mL. Roztok je nutné uchovávat v tmavé lahvi. 4. Roztok 10% kyseliny chlorovodíkové  100 mL koncentrované kyseline chlorovodíkové (37%) se smíchá s 324 mL destilované vody. 5. Roztok 50 mM thiosíranu sodného  26 g pentahydrátu thiosíranu sodného se rozpustí ve 100 mL deionizované vody a zakonzervuje se přídavkem 1 g kyanidu rtuťnatého. Roztok je nutné uchovávat v lednici. 6. Roztok 5 mM thiosíranu sodného  25 mL 50 mM thiosíranu sodného se rozpustí ve 250 mL deionizované vody. Roztok se připraví vždy čerství před samotným stanovením.

12

Izolace, zakoncentrování a stanovení post blast (povýbuchových) zplodin metodou kapalinové chromatografie s DAD detektorem kapilární elektroforézy s DAD detektorem

3

Izolace, zakoncentrování a stanovení post blast (povýbuchových) zplodin metodou kapalinové chromatografie s DAD detektorem   kapilární elektroforézy s DAD detektorem Povýstřelové zplodiny (vedlejší produkty výstřelu) - různé kovové i nekovové částice vzniklé hořením prachové náplně náboje a zápalkové slože a průchodem střely vývrtem v hlavě zbraně. Patří sem i další nečistoty vymetené střelou v průběhu výstřelu (rez, zbytky konzervačních prostředků). Povýstřelové zplodiny jsou i viditelné v okamžiku výstřelu jako záblesk nebo plamen a dým v okolí ústí hlavně střílející zbraně. Část povýstřelových zplodin se zachycuje i na rukou a oděvu střílející osoby i na předmětech  v blízkosti střely. Zkoumání povýstřelových zplodin má význam především pro určení vzdálenosti střelby. Význam mají při posouzení sebevraždy nebo sebepoškození. Je známo, že člověk si může způsobit zásah do životně důležitých center organismu z maximální vzdálenosti asi 75 cm. Povýstřelové zplodiny, které unikly netěsnostmi zbraně při střelbě, mají společně s povýstřelovými zplodinami, které unikly z hlavně význam při posouzení, zdali konkrétní osoba střílela, nebo byla v blízkosti střelby, eventuálně bylo stříleno v určitém prostoru (místnosti, dopravní prostředek apod.). Stejně tak je analýza povýbuchových zplodin důležitá při posouzení, zda palná zbraň byla v okamžiku střelby v určitém místě či zavazadle. Jako vzorky určené k expertíze jsou pak odebírány povýbuchové zplodiny z různých míst z b r a n ě ,  v okolí výstřelu a také z rukou samotného střelce. Hlavní metodou analýzy povýstřelových zplodin je analýza pomocí elektronového skenovacího mikroskopu. Částečky, které jsou hlavní součástí povýstřelových zplodin, mají charakteristický tvar i chemické složení. Další metodou analýzy chemického složení povýstřelových zplodin jsou chromatografické metody, kapilární elektroforéza, metody atomové spektrometrie a hmotnostní spektrometrie. Chromatografické metody a elektroforetické metody umožňují separaci jednotlivých chemických individuí tvořích povýstřelovou zplodinu stejně tak umožňují provádět analýzu složení nevybuchlých zajištěných složí, náloží amatérsky konstruovaných výbušnin apod. Základní dělení explosiv pro forenzní účely je zobrazeno na obr. 1.

Obr. 1: Základní dělení explosiv pro forenzní účely

Z dělení je patrné, že mezi explosiva jsou řazeny i pohonné hmoty, které v mnoha případech tvoří hlavní složku výbušnin připravených ilegální domácí výrobou. Dále se explosiva dělí na primární a sekundární explosiva. Primární explosiva jsou velmi citlivá k iniciaci jiskrou, plamenem, či mechanickou silou. Sekundární explosiva jsou obecně méně citlivé vůči uvedeným mechanismům iniciace explose a k jejich iniciaci typicky dochází s pomocí primární explosiv. Jako terciární explosiva jsou pak označovány látky a směsi, které jsou relativně necitlivé vůči iniciaci, např. NH4NO3. Tyto látky vyžadují přítomnost nějaký další složky k detonaci. Zvláštní skupinu tvoří explosiva domácí výroby, které jsou vyráběny z dostupných prekurzorů evenutálně z explosiv pocházející z trestné činnosti. Z chemického hlediska je možné dělit explosiva podle chemické struktury a funkčních skupin: • sloučeniny obsahující dusík (např. TNT), • aromatické nitraminy (Tetryl), • estery kyseliny dusičné (nitroglycerin), • peroxidy (TATP), • iniciační explosiva (styfnát olova),

14

• soli (nitrát močoviny), • palivo/oxidující složka (dusičnan amonný/benzíd nebo ANFO). Příklady struktur některých explosiv jsou na obr. 2.

Analýza výbušnin a povýbuchových zplodin s pomocí kapalinové chromatografie Analýza výbušnin a povýbuchových zplodin obecně klade vysoké nároky na odběr, přípravu, zakoncentrování a přečištění vzorku před vlastní analýzou. Povýbuchové zplodiny i nevybuchlé rozbušky je vždy nutné podrobit extrakci do dvou extrakčních činidel (vodné a organické). Voda nebo vodné pufry se používají pro extrakci ve vodě rozpustných složek, jako jsou anorganické ionty nebo například cukry. Jako organické rozpouštědlo se nejvíce využívá aceton pro organické ve vodě nerozpustné složky explosiv. Organické balasty a rušivé složky, které se v tomto případě velmi ochotně koextrahují musí pak být v extraktu odstraněni dalšími přečišťovacími postupy. Konkrétní přečišťovací postup pak závisí na použité koncové analytické technice. Velmi často se využívá přečištění acetonového extraktu pomocí vhodného sorbentu, kterými mohou být například Porapak T nebo Florisil. Organické složky explosiv jsou tak zachyceny na zvoleném sorbentu, mohou být promyty a eluovány vhodným organickým rozpouštědlem. Vodné extakty jsou přečišťovány obyčejně pouze filtrací. Pro některé organické složky explosiv je vhodná i SPE extrakce. Anorganické složky mohou být zachyceny na iotoměničích Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-8 (v poměru 1:1:1), C18 fázích, fenylových fázích a kyano- fázích. Úkol: Prověďte izolaci, zakoncentrování a analýzu povýstřelových zplodin a explosiv po-

mocí HPLC-DAD a CE-DAD Chemikálie: standardy explosiv v methanolu o koncentraci 10 mg/L (TNT, 2,4-DNT, 2,6DNT, Tetryl RDX), dusičnany kovů (mědnaté, vápenaté, barnaté) methanol, acetonitril, pyridinium sulfát, 1M HCl, mravenčan amonný, deionizovaná voda. Pomůcky: kádinky, mikrozkumavky, injekční stříkačka - hamiltonka, láhve pro mobilní fáze, stříkačkové filtry s póry 45 um, automatické pipety a špičky, vialky a víčka pro LC a CE, ultrazvuk. Parametry LC separace LC kolona - hypersil GOLD PFP, 1,9 um, 100 x 2.1 mm. Mobilní fáze: A: 1 mM ammonium formiát ve vodě, B: methanol Injekce 2 uL, detekční vlnová délka 214 a 254 nm. Obr. 2: Příklady struktur některý explosiv

Gradient Time (min) 0.0 10.0 12.0

A(%) 80.0 45.0 20.0

B(%) 20.0 55.0 80.0

15

12.1 12.9 13.0 15.0

5.0 5.0 80.0 80.0

95.0 95.0 20.0 20.0

Parametry CE separace Nepokrytá křemenná kapilára, vnitřní průměr 50 µm, celková délka 48.5 cm, efektivní délka 40 cm, Pracovní elektrolyt 10 mM pyridinium sulfát pH 7.0 Napětí + 15 kV, injekce 100 mbar/10s Postup práce:

Pro obě metody sestrojte kalibrační křivky a proveďte stanovení koncentrací kovů a organických látek v předložených vzorcích.

Doplňující otázky 1. Jakým způsobem byste provedli analýzu zábavné pyrotechniky na přítomnost nepovolených výbušnin (TNT, hexogen)? 2. Jaké další typy detekce ve spojení s kapalinovou chromatografií a kapilární elektroforézou je možné pro analýzu kovů a organických složek výbušnin

Použitá literatura 1. J. Bogusz, Forensic Science, 2000. 2. B.H. Stuart, Forensic Analytical Techniques, 2013. 3. B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, AACCPress, 2013.

Stanovení vápenatých, barnatých a mědnatých iontů s pomocí CE-DAD 1. Předložený vzorek zábavné pyrotechniky nejdříve extrahujte 10 mL deionizované vody v plastové nádobce v ultrazvuku po dobu 15 min. Vodný extrakt přefiltrujte a použijte pro analýzu na přítomnost anorganických kovových iontů s pomocí kapilární elektroforézy s nepřímou UV-VIS detekcí. 2. Připravte pracovní elektrolyt o složení 10 mM pyridinium sulfát a upravte na pH 7.0 s pomocí zředěné kyseliny chlorovodíkové. 3. Připravte standardní kalibrační roztoky pro barnaté, vápenaté a mědnaté ionty (použijte dusičnany kovů) v rozmezí 0.5 mg/L až 50 mg/L. 4. Na kapilární elektroforéze nastavte metodu CE_postblast.M a proveďte analýzy standardních kalibračních roztoků a extrahovaného vzorku dle pokynů vedoucího cvičení. Stanovení organických složek s pomocí LC-DAD 1. Druhou část předloženého vzorku extrahujte v 10 mL acetonu po dobu 15 min v ultrazvuku ve skleněné baňce. Proveďte SPE extrakci s pomocí C18 fází. Návod k SPE extraktoru je v příloze. Po extrakci eluujte organických post blast residua s pomocí hexanu. 2. Po SPE extrakci eluát jímejte do připravené mikrozkumavky. Extrakt odpařte pod proudem dusíku při teplotě 25 C do sucha. Odparek po extrakci rekonstituujte ve 200 uL mobilní fáze, která bude použita pro separaci. 3. Připravte kalibrační roztoky organických látek (TNT, 2,4-DNT, 2,6-DNT, Tetryl RDX)  v koncentračním rozmezí 0.5 ug/L až 50 ug/L 4. S pomocí vedoucího cvičení spusťte na LC-DAD chromatografu metodu LC_postblast.M  a proměřte kalibrační roztoky a extrahovaný vzorek. 5. Na základě retenčních časů standardů a separovaných látek v extraktu proveďte identifikaci jednotlivých organických látek ve vzorku.

16

Identifikace barviv

4

Identifikace barviv pomocí Ramanovy spektrometrie V kriminalistických laboratořích se provádí technická expertíza písemností, která se mimo jiné zabývá zkoumáním použitých psacích prostředků: tiskových inkoustů, propisek, centropenů, razítek, atd. Analýza tohoto typu pomáhá zodpovědět následující otázky: • Zda byly dokumenty napsané stejným psacím prostředkem? • Zda jsou dokumenty pravé? • Zda byly dokumenty vytvořené ve stejnou dobu, nebo • Jak starý je zkoumaný text? Každý zpochybněný dokument je nejdříve zkoumán vizuálními metodami. Objekt se posuzuje pouhým zrakem nebo s pomocí lupy za denního nebo umělého osvětlení, případně v různém barevném osvětlení. Při expertíze je potřeba pracovat v gumových rukavicích, aby nedošlo ke kontaminaci nebo poškození dalších případných stop. Když výše uvedené metody nedávají jednoznačné odpovědi, je nutné použit další techniku. Tabulka 1: Analytické metody využívané v analýze inkoustů. Metoda Op#cká mikroskopie   v polarizovaném světle – Polarized Light Microscopy (PLM) Chromatograﬁe na tenké vrstvě-‐Thin Layer Chromatography (TLC) Infračervená spektroskopie   a mikrospektrofotometrie Ramanova spektroskopie

Destruk,vní? ne ano ne ne

Rentgenová analýza ne

Hmotnostní spektrometrie – Mass Spectrometry (MS) Hmotnostní spektrometrie indukčně vázaného plazmatu ICP-‐MS Hmotnostní spektrometrie indukčně vázaného plazmatu   s laserovou ablací (LA-‐ICP-‐MS) Pyrolyza GC/GC-‐MS

Závisí na zkoumaném vzorku   a způsobu ionizaci ano

Využi, Charakteris#ka barviv, určení pořadí nanesených barviv, makroskopická analýza. Srovnávací analýza pigmentů   a barviv. Charakteris#ka barviv   a polymerů, srovnávací analýza zkoumaných objektů. Charakteris#ka anorganických barviv, komplexní exper#za při určování fází pigmentů uměleckých předmětů (obrazů, soch, plas#k apod.), automobilových laků. Charakteris#ka organických složek badaného objektu. Charakteris#ka barviv. Charakteris#ka barviv.

Ne/minimálně ano

Charakteris#ka pryskyřic.

Kriminalistické laboratoře upřednostňují spektroskopické metody, a to z důvodu, že tyto metody nepotřebují speciální předúpravy vzorku a navíc jsou nedestruktivní. Při analýze inkoustů musíme pamatovat, že se jedná o směs látek (filmotvorné látky, aditiva, rozpouštědla, konzervační prostředky, barviva). Mezi hlavní složky inkoustů patří pojivo, konzervační a barvonosné látky. Typické složení inkoustu v kuličkovém peru je: 50 % rozpouštědla, 25 % barviva, 25 % jiné látky, ale konkrétní chemické a množstevní složení inkoustů je u všech výrobců výrobním tajemstvím. Chemické a fyzikální vlastnosti psacích prostředků závisí na jejich podobě a to zejména na původní podobě, kdy se jedná o nádobky s inkousty, tušemi, různými druhy tužek a popisovačů, nebo v podobě po jejich aplikaci na zkoumaný objekt (otisky razítek, vytvořený tisk, psací tahy různých psacích prostředků). Původní podoba vzorků přináší méně informací a z hlediska interpretace výsledků je jednodušší. V případě aplikování inkoustů na objekt (nejčastěji papír) se mění jejich vlastnosti z úvahy na probíhající změny (odpařování rozpouštědel, polymerace, oxidace nebo jiné chemické reakce).

Ramanova spektrometrie Ramanova spektrometrie je perspektivní, nedestruktivní metodou umožňující analýzu in-situ. Nejčastěji je využívána pro identifikaci zakázaných drog, analýzu vláken, inkoustů, výbušnin, padělaných výrobků a peněz. Ramanova spektroskopie podobně jak infračervená spektrometrie (IČ) měří vibrační pohyby molekuly, observovaný fyzikální jev je však rozdílný. Ramanova spektrometrie měří rozptyl světla, zatímco IČ je založena na absorbci fotonů. Ramanovo spektrum je závislostí intenzity rozptýleného záření na Ramanově posunu ∆ν  (cm-1), což je rozdíl energie mezi laserovým paprskem a rozptýleným zářením. Intenzita Ramanových čar je dána změnami polarizovatelnosti molekuly během vibračního pohybu. Absorpční pásy mající vrcholy v intervalu 4000–1500 cm-1, jsou vhodné pro identifikaci funkčních skupin (např. –OH, C=O, N–H, CH3 aj.). Pásy v oblasti 1500–400 cm-1 se nazývají oblastmi „otisku palce“ (fingerprint region). Změřená Ramanova spektra neznámých vzorků jsou srovnávána s referenční knihovnou spekter, čímž se metodou otisku prstu identifikují neznámé molekuly.

Pozorované typy čar v Ramanově spektru: →Rayleighův čáry - když se molekula po interakci se zářením vrátí do stejného energetického stavu. Při přechodu z vyššího do nižšího energetického stavu dojde k vyzáření fotonu se stejnou vlnovou délkou, jako měl budící laser. → anti-Stokesovy čáry - v oblasti vyšších frekvencí. Pokud se elektron při přechodu dostane do nižší energetické hladiny, než ze které byl vybuzen, dojde k vyzáření fotonu s kratší vlnovou délkou.

18

→ Stokesovy čáry - u nižších frekvencí Ramanova spektra. Molekula po interakci se zářením se přenáší do vyššího energetického stavu. Elektron se po excitaci vrátí na vyšší energetickou hladinu, než ze které byl vybuzen, tak dojde k vyzáření fotonu s delší vlnovou délkou než má budící laser. Všechny typy čar jsou schematicky znázorněny na Obr. 1.

Obr. 2 – Schéma Ramanova spektrometru [5].

Častým problémem, který se vyskytuje při analýze inkoustů Ramanovou spektroskopií, je fluorescence. K eliminaci tohoto problému se využívá buď concave baseline correction nebo metoda povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS). SERS využívá skutečnost, že Ramanův signál z molekuly adsorbované na povrchu některých kovů (např. Ag, Au) může být výrazně silnější než Ramanův signál z té samé molekuly (může být řádově až 105-106). Úkol: Porovnejte inkousty ze dvou částí dokumentů. Zjištěte zda byl dokument padělán. Obr.1. Ramanův rozptyl a Stokesovy a anti-Stokesovy linie.

Experimentalní uspořadaní Zdroj monochromatického záření z UV/VIS oblasti: rtuťová výbojka (dříve), lasery (plynové nebo pevnolátkové; oblast VIS nebo blízká IČ) Vzorek: plynný, kapalný, pevný Kyvety skleněné nebo nefluoreskující křemenné; vyhřívané, chlazené, rotující Rozpouštědla: vodná, organická se slabými Ramanovými pásy Detektory: dříve fotografická deska, dnes fotonásobič, event. diodové pole

Pomůcky a chemikálie: Roztok Ag nanočástic o koncentraci 5M, pipety, kádinky, viálky na vzorky, propisky, nůžky Postup: 1. Proveďte odběr vzorků z dokumentu a z dostupného srovnávacího materiálu (různé propisky) 2. Proveďte extrakci do methanolu – rozpusťte odebraný vzorek v 500 µl methanolu, umístěte do ultrazvukové lázně na 5 minut 3. Proveďte SERS experiment, z důvodu zesílení signálu a redukce možné fluorescence – k 1 ml Ag nanočástic přidejte 10 µl roztoku NaCl a 10µl vzroku Podle pokynů vedoucího cvičení proveďte měření pomocí Ramanovy spektroskopie 4. Proveďte vyhodnocení spekter a srovnejte naměřená data Tabulka 2: Parametry měření pro Ramanovu spetrometrii Ramanův spektrometr (Nicolet) Laser Nd:YAG (1064 nm) Rozsah vlnočtů 4000-500 cm-1 Rozlišení 4 cm-1

iRaman Plus spektrometr Laser 532 nm Rozsah vlnočtů 4000-200 cm-1 Rozlišení 4 cm-1

19

Doplňující otázky: 1. Které další analytické metody, by bylo možné použít pro analýzu inkoustů a barviv? 2. Navrhněte metodu pro odhalení padělání úředních razítek.

Použitá literatura: 1. J. Straus, J. Suchánek, V. Porada „Kriminalistické stopy obsahující informaci   o vlastnostech vnitřní stavby (struktury) nebo vnitřního složení objektu”, Soudní inženýrství ročník 15, 2004. 2. I. Doležal: Svět tisku-Padělání tiskovin. http://www.svettisku.cz/buxus/generate_page.php?page_id=7003&buxus_svettisku= (20.10.2014). 3. S. Bell: Forensic Chemistry, Parentice Hall, 2005. 4. P. Matějka: „Ramanova spektroskopie“ v Návody pro laboratorní cvičení z analytické chemie III, (Matějka P. a kol.), VŠCHT Praha 2002, vydání první. 5. V. Milata a kol. Aplikovaná molekulová spektroskopia 1. vyd. Bratislava: Slovenská technická univerzita v Bratislavě. 2008. 602 s. 6. J.M. Chalmers, H.G.M. Edwards, M.D. Hargreaves, by John Wiley & Sons, Ltd., 2012. Infrared and Raman Spectroscopy in Forensic Science, chapter: A. Guedes, A.C. Prieto, Raman Spectroscopy for the Characterizations of Inks on Written documents.

Příloha 1: Charakteristické vlnočty absorpce pro Ramanovu spektrometrii Převzato z P. Matějka: Ramanova spektroskopie v Návody pro laboratorní cvičení z analytické chemie III (Matějka P. a kol.) VŠCHT Praha 2002, vydání první.

20

21

22

23

Analýza skla

5

Analýza skleněných střepů Sklo se vyrábí z anorganických oxidů. Hlavní složkou je oxid křemičitý SiO2. Specifické vlasnosti skla závisí na obsahu a zastoupení oxidů ve směsi. Např. Na2O.CaO.SiO2 - sklo sodnovápenatokřemičité (typické složení 71-75 % SiO2, 12-16 % Na2O, 10-15 % CaO a další minoritní příměsi) se převážně používá na výrobu lahví, sklenic, běžného stolního skla a k výrobě velkoformátového skla (sklenné tabule, vytríny,...). Pokud větší množství oxidu vápenatého nahradíme oxidem olovnatým, vznikne sklo známé jako křišťál (typické složení 54-65 % SiO2, 25-30 % PbO, 13-15 % Na2O nebo K2O a další minoritní příměsi). Obsah PbO nad 24 % dává sklu vysokou hustotou a vyšší index lomu. Všude tam, kde je potřeba vysoká odolnost skla vůči teplotě, se používá sklo boro-silikatové (boritokřemičité), vyznačující se vysokou chemickou odolnosti a nízkým koeficientem teplotní roztažnosti. Jeho typické složení je: 75-80 % SiO2, 8-13 % B2O3, 4-8 % Na2O nebo K2O a 2-7 % Al2O3. Pro speciální účely se používají skla fluoridová, fosforečná nebo chalkogenidová (tj. na bázi S-Se-Te) skla. Tabulka 1 prezentuje přehled sklářských surovin rozdělených podle jejich funkcí a chemického složení.

Cílem forenzní analýzy skleněných střepů je rozpoznání původu skla, zda pochází z místa činu. Analýza skleněných střepů spočívá předvším v analýze fyzikálních a optických vlastností skla, jako jsou/je: barva, tloušťka, hustota či refrakční index (RI). Pokud obě sady skla ( z m í s t a č i n u  a např. nalezené na oděvu podezřelého) mají totožnou hustotu a index lomu neznamená to, že mají stejný původ, proto se musí provést další zkoumání jako je chemická analýza. Jde zejmena o elementární analýzu, zjišťění přitomnosti určitých prvků a jejich množství ve zkoumaném vzorku. Nejčastěji použiváné metody jsou elektronová mikroanalýza (EPMA), elektronová mikroskopie (SEM), atomová emisní spektrometrie (AES), hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) nebo rentgenfluorescenční spektroskopie (XRF). Níže je uvenedné typické schéma pro forenzní analýzu skla:

Tabulka 1. Přehled sklářských surovin podle jejich funkcí a chemického složení.

Minerály, sloučeniny Sklotvorné suroviny SiO2 křemen, živce, nefelin Al2O3 živce, nefelin, kryolit, hydroxid hlinitý B2O3 borax, sassolin, kyselina boritá P 2O 5 fosfáty-apatit, kostní moučka Stabilizátory CaO MgO PbO BaO ZnO Taviva Na2O K 2O Li2O

Horniny sklářský (křemenný) písek kaolin, fenolit, pegmatity, aplity

kalcit, dolomit, fluorit dolomit, magnezit oxidy Pb3O4, PbO, cerusit uhličitan nebo dusičnan barnatý zinková běloba

vápenec, dolomit dolomit, magnezit

soda, síran a dusičnan sodný, borax, plagioklasty, nefelin, kryolit potaš, ledek, draselné živce sloučeniny Li

fenolit a další horniny fenolit a další horniny Obr.1. Schéma pro forenzní analýzu skla [4].

25

Hlavní výhodou ICP-AES je relativně nízká cena, šíroký lineární dynamický rozsah 

ICP-AES, ICP-MS, LA-ICP-MS ICP-MS je vysoce citlivá metoda umožňující rychlou elementární analýzu. Technika poskytuje nízké detekční limity (pg/ml) a možnost stanovení více než 70 izotopů. U ICP-MS můžeme rozlišit tří části: 1. mechanismus zavedení vzorku (podle typu vzorku: plyn, kapalina, vzorek v pevné fázi), 2. plasma a zdroj hmotnostní spektrometrie, 3. analyzátor a detektor (viz obr.1.). Vzorek zavedený do plasmatu je zplyněn a atomizován, vytvořené atomy jsou následně ionizované v plasmě a dále transportované do MS zdroje, kde jsou separovány na základě poměru hmotnosti iontů a jeho náboje (m/z).

a jednoduchost ovládání. ICP-MS poskytuje oproti ICP-AES 10 až 100-krát lepší citlivost  a informaci o izotopovém složení. Nevýhodou obou postupů je však ztráta vzorku. Řešením tohoto problému je využití laserové ablace (LA), u které je spotřeba vzorku zhruba 280 ng. Navíc tato metoda nevyžaduje žádné chemické úpravy vzorku, tj. použití směsi kyselin pro rozklad, a tím dochází k minimalizaci problému s tvořením oxidů a hydridů, které jsou zdrojem interferencí.

Laserová ablace, LA Technika umožňuje generovaní aerosolu jak z vodivých (kovy a jejich slitiny) tak i z nevodivých materiálů (vzorky geologické, archeologické a biologické). Nevýhodou této metody je absence vhodných certifikovaných materiálů, nutných ke kvantifikaci analyzovaného prvku. Pro přímou analýzu pevných vzorků se používá laserová sonda ve spojení s ICP MS. Nejčastěji používané vlnové délky pro lasery (pevnolátkové nebo plynové) jsou 1064, 266, 213, 193 nm. Pevnolátkový nebo plynový pulsní laser je nejčastěji zdrojem záření (infračerveného nebo ultrafialového, λ = 1064, 266, 213 nebo 187 nm). Vzorek se umisťuje v ablační cele, na pohyblivém a ovladatelném stolku a je možné jej pozorovat pomocí mikroskopu či kamery. Průměr kráteru (viz obr.3) vzniklého působením laseru na povrch vzorku se většinou pohybuje od 5 do 100 µm, hloubka závisí na energii a době působení laseru. Odpařený materiál je stržen proudem plynného argonu, atomizován, ionizován a vzniklé ionty jsou třiděny v hmotnostním spektrometru a v detektoru jsou konvertované na elektrický impuls.

Obr. 2. Schéma hmotnostního spektrometru s indukčně vázaným plazmatem.

Příprava vzorku skla pro ICP-AES a ICP-MS Před přistoupením k analýze musíme vzorek skla umýt a vysušit. Pro analýzu pomocí ICPA E S  a ICP-MS potřebujeme vzorek skla zmineralizovat. Nejdříve rozdrtíme vzorek na mouku  a zvážíme (pro AES potřebujeme zhruba 5 až 8 mg, a pro MS 2 mg vzorku). Následně vzorek skla rozložíme pomocí směsi kyselin (HF, HCl, HNO3) v ultrazvukové lázni a potom vysušíme při teplotě 80 ºC. Ve finále vzorek rozpouštíme v kyselině dusičné. Podrobný popis mužete najt v normě ČSN 70 0601.

26

Úkol: Srovnejte 3 typy skleněných střepů. Proveďte identifikaci původu vzorku skleněného střepu. Pomůcky a chemikálie: Vzorky skla, interní standard skla, ubrousky. Postup: 1. Přípravte vzorky skla (umytí vodou a osušení obrouskem) a pomocí plasteliny je umistěte na držáku vzorku (viz Obr.4.). 2. Pod dohledem vedoucího cvičení nastavte parametry metody (viz tabulka 2) a proveďte měření. Obr.3: Řez kráterem, vypáleným do vzorku laserem u metody LA-ICP-MS.

3. Výhodnoťte změřené spektra pomocí softwaru.

LA-ICP-MS Výhody • Minimální spotřeba vzorku. • Minimální příprava vzorku. • Redukce/minimalizace možnosti kontaminace a spektrálních interferencí. • Možnost analýzy vzorků těžce tavitelných kyselinami. • Možnost studia laterální distribuce prvků ve vzorku. Obr. 4: Držák vzorku se skleným střepem

Tabulka 2. Podmínky analýzy

Velikost spotu Délka linie Energie

Doplňující otázky: 50 µm 3,5 mm 4 mJ

Příkon generátoru Plasmový plyn Nosný plyn Acuire time

1550 W 14 L/min 1 L/min 114 s

1. Je možné výše uvedené spektrální metody využít i pro identifikaci úlomků kovových částí aut?

27

Použitá literatura: 1. J. Jírasek, M. Vavro: Sklo Dostupné z: VŠB-TU Ostrava, Hornickogeologická fakulta. 2. L. Kopecký, Charakteristiky skla [online]. 29.6. 2003. Dostupné z: [cit. 20.5.2014]. 3. M. Gregerová, Petrografie technických hmot, Brno, skripta Masarýkové univerzity v Brně, 1996, s.139. 4. R.T. Almirall, T. Trejos, International Forensic Research Ins4tute, Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, Miami FL, 2010, Introduction to the Examination and Comparison of Glass Evidence Web-based course. 5. Norma ČSN 70 0601: Zkušební metody skla. Chemiský rozbor skla. Rozklady. 6. M. Mihaljevič, L. Strnad, O. Šebek, Chem. Listy (2004), 98, 123-130. 7. Z. Dolníček, Laboratorní metody výzkumu. UP, Olomouc, 2005.

28

Detekce hořlavin

6

Detekce a identifikace hořlaviny Hoření je fyzikálně-chemický děj. Jde o oxidační reakci, při které hořlavá látka reaguje vysokou rychlostí s oxidačním prostředkem za vzniku tepla a světla. Jde o exotermní reakci. A b y d o š l o  k zahoření je potřeba přítomnosti několika faktorů: (i) pevná látka (dřevo, papír, textil), (ii) kapalná látka (benzín, ředidlo) (iii) plynná látek (např. zemní plyn, acetylen) (iv) oxidační prostředek (oxidovadlo, kyslík) (v) iniciátor hoření (plamen, elektrický výboj, vysoká teplota). K procesu hoření je obvykle zapotřebí všech 3 složek. Hořlavost látek závisí na jejich afinitě ke kyslíku jednak volnému, jednak chemicky vázanému ve sloučeninách. Hořlaviny lze z pohledu chemického složení rozdělit na látky obsahující pouze hořlavé prvky (samostatné prvky, chemické sloučeniny složené pouze z hořlavých prvků a směsi těchto p r v k ů )  a látky obsahující prvky hořlavé i nehořlavé. U těchto látek závisí hořlavost na počtu a hmotnosti zastoupených hořlavých prvků.

Hořlavé kapaliny U každé kapaliny dochází vlivem prostředí k odpařování. Teplota vzplanutí je taková teplota, při níž jsou páry nad kapalinou natolik koncentrované, že dojde k jejich vzplanutí. Tato teplota je charakteristická pro každou hořlavou kapalinu, a podle této hodnoty je řadíme do tříd nebezpečnosti. Vznícení je vlastnost látek uvolňovat při vyšších teplotách prchavé, hořlavé produkty, které se při smísení s oxidačním prostředkem vznítí. Ke vznícení dochází pouze působením tepla, nikoliv iniciačního zdroje a projevuje se plamenným hořením. Může také dojít k jevu nazývanému samovznícení. Jednou ze základních podmínek šíření požáru je množství hořlavé látky a její rozmístění. To následně určuje i směr šíření požáru. Je zřejmé, že pokud se budou na místě požáru vyskytovat látky s vyšší hořlavostí, bude i rychlost šíření požáru vyšší. Pokud vezmeme  do úvahy fyzikální vlastnosti hořlavých látek, má největší vliv na šíření požáru skupenství látek. Obecně lze konstatovat, že nejvyšší rychlost šíření je při hoření plynných látek, následně látek kapalných a nejmenší rychlost šíření je při hoření pevných látek. Tato skutečnost je dána tím, že hoření probíhá vesměs v plynné fázi a pevné látky se do tohoto stavu musí nejprve připravit.

I. třída nebezpečnosti - teplota vzplanutí do 21 °C II. třída nebezpečnosti - teplota vzplanutí nad 21 °C do 55 °C III. třída nebezpečnosti - teplota vzplanutí nad 55 °C do 100 °C IV. třída nebezpečnosti - teplota vzplanutí nad 100 °C do 250 °C Nejvíce nebezpečné jsou hořlavé kapaliny I. a II. třídy nebezpečnosti. Do I. třídy nebezpečnosti patří např. benzín, aceton, líh a některá ředidla. Mezi hořlavé kapaliny II. třídy nebezpečnosti můžeme zařadit např. ředidla, barvy i některé druhy nafty. V mnoha případech, kdy je nalezena neznámá kapalina na místě trestného činu či náhodného požáru (např. ilegální sklady, nebo pyrotechnický nálož, průmyslové prostory), je nutné provést identifikaci hořlaviny a posouzení, zdali konkrétní látka a její množství mohlo vést k ohrožení života či majetku. V tomto případě hraji roli rychlé a citlivé metody. V případě že se jedná o analýzu makrokomponenty vzorku, jsou vhodné spektrální metody (např. infračervená spektrometrie, Ramanova spektrometrie), které umožní přesnou identifikaci hlavní složky vzorku bez náročné úpravy. Navíc existují speciální databáze spekter, takže identifikace může proběhnout automaticky bez nutnosti srovnání se standardem. V případě složitější mnohasložkové směsi se hořlaviny velmi často analyzují s pomocí GCMS. Tato technika disponuje několika výhodami: (i) velmi dobře se hodí pro analýzu těkavých a tedy i hořlavých kapalin, (ii) umožňuje provést jak separaci, tak identifikaci složení směsi kapalin bez nutnosti analyzovat standard, (iii) umožňuje provést opakované analýzy vzorku i v případech, kde je vzorku k dispozici velmi málo. GC-MS je nejvyužívanější analytická technika v požárních laboratořích, kde se identifikují  a stanovují nejen hořlaviny, ale také tzv. akceleranty hoření, které umožňují odhalit příčinu požárů. V rámci zjišťování příčin vzniku požárů se mj. provádí identifikace případných akcelerantů hoření ve vzorcích z požářiště (popel). Akcelerantem hoření se rozumí materiál použitý k iniciaci vzniku a podpoře šíření ohně nebo požáru. Jedná se o hořlavou kapalinu, obvykle ropnou frakci, případně organické rozpouštědlo nátěrových hmot (možný obsah alkoholů, esterů, ketonů, cykloalkanů aj.), použitou žhářem k úmyslnému založení požáru. Běžná metodika analýzy akcelerantů hoření využívá k odběru par z head-space vialky techniku mikroextrakce na tuhou fázi (SPME). Nejčastěji se využívá vlákno Carboxen/polydimethylsiloxan. Obecné schéma SPME vlákna je na obr. 1

Hořlavé kapaliny se podle teploty vzplanutí dělí do čtyř tříd nebezpečnosti:

30

Postup práce: 1. Z předloženého materiálu pomocí nůžek odstřihněte 3 vzorky z různých míst. Každý vzorek přesně zvažte a upravte jeho velikost, tak aby jeho hmotnost byla asi 10 g. 2. Každý zvážený vzorek umístěte s pomocí pinzety do headspace vialek pro plynový chromatograf, uzavřete víčkem se septem. 3. Do dalších vialek napipetujte po 10 !L standardů leteckého benzínu, petroleje, benzínu NATURAL 95 a technického benzínu. 4. S pomocí vedoucího cvičení umístěte headspace vialky do termostatovaného karuselu GC-MS umístěte SPME vlákno dovnitř nad navážený vzorek a nechte temperovat a sorbovat po dobu 15 minut při 60 °C. 5. Po 15 minutých přesuňte vlákno SPME do vyhřívaného prostoru dávkování GC-MS a proveďte desorpci sorbovaných analytů z SPME vlákna na kolonu v plynovém chromatografu. 6. S pomocí vedoucího cvičení (práce s MS databází) proveďte identifikaci jednotlivých složek a určete složení těkavé kapaliny, který byla přítomna ve vzorku s pomocí přiložené tabulky a výsledků analýzy standardů těkavých látek. Obr. 1: Schéma SPME vlákna

Podmínky stanovení na GC-MS Identifikace akcelerenatů hoření je závislá na odběru vzorku a nalezení odpovídající stop na místě požáru. Tyto stopy jsou předmětem tzv. dynamického ohledáním místa požáru, kdy se odkrývají místa kriminalistického ohniska při mechanickém odstraňování vrstev spalků, popela či ohořelých konstrukcí a vyhledávají možné iniciátory nebo jejich zbytky. Zjišťují se použité hořlavé Řádné shromažďování důkazů je první klíčový krok v analýze trosek z požáru.Hlavním cílem je zajištění důkazů, aby mohly být řádně analyzovány v laboratoři, a aby se zabránilo nebezpečí kontaminace nebo křížové kontaminaci mezi kapaliny k rozvoji nebo k zintenzivnění hoření. Úkol: Proveďte identifikaci složek hořlaviny v materiálu nalezeném na místě vzniku požáru (hadr se zbytky zeminy, zjevně nasáklý těkavými organickými látkami). Pomůcky: Vialky o objemu 20 mL se šroubovacím víčkem a silikon-teflonovým septem, automatická pipeta 10 - 100 uL, špičky pro automatickou pipetu. Chemikálie: letecký benzín, petrolej, automobilových benzín NATURAL 95, motorová nafta, technický benzín.

Separace a analýza látek byla provedena za následujících podmínek: • Kolona: HP-5 MS (5% fenylmethoxysilan), délka 30 m, Ø 0,32 mm, fáze 1 µm. • Nosný plyn: Helium, průtok 1 mL/min • Scan range: 30-400 amu. • GC program: 40°C–2min, od40°Cdo280°C-dT/dt10°C/min, o 280°C–10min.

Použitá literature: 1. J.R. Almirall, K.G. Furton, Analysis and Interpretation of Fire Scene Evidence. CRC Press, USA, 2004. 2. J.J. Lentini, „Fire Debris: Laboratory Analysis of“ in: Encyclopedia of Forensic Science, Wiley, 2009. 3. L. Přichystal, Nové metody používané při zjištování příčin vzniku požárů, VUT Brno, 2011 (diplomová práce).

Doplňující otázky: 1. K detekci těkavých látek v ovzduší je také používán fotoinizační detektor. Vysvětlete stručně jeho princip. 2. Důležitým faktorem při šetření příčin vzniku požárů je i správný odběr vzorků. Jaké metody vzorkování byste uplatnili, při odběru vzorků z požářiště?

31

Tabulka: Charakteristické zastoupení jednotlivých typů organických těkavých složek v benzínech a ropných produktech (převzato z E. Staufer, Fire debris analysis, Elsevier 2008, USA). TIC = celkový iontový proud

32

identifikace drog imunochemicke testy

7

Identifikace drog v pevném stavu pomocí spektrálních metod imunochemické diagnostické testy Identifikace drog v pevném stavu pomocí spektrálních metod – infračervená spektrometrie Spektrální metody představují ve forenzní chemii jedny z hlavních a dynamicky se rozvíjejících metod. Umožňují objektivní identifikaci neznámé látky na základě různých fyzikálně-chemických principů. Jednou z metod, které se ve forenzních laboratořích běžně používají je infračervená spektrometrie (IR). Infračerveným zářením rozumíme elektromagnetické záření v rozsahu přibližně 800 nm až 1000 µm. Na rozdíl od spektrometrie ve viditelné nebo UV oblasti, kdy je principem absorpce záření excitace valenčního elektronu na vyšší energetickou hladinu, využívá infračervená spektrometrie záření s nižší energií. Při absorpci infračerveného záření molekulou dochází ke změnám v jejich vibračních stavech, které jsou charakteristické pro určité vlnočty (namísto vlnové délky se v IR používá jednotka vlnočet – jde o reciprokou hodnotu vlnové délky vyjádřené v cm-1). Atomy v molekulách vibrují na určitých frekvencích. Je-li frekvence IR záření shodná s frekvencí vibrace daného atomu, dojde k absorpci tohoto záření. Mnohé funkční skupiny jsou charakteristické svými vlnočty a tak lze kromě identifikace neznámé látky rovněž získat alespoň základní informace o její možné struktuře. Klasickou metodou infračervené spektroskopie je transmisní měření IR spekter, při kterém dochází k absorpci IR záření zkoumanou látkou. Výsledkem je tzv. infračervené spektrum, které poskytuje jak zmíněné informace o některých funkčních skupinách, tak v oblasti cca 200 – 1500 cm-1 také tzv. „otisk prstu“, který je pro každou individuální chemickou struktury charakteristický, a lze jej použít k identifikaci neznámé látky. Výhodou IR je možnost měření vzorků jak v kapalném stavu (např. tenký film), tak ve stavu pevném (homogenizací a slisování tablety s KBr nebo tzv. nujolová metoda, při které je látka měřena v chemicky inertním minerálním oleji). Značnou nevýhodou infračervené spektroskopie je fakt, že voda (jakožto nejběžnější rozpouštědlo) vykazuje silnou absorpci IR záření a je nutné analyzované vzorky, stejně jako veškerý použitý materiál důkladně vysušit. Infračervená spektrometrie se v analýze drog využívá především k rychlé identifikaci chemického složení pevné drogy, při záchytu drog (drogový dealeři, letiště, kontrola nelegálních skladů A) apod.). Vychází se z předpokladu, že hlavní substancí v zadržené látce je samotná droga. Postup práce je velice jednoduchý. Zadržená látka, která pravděpodobně obsahuje drogu se smíchá s pevným KBr (obvykle v poměru 1:100 ve prospěch KBr). Z této směsi se vylisuje tableta, která se proměří v IR spektrometru. Následuje identifikace srovnáním získaného spektra neznámé látky s knihovou spekter, případně se proměří i standard.

Tento jednoduchý postup se využívá v kriminalistických laboratořích ke konečné identifikaci hlavní substance v zadržených podezřelých látkách. Bohužel tento postu není vhodný pro rychlý předběžný průkaz přímo v terénu. Pro tyto účely jsou pak vhodné barevné reakce, které je možné udělat ihned po zadržení podezřelé látky.

Barevné reakce drog („pill testing“) Vzhledem k tomu, že organických látek vč. kontrolovaných substancí (návykové látky, léčiva, prekurzory apod.) existují tisíce, před vlastní instrumentální analýzou je vhodné předběžnými kvalitativními metodami zúžit okruh možných látek nebo některé zcela vyloučit. Kromě základního fyzikálně-chemického popisu (vzhled, barva, krystalická struktura, rozpustnost, fluorescence, zápach, pH roztoku apod.) je lze některými předběžnými reakcemi prokázat nebo vyloučit přítomnost neznámé látky ve vzorku. Chemické reakce vedoucí k úplné či předběžné identifikaci podezřelé látky (návykové látky, psychofarmaka či jiného léčiva) představují širokou škálu metod založených na jednoduchých testech, které v ideálním případě vyloučí či přímo potvrdí přítomnost zkoumané látky ve vzorku. V mnoha případech se jedná o běžné chemické reakce využívané zejména v kvalitativní analýze organických sloučenin založených na více či méně selektivních reakcích různých funkčních skupin s určitým činidlem. Existuje celá řada postupů a metod, kterými lze prokázat hledanou látku ve vzorku. Obecně platí, že pro praktické aplikace je vhodné nalézt co nejvíce specifický test, který probíhá za běžných podmínek (laboratorní teplota, dostupná rozpouštědla, materiál apod.), využívají se při něm netoxické chemikálie a lze jej nejlépe provádět i mimo laboratoř (tzn. např. na místě činu, při policejních či celních kontrolách apod.) a jejichž použití a vyhodnocení zvládne i osoba bez odborného vzdělání v příslušeném oboru. Mnohé z těchto testovacích reakcí pak využívají i samotní konzumenti nebo distributoři návykových látek aby předešli možné nebo záměrné záměně za látku jinou, mnohdy podstatně nebezpečnější (tzv. „pill testing“). Předběžný test je obvykle prováděn s několika činidly a to se vzorkem přímo v pevném stavu (např. krystalický metamfetamin) nebo po jeho převedení do roztoku v příslušném rozpouštědle (nejčastěji voda nebo polární organická rozpouštědla jako např. methanol nebo ethanol). Níže je uveden přehled nejběžněji používaných chemických činidel, která se v praxi využívají k detekci široké škály podezřelých látek. 1.) Marquisova reakce Jedná se o jednu z nejběžnějších předběžných reakcí při testování podezřelých látek. Využívá se jí nejen při analýze drog ale rovněž k identifikaci alkaloidů či běžně používaných léčiv, což výrazně snižuje její selektivitu. Nicméně její relativní jednoduchost a zejména kombinace s doplňujícími testy (viz níže) může vést k dostatečně věrohodnému průkazu hledané látky ve vzorku. Využívá se především při testování extáze (MDMA), drog odvozených od amfetaminů (deriváty fenylethylaminů) a opiátů.

34

Marquisovou reakcí lze od sebe např. rozlišit nejčastěji zneužívané drogy – MDMA a metamfetamin, které mnohými dalšími reakčními činidly odlišit nelze. Jako činidlo se využívá směs koncentrované kyseliny sírové a formaldehydu (100 mL 98 % kyseliny sírové se opatrně smíchá s 5 mL 38-40 % vodného roztoku formaldehydu). Mechanismus reakce je poměrně složitý, obecně lze říci, že je založen na polymerizaci molekul zkoumané látky a formaldehydu v prostředí kys. sírové, kdy vznikají nabité oxoniové nebo karboniové sloučeniny (obr. 1). Příklad reakce Marquisova činidla s látkami amfetaminového typu je uveden na obr. 2.

Obr. 1: Oxoniový resp. karboniový ion.

černou sraženinu. Lze tak snadno odlišit DXM od jiných opiátů nebo opioidů. S látkami amfetaminového typu vznikají produkty červené až hnědé barvy, které postupem času tmavnou. Obsahuje-li molekula methylendioxidový skelet (např. MDMA) pak je zbarvení fialové. Marquisovo činidlo však reaguje i s mnoha běžnými látkami (z nichž se některé mohou vyskytovat jako ředidla pro fiktivní zvětšení dávky drogy). Mezi tyto látky patří např. cukry (sacharóza, glukóza), které mají charakteristickou tmavě hnědou barvu. Typická je pak reakce s kyselinou acetylsalicylovou (aspirin), které poskytuje červený nebo oranžový produkt (avšak až po delší době cca 2-3 min) a může tak vést k falešně pozitivnímu závěru na přítomnost amfetaminů. 2.) Simonovo činidlo Simonovo činidlo je relativně selektivním činidlem pro aromatické sekundární aminy (jeho modifikace známá jako Robadopovo činidlo pak také pro aminy primární). Pozitivní reakce se projeví jako světle či tmavě modré zbarvení, při nižší koncentraci zkoumané látky často až po několika minutách. Jedná se o reakci sekundárního aminu s acetaldehydem za vzniku enaminu, který následně reaguje s nitroprussidem sodným za vzniku immoniové soli, která je následně hydrolyzována na tzv. Simon-Aweův komplex (Obr. 3). Ten je charakteristický svým modrým zbarvením.

Obr. 3: Simonova reakce s metamfetaminem za vzniku barevného Simon-Aweova komplexu s nitroprussidem sodným. Obr. 2 : Marquisova reakce amfetaminu (R = H) nebo metamfetaminu (R = CH3).

Marquisovo činidlo je vhodné zejména pro opiáty, se kterými poskytuje tmavě fialové nebo červenofialové produkty. Naopak častá náhražka nebo „ředidlo“ drog na bázi opiátů (heroin, morfin, kodein atp.), dextrometorfan (DXM) poskytuje s tímto činidlem temně

Reakce je poměrně selektivní, avšak reaguje s mnoha jinými sekundárními aminy a proto je nutné potvrdit přítomnost hledané látky i dalším testem.

35

3.) Chen-Kaovo činidlo Některé látky, které jsou samy považovány za drogy nebo jejich prekurzory nereagují s žádným běžným činidlem. Typickým příkladem je efedrin a jeho deriváty (vč. enantiomerů). Ačkoli je efedrin rovněž sekundární amin, obsahuje ve své molekule hydroxylovou skupinu a díky tomu poskytuje negativní reakci se Simonovým činidlem. Vzhledem k tomu, že efedrin a jeho deriváty (pseudoefedrin, chloroefedrin, chloropseudoefedrin apod.) jsou důležitými výchozími látkami při syntéze metamfetaminu (obr. 4), je činidlo na tento typ látek velice důležité.   Obr. 5: Chen-Kaova reakce s efedrinem (resp. norefedrinem) za vzniku komplexu s měďnatými ionty.

4.) Detekce THC pomocí diazoniových solí řady „Fast“ Tzv. Fast soli jsou diazoniové sloučeniny využívané v analytické chemii a biochemii především jako barviva nebo derivatizační činidla. Několik látek z této řady však umožňují značně selektivní detekci THC v marihuaně a produktech z ní. Jednou z nejpoužívanějších je Fast Blue B (nebo také BB, obr. 6).

Obr. 6: Struktura soli Fast Blue B

  Obr. 4: Syntéza metamfetaminu z efedrinu (resp. chloroefedrinu, A) a stereoselektivní syntéza z (+) nebo (-) pseudoefedrinu redukcí kyselinou jodovodíkovou za katalýzy fosforem (nejčastější ilegální metoda).

Chen-Kaova reakce využívá vznik fialového nebo modrého komplexu s ionty mědi (obr. 5) a je více méně selektivní pro fenylalkylaminy s vicinálními amino a hydroxy skupinami. S látkami amfetaminového typu reakce neprobíhá. Reakce však může probíhat také s norefedrinem nebo chloroderiváty efedrinu. Zbarvení pak bývá tmavě modré. Vzniklý komplex je možné extrahovat do nepolárního rozpouštědla, např. diethyl etheru nebo n-butanolu.

Tato látka reaguje v bazickém prostředí se dvěma molekulami THC za vzniku charakteristicky zbarvené sloučeniny (obr. 7). Barva a rychlost reakce záleží na typu barviva, v praxi se nejčastěji používá zmíněná Fast Blue B (pozitivní reakce se projeví jasně červenou barvou) a dále pak Fast Garnet GC (výsledná barva je oranžová), Fast Blue RR (výsledná barva je růžová) nebo Fast Corinth V (výsledná barva je fialová). Nejběžnější metodou detekce je provedení extrakce podezřelé látky (např. sušené marihuany nebo hašiše) do etanolu s následným přídavkem zvolené Fast soli (obvykle smíchané s bezvodým síranem sodným v poměru 1:100). Bazické prostředí je zajištěno přidáním několika kapek 25 % roztoku uhličitanu sodného. Pokud barva extraktu znemožňuje pozorovat barevnou změnu, lze barevný produkt vyextrahovat do nepolárního rozpouštědla (např. chloroform).

36

Obr. 7 – Výsledný produkt reakce THC s diazoniovým barvivem Fast Blue B.

Imunochemické testy pro detekci drog Zatímco barevné reakce spolu s infračervenou spektrometrií umožňují identifikovat přímo drogu ve zdrojovém materiálu (zadržený prášek, tablety apod.), není možné tyto metody využít pro přímou orientační identifikaci zneužití drog a dalších omamných a psychotropních látek. Je také potřebné vzít do úvahy, že po požití a absorpci drogy dochází v drtivé většině případů k její metabolizaci a koncentrace původní formy v biologickém materiál postupně klesá. V tomto případě lze využit imunochemické diagnostické testy. Imunochemické metody jsou založeny na specifické reakci antigenu (resp. analytu)  s přítomnou protilátkou. Podmínkou je existence specifické protilátky, která je citlivá na přítomnost analytu ve vzorku. Tyto metody pracují na principu kompetice mezi analytem  a značeným analytem (nejčastěji radioaktivně, fluorescenčně, enzymaticky atd.) o přítomnou protilátku. Detekce analytu je poté založena na jeho schopnosti vytěsnit značený analyt  z vazby na protilátku. Jedná se o technicky nenáročné metody, které jsou však často nedostatečně specifické, a proto je nutné potvrdit pozitivní výsledek jinou objektivní analytickou metodou. V současné době pracují specializované laboratoře s automatickými imunoanalyzátory, které jsou schopny rychle analyzovat především biologické vzorky. Pro rychlou orientační analýzu nebo potvrzení však existují i jednorázové imunochromatografické testy, které pracují na obdobném principu s vizuálním vyhodnocením výsledku (obr. 8).

Imunochromatografické testy fungují na principu chromatografického vzlínání vzorku podobně jako třeba papírová chromatografie nebo TLC. Testovaný vzorek vzlíná do oblasti, kde je umístěna značená protilátka (v těchto případech obvykle barevně). Pokud testovaný vzorek neobsahuje hledanou látku (nebo je její obsah nižší než je detekční limit daného testu), nedojde k navázání protilátky (tedy ani ke kompetici) a v určité oblasti testu se protilátka naváže na tzv. drogový protein (který je imobilizovaný v testu). Negativní výsledek se potom projeví jako dvě viditelné barevné zóny (viz obrázek 8). V opačném případě přítomný analyt zamezuje navázání protilátky na drogový protein a sám s ním vytvoří komplex. To se projeví jako chybějící barevná zóna v testu. Pro ověření funkčnosti testu musí být druhá (tzv. kontrolní) zóna vždy pozitivní bez ohledu na přítomnost hledané látky. Imunochemické testy mohou být vysoce specifické (např. test na THC, resp. jeho metabolit), na druhou stranu však mohou reagovat neselektivně s celou řadou podobných látek včetně metabolitů. Tento fakt je nutno brát v potaz při vyhodnocení výsledku a imunochemický test by měl vždy sloužit spíše jako rychlá a orientační metoda k potvrzení nebo vyloučení hledaných látek. Úkol: 1) Proveďte identifikace neznámého prášku s pomocí barevných reakcí na drogy a dále s pomocí infračervené spektrometrie. 2) Proveďte identifikaci zneužité drogy v moči s pomocí imunochemických diagnostických testů. Pomůcky a chemikálie: bromid draselný, roztoky činidel (Marquisovo, Chen-Kaovo, Simonovo, Fast Blue B), imunochemické diagnostké testy, infračervený spektrometr, lis na tablety.

Doplňující otázky: 1. Které další spektrální metody je možné využít k rychlé identifikaci drog v pevném či kapalném stavu? 2. Je možné pro identifikaci drog využít kromě imunochemických metod také enzymatické metody?

Použitá literatura:

Obr. 8: Imunochromatografický test s naznačeným vyhodnocením výsledku.

1. A. C. Moffat: Clark Analysis of Drugs and Poisons, 3rd edition, Vol. 1, Pharmaceutical Press, 2004. 2. B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, 4th edition, AACC Press, 2013. 3. http://www.dancesafe.org/testing-kit-instructions/.

37

Analýza budivých aminů

8

Stanovení budivých návykových látek (amfetamin, efedrin, extáze) pomocí LC-MS, GC-MS a CE-MS Budivé aminy Budivé aminy patří mezi stimulační látky (stimulanty) zvyšující hladinu noradrenalinu, serotoninu, a dopaminu v mozku. Využívají se v léčbě poruchy pozornosti s hyperaktivitou [ADHD] zejména u dětí, dále při léčbě úrazů mozku, narkolepsie a chronického únavového syndromu. Původně se některé budivé aminy používaly i jako anorektikum k potlačení hladu a snížení tělesné hmotnosti. Budivé aminy patří mezi drogy. Drogy je možné definovat jako jakoukoli látku, která je-li vpravena do živého organismu, může pozměnit jednu nebo více jeho funkcí a vyvolat závislost. Kromě budivých aminů patří mezi stimulanty i např. kofein a thein, nikotin a kokain a částečně i extáze. Chemické struktury drog patřící do skupiny amfetaminů (fenetylaminy amfetaminového typu) a jejich prekurzorů jsou zobrazeny na obr. 1.

Stimulační drogy mají obecně následující účinky na lidský organismus: 1) zvyšují vnitřní napětí a strach, vyvolávají úzkostné stavy a psychózy, 2) zvyšují riziko agresivního chování, 3) vedou ke změnám v chování (např. zvyšují sebevědomí, vedou k přeceňování vlastních schopností), 4) vysazení užívání budivých aminů vede ke spavosti, únavě, zvýšenému snění, dysforie  a deprese, 5) jejich užívání vede ke vzniku psychické závislosti, fyzická závislost nevzniká.

Amfetamin a methamfetamin Amfetamin (a-methylphenythylamin) a methamfetamin (N-methyl-a-methylphenetylamin). Jako volná báze je dostupný v kapalné formě. Nejčastěji je amfetamin distribuován jako síran, hydrochlorid nebo fosfát ve formě bílé až nažloutlé krystalické látky. Čistota distribuovaného amfetaminu v ilegálním pouličním prodeji bývá nejčastěji méně než 20 %. Kromě prášku bývá někdy amfetamin v podobě tablet.

Syntéza amfetaminu a methamfetaminu Existuje mnoho metod syntézy amfetaminu. Nejjednodušší syntéza amfetaminu je Leuckartova syntéza. Kromě Leuckartovy syntézy existují například ještě Birchova metoda (využívaná nacisty za II. světové války a metoda využívající jodovodík. Obě syntetické cesty jsou zobrazeny na obr. 2.

(I.)

Obr. 1: Struktury amfetaminů a jejich prekurzorů

39

(II.)

(III.)

Podstatná část aplikovaného metamfetaminu se vylučuje močí v nezměněné formě (cca 45% během 24 h po aplikaci). Vylučování je silně závislé na pH. V kyselé moči se v nezměněné formě vyloučí až 76%, zatímco v alkalické moči jsou to jen cca 2% aplikované dávky. Asi 15% dávky se v játrech metabolizuje hydroxylací na hydroxymetamfetamin. Přibližně 7% dávky se N-demethylací metabolizuje na amfetamin, ze kterého dále vznikají hydroxyamfetam i n  (2-4%) a norefedrin (2%) (z kterých vzniká hydroxynorefedrin (0,3%)) a konečně fenylaceton (0,9%) metabolizovaný dále na kyselinu benzoovou, resp. kyselinu hippurovou. Jeden z me-

tabolitů, tj. amfetamin je aktivní, ale má slabší účinky než metamfetamin. Schématické znázornění metabolismu methamfetaminu a amfetaminu je na obr. 3 Obr. 3: Schématické znázornění metabolismu methamfetaminu a amfetaminu.

Obr. 2: Reakční schémata vedoucí k syntéze methamfetaminu. (I.) Leuckartova syntéza, (II.) metoda využívající jodovodík, (III.) Birchova syntéza (převzato a upraveno z S. Bell: Forensic Chemistry)

Amfetamin je nejčastěji ředěn kofeinem, aby byla maskována nízká koncentrace amfetaminu  v dávce a ke zvýšení stimulačního účinku amfetaminu. Amfetamin i methamfetamin jsou navíc opticky aktivními sloučeninami a oba se vyskytují ve dvou optických izomerech L- a D-. D-enantiomery jsou mnohem více fyziologicky účinnější formy, ale jsou z organismu rychleji eliminovány než odpovídající L-isomery.

Metabolismus amfetaminu a methamfetaminu

MDMA Methylendioxymethamfetamin (MDMA) patří mezi skupinu drog s budivými účinky obecně označována jako fenetylaminy. Kromě MDMA existuje ještě několik strukturně podobných látek s podobnými působením na lidský organismus (MDA - methylendioxyamfetamine, MDEA - methylendioxyethylamfetamin, MBDB - N-methyl-1-(1,3-benzodioxol-5-yl)butanamin). MDMA je nejběžnější a nejčastější součástí tablet označovaných jako extáze (taneční droga). Tablety mají typický rozměr okolo 10 mm, jsou ploché eventuálně bikonvexní a váží obvykle v rozmezí 200 až 300 mg. Tablety mají vyraženou charakteristické logo, či strukturu. Charakteristický design tablet není ale vázán pouze na extázi, ale také na další drogy např. amfeta-

40

min. Logo na tabletách nevypovídá nic o obsahu a chemické struktuře drogy. Do dnešního dne byly zaznamenány stovky různých log na tabletách obsahující drogu. Jedna z mnoha

Průkaz MDMA barevnou reakcí Marquisovo činidlo poskytuje temně modré zbrarvený s MDMA. Reakce není specifická  s Marquisovým činidlem reagují i další léčíva či drogy (např. fenothiaziny, betablokátory  a alkaloidy). Marquisovo činidlo: K 5 mL 37-40% roztoku formaldehydu se opatrně přidá 100 mL koncentrované kyseliny sírové (18 M).

Analýza budivých aminů chromatografickými metodami

možností jak mohou vypadat tablety obsahující extázi je zobrazena na obr. 4. Obr. 4: Příklad tablety obsahující MDMA.

Hlavní farmakologický účinek MDMA je zvýšení sekrece a inhibice vychytávání serotoninu, dopaminu a norepinefrinu v mozku. MDMA způsobuje euforii, zvýšenou empatii pocit zvýšení energie v organismu a také prohloubení hmatových vjemů. Často je také užití MDMA spojeno přechodně s hypertenzí, hypertermií a dehyratací, zatímco dlouhodobé působení vede k depresi díky snížené produkci serotoninu v CNS.

Syntéza MDMA Několik syntetických metod bylo popsáno, přičemž nejznámější je uvedena na následujícím reakčním schématu (obr. 5)

Obr. 5: Reakční schéma syntézy MDMA.

Identifikace reakčních meziproduktů a vedlejších produktů syntézy umožňuje provést identifikaci konkrétní syntetické cesty a tím i odhalit původ zachycených drog.

Pro rozlišení a identifikaci jednotlivých budivých aminů v biologickém materiálu případně  v materiálech zadržených v sítích nelegální distribuce jsou nejvhodnější chromatografické metody (GC, LC), případě kapilární elektroforéza (CE). Zejména v případě analýzy biologického materiálu je nutné provést úpravu a extrakci budivých aminů. Budivé aminy v lidském organismu podléhají jen velmi minimálně konjugaci a není tedy nutná hydrolýza metabolitů (konjugátů) před vlastní extrakcí. Jako extrakční metody se nejčastěji používá extrakce z kapaliny do kapaliny (L-L) extrakce a extrakce pevnou fází (SPE) extrakce. V případě následné analýzy budivých aminů pomocí GC je nutné aminy derivatizovat, zatímco derivatizace aminů pro LC není nutná. V mnoha případech se ale derivatizace budivých aminů provádí i před LC analýzou, a to zejména pro zlepšení retence. Derivatizace není nutná v případě následné analýzy pomocí CE.

Derivatizace amfetaminů pro GC V případě GC dochází velmi často k rozmývání a deformacím píků (“tzv. tailing”) budivých aminů a derivatizace se tedy provádí za účelem zlepšení tvaru píků a snížení nežádoucí sorpce analytů na stacionární fázi. Derivatizací amfetaminů před GC analýzou navíc dojde ke zvýšení selektivity stanovení a snížení vlivu nežádoucích interferentů. Derivatizace může být prováděna jako achirální či chirální. Derivatizace achirálními derivatizačními činidly je využívána častěji a hlavně v případech, kdy není nutná separace jednotlivých optických izomerů budivých aminů. V případě, že je studován i poměr jednotlivých enantiomerů budivých aminů ve vzorku provádí se derivatizace chirálními derivatizačními činidly. Další výhodou derivatizace může být zvýšení citlivosti a selektivity hmotnostně spektrometrické detekce. Samotné budivé aminy neposkytují příliš velkou citlivost při hmotnostně spektrometrické detekci s pomocí ionizace elektronem. Vnesením elektronegativního zbytku do molekuly budivých aminů se výrazně zvýší účinnost ionizace a tím i citlivost detekce oproti nederivatizovaným analytům. Navíc MS spektra derivátů budivých aminů jsou mnohem unikátnější než MS spektra nederivatizovaných aminů, které obsahují nespecifické fragmenty a jejich identifikace je velmi složitá. Stejné nespecifické fragmenty se běžně vyskytují i v MS spektrech biologických vzorků, ve kterých budivé aminy nejsou přítomny. Nejčastější derivatizační reakce pro derivatizaci budivých aminů zahrnují silylaci, acylaci  a alkylaci. Jako derivatizační činidla se využívají anhydrid trifluoroctové kyseliny (TFA), an-

41

hydrid kyseliny pentafluorpropionové (PFPA), anhydrid kyseliny heptafluoromáselné (HFBA) a dále perflourooktanoylchlorid, carbethoxyhexafluorobutyrylchlorid (CB) a Nmethyl-N-t-butyl-dimethylsilyltrifluoroacetamid (MTBSTFA). Pro chirální derivatizaci jsou využívány trifluoroacetyl-L-prolylchlorid (L-TPC), pentafluoropropionyl-L-prolylchloride (L-PPC) a heptafluorobutyryl-L-prolylchlorid (L-HPC). Reakční schéma acetylace amfetaminů je na obr. 6. Kromě spojení GC-MS se pro detekci derivátů budivých aminů využívají ještě plamenověionizační detekce (FID), dusíkový-fosforový detektor (NPD), a detektor elektronového záchytu (ECD).

trakci neutrálních látek, takže se extrakt většinou přečištuje reextrakcí do vodné fáze a nakonec zpět do organické fáze. Jako činidlo pro úpravu pH vodných vzorků před extrakcí do organického činidla se nejčastěji používá NaOH. Úkol: Proveďte izolaci amfetaminů z předloženého vzorku moči a identifikujte jednotlivé budivé aminy ve vzorku a proveďte jejich stanovení. Chemikálie: standardní roztoky methamfetaminu, amfetaminu a efedrinu o koncentraci 10 mg/L ve vodě, 50% (w/v) roztok NaOH, 1-chlorobutan, zředěná kyselina sírová (1:1), deionizovaná voda, anhydrid kyseliny heptafluoromáselné, methanol. Pomůcky: mikrozkumavky, vialky pro GC, LC a CE, ultrazvuk, kádinky, odměrný válec, termovap pro odpařování pod proudem dusíku, SPE manifold, SPE kolonky BondElut RP/katex. Postup práce:    L-L Extrakce   

Obr. 6: Příklad acetylace amfetaminů a jeho derivátů.

Derivatizace amfetaminů pro LC Retenční chování budivých aminů v LC je obecně lepší než v případě GC analýz. Nicméně i zde je derivatizace prováděna pro zlepšení retenční vlastností a zvýšení citlivosti detekce. Například amfetamin absorbuje UV záření, ale jeho molární dekadický absorpční koeficient je nízký. Vnesením dalšího chromoforu do molekuly budivého aminu tak dojde ke zvýšení absorpce UV záření a tím i citlivosti detekce. Některé derivatizační činidla navíc umožňují uskutečnit citlivou fluorescenční detekci, či elektrochemickou detekci. Jako derivatizační činidla se pro LC používají 3,5-dinitrobenzylchlorid (DNB), fenylisothiokyanát, 4-(N,N-dimethylaminosulphonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazol (DBD-F), fluorosceinisothiokyanát, 1,2-naftochinon-4-sulfonát, fluorenylmethylchloroformiát (FMOCCl) a dansyl chlorid. Pro chirální derivatizaci se využívá Marfyho činidla (1-fluoro-2,4-dinitrofenyl-5-Lanilinamid) a dále (-)-1-(9-fluorenyl)ethylchloroformiát (FLEC) a fluorenylmethylchloroformiát-L-prolyl chlorid (FMOC).

L-L extrakce budivých aminů L-L představuje nejjednodušší způsob extrakce budivých aminů z biologického materiálu. Budivé aminy mají pK okolo 10. Jde o bazické sloučeniny, které do organického rozpouštědla z vodné fáze budou přecházet z bazického pH. Spolu s bazickými sloučeninami dojde i k ex-

a) Ke 2 mL vzorku ve zkumavce se přidá 50% (w/v) roztok NaOH, výsledné pH musí být okolo 10. b) Ke vzorku se dále přidá 5 mL 1-chlorobutanu a 5 minut se protřepává. Po ustavní rovnováhy se organická fáze přenese do čisté další zkumavky. c) K organické fázi v čisté zkumavce se přidá zředěná kyselina sírová (5 mL) a zkumavka se opět uzavře a 5 min protřepe. d) Vodná fáze po reextrakci se přenese do další čisté zkumavky a budivé aminy se znovu extrahují do 5 mL 1-chlorobutanu. Organická fáze po extrakci se přenese do čisté zkum a v k y  a nechá se za laboratorní teploty odpařit pod proudem dusíku. e) Extrakt se derivatizuje pomocí HFBA pro případ analýzy vzorku pomocí GC-MS. f) Pro analýzu s pomocí CE a LC se vzorek nederivatizuje. Odpařený extrakce se rekonstituje ve 200 uL methanolu a dávkuje do kapalinového chromatografu či do kapilární elekt r o f o r é z y . 

SPE extrakce K vlastní SPE extrakci se využije SPE kolonek obsahující směs katexu a reverzní fáze (SPE BondElute Certify RP/Katex). Návod k SPE extraktoru je přiložen níže. 1. Tři kolonky SPE umístěte do SPE extraktoru a proveďte jejich postupnou kondicionaci. Nejprve kolonky kondicionujte s pomocí 2 mL methanolu a dále s pomocí pufru 2 mL 100 mM fosfátu sodného pH 6,0.

42

2. Následně na kolonky naneste 5 mL vzorku moči, a 5 mL směsi standardů amfetaminu a methamfetaminu a blank (deionizovaná voda) a kolonky opět promyjte 2 mL 100 mM fosfátu sodného pH 6,0. 3. Následně všechny 3 kolonky promyjte 2 mL 1 M kyseliny octové a kolonky proudem dusíku vysušte a kolonky promyjte 6 mL methanolu. 4. Proveďte eluci zachycených analytů s pomocí 2 mL směsi dichlormethan/isopropanol/ hydroxid amonný (78/20/2). 5. Eluované vzorky odpařte do sucha pod proudem dusíku, extrakt rekonstitujte v 50 uL mobilní fáze případně pufru pro CE a analyzujte.   

Vlastní analýza a) Pod vedením vedoucího cvičení postupně proměřte extrakt po derivatizaci na GC-MS a extrakty bez derivatizace s pomocí LC-ESI-MS a CE-ESI-MS.

Podmínky analýz 1. GC Kolona: 100% methyl polysiloxane, 12.5 m × 0.2 mm I.D., 0.33 µm, teplotní program: oven: 60 °C (1 min) to 140 °C (4 min) at 30 °C/min, then to 276 °C at 20 °C/min, 4 min. 2. LC Kolona: Discovery HS F5, 5 cm x 2.1 mm I.D., 3 µm, mobile phase: [A] 0.1% ammonium acetát ve vodě; [B] 0.1% ammonium acetát v acetonitrilu; [C] acetonitril; (10:30:60, A:B:C), průtok mobilní fáze 2 uL/min, teplota kolony 35 °C, MS ionizace v kladném modu, injekce vzorku 5 uL. 3. CE Kapilára: nepokrytá křemenná kapilára, 60 cm celková délka, pracovní elektrolyt 50 mM acetát amonný pH 4.5, U = + 20 kV, injekce vzorku 100 mbar/10s. Složení pomocné kapaliny 50:49.5:0.5 (%, v/v) MeOH:H2O:HCOOH, průtok pomocné kapaliny 4 ul/min. MS ionizace v kladném modu.

Návod k obsluze SPE extraktor (membránové čerpadlo M 401 a Manifold SPE Supelco) Membránové čerpadlo M 401 Membránové čerpadlo slouží k vytvoření potřebného vakua v SPE manifoldu, tak aby mohla být provedena kondicionace SPE patrony, samotný proces extrakce analytů a následně jejich eluce. 1. Membránové čerpadlo (MČ) se uvede do provozu zastrčením přívodního kabelu do zástrčky elektrické sítě. MČ nemá samostatný vypínač. Zároveň je potřebné zkontrolovat, zdali je připojena gumová hadice vedoucí od MČ na výstupu zajišťující vakuum. Příslušný výstup je označen jako „VAKUUM“. 2. Na ventilu manometru SPE manifoldu se povolí bílý plastový ventil na maximum. 3. Druhý konec gumové hadice se připojí na vstup SPE manifoldu. Samotná regulace vakua probíhá na regulátoru vakua na SPE manifoldu a s pomocí ventilů pro jednotlivé SPE kolonky na horním víku manifoldu. SPE Manifold SPE manifold slouží k uskutečnění vlastní SPE extrakce 1. Do vnitřního prostoru manifoldu se umístí příslušná nádobka (odpadní nádobky, či nádobky na záchyt eluátu). A manifold se uzavře víkem. 2. Zkontrolovat, zdali jsou všechny ventily pro SPE kolonky (hnědé ferulky na horní desce manifoldu) uzavřeny (ferulky se utáhnou ve směru hodinový ručiček). 3. Do těchto ventilů se umístí SPE patrony pro extrakci. 4. Potřebné vakuum pro kondicionaci, nanášení vzorků, promývání SPE kolonek a eluci vzorku se nastaví na hlavním regulátoru vakua (bílý plastový ventil) na manometru manifoldu, přičemž velikost vakua musí být vždy nižší, než 20 mm Hg sloupce (červená stupnice manometru) 5. Pro kondicionaci, promývání, nanášení vzorku a eluci, se míra vakua adjustuje pomalým pootevřením ventilů (hnědé ferulky se povolí proti směru hodinových ručiček) pro příslušnou SPE kolonku. Opětovně je možné vakuum pro danou SPE kolonku zastavit utáhnutím příslušného ventilu (hnědé ferulky ve směru hodinových ručiček). Ukončení práce na SPE extraktoru Vytáhnutí přívodního kabelu MČ z elektrické sítě se přeruší tvorba vakuu v SPE manifoldu. Je možné ho případně vyčistit.

43

Použitá literature: 1. S. Bell, Forensic Chemistry, Prentice Hall, 2nd edition, 2012 2. D.G. Barceloux, Medical Toxicology of Drug Abuse, Wiley, 2012 3. B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, AACCPress, 4 edition, 2013 4. W.R. Kuelpmann ed., Clinical Toxicology Analysis Vol .1,2, Wiley 2009. 5. J. Bogusz: Forensic Science, Wiley, 2000.

Doplňující otázky: 1. Jaké jiné analytické techniky by bylo možné využít pro detekci amfetaminů a

jejich metabolitů v moči a krvi? 2. Navrhněte fragmentační cestu pro EI-MS amfetaminu.

44

Analýza vlasů

9

Analýza vlasů na přítomnost drog Po vstupu drogy (obecně noxy) do lidského organismu dojde k její absorpci, distribuci  a metabolizaci. Tradiční biologický materiál, který se analyzuje, za účelem prokázání přítomnosti drogy či jejich metabolitů umožňuje prokázat, že je člověk pod vlivem drog. Vzhledem k tomu, že dochází k postupné eliminaci drogy a jejich metabolitů z lidského organismu (převážně močí a stolicí), není možné prokázat zpětně s odstupem delšího časového období intoxikaci organismu analýzou krve či moči. Krev i moč je možné odebrat i post mortem (po smrti) pro zjištění, zda byl mrtvý v době smrti pod vlivem této látky a zda hladina látky nalezená v krvi nesouvisí se smrtí. Pro uvedené účely nejsou vlasy vhodným materiálem k analýze. Analýzou vlasů na přítomnost drog není možné prokázat ovlivnění lidského organismu drogou. Vlasy je ale možné použít k prokázání dlouhodobého zneužívání (abúzu) drog. Vlasy mohou velmi dobrým biologickým materiálem pro toxikologickou analýzu i v případě, kdy nelze post mortem získat jiný biologický materiál k analýze díky například velmi pokročilé hnilobě těla po smrti. Vyšetřování vlasů podstatně rozšiřuje možnosti detekce v čase po dávce. Vlas má jako biologický materiál k analýze specifické vlastnosti, které je potřeba brát  v úvahu při odběru vzorku, jeho zpracování k analýze, vlastní analýze a také i intepretaci získaných výsledků. Vlas je složen z proteinů (65 – 95 %), lipidů, stopových minerálů, polysacharidů a vody. Má slabě zásadité pH. Hodnota pH vlasů výrazně ovlivňuje i typ látek, které se budou ve vlasech ukládat. O ukládání konkrétní látky ve vlasech rozhoduje afinita látky k melaninu, lipofilita látky a její acidobazické vlastnosti. Vlasová matrice má nižší pH než krev, a proto je výsledný gradient pH výhodnější pro přechod spíše bazických látek, než látek neutrálních nebo kyselých. I barva vlasů mý vliv na ukládání chemických látek do vlasů. Koncentrace drog je většinou větší v tmavých vlasech než ve světlých vlasech. Prostup chemických látek do vlasů z krve je možný trojím mechanismem: (i) pasivní difúze z krevních kapilár (tímto způsobem se do vlasů dostává největší podíl látek   i jejich metabolitů), (ii) vylučování na povrch vlasů z potu a kožního mazu a částečná difúze do vnitřních struktur vlasů a další případná difúze z hlubokých kompartmentů kůže, (iii) záchyt na povrch z vnějšího prostředí, tzv. externí kontaminace. Externí kontaminaci (např. barviva z barvených vlasů, působení okolních látek v případě těla nalezeného v zemi) je nutné odstranit, protože ruší stanovení. Jedna z důležitých úprav před vlastní extrakcí drog a nox z vlasů je tedy mytí a praní vlasů.

Způsob odběru vzorků vlasů Nejvhodnější je odebírat vlasy ze zadních oblastí hlavy. Oproti ostatním oblastem hlavy, vykazuje zadní oblast nejnižší variabilitu v rychlosti růstu vlasů. Množství vlasů v růstové fázi je méně proměnlivé a jsou méně ovlivněny věkovými faktory  a faktory závislými na pohlaví. Vlasové prameny se odebírají co nejblíže povrchu hlavy  a místo odběru musí být zaevidovaná. Vzorek vlasů je možné skladovat při pokojové teplotě v hliníkové fólii, obálce nebo plastové trubici. Velikost odebíraných vzorků se liší v závislosti na požadované analýze, použité analytické metody. Množství vzorku, které se odebírá, se nejčastěji pohybuje v rozmezí od jednoho vlasu až po 200 mg vzorku. Pro účely analýz je však ideální odebírat pramen vlasů o tloušťce tužky.

Obecný postup zpracování vzorku vlasů Nejdříve je nutné provést dekontaminaci vlasů, tak aby se odstranili rušivé chemické látky  z povrchu vlasů. Dekontaminace se provádí promýváním vlasů roztoky tenzidů. Dále se provádí odmaštění vzorků vlasů nejčastěji s pomocí acetonu. Následně je nutné provést homogenizaci vzorku, nejčastěji postačí stříhání. V případně nutnosti provádět sekvenční analýzu (tj. zjištění obsahu nox či drog v závislosti na růstu vlasu podél jeho délky) se vlasy stříhají na segmenty o délce 1 cm, které se pak zpracovávají a analyzují samostatně. Následuje další homogenizace na milimetrové kousky, opět s pomocí nůžek. Dalším krokem je tzv. desintegrace vlasů, která se provádí za účelem uvolnění nox, či drog z vlasů v co největším množství. Desintegrace vlasů se provádí methanolem nebo se hydrolyzují s minerální kyselinou či alkalickým hydroxidem. Při desintegrace je důležitým parametrem teplota a čas, po kterou desintegrace probíhá. Po desintegraci následuje extrakční a prekoncentrační krok. Jako extrakční techniky se používají L-L extrakce, extrakce pevnou fází SPE, SPME a pod. Koncentrace nox ve vlasech se pohybuje na velmi nízkých úrovních, proto je nutný extrakční  a prekoncentrační krok s následnou analýzou vyextrahovaných a zakoncentrovaných analytů pomocí velmi citlivých analytických technik. Nejčastějšími technikami jsou plynová nebo kapalinová chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (GC-MS/MS a LC-MS/MS). Vlasy se tedy nepoužívají jako biologický materiál pro průkaz akutní intoxikace drogou, ale pro průkaz chronického zneužívaní drog. Může pouze prokázat, zda vyšetřovaný užíval delší dobu nějakou látku ve významnějších dávkách. Ve významnějších dávkách proto, že všechny látky mají ve vlasech určitý limit detekce, tj. množství, které lze pomocí analytických metod z j i s t i t . 

46

Ke zjišťování průběhu podávání určité látky vyšetřovanému slouží sekvenční analýza. Ta nám umožňuje stanovit kdy a v jakých dávkách byla látka pravděpodobně podána.

Úkol: Proveďte identifikaci a stanovení amfetaminů v předloženém vzorku vlasu. Pomůcky: ultrazvuk, kádinky, odměrný válec, mikrozkumavky, SPE extrakční patrony (hydrophilic polymer phase), automatické pipety a špičky. Chemikálie: methanol, acetonitril, hydroxid amonný, kyselina octová, kyselina trifluoroctová, standardy amfetaminu, methamfetaminu a efedrinu v methanolu 1 mg/mL. Podmínky LC separace Kolona: Ascentis C18, 15 cm x 2.1 um, 5 µm velikost částic Mobilní fáze: A: deionizovaná voda + 0.05% trifluooctové kyseliny B: acetonitril + 0.05% trifluoroctové kyseliny Průtok: 200 uL/min Gradient 0 min 7 min 10-11 min

90% A 10% B 70% A 30% B 10% A 90% B

c) proveďte promytí (odstranění balastů) SPE kolonky s pomocí 1 mL 5 % methanolu obsahujícího 2% hydroxid amonný a následně 1 mL 20% methanolu obsahující 2% hydroxid amonný. d) Proveďte eluci zachycených amfetaminů 0,5 mL 20% methanolu obsahující 2 % kyselinu octovou. e) Eluát rekonstituujte ve 150 uL mobilní fáze. 4. Připravte kalibrační sadu roztoků obsahující amfetamin, methamfetamin a efedrin v koncentračním rozmezí (0.05 ug/L až 5 ug/L) v mobilní fázi a proměřte je s pomocí vedoucího cvičení. Proveďte vyhodnocení obsahu amfetaminu, methamfetaminu a efedrinu v předloženém vzorku vlasů.

Doplňující otázky: 1. Je možné z výsledků analýzy vlasů na přítomnost drog dělat závěry o akutní intoxikaci organismu?

Použitá literatura: 1. B. Levine, Principles of Forensic Toxicology, AACC Press; Fourth edition, 2013. 2. M.J. Bogusz, R. Smith, Forensic Science, Volume 6, Second Edition (Handbook of Analytical Separations), Elsevier Science; 2 edition (2007). 3. S.H.Y. Wong, I. Sunshine, Handbook of Analytical Therapeutic Drug Monitoring and Toxicology, CRC Press; 1 edition (1996).

MS podmínky: ESI ionizace: pozitivní mód, + 5,5 kV, teplota iontového zdroje 300 C, kolizní plyn 6 psi

Pracovní postup: 1. Předložený vzorek vlasů nastříhejte na asi 3 mm kousky a navažte 1 g přesně na analytických vahách do skleněné nádoby. 2. Proveďte desintegraci naváženého vzorku vlasů v 5 mL methanolu s pomocí ultrazvuku po dobu 20 minut. 3. Desintegrovaný vzorek přefiltrujte a filtrát naneste na SPE kolonku pro záchyt amfetanimů podle následujícího postupu: a) SPE fázi kondicionujte 1 mL methanolu a 1 mL vody a opět 1 mL methanolu b) Naneste 3 mL vzorku extraktu vlasů.

47

Cvičení z forenzní chemie

Recommend Documents