Analisis Komponen Kimia dan Uji KLT Bioautografi Fungi Endofit dari Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl)
OLEH Burhanuddin Taebe Andi Reski Amalia Sartini
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) masuk dalam suku Thymelaeaceae merupakan tanaman tropis dan banyak digunakan sebagai bahan baku obat tradisional. Daun dan kulit buah mengandung alkaloid, steroid, flavonoid, saponin, dan polifenol. Telah diisolasi lignan piroresinol, lariciresinol dan matairesinol dari beberapa bagian tanaman. Pada buah mahkota dewa telah berhasil disolasi icarisida-C, falerin, dan magiferin serta asam galat.
Selain kandungan kimia juga terdapat mikroba yang hidup di dalam jaringan hidup tanaman dan dikenal sebagai mikroba endofit.
Fungi endofit adalah fungi yang hidup berkolonisasi dalam jaringan tanaman tanpa menyebabkan efek negatif dalam tanaman tersebut.
•Dengan jamur endofit, secara fermentasi dapat dihasilkan metabolit yang berkhasiat obat secara berkesinambungan (reproducible) dalam skala industri, dengan keuntungan : waktu relatif singkat, tidak merusak tanaman inangnya dan tidak menimbulkan kerusakan ekologi
TUJUAN PENELITIAN
Untuk mengetahui komponen antibakteri yang dihasilkan oleh fungi endofit dari daun mahkota dewa
Penyiapan Alat dan Bahan Yang Digunakan - Alat - alat - Bahan-bahan daun mahkota dewa, media dan bahan kimia Penyiapan Sampel - Pengambilan Sampel Daun mahkota dewa diambil di TOGA SMAN 1 Makassar.
- Penyiapan Sampel Bagian tanaman yang digunakan adalah daun segar; cuci, potong kecil-kecil + 2 cm, sterilisasi permukaan berturut-turut etanol 70%, Bayclin® (NaOCl 5,25% ) , etanol 70% ,bilas dengan air steril. Bagian tepi dari potongan tadi dibuang kemudian tiap potongan dibelah menjadi 2 bagian yang sama secara longitudinal. (39)
- Isolasi Fungi Endofit Potongan sampel tanaman (steril) tempelkan pada cawan Petri yang berisi media PDA + diberi kloramfe-nikol 0,05 % secara aseptik. Inkubasi suhu kamar selama 5 - 21 hari (tergantung tingkat pertumbuhan kapang). Isolat diamati bentuk dan warna koloni, selan-jutnya diamati di bawah mikroskop. (39)
- Pemurnian Kapang Endofit Koloni-koloni fungi yang tumbuh masing-masing dipindahkan ke dalam cawan yang berisi media PDA dan diinkubasi selama 3-5 hari. Pemurnian dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh koloni yang murni. Setiap koloni murni dipindahkan ke media PDA agar miring untuk disimpan sebagai stock culture.
- Produksi Metabolit Sekunder dari Fungi Endofit Isolat fungi endofit difermentasi dalam 50 ml media PD-Y (Potato Dextrose Broth 25 g/l, Yeast extract 2 g/l) suhu kamar selama 7 hari. Koloni dan supernatan dipisahkan, ambil supernatan (hasil fermentasi). Ekstraksi 50 ml etil asetat menggunakan corong pisah selama 1 menit, lapisan atas (etil asetat) dan lapisan bawah (air) dilakukan sebanyak 3 kali. Lapisan etil asetat diuapkan pada suhu kamar hingga diperoleh ekstrak kering.
- Analisis Komponen Kimia KLT Ekstrak uji ditotolkan pada lempeng silika gel GF 254 dan dielusi dengan eluen heksan : etil asetat (1:2). Bercak diamati di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm. Profil diidentifikasi komponen kimianya dan dilakukan uji aktivitas antibakterinya menggunakan metode KLT Bioautografi.
- Identifikasi Komponen Kimia Alkaloid Identifikasi alkaloid dengan menyemprotkan pereaksi Dragendorf ((1) 0,6 gram bismutsubnitrat dalam 2 ml HCl pekat dan 10 ml air (2) 6 gram KI dalam 10 ml air. Larutan 1 dan 2 dicampur dengan 7 ml HCl pekat dan 15 ml air) pada profil KLT ekstrak uji. Hasil positif jika bercak noda menunjukkan warna coklat jingga dengan latar belakang kuning.
- Identifikasi Flavonoid a. FeCl3 5% Hasil positif jika bercak noda warna hijau kehitaman. b. AlCl3 5% Hasil positif jika bercak noda warna kuning. c. Sitroborat Hasil positif jika bercak noda warna kuning.
- Steroid a. Lieberman-Buchard Hasil positif jika bercak noda pada warna ungu. b. Vanilin-H2SO4 Hasil positif jika bercak noda warna merah ungu. c. H2SO4 10% Hasil positif jika bercak noda warna merah keunguan.
- KLT Bioautografi a. Pembuatan Medium - Medium Nutrien Agar (NA) - Medium Muller Hilton Agar (MHA) b. Peremajaan Bakteri Uji c. Uji Aktivitas Antimikroba d. Identifikasi Fungi Endofit e. Pengumpulan dan Analisis Data f. Penarikan Kesimpulan
Daun mahkota dewa Dicuci dengan air mengalir selama 10 menit Bagian tanaman dipotong kecil-kecil ± 2 cm Sterilisasi permukaan dengan Etanol 70% selama 1’, NaOCl selama 1,5’, Etanol 70% selama 0,5’, bilas dengan air steril Dikeringkan di atas kertas saring steril Bagian tepi dibuang, tiap potongan dibelah 2 secara longitudinal
Potongan sampel Ditempelkan pada media PDA + Kloramfenikol 0,05% Inkubasi 3-14 hari Diamati koloni yang terbentuk Dipindahkan pada media PDA yang baru Inkubasi 3-5 hari
Koloni murni Dipindahkan ke media PDA agar miring
Stock culture Difermentasi dengan media PD-Y 50 ml pada suhu kamar selama 7 hari
Hasil fermentasi
Hasil fermentasi Ekstraksi dengan etil asetat 50 ml
Lapisan air
Lapisan etil asetat Uapkan
Ekstrak uji Elusi dengan Heksan:Etil asetat (1:2)
Kromatogram
Uji Golongan
Uji KLT Bioautografi •Lempeng KLT di atas medium •Inkubasi suhu 37oC 24 jam •Pengamatan zona hambat
Pembahasan
KESIMPULAN
Skema Identifikasi Fungi Sampel Diidentifikasi
Makroskopik Sampel diinokulasikan dalam media PDA
Diamati bentuk koloninya
Mikroskopik
Diamati bentuk morfologi selnya
Berdasarkan hasil diperoleh 2 isolat fungi yaitu isolat A dan B
a
b
Isolat Murni Fungi Endofit Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) a. Isolat Fungi A b. Isolat fungi B
No Pereaksi penampak noda
Warna
Nilai Rf (cm)
-
-
2 FeCl3
Hijau kehitaman
0,4
3 AlCl3
Kuning
0,4
4 Sitroborat
Kuning
0,4
5 Lieberman-Buchard
Ungu
0,1
6 Vanilin-H2SO4
Ungu
0,1
7 H2SO4 10%
Ungu
0,1
1 Dragendorrf
No
Bakteri uji
1
Staphylococcus aureus
2
Escherichia coli
Nilai Rf yang menghambat (cm) 0,1 0,4 0,1 0,4
1. Pada daun mahkota dewa
(Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) diperoleh dua isolat fungi endofit.
2. Fungi endofit B menunjukkan adanya golongan flavonoid dan steroid sebagai metabolit sekunder yang dihasilkan.
3.Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh fungi endofit B menunjukkan adanya aktivitas antibakteri thd Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
SARAN Sebaiknya dilakukan optimalisasi
media dan kondisi fermentasi untuk produksi metabolit sekunder dari isolat fungi B. Sebaiknya dilakukan pembuktian lebih lanjut melalui studi elusidasi struktur dari hasil identifikasi komponen kimia yang diperoleh.
a
b
c
Gambar 2.Kromatogram dengan Eluen Heksan : Etil asetat (1:2) thd (1) ekstrak etil asetat daun mahkota dewa, (2) ekstrak etil asetat isolat fungi A dan (3) ekstrak etil asetat isolat fungi B a. Dilihat pada lampu UV 254 nm b. Dilihat pada lampu UV 366 nm c. Setelah disemprot H2SO4 10%
a
b
c
Gambar 3. Kromatogram Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B dengan Menggunakan Eluen Heksan : Etil asetat (1:2) a. setelah disemprot H2SO4 10% b. setelah disemprot Lieberman-Buchard c. setelah disemprot Vanilin-H2SO4
a Gambar 4.
b
Kromatogram Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B dengan Menggunakan Eluen Heksan : Etil asetat (1:2) a. Setelah disemprot FeCl3 5% b. Setelah disemprot AlCl3 5%, dilihat di bawah sinar UV 366 nm
Zona hambat
Zona hambat
a
b
Gambar 5. Foto KLT Bioautografi Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B terhadap pertumbuhan bakteri (a) Staphylococcus aureus, dan (b) Escherichia coli
a Gambar 6.
b
Kromatogram Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B dengan Menggunakan Eluen etil asetat : metanol : asam asetat glasial (4:0,5:4) a. Setelah disemprot AlCl3 5%, dilihat di bawah sinar UV 366 nm b.Setelah disemprot Sitroborat, dilihat di bawah sinar UV 366 nm
Gambar 7. Foto Hasil Identifikasi Isolat Fungi B
Gambar 8. Foto tanaman mahkota dewa
Gambar 9. Foto daun mahkota dewa
TERIMA KASIH WASSALAMU’ALAIKUM WR.WB.,
