OKRASNÉ RYBY JAKO VEKTORY AEROMONAS SPP. NESOUCÍ GENY

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

OKRASNÉ RYBY JAKO VEKTORY AEROMONAS SPP. NESOUCÍ GENY PLAZMIDOVĚ KÓDOVANÉ REZISTENCE K CHINOLONŮM

Rigorózní práce

Hana Dobiášová

Brno 2014

Bibliografický záznam Autor:

Název práce:

Mgr. Hana Dobiášová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Okrasné ryby jako vektory Aeromonas spp. nesoucí geny plazmidově kódované rezistence k chinolonům

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Speciální biologie

Akademický rok:

2014/2015

Počet stran:

83+7

Klíčová slova:

okrasné ryby, Aeromonas spp., chinolony, plazmidově kódovaná rezistence k chinolonům, plazmidy

Bibliographic Entry Author

Title of Thesis:

Mgr. Hana Dobiášová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Ornamental fish as vectors of Aeromonas spp. carrying plasmid-mediated quinolone resistance genes

Degree programme:

Experimental Biology

Field of Study:

Special Biology

Academic Year:

2014/2015

Number of Pages:

83+7

Keywords:

ornamental fish, Aeromonas spp., quinolones, plasmidmediated quinolone resistance, plasmids

Abstrakt Chov a dovoz okrasných ryb je spojen s nadměrnou spotřebou antibiotik vedoucí k rozvoji a rozšíření rezistence u bakterií vodního prostředí. Cílem této studie bylo zhodnotit význam importovaných tropických okrasných ryb a kaprů koi chovaných v České republice jako vektorů Aeromonas spp. s geny plazmidově kódované rezistence k chinolonům (PMQR) a mobilních genetických elementů nesoucích tyto geny rezistence. Izoláty Aeromonas spp. se sníženou citlivostí k fluorochinolonům [minimální inhibiční koncentrace (MIC) ciprofloxacinu ≥ 0,05 mg/l] byly testovány na přítomnost genů PMQR pomocí PCR a sekvenování. U izolátů Aeromonas spp. s geny PMQR byla stanovena epidemiologická příbuznost pulzní gelovou elektroforézou, schopnost tvorby biofilmu modifikovanou Christensenovou metodou, MIC různých chinolonů agarovou diluční metodou, profil fenotypové rezistence k různým skupinám antibiotik diskovou difúzní metodou, geny rezistence k antibiotikům pomocí PCR, profil integronů pomocí PCR a sekvenování. Plazmidy s geny PMQR byly testovány na schopnost horizontálního přenosu konjugací a transformací a jejich příbuznost byla hodnocena restrikční analýzou a hybridizací se značenými sondami. Celkem 18 izolátů (24 %, n=76) z importovaných okrasných ryb a 15 izolátů (19 %, n=80) Aeromonas spp. z kaprů koi z českých chovů neslo geny PMQR (qnrS2, aac(6‘)-Ib-cr a qnrB17). Izoláty s PMQR z importovaných okrasných ryb měly vyšší hodnoty MIC různých skupin chinolonů, byly multirezistentní, měly rozmanitější profily genů rezistence i integronů ve srovnání s izoláty z kaprů koi z českých chovů. U nepříbuzných izolátů z importovaných okrasných ryb a kaprů koi z českých chovů byly detekovány příbuzné IncU plazmidy s geny qnrS2 a aac(6‘)-Ib-cr. Okrasné ryby mohou představovat významný vektor multirezistentních bakterií i mobilních genetických elementů s geny PMQR.

Abstract Ornamental fish farming and importation are associated with extensive antibiotic use leading to development and dissemination of antibiotic resistance in bacteria in aquatic environment. The aim of the study was to assess the significance of imported tropical ornamental fish and koi carps bred in the Czech Republic as possible vectors of Aeromonas spp. carrying plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes and mobile genetic elements harbouring these resistance genes. Aeromonas spp. isolates with decreased susceptibility to fluoroquinolones [minimal inhibitory concentration (MIC) of ciprofloxacin ≥ 0.05 mg/L] were screened for PMQR genes using PCR and sequencing. PMQR-positive isolates were analysed for their epidemiological relatedness using pulsed-field gel electrophoresis, biofilm formation using modified Christensen’s method, MIC of various quinolones using agar dilution method, antibiotic resistance phenotype using disk diffusion method, antibiotic resistance genes using PCR and integrons using PCR and sequencing. Horizontal transfer of plasmids carrying PMQR genes was tested using conjugation and transformation. Relatedness of the plasmids was determined using restriction analysis and hybridization with labelled probes. A total of 18 Aeromonas spp. isolates (24%, n=76) from imported ornamental fish and 15 isolates (19%, n=80) from koi carps from Czech farms were positive for PMQR genes (qnrS2, aac(6‘)-Ib-cr and qnrB17). Isolates originating from imported ornamental fish showed higher MIC levels to all quinolones tested, were multiresistant and carried more diverse set of antibiotic resistance genes and integrons in comparison with isolates from koi carps bred in Czech farms. Non-related isolates from imported ornamental fish and koi carps from Czech farms carried related IncU plasmids with the genes qnrS2 and aac(6‘)-Ib-cr. Ornamental fish may represent an important vector of multiresistant bacteria and mobile genetic elements carrying PMQR genes.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala své školitelce RNDr. Monice Dolejské, Ph.D. za podnětné rady při psaní rigorózní práce, prof. MVDr. Aloisi Čížkovi, CSc. za poskytnutí izolátů analyzovaných v této studii, prof. MVDr. Ivanu Literákovi, CSc. za možnost zpracovat tento výzkumný projekt v laboratořích Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat (Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Fakulta veterinární hygieny a ekologie) a v neposlední řadě Bc. Ivě Kutilové za pomoc při zpracovávání experimentální části této práce. Tato studie byla finančně podpořena Národní agenturou pro zemědělský výzkum (projekt č. QJ1210237), Ministerstvem zemědělství (MZE0002716202), projektem CEITEC (CZ.1.05/1.1.00/02.0068), CENAKVA (CZ.1.05/2.1.00/01.0024) a Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy (LO1205).

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji rigorózní práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 22. září 2014

……………………………… Hana Dobiášová

Předchozí publikace výsledků Část výsledků této studie byla uveřejněna na konferencích 5th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (30.6.–3.7. 2013, Gent, Belgie); Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (10.–13.9. 2013, Denver, USA) a XVI. Konferenci mladých vědeckých pracovníků s mezinárodní účastí, (28.5. 2014, Brno, Česká republika). Kompletní výsledky této studie byly publikovány autory Dobiasova a kol. (2014) (10. Seznam příloh).

Obsah Seznam použitých zkratek ........................................................................................................ 11 1.

Úvod k literárnímu přehledu ............................................................................................. 12 1.1.

Trh s okrasnými rybami ............................................................................................. 12

1.2.

Chov okrasných ryb ................................................................................................... 13

1.2.1.

Mořské tropické okrasné ryby ............................................................................ 13

1.2.2.

Sladkovodní okrasné ryby .................................................................................. 14

1.2.3.

Antibiotická praxe v chovech okrasných ryb ..................................................... 15

1.3.

Klasifikace a charakteristika Aeromonas spp. ........................................................... 17

1.3.1. 1.4.

Klinický význam Aeromonas spp. ..................................................................... 18

Chinolony .................................................................................................................. 19

1.4.1.

Klasifikace chinolonů a jejich použití v humánní a veterinární medicíně ......... 19

1.4.2.

Cílové molekuly chinolonů a mechanismus účinku ........................................... 21

1.4.3. Používání chinolonů v ekologických souvislostech - vodní prostředí jako centrum rozvoje a rozšíření rezistence k antibiotikům ..................................................... 22 1.5.

Mechanismy rezistence k chinolonům ...................................................................... 23

1.5.1.

Struktury buněčné stěny a cytoplasmatické membrány ..................................... 24

1.5.2.

Substituce v primární struktuře topoizomeráz II ................................................ 24

1.5.3.

Plazmidově kódovaná rezistence k chinolonům ................................................ 25

1.6.

Mobilní genetické elementy a mechanismy horizontálního přenosu genů ................ 27

1.6.1.

Elementy zajišťující mobilizaci genů rezistence ................................................ 28

1.6.2.

Mobilní genetické elementy zajišťující horizontální přenos genů rezistence .... 29

1.6.3.

Mechanismy horizontálního šíření genů rezistence ........................................... 30

2.

Cíle studie ......................................................................................................................... 31

3.

Materiál a metody ............................................................................................................. 32 3.1.

Bakteriální izoláty...................................................................................................... 32

3.2.

Spotřební materiál...................................................................................................... 32

3.3.

Charakterizace izolátů Aeromonas spp...................................................................... 34

3.3.1.

Izolace, identifikace a uchovávání bakteriálních izolátů.................................... 35

3.3.2.

Stanovení minimální inhibiční koncentrace chinolonů ...................................... 35

3.3.3.

Detekce genů plazmidově kódované rezistence k chinolonům .......................... 36

3.3.4.

Stanovení profilu fenotypové rezistence k antibiotikům.................................... 36

8

3.3.5. kazet

Detekce genů rezistence k dalším skupinám antibiotik, integronů a genových ………………………………………………………………………………….36

3.3.6.

Stanovení epidemiologické příbuznosti pulzní gelovou elektroforézou ............ 39

3.3.7.

Tvorba biofilmu.................................................................................................. 40

3.3.8.

Detekce skupin inkompatibilit plazmidů............................................................ 41

3.4.

Charakterizace plazmidů ........................................................................................... 42

3.4.1.

Konjugace........................................................................................................... 42

3.4.2.

Izolace plazmidů a transformace ........................................................................ 43

3.4.3. Stanovení velikosti a profilu plazmidů pomocí běžné a pulzní gelové elektroforézy ..................................................................................................................... 44 3.4.4.

Restrikční analýza plazmidů .............................................................................. 45

3.4.5.

Southernův přenos .............................................................................................. 45

3.4.6.

Příprava značených sond a hybridizace ............................................................. 46

3.4.7.

Analýza genetického pozadí genu qnrS2 ........................................................... 47

3.5. 4.

5.

Statistická analýza výsledků pomocí Chí-kvadrát testu ............................................ 48

Výsledky ........................................................................................................................... 49 4.1.

Aeromonas spp. nesoucí geny PMQR ....................................................................... 49

4.2.

Epidemiologická příbuznost izolátů Aeromonas spp. ............................................... 50

4.3.

Minimální inhibiční koncentrace chinolonů u Aeromonas spp. ................................ 51

4.4.

Detekce fenotypu rezistence k různým skupinám antibiotik u Aeromonas spp. ....... 53

4.5.

Detekce genů rezistence a integronů u Aeromonas spp. ........................................... 55

4.6.

Tvorba biofilmu ......................................................................................................... 57

4.7.

Horizontální přenos plazmidů ................................................................................... 57

4.8.

Charakteristika plazmidů s PMQR u Aeromonas spp. .............................................. 58

4.9.

Genetické pozadí genu qnrS2 .................................................................................... 59

Diskuze ............................................................................................................................. 63 5.1.

Importované okrasné ryby jakožto vektory rezistentních bakterií ............................ 63

5.2.

Používání antibiotik a rozvoj rezistence k antibiotikům u Aeromonas spp. .............. 63

5.3.

Aeromonas spp. z okrasných ryb jakožto vektor genů rezistence k chinolonům ...... 64

5.4.

Rezistence Aeromonas spp. k chinolonům ................................................................ 65

5.5.

Rezistence k dalším skupinám antibiotik u Aeromonas spp...................................... 67

5.6.

Geny rezistence k dalším skupinám antibiotik u Aeromonas spp. ............................ 68

5.7.

Integrony u Aeromonas spp. ...................................................................................... 69

5.8.

Příbuznost izolátů Aeromonas spp. s geny PMQR .................................................... 71 9

5.9. Schopnost tvorby biofilmu u Aeromonas spp. a horizontální přenos plazmidů s geny PMQR ................................................................................................................................... 72 5.10.

Charakteristika plazmidů s geny PMQR z Aeromonas spp. .................................. 73

5.11.

Genetické pozadí genu qnrS2 na IncU plazmidech ............................................... 74

6.

Závěr ................................................................................................................................. 76

7.

Seznam obrázků ................................................................................................................ 77

8.

Seznam tabulek ................................................................................................................. 78

9.

Bibliografie ....................................................................................................................... 79

10.

Seznam příloh ................................................................................................................ 90

10

Seznam použitých zkratek ABC ATP BHI bp; kb C CFU CIP CLB CLSI CN CSB ENR F FFC Inc IS MATE MFS MGE MIC mic MMA NA OA OT PCR orf PFGE PMQR QRDR RFLP RND S3 SMR SXT T Ta TF UB

rodina efluxních pump („adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette“) adenozintrifosfát bujón „brain-heart infusion“ páry bazí („base pair“); kilobaze („kilobase“) chloramfenikol „colony-forming units“ ciprofloxacin pufr, „cell lysis buffer“ „The Clinical Laboratory and Standards Institute“ gentamicin pufr, „cell suspension buffer“ enrofloxacin nitrofurantoin florfenikol skupina inkompatibility plazmidů inzerční sekvence rodina efluxních pump („multidrug and toxic compound extrusion“) rodina efluxních pump („major facilitator superfamily“) mobilní genetický element minimální inhibiční koncentrace mobilní inzerční kazeta syndrom „mastitis, metritis, agalactiae“ kyselina nalidixová kyselina oxolinová oxytetracyklin polymerázová řetězová reakce otevřený čtecí rámec pulzní gelová elektroforéza plazmidově kódovaná rezistence k chinolonům oblast určující rezistenci k chinolonům polymorfismus délky restrikčních fragmentů rodina efluxních pump („resistance-nodulation-cell division“) sulfonamidy rodina efluxních pump („small multidrug resistance“) sulfametoxazol/trimetoprim trimetoprim teplota připojení primerů transformace flumekvin

11

1. Úvod k literárnímu přehledu Narůstající rezistence k antibiotikům včetně rozvoje multirezistence u bakterií je jedním z nejzávažnějších problémů současné humánní i veterinární medicíny. Šíření rezistentních mikroorganismů a mobilních genetických elementů s geny rezistence k antibiotikům mezi různými ekosystémy je negativním důsledkem lidské činnosti. Chov okrasných ryb je rozvíjejícím se lukrativním oborem podnikání. Chov ryb i mezinárodní obchod s okrasnými rybami je však spojen s řadou rizik. Z hlediska zdraví člověka i zvířat je rozšíření původců infekčních onemocnění a bakterií rezistentních k antibiotikům jedním z nejvýznamnějších problémů spojených s akvakulturami. V chovech okrasných ryb dochází k nekontrolované a nadměrné spotřebě antibiotik, přičemž v rámci akvakultur patří chinolony mezi antibiotika hojně využívaná pro preventivní a terapeutické účely. Intenzivní spotřeba chinolonů v akvakulturách okrasných ryb může podnítit selekci mikroorganismů rezistentních k chinolonům. Z tohoto důvodu může sledování rezistence k chinolonům u aeromonád, jakožto mikroorganismů s ubikvitním výskytem ve vodách, představovat vhodný indikátor zatížení vodního prostředí antibiotiky. Následující podkapitoly jsou soustředěny na význam celosvětového obchodu s okrasnými rybami, techniky chovu okrasných ryb a jejich dopad na životní prostředí. V textu této práce pojem „okrasné ryby“ zahrnuje okrasné i akvarijní ryby. Dále je zmíněna stručná charakteristika rodu Aeromonas včetně jeho klinického potenciálu. V dalších podkapitolách je uvedena základní charakteristika a použití chinolonů v klinické praxi včetně dopadu používání chinolonů na mikroorganismy v životním prostředí. V neposlední řadě jsou zmíněny mechanismy rezistence k chinolonům doplněné o stručnou charakteristiku vybraných mobilních

genetických

elementů,

které

geny

rezistence

k chinolonům

přenášejí,

a mechanismů šíření genů rezistence v populaci bakterií.

1.1.Trh s okrasnými rybami V posledních třech dekádách došlo k výraznému nárůstu celosvětového obchodu s okrasnými rybami, který ročně zahrnuje více než 1 bilion jedinců ryb (Whittington a Chong 2007; Verner-Jeffreys a kol. 2009; Rose a kol. 2013). Trh s okrasnými rybami zahrnuje více než 4 500 druhů sladkovodních ryb a 1 450 druhů mořských ryb, které jsou exportovány z více než 100 různých zemí světa (Whittington a Chong 2007; Rose a kol. 2013). Mezi tradiční exportéry okrasných ryb patří asijské země – Singapur, Hongkong, Indonésie a 12

Malajsie. Naopak mezi hlavní dovozce těchto ryb patří Spojené státy americké, státy Evropské unie nebo Japonsko (Lucas a Southgate 2012). Hodnota chovaných okrasných ryb je odhadována na více než devět set milionů amerických dolarů, přičemž sladkovodní okrasné ryby tvoří přibližně 90 % této hodnoty a mořské okrasné ryby přibližně 10 % (Whittington a Chong 2007; Lucas a Southgate 2012; Rose a kol. 2013). Celková hodnota tohoto odvětví rybářského průmyslu je odhadována přibližně na patnáct bilionů amerických dolarů (Tlusty 2002; Whittington a Chong 2007; Lucas a Southgate 2012). Rybolov, chov a dovoz okrasných ryb je spojen s řadou rizik a negativ. Kromě poškozování životního prostředí nevhodnými technikami lovu okrasných ryb nebo snížení přirozené abundance těchto ryb v prostředí se jedná například o šíření původců infekčních onemocnění ryb (Whittington a Chong 2007; Lucas a Southgate 2012). Nadměrná až neuvážlivá medikace okrasných ryb antibiotiky bez veterinárního dohledu, časté používání různých dezinfekčních prostředků a následný vznik a rozšíření rezistence k antibiotikům u bakterií vodního prostředí je jedním z nejzávažnějších dopadů tohoto odvětví (Arthur a kol. 1996; Chanda a kol. 2011; Weir a kol. 2012).

1.2.Chov okrasných ryb Trh s okrasnými rybami je tvořen přibližně z 80 % sladkovodními rybami chovanými na farmách, z 15 % lovenými mořskými rybami a z 5 % lovenými sladkovodními rybami (Rose a kol. 2013). Chov ryb tedy hraje nezastupitelnou roli v produkci okrasných ryb (Lucas a Southgate 2012). Mezi nejzávažnější problémy chovů ryb je časté používání široké škály různých antibiotik včetně těch, které jsou určeny pro humánní medicínu, dalších antiinfektiv a dezinfekčních látek. Mezi nejčastěji používané dezinfekční látky patří formalín, malachitová zeleň, manganistan draselný, metylenová modř, akriflavin, hypochlorid, sulfid měďný aj. (Arthur a kol. 1996; Chanda a kol. 2011).

1.2.1. Mořské tropické okrasné ryby

Více než 90 % mořských okrasných ryb je loveno v mořích a na korálových útesech a pouze menší část celosvětové produkce je chována na farmách. Chov mořských okrasných ryb korálových útesů za účelem produkce má velké nároky na výživu ryb, kvalitu vody a absenci stresových faktorů. Tropické mořské okrasné ryby mohou být chovány v uzavřených nádržích s vodou, v relativně malých a mělkých rybnících volně nebo v klecích 13

(Tlusty 2002; Lucas a Southgate 2012). Mezi běžně chované mořské tropické ryby patří rody Amphiprion,

Premnas,

Gobiosoma,

Pseudochromis,

Hippocampus,

Pomacanthus

a Chromileptus (Lucas a Southgate 2012). Mezi hlavní exportéry mořských tropických ryb patří Indonésie, Filipíny, Srí Lanka, Maledivy, země Karibiku, přilehlé oblasti Rudého moře nebo některé další státy ležící v Tichém oceánu (Lucas a Southgate 2012).

1.2.2. Sladkovodní okrasné ryby

Oproti mořským tropickým okrasným rybám je většina celosvětové produkce sladkovodních okrasných ryb chována na farmách (Whittington a Chong 2007; Lucas a Southgate 2012; Weir a kol. 2012; Rose a kol. 2013). Menší část celosvětové produkce je lovena v zemích Jižní Ameriky - Brazílie, Kolumbie, Peru, nebo v asijských zemích – Thajsko, Indonésie, nebo v afrických zemích - Kongo, Nigérie nebo Malawi. Sladkovodní okrasné ryby byly tradičně chovány v asijských zemích – například Thajsko, Indonésie, Singapur, Čína, Malajsie a Japonsko, nicméně v posledních letech se mezi hlavní producenty sladkovodních okrasných ryb zařadily i evropské země jako Česká republika, Španělsko, Belgie a Nizozemí, dále také Izrael nebo Florida (Lucas a Southgate 2012). V rozvojových zemích jsou sladkovodní okrasné ryby většinou chovány na malých rodinných farmách, v rybnících nebo vodních nádržích. V rozvinutých zemích jsou tyto ryby chovány spíše intenzivně ve velkochovech nebo amatérskými či profesionálními chovateli okrasných ryb. Intenzivní akvakultury jsou spojeny s vysokou produkcí ryb, malými ztrátami a relativně menší spotřebou vody. Vývozci okrasných ryb nakupují ryby od rybářů, farmářů nebo od velkoobchodníků. Vývozci i dovozci obvykle disponují rozsáhlými nádržemi, sádky a akvárii pro uskladnění ryb před jejich vývozem nebo prodejem. Tyto nádrže slouží také pro primární karanténu ryb a aklimatizaci na podmínky v zajetí (Lucas a Southgate 2012). Důležitou roli hraje především Singapur jakožto hlavní překladiště různých druhů okrasných ryb, které jsou exportovány do celého světa (Whittington a Chong 2007; Rose a kol. 2013). Sladkovodní tropické okrasné ryby mohou být chovány v rybnících volně nebo v klecích, ve speciálních kanálech, uzavřených nádržích nebo akváriích. Chov okrasných ryb v rybníku patří mezi nejčastější způsoby chovu pro komerční účely. Ryby jsou obvykle chovány extenzivním způsobem, při kterém počet ryb odpovídá úživnosti rybníka a přirozenému množství potravy více méně bez dalšího dokrmování. Mezi jednotlivými 14

výsadbami ryb jsou rybníky obvykle vysušeny, plevelné rostliny odstraněny a posléze jsou rybníky opět napuštěny vodou. V některých případech mohou být rybníky dezinfikovány a může být podpořena primární produktivita rybníka a růst zooplanktonu. Chov v rybníku je relativně levný a méně pracný způsob produkce okrasných ryb. Do rybníků se mohou snadno dostat plevelné rostliny, patogeny a predátoři, což může snižovat výnos chovu. Chovné kanály a nádrže patří také mezi často využívané způsoby chovu okrasných ryb a jedná se o statické, průtočné, částečně recirkulační nebo recirkulační systémy. Oproti rybníkům jsou ryby chovány ve větším počtu s častějším dokrmováním. Chov okrasných ryb v akváriích a intenzivních recirkulačních systémech umožňuje lepší sledování kvality vody a hustotu obsádky, snížení šíření onemocnění aj. (Lucas a Southgate 2012) Z hlediska výživy jsou okrasné ryby obvykle ve všech svých vývojových stádiích krmeny zooplanktonem a některými bezobratlými, kteří jsou obvykle upřednostňováni před jinými typy krmiva. Nicméně zooplankton i bezobratlí však mohou představovat vektor pro různé patogenní mikroorganismy, pokud nejsou patřičně skladováni a dezinfikováni (Lucas a Southgate 2012). Mezi běžně chované sladkovodní tropické okrasné ryby patří rody čeledí Poeciliidae (Poecilia,

Xiphophorus),

Symphysodon,

Astronotus,

Characidae

(Paracheirodon),

Archocentrus),

Cichlidae

Osphronemidae

(Betta,

(Pterophyllum, Macropodus),

Helostomatidae (Helostoma, Trichogaster, Colisa) a Cyprinidae (Cyprinus, Barbus, Capoeta, Puntius, Brachydanio, Danio, Rasbora, Epalzeorhynchus, Labeo) (Lucas a Southgate 2012).

1.2.3. Antibiotická praxe v chovech okrasných ryb

Antibiotika jsou v chovech okrasných ryb podávána především z terapeutických a preventivních důvodů (Arthur a kol. 1996; Lewbart 2001; Weir a kol. 2012; Yanong 2013). Většina běžných bakteriálních onemocnění je u ryb vyvolána mikroorganismy vodního prostředí. Nejčastěji se jedná o Gramnegativní bakterie (Aeromonas hydrophila, A. salmonicida, Flavobacterium columnare, Vibrio spp., Pseudomonas spp.) a spíše sporadicky Grampozitivní bakterie (Streptococcus spp. nebo Mycobacterium spp.) (Lewbart 2001; Yanong 2013). Bakteriální infekce se u ryb mohou rozvinout v důsledku stresu (změny teplot vody, špatná kvalita vody, vysoká hustota obsádky, kvůli přechodným stavům hypoxie během dlouhé doby přepravy), kterému jsou ryby v chovu nebo při přepravě vystaveny. Ryby mohou mít sníženou funkci imunitního systému, a tak jsou vnímavější k bakteriálním 15

patogenům (Lewbart 2001; Nifty a Hatha 2012; Weir a kol. 2012; Yanong 2013). V některých zemích, např. v Indii, jsou antibiotika podávána jako profylaktická léčba okrasným rybám na základě vnějších příznaků onemocnění podle úsudku chovatele (Chanda a kol. 2011). I ve Spojených státech amerických jsou některá antibiotika pro okrasné ryby volně v prodeji (např. oxytetracyklin), nicméně léčba bakteriálních infekcí ryb je prováděna pod odborným dohledem veterináře (Lewbart 2001; FDA 2011). V České republice je v akvakulturách dovoleno používání pouze oxytetracyklinu a flumekvinu, nicméně v chovech kaprů koi nebo jiných okrasných ryb není spotřeba antibiotik regulována (Čížek a kol. 2010). Spotřeba antibiotik v akvakulturách okrasných ryb není do značné míry vůbec regulována a v podstatě není dokumentována nebo jsou dostupné pouze dílčí informace. Obvykle jsou uvedena pouze často používaná antibiotika nebo doporučená antibiotika pro akvakultury okrasných ryb (Arthur a kol. 1996; Alday a kol. 2006; Weir a kol. 2012). Například na Filipínách jsou v akvakulturách okrasných ryb používány chinolony, ormetoprim, sulfonamidy včetně potencovaných, aminoglykosidy, makrolidy, tetracykliny furazolidon, nifurpirinol a další (Arthur a kol. 1996; Alday a kol. 2006). V thajských akvakulturách okrasných ryb patří mezi často používaná antibiotika enrofloxacin a oxytetracyklin, v indických akvakulturách jsou navíc používány také chloramfenikol, erytromycin, a nitrofurany (Jongjareanjai a kol. 2009; Chanda a kol. 2011). V Indonésii je v chovech okrasných ryb běžně používán chloramfenikol, erytromycin, streptomycin, nifurpirinol, neomycin, enrofloxacin, oxytetracyklin (Arthur a kol. 1996). Zásadní otázkou je i obsah a kvalita používaných antibiotik, respektive obsah účinné látky (Yanong 2013). Ve Spojených státech amerických byl pro léčbu infekcí okrasných ryb běžně využíván amikacin, enrofloxacin, ceftazidim, florfenikol, nitrofurazon, tetracyklin a potencované sulfonamidy (Lewbart 2001). Antibiotika jsou rybám podávána injekčně, v krmivu nebo se podávají přímo do vody. Podávání antibiotik injekčně je značně pracné a je využíváno u menšího počtu vzácných jedinců. Podávání antibiotik v krmivu je jedním z nejčastějších a nejvýhodnějších způsobů podávání antibiotik rybám. Nicméně ryby, u kterých došlo k rozvinutí bakteriální infekce, přestanou konzumovat krmivo s dávkou antibiotik, a tak přispívají k narůstající morbiditě a mortalitě v chovu. Podávání antibiotik do vody vyžaduje celkově větší množství antibiotik pro dosažení účinné koncentrace ve srovnání s podáváním antibiotik injekčně nebo v krmivu. Vysoké koncentrace antibiotik ve vodě také vytváří selekční tlak na celé populace mikroorganismů vodního prostředí. Přítomnost velké koncentrace antibiotik také zvyšuje 16

toxicitu vody v akvakulturách a může vést k poškození jater, ledvin a dalších orgánů léčených ryb (Yanong 2013). Jako hlavní chyby v antibiotické praxi v akvakulturách okrasných ryb byla zjištěna absence správné a přesné diagnózy, medikace bez veterinárního dohledu, nepřiměřená doba podávání antibiotik a také podávání antibiotik namísto zlepšení hygienických podmínek chovu. Antibiotika jsou nejčastěji podávána dospělcům okrasných ryb. Antibiotika jsou z profylaktických důvodů obvykle přidávána také do vody, ve které jsou ryby exportovány, aby ryby lépe překonaly stres z dlouhé přepravy (Weir a kol. 2012).

1.3.Klasifikace a charakteristika Aeromonas spp. Aeromonas spp. jsou Gramnegativní bakterie, které jsou řazeny do kmene Proteobacteria, třídy Gammaproteobacteria, řádu Aeromonadales a čeledi Aeromonadaceae. Aeromonas spp. jsou rovné nesporulující tyčky, které jsou uspořádány jednotlivě, po dvou, nebo tvoří krátké řetízky. Aeromonády jsou fakultativně anaerobní, chemoorganotrofní s fermentatorním nebo respiratorním typem metabolismu, mezofilní nebo psychrofilní. Aeromonády jsou obvykle pozitivní na oxidázu, katalázu a indol (Garrity a kol. 2005; Parker a Shaw 2011). Aeromonády mohou být kultivovány na běžných médiích. Na krevním agaru tvoří bílé až šedé kolonie s beta-hemolýzou (Obrázek 1) (Parker a Shaw 2011). Nicméně betahemolytických je přibližně 90 % aeromonád (Janda a Abbott 2010). Druhová identifikace aeromonád je obvykle obtížná, a proto jsou izoláty často zařazeny do skupin druhů: skupina A. hydrophila (A. hydrophila sensu stricto, A. bestiarum, A. salmonicida), skupina A. caviae (A. caviae sensu stricto, A. media, A. eucrenophila) a A. sobria (A. veronii bv. sobria, A. jandaei, A. schubertii, A. trota) (Abbott a kol. 2003; Janda a Abbott

2010).

ubikvitně

ve

Aeromonády

vodním

se

prostředí,

vyskytují v lotických

i lentických sladkovodních habitatech, brakických vodách i mořích, v pitné vodě a také ve vodách odpadních (Janda a Abbott 2010). Schopnost tvorby

biofilmu

umožňuje

aeromonádám

kolonizovat vodní prostředí (Parker a Shaw 2011). Aeromonády byly dále izolovány z půd, zvířat

Obrázek 1. A. hydrophila (krevní agar). Převzato z www University of Copenhagen (Department of Veterinary Disease Biology 2011).

17

(ryby, ptáci, zvířata chovaná ze záliby, bezobratlí včetně klíšťat), potravin a také z humánního klinického materiálu (Janda a Abbott 2010; Parker a Shaw 2011).

1.3.1. Klinický význam Aeromonas spp.

Tradičně jsou aeromonády rozdělovány do dvou skupin. První skupina je tvořena psychrofilními a nepohyblivými druhy, které jsou patogenní pro ryby a plazy a jsou reprezentovány A. salmonicida. Druhou skupinu tvoří druhy mezofilní a pohyblivé pomocí jednoho polárního bičíku (Obrázek 2), které zahrnují patogeny člověka. Toto rozdělení je spíše orientační a neplatí zcela striktně (Garrity a kol. 2005; Parker a Shaw 2011). Druhy A. salmonicida sensu stricto, A. hydrophila, A. veronii patří mezi významné patogeny ryb. A. salmonicida patří mezi nejvýznamnější patogeny sladkovodních i mořských ryb a je původcem furunkulózy. Druhy skupiny A. hydrophila patří mezi nejčastější patogeny sladkovodních ryb a vyvolávají tzv. nemoc pohyblivých aeromonád (z angl., „motile aeromonad disease“ neboli „motile aeromonad septicemia“). V posledním desetiletí byly nejvyšší úhyny ryb způsobeny primárními nebo sekundárními infekcemi A. hydrophila (Lewbart 2001; Janda a Abbott 2010). Mezi nejčastější původce infekcí u člověka patří A. hydrophila, A. caviae a A. veronii bv. sobria, nicméně patogenní potenciál byl dokumentován i u dalších druhů rodu Aeromonas (Parker a Shaw, 2011). Aeromonas spp. není přirozenou složkou lidské střevní mikroflóry a hlavním zdrojem těchto bakterií pro člověka je většinou

kontaminovaná

pitná

voda

nebo potraviny (Janda a Abbott 2010; Parker a Shaw 2011). Z infekcí, které u člověka mohou aeromonády

vyvolat,

patří

gastroenteritis

a infekce ran k těm nejčastějším. Septikémie vyvolaná aeromonádami se může rozvinout u imunokompromitovaných pacientů, u zdravých jedinců spíše jako následek infekce ran. Mezi další onemocnění, které mohou vyvolat aeromonády,

patří

peritonitis,

meningitis,

infekce oka, kloubů, kostí a další (Abbott a kol. 2003; Janda a Abbott 2010; Parker a Shaw

Obrázek 2. Aeromonas caviae kmen Sch3N (snímek z transmisního elektronového mikroskopu, Parker a Shaw 2011).

18

2011). Aeromonas spp. je významným oportunním patogenem především v rozvojových zemích a pro imunokompromitované pacienty. Celogenomovým sekvenováním genomu A. hydrophila ATCC 7966T (4,7 Mb) bylo zjištěno, že tento kmen nese geny pro rozmanité metabolické dráhy a faktory virulence, díky kterým se může uplatňovat v různých prostředích a u různých hostitelů (Parker a Shaw 2011).

1.4.Chinolony Chinolony byly objeveny v roce 1962 při syntéze antimalarika chlorochinu (Lesher a kol.

1962).

V současné

době

patří

chinolony

mezi

nejvýznamnější

skupiny

antibiotik humánní i veterinární medicíny. Novější generace chinolonů mají široké spektrum účinku a dobré farmakologické vlastnosti. Účinek chinolonů je baktericidní (Emmerson a Jones 2003; Suzuki a Hoa 2012; Frade a kol. 2014). Chinolony v současnosti používané ve veterinární i humánní medicíně jsou dobře absorbovány po podání per os a mají velký distribuční objem. Dobře pronikají do většiny tkání a buněk a mají prodloužený eliminační poločas, díky čemuž mohly být dávkovací intervaly prodlouženy na 24–48 hodin. Chinolony jsou charakteristické účinkem závislým na koncentraci a vykazují postantibiotický efekt na některé druhy bakterií. Chinolony jsou vylučovány převážně močí jakožto nemetabolizované látky. Chinolony a jejich metabolity mohou být vylučovány žlučí nebo močí. Nevýhodou použití chinolonů je tendence selektovat rezistentní mikroorganismy jako důsledek nedodržení správného dávkování (Hooper 1998; Emmerson a Jones 2003; Giguère a kol. 2013; Frade a kol. 2014).

1.4.1. Klasifikace chinolonů a jejich použití v humánní a veterinární medicíně

Použití konkrétních antibiotik na základě určité indikace je obvykle specificky legislativně regulováno v různých zemích a případně jurisdikcích. Pokud není uvedeno jinak, níže uvedené odstavce představují spíše rámcový přehled o možnosti použití jednotlivých chinolonů k léčbě infekcí vyvolaných konkrétními patogeny bez ohledu na příslušný stát nebo státy, ve kterých bylo použití chinolonů na danou indikaci schváleno. První generace chinolonů, do které jsou řazeny např. kyselina nalidixová a oxolinová, vykazovaly účinek proti některým Gramnegativním bakteriím a jejich použití bylo omezeno na nekomplikované infekce močových cest. Rysem první generace chinolonů je poměrně 19

rychlý vznik rezistence k těmto antibiotikům u různých druhů bakterií (Emmerson a Jones 2003; Martinez a kol. 2006; Pallo-Zimmerman a kol. 2010; Cheng a kol. 2011). Modifikacemi molekul farmakoforu bylo v dalších generacích těchto terapeutik docíleno zlepšení farmakologických vlastností, rozšíření spektra účinku a zvýšení účinnosti (Obrázek 3). Druhá generace chinolonů, např. norfloxacin a ciprofloxacin, je charakteristická atomem fluoru na pozici C-6 a objemným substituentem piperazinylem na pozici C-7 molekuly farmakoforu, díky čemuž bylo spektrum účinku rozšířeno na pseudomonády a některé Grampozitivní bakterie (např. Staphylococcus aureus). Třetí generace chinolonů, která zahrnuje např. moxifloxacin a levofloxacin, je charakteristická substituenty na pozici C-7 a C-8, které zvyšují účinnost chinolonů proti Grampozitivním bakteriím (např. Streptococcus pneumoniae a S. aureus vyvolávající infekce respiračního traktu, meningitis nebo akutní otitis). Moxifloxacin navíc vykazuje antibakteriální aktivitu proti Mycobacterium tuberculosis. Čtvrtá generace chinolonů, např. gemifloxacin a trovafloxacin, vykazuje vyšší účinnost a spektrum účinku zahrnuje také anaerobní bakterie. Gemifloxacin se používá k léčbě akutní bronchitis nebo komunitní pneumonie, zatímco trovafloxacin se využívá při léčbě nitrobřišních a pánevních infekcí. Druhá až čtvrtá generace chinolonů je souhrnně označována jako fluorochinolony z důvodu přítomnosti atomu fluoru na C-6 u téměř všech zástupců této skupiny antibiotik (Emmerson a Jones 2003; Pallo-Zimmerman a kol. 2010; Cheng a kol. 2011). Mezi chinolony určené výhradně pro léčbu bakteriálních infekcí zvířat patří enrofloxacin, danofloxacin, difloxacin, marbofloxacin, orbifloxacin, sarafloxacin, ibafloxacin a pradofloxacin (Sárközy 2001; Martinez a kol. 2006; Pallo-Zimmerman a kol. 2010; Giguère a kol. 2013; Quesada a kol. 2013). Ve veterinární medicíně jsou chinolony využívány k léčbě infekcí urogenitálního traktu, pneumonií a septikémií vyvolaných Gramnegativními bakteriemi (Escherichia coli, Pasteurella spp.), pro léčbu infekcí kůže a měkkých tkání vyvolaných

Gramnegativními

a

některými

Grampozitivními

aerobními

bakteriemi

a intraabdominálních infekcí vyvolaných Gramnegativními aerobními bakteriemi. U některých druhů zvířat mohou být využity k léčbě infekcí vyvolaných Mycoplasma spp. Mohou být dále využity při léčbě infekcí vyvolaných mykobakteriemi nebo intracelulárními patogeny (Brucella spp., Chlamydia spp., Chlamydophila spp., Coxiella spp., Ehrlichia spp., Rickettsia spp.) (Sárközy 2001; Giguère a kol. 2013). Enrofloxacin, danofloxacin a marbofloxacin jsou používány při léčbě pneumonií, mastitis a kolibacilózy u skotu. U prasat mohou být chinolony využity k léčbě onemocnění respiračního traktu nebo syndromu MMA („mastitis, metritis, 20

agalactiae“). U koní se fluorochinolony používají často proti rozmanitým infekcím, které byly vyvolány Gramnegativními bakteriemi (Giguère a kol. 2013). U malých zvířat (kočky, psi) je dovoleno používání enrofloxacinu, difloxacin, marbofloxacin, ibafloxacin, pradofloxacin a orbifloxacin k léčbě infekcí respiračního a urogenitálního traktu, pyodermií, infekcí ran a měkkých tkání, peritonitis, osteomyelitis a dalších infekcí (Pallo-Zimmerman a kol. 2010; Giguère a kol. 2013). U drůbeže mohou být použity enrofloxacin a další chinolony k léčbě kolibacilózy, onemocnění respiračního traktu a dalších infekcí (Sárközy 2001). V rámci akvakultur patří chinolony k nejvýznamnějším antibiotikům především kvůli širokému spektru účinku, které zahrnuje Gramnegativní i Grampozitivní bakterie. Mezi nejčastěji používané látky patří enrofloxacin, sarafloxacin, flumekvin a kyselina oxolinová (Cardoza a kol. 2005; Martinez a kol. 2006; Suzuki a Hoa 2012; Quesada a kol. 2013).

Obrázek 3. Struktura farmakoforu chinolonů. X, atom uhlíku (např. ciprofloxacin) nebo dusíku (např. kyselina nalidixová), (Andersson a MacGowan 2003).

1.4.2. Cílové molekuly chinolonů a mechanismus účinku

Cílovými molekulami chinolonů jsou topoizomerázy II – DNA gyráza a topoizomeráza IV. Oba enzymy jsou heterotetramerní. DNA gyráza se skládá ze dvou podjednotek GyrA a dvou podjednotek GyrB. Topoizomeráza IV je tvořena dvěma podjednotkami ParC a dvěma podjednotkami ParE. Topoizomerázy II katalyzují změnu terciální struktury molekuly DNA a jsou nezbytné při transkripci, replikaci, dekatenaci a dalších procesech (Cheng a kol. 2011; Miranda a kol. 2013). Tyto enzymy relaxují záporné nebo kladné nadšroubovicové vinutí molekul DNA prostřednictvím ATP-dependentní tvorby dvouřetězcových zlomů v molekule DNA a jejich opětovným spojením. Baktericidní účinek chinolonů v bakteriální buňce pravděpodobně spočívá ve stabilizaci přechodného stavu, 21

při němž topoizomerázy II rozštěpily molekulu DNA. Vazba chinolonů na komplex topoizomeráza II-DNA pravděpodobně zabraňuje opětovnému spojení zlomu DNA, což vede k fragmentaci genomové DNA. K letálnímu efektu chinolonů na bakteriální buňku také přispívají reaktivní formy kyslíku a některé toxin-antitoxin systémy, které se uplatňují při programované buněčné smrti (Cheng a kol. 2011).

1.4.3. Používání chinolonů v ekologických souvislostech - vodní prostředí jako centrum rozvoje a rozšíření rezistence k antibiotikům

Selekční tlak antibiotik na mikroorganismy je spojen se vznikem a rozšířením rezistence k antibiotikům (Baquero a kol. 2008). Používání chinolonů v humánní i veterinární medicíně vytváří selekční tlak na mikroorganismy střevní mikroflóry léčených jedinců, ale také na mikroorganismy v životním prostředí (Baquero a kol. 2008; Li a kol. 2012). V tomto kontextu má vodní prostředí zásadní význam (Baquero a kol. 2008; Lupo a kol. 2012; Frade a kol. 2014). Bakterie, které pochází z mikroflóry člověka, zvířat, rostlin nebo půd, se ve vodním prostředí vyskytují pouze přechodně a představují určitý indikátor přítomnosti zdroje rezistentních bakterií v dané lokalitě. Sledování rezistence k antibiotikům u bakterií vodního prostředí má zásadní význam pro hodnocení zatížení životního prostředí antibiotiky (Baquero a kol. 2008; Naviner a kol. 2011; Lupo a kol. 2012). Mikroorganismy rezistentní k antibiotikům lidského nebo zvířecího původu vstupují prostřednictvím exkrementů, moči, chlévské mrvy a případně také v kadáverech do odpadních vod. Odpadní vody z nemocničních zařízení a z intenzivních chovů zvířat představují významný zdroj patogenních bakterií, bakterií rezistentních k antibiotikům a genů rezistence k antibiotikům (Baquero a kol. 2008; Li a kol. 2012). Nadměrná profylaktická léčba ryb antibiotiky v akvakulturách představuje jednu z hlavních hnacích sil rozvoje a rozšíření rezistence u mikroorganismů vodního prostředí včetně patogenů ryb i člověka. Rezidua antibiotik, dezinfekčních látek, detergenty a těžké kovy ve vodním prostředí představují hlavní faktory pro selekci genů rezistence k antibiotikům a rozvoji komplexity profilů rezistence i mobilních genetických elementů, které zajišťují mobilizaci a horizontální šíření genů rezistence, u mikroorganismů vodního prostředí (Baquero a kol. 2008). Bakterie vodního prostředí mohou následně přenést geny nových mechanismů rezistence do bakterií patogenních pro člověka nebo zvířata, například prostřednictvím pitné vody (Lupo a kol. 2012).

22

Proces čištění odpadních vod obvykle odstraní téměř 80 % celkového množství chinolonů v odpadních vodách (Baquero a kol. 2008; Frade a kol. 2014). Antibiotika včetně chinolonů o potenciálně účinné koncentraci byly prokázány v aktivovaném kalu v čistírnách odpadních vod. Aktivovaný kal může být využíván jako hnojivo pro zemědělské půdy. Po použití aktivovaného kalu obsahujícího chinolony byla prokázána poměrně dlouhá perzistence těchto molekul v prostředí, nicméně s nízkou schopností proniknout do podloží (Baquero a kol. 2008). Na rozkladu chinolonů v prostředí se různou měrou podílí především fotodegradace a adsorpce antibiotika na částice v závislosti na konkrétním vodním ekosystému. Biotransformace chinolonů hraje spíše minoritní roli při rozkladu těchto antibiotik v prostředí, protože se jedná o relativně pomalý proces, který vyžaduje specifické podmínky. Chinolony mohou být poměrně rychle rozloženy působením světla (Cardoza a kol. 2005). Nicméně i meziprodukty rozkladu chinolonů mají určitou antibakteriální aktivitu (Quesada a kol. 2013). Například poločas rozkladu ciprofloxacinu světlem se v závislosti na experimentálních podmínkách in vitro pohybuje mezi 5 minutami až 1,5 hodiny. V reálném prostředí se efektivita rozkladu chinolonů odvíjí od konkrétních fyzikálně-chemických vlastností daného vodního prostředí. Chinolony ochotně adsorbují na částečky ve vodním prostředí. Adsorpce chinolonů na částice pravděpodobně nevede k rozkladu těchto antibiotik (Cardoza a kol. 2005). Adsorpce antibiotik na částice půdy nebo sedimentů snižuje volnou koncentraci antibiotika ve vodě, adsorpce však také zpomaluje biologické odbourávání antibiotik a umožňuje dlouhodobou perzistenci antibiotik v prostředí (Baquero a kol. 2008).

1.5.Mechanismy rezistence k chinolonům Fenotyp rezistence bakterií k chinolonům může být způsoben spolupůsobením řady mechanismů. Snížená citlivost nebo rezistence bakterií k antibiotikům šířící se vertikálně může vznikat v důsledku změn aminokyselinového složení nebo exprese struktur, které jsou zahrnuty v příjmu antibiotika nebo jeho odstraňování z cytoplazmy bakteriální buňky. Tyto mechanismy ovlivňují citlivost bakterií k různým skupinám antibiotik včetně chinolonů (Delcour 2009; Fernández a Hancock 2012). Změna primární struktury cílových molekul chinolonů je podstatou rezistence bakterií k chinolonům a je důsledkem změny genetické informace nesené bakteriálním chromozomem (Yoshida a kol. 1990; Goñi-Urriza a kol. 2002; Arias a kol. 2010). Snížená citlivost bakterií k chinolonům může být spojena s geny nesenými 23

extrachromozomální DNA, plazmidy. Plazmidově kódovaná rezistence k chinolonům usnadňuje vznik rezistence a v důsledku možnosti horizontálního přenosu této rezistence na jiné bakterie je epidemiologicky významná (Martínez-Martínez a kol. 1998; Strahilevitz a kol. 2009; Arias a kol. 2010).

1.5.1. Struktury buněčné stěny a cytoplasmatické membrány

Buněčná stěna Gramnegativních bakterií se skládá z tenké vrstvy peptidoglykanu, periplazmatického prostoru a vnější membrány tvořené asymetrickou dvojvrstvou fosfolipidů s lipopolysacharidy, proteiny a lipoproteiny. Chinolony mohou difundovat vnější membránou nebo mohou být do intracelulárního prostoru transportovány nespecifickými kanálky neboli poriny v závislosti na protonaci nebo deprotonaci molekul chinolonů (Delcour 2009). Ačkoliv se autoři shodují na významu změny profilu porinů ve vnější membráně a snížení její permeability v důsledku mutací na rozvoj rezistence k chinolonům u Gramnegativních bakterií (Delcour 2009; Fernández a Hancock 2012), konkrétní struktury zahrnuté v příjmu chinolonů u aeromonád studovány zatím nebyly. Změny propustnosti vnější membrány pro antibiotika jsou často spřaženy se zvýšeným odčerpáváním antibiotika z buňky (Delcour, 2009). Efluxní pumpy aktivně odčerpávají antibiotikum z cytoplazmy bakteriální buňky. U aeromonád byla detekována řada efluxních pump rodiny RND (z angl., „resistance-nodulation-division“, např. AheB, AcrAB, MexF, MexW), rodiny MFS (z angl., „major facilitator superfamily“, např. MdtH, EmrD), rodiny MATE (z angl., „multidrug and toxic compound extrusion“, např. NorM), rodiny SMR (z angl., „small multidrug resistance“, např. EmrE), rodiny ABC (z angl., „ATP-binding cassette“, např. efluxní pumpy homologické s MacAB) (Li a Nikaido 2009). Z hlediska substrátové specifity byla u aeromonád doposud studována pouze efluxní pumpa rodiny RND AheABC, která se však na odčerpávání chinolonů z cytoplazmy nepodílí (Hernould a kol. 2008). Nicméně na rezistenci k chinolonům se u aeromonád mohou podílet další efluxní pumpy (Giraud a kol. 2004; Arias a kol. 2010).

1.5.2. Substituce v primární struktuře topoizomeráz II

Vznik rezistence bakterií k chinolonům je způsoben vznikem bodových mutací v genech topoizomeráz II. Tyto bodové mutace vznikají v homologických oblastech genů podjednotek topoizomeráz II v tzv. oblastech určujících rezistenci k chinolonům (QRDR, 24

z angl., „quinolone resistance-determining region“). QRDR se vyskytuje v blízkosti aktivního centra obou enzymů (Tyr122), které interaguje s DNA (Yoshida a kol. 1990; Goñi-Urriza a kol. 2002). Mechanismus rezistence tedy pravděpodobně spočívá ve snížení specifické interakce chinolonů s QRDR topoizomeráz II (Vashist a kol. 2009). Klinická rezistence bakterií k chinolonům vzniká stupňovitě, tedy se zvyšujícím se počtem patřičných mutací v QRDR gyrA a parC se u bakterií zvyšuje i minimální inhibiční koncentrace chinolonů. U Aeromonas spp., jako u dalších Gramnegativních bakterií, je DNA gyráza primárním cílem působení chinolonů. Z tohoto důvodu jsou u rezistentních izolátů Aeromonas spp. nejčastěji detekovány mutace v QRDR gyrA. Konkrétně substituce Ser83→Ile v QRDR GyrA je detekována u rezistentních izolátů nejčastěji (Goñi-Urriza a kol. 2002; Arias a kol. 2010; Alcaide a kol. 2010). U rezistentních izolátů A. salmonicida byla také v GyrA prokázána substituce Asp87→Asn (Giraud a kol. 2004). Topoizomeráza IV je u aeromonád sekundárním cílem účinku chinolonů. Mutace v QRDR parC jsou nejčastěji detekovány u izolátů s mutacemi v gyrA. Ser80→Ile patří k nejčastěji popisovaným substitucím v QRDR ParC u Aeromonas spp. (Goñi-Urriza a kol. 2002; Arias a kol. 2010; Alcaide a kol. 2010). Substituce v QRDR GyrB a ParE nejsou obvykle u izolátů Aeromonas spp. detekovány (Goñi-Urriza a kol. 2002).

1.5.3. Plazmidově kódovaná rezistence k chinolonům

Plazmidově kódovaná rezistence k chinolonům (PMQR, z angl., „plasmid mediatedquinolone resistance“) způsobuje rezistenci ke kyselině nalidixové (1. generace chinolonů) a sníženou citlivost bakterií k fluorochinolonům (2.–4. generace chinolonů) (MartínezMartínez a kol. 1998; Strahilevitz a kol. 2009). PMQR usnadňuje vznik bodových mutací v genech gyrA a parC (Martínez-Martínez a kol. 1998; Robicsek a kol. 2006a). V současné době PMQR zahrnuje proteiny Qnr, AAC(6‘)-Ib-cr a efluxní pumpy QepA a OqxAB (Strahilevitz a kol. 2009). Jednotlivé struktury kódované PMQR geny zajišťují rezistenci k chinolonům odlišným mechanismem a mají synergický efekt na zvýšení minimální inhibiční koncentrace chinolonů (Robicsek a kol. 2006a). Geny rezistence k chinolonům se mohou vyskytovat na plazmidech multirezistence společně s geny rezistence k různým skupinám antibiotik (Strahilevitz a kol. 2009). Plazmidy multirezistence umožňují rozšíření profilu multirezistence v populaci bakterií a koselekci genů rezistence k nepříbuzným skupinám antibiotik (Partridge 2011).

25

1.5.3.1.

Proteiny Qnr

Geny qnr byly objeveny na plazmidu klinického izolátu Klebsiella pneumoniae v roce 1998 ve Spojených státech amerických a jejich název je odvozen z anglického „quinolone resistance“, zkratkou qnr (Martínez-Martínez a kol. 1998). Až do současné doby bylo popsáno 6 rodin proteinů Qnr: QnrA, QnrB, QnrC, QnrD, QnrS a QnrVC (Martínez-Martínez a kol. 1998; Hata a kol. 2005; Jacoby a kol. 2006; Fonseca a kol. 2008; Wang a kol. 2009; Cavaco a kol. 2009). U aeromonád byly doposud detekovány geny qnrS2 a qnrVC4 (Cattoir a kol. 2008; Xia a kol. 2010). Gen qnrS2 byl u izolátů Aeromonas spp. detekován v genetickém elementu nazvaném mobilní inzerční kazeta (mic, z angl., „mobile insertion cassette“) (Cattoir a kol. 2008). Gen qnrVC4 nese rekombinační místo attC a byl detekován uvnitř struktury integronu třídy 1 u Aeromonas spp. (Xia a kol. 2010). Některé mikroorganismy vodního prostředí (např. někteří zástupci Alteromonadaceae, Vibrionaceae aj.) nesou geny qnr na nukleoidu, a proto jsou považovány za jejich pravděpodobný zdroj (Fonseca a kol. 2008; Strahilevitz a kol. 2009). Ve vodním prostředí v různých oblastech světa byla dokumentována nízká koncentrace fluorochinolonů, a proto geny PMQR zajišťující sníženou citlivost k fluorochinolonům mohou představovat selektivní výhodu pro hostitelské mikroorganismy (Strahilevitz a kol. 2009). Proteiny Qnr zvyšují minimální inhibiční koncentraci fluorochinolonů mírně a umožňují vznik mutací v genech topoizomeráz II (Martínez-Martínez a kol. 1998). Charakteristickým rysem proteinů Qnr jsou pentapeptidové repetitivní motivy. Konsenzuální sekvence těchto repetitivních motivů je tvořena (Ser/Thr/Ala/Val)(Asp/Asn)(Leu/Phe) (Ser/Thr/Arg)(Gly). Počet repetitivních motivů je specifický pro každou rodinu proteinů Qnr (Strahilevitz a kol. 2009). Protein QnrB1 se stal modelem pro studium struktury proteinů Qnr. QnrB1 je dimerní protein tvořený pravotočivým čtyřbokým β-helixem, ze kterého vystupují smyčky A a B. Tyto smyčky pravděpodobně hrají

zásadní

pro snížení

roli

citlivosti

bakterií k fluorochinolonům (Obrázek 4). Předpokládaný mechanismus rezistence vyvolaný proteiny

Qnr

spočívá

Obrázek 4. Struktura proteinu QnrB1 (Vetting a kol. 2011). Vysvětlivky: C-term, C-konec proteinu; N-term, N-konec proteinu; černá - smyčky A a B.

26

v destabilizaci komplexu DNA-topoizomeráza II-chinolon a následném uvolnění chinolonu z tohoto komplexu (Vetting a kol. 2011).

1.5.3.2.

Aminoglykosidová N-acetyltransferáza

Aminoglykosidová N-acetyltransferáza AAC(6‘)-Ib modifikuje aminoglykosidy amikacin, kanamycin a tobramycin. Mutatní forma tohoto enzymu, AAC(6‘)-Ib-cr, obsahuje 12 unikátních párů bazí na 5‘ konci genu a mutace měnící smysl dvou kodónů Trp102→Arg a Asp179→Tyr. Tyto mutace v sekvenci genu aac(6‘)-Ib-cr mají vliv na rozšíření spektra substrátů tohoto enzymu o ciprofloxacin a norfloxacin, nicméně částečně snižují účinnost proti aminoglykosidům (Robicsek a kol. 2006a). Genová kazeta aac(6‘)-Ib-cr je u aeromonád nalézána jakožto součást integronů třídy 1 (Marti a Balcázar 2012). Alternativní název genu aac(6‘)-Ib-cr je aacA4 (Partridge a kol. 2009).

1.5.3.3.

Efluxní pumpy QepA a OqxAB

QepA a OqxAB patří mezi plazmidově kódované efluxní pumpy zajišťující sníženou citlivost bakterií k fluorochinolonům aktivním odčerpáváním antibiotika z buňky. Efluxní pumpa QepA patří do rodiny MFS a je charakteristická 14 transmembránovými segmenty. Primární struktura QepA nese značnou podobnost s domnělými efluxními pumpami zástupců řádu Actinomycetales (Yamane a kol. 2007). OqxAB patří do rodiny RND. U enterobakterií se účinnost aktivního odčerpávání chinolonů z buňky odvíjí od přítomnosti kanálku procházejícího vnější membránou (Hansen a kol. 2007). U aeromonád tyto efluxní pumpy nebyly doposud detekovány.

1.6.Mobilní genetické elementy a mechanismy horizontálního přenosu genů Geny rezistence k antibiotikům nejsou přirozeně mobilní a předpokládá se, že u svých původních bakteriálních hostitelů mohou zastávat i jiné funkce než být zahrnuty pouze v obraně proti působení antibiotika (Martinez a kol. 2009). Mobilizace genů rezistence z chromozomů různých druhů bakterií je zajištěna dvěma typy mobilních genetických elementů (MGE). První typ MGE umožnuje rozšíření genů rezistence mezi různými genofory bakteriální buňky a druhý typ MGE umožňuje rozšíření genů rezistence horizontálně (Partridge 2011). Geny rezistence nesené mobilními genetickými elementy mohou být 27

v populaci bakterií přenášeny třemi mechanismy – konjugací, transformací nebo transdukcí (Thomas a Nielsen 2005; Kelly a kol. 2009).

1.6.1. Elementy zajišťující mobilizaci genů rezistence

Inzerční sekvence, složené transpozony, ISEcp, ISCR a příbuzné elementy, integrony s genovými kazetami, transpozony rodiny Tn3 a Tn5053 patří mezi nejvýznamnější mobilní genetické elementy zajišťující mobilizaci a přenos genů mezi různými molekulami DNA uvnitř buňky Gramnegativních bakterií. Úspěšná mobilizace a přenos genů mezi různými genofory se děje spíše vzácně (Partridge 2011). Ve vodním prostředí hrají nejvýznamnější roli integrony (Lupo a kol. 2012). Ve struktuře integronů byly u aeromonád detekovány geny qnrVC4 a aac(6‘)-Ib-cr (Xia a kol. 2010; Marti a Balcázar 2012). Integrony třídy 1 typu sul1 se skládají ze dvou konzervativních úseků, 5’-CS a 3’-CS. Oblast 5’-CS se skládá z promotoru Pc, genu pro integrázu intI a rekombinační místo attI. Integráza zajišťuje místně specifickou rekombinací začlenění genových kazet do struktury integronu nebo jejich excizi ze struktury integronu. Genové kazety obsahují samotný gen, Shine-Dalgarnovu sekvenci a rekombinační místo attC. Na 5’-CS navazuje sestava genových kazet, které jsou exprimovány z promotoru tohoto segmentu. Genové kazety mohou nést geny rezistence k různým skupinám antibiotik (např. aminoglykosidům, chinolonům, beta-laktamům, chloramfenikolu, trimetoprimu, rifampicinu a dalším). Oblast 3’-CS obsahuje deletovanou genovou kazetu qacE∆1 a gen sul1, orf5 a orf6. Intergon třídy 1 typu sul1 byl odvozen od transpozonu typu Tn402, který zajistil mobilizaci genů intI1 a attI1 z chromozomálního integronu. Začleněním genu rezistence k sulfonamidům sul1 do genové kazety kódující rezistenci ke kvartérním amoniovým solím qacE byla část této kazety deletována včetně části transpozonu typu Tn402. Touto delecí vznikl defektní transpozon a integrony třídy 1 typu sul1 nemají geny zajišťující přenos integronu mezi různými molekulami DNA. Nicméně transpozon typu Tn402 disponuje intaktními sekvencemi obrácených repetic, a proto může být přenášen mezi různými genofory pomocí transponáz poskytovaných in trans a proteinů RecA, které nahrazují funkci resolvázy. Integrony mohou být ale spřaženy s jinými transpozony, které zajistí jejich přenos, nebo mohou být neseny na plazmidech, díky čemuž mohou být rozšiřovány horizontálně (Partridge 2011).

28

Unikátním MGE je mobilní inzerční kazeta (mic), která byla popsána u Aeromonas spp. z vodního prostředí v souvislosti s PMQR. Jedná se o mobilní element (< 1,5 kb), který je ohraničen nedokonalými obrácenými repeticemi (22 bp). Bezprostředně za vnějšími hranicemi tohoto elementu tvořenými nedokonalými repeticemi byly nalezeny přímé repetice (5 bp). Na základě přítomnosti krátkých přímých repetic je předpokládaným mechanismem přenosu tohoto elementu transpozice. Také struktura mic připomíná strukturu transpozonu, nicméně uvnitř tohoto elementu byl detekován gen qnrS2, nikoliv gen transponázy. Pravděpodobný mechanismus přenosu tohoto elementu mezi různými molekulami DNA je trans-transpozice. Element mic nese domnělé promotorové sekvence (Cattoir a kol. 2008).

1.6.2. Mobilní genetické elementy zajišťující horizontální přenos genů rezistence

Mezi genetické elementy, které jsou zodpovědné za široké rozšíření genů v populaci bakterií, patří plazmidy a integrativní konjugativní elementy (Partridge 2011). Plazmidy patří k nejvýznamnějším vektorům genů rezistence k antibiotikům. Plazmidy jsou obvykle cirkulární samostatně se replikující molekuly DNA, které nenesou esenciální geny bakteriální buňky a naopak nesou geny, které mohou přinést selektivní výhodu svému hostiteli (Kelly a kol. 2009; Carattoli 2009). Plazmidy mají modulární mozaikovou strukturu (Kulinska a kol. 2008; Fricke a kol. 2009). Plazmidy mohou být kategorizovány na základě inkompatibility (Inc). Inkompatibilita je neschopnost koexistence dvou plazmidů se stejným mechanismem kontroly replikace v jedné buněčné linii (Novick, 1987). Plazmidy mohou být rozděleny z hlediska schopnosti vlastního horizontálního přenosu na plazmidy konjugativní, mobilizovatelné a nekonjugativní (Smillie a kol. 2010). Konjugativní plazmidy kódují všechny

struktury

potřebné

pro

vlastní

konjugativní

přenos,

zatímco

plazmidy

mobilizovatelné kódují pouze část těchto struktur. Mobilizovatelné plazmidy mohou být přenášeny konjugací v případě, že je v buňce přítomen také konjugativní plazmid, který kóduje veškeré proteiny pro úspěšný horizontální přenos (Thomas a Nielsen 2005; Kelly a kol. 2009; Smillie a kol. 2010). U aeromonád byly doposud detekovány plazmidy skupiny inkompatibility A/C, U, FrepB, FIC, I1, Q, a také ColE (Cattoir a kol. 2008; Verner-Jeffreys a kol. 2009; Moura a kol. 2012; Han a kol. 2012b,c). Referenční IncA/C plazmid, pRA1, byl izolován z A. hydrophila (dříve A. liquefaciens) v roce 1971 (Aoki a kol. 1971a). Plazmidy IncA/C patří mezi konjugativní plazmidy se širokým spektrem hostitelů. Velikost dosud sekvenovaných IncA/C plazmidů se pohybuje přibližně od 49 do 183 kb. Geny rezistence k antibiotikům byly 29

detekovány v částečně se překrývajících specifických mozaikových oblastech, které jsou lokalizovány na několika málo místech v konzervativních sekvencích, které u IncA/C plazmidů zajišťují replikaci, stabilní udržování v bakteriální buňce a vlastní přenos (Fricke a kol. 2009). Referenčním IncU plazmidem je pRA3, který byl izolován z A. salmonicida z nemocné ryby (Aoki a kol. 1971b). IncU plazmidy jsou konjugativní a mají široké spektrum hostitelů v rámci Gramnegativních bakterií a jejich stabilní udržování bylo prokázáno v buňkách E. coli, Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha a Agrobacterium tumefaciens. Původně se předpokládalo, že tyto plazmidy jsou poměrně homogenní skupinou, která je charakteristická konzervativní oblastí genů zahrnutých v replikaci, stabilním udržování a přenosu těchto plazmidů a jednou variabilní oblastí s geny rezistence (Kulinska a kol. 2008). Nicméně mezi IncU plazmidy byl zařazen i plazmid Rms149 izolovaný z P. aeruginosa, který s plazmidem pRA3 sdílí homologické sekvence pouze ve dvou genech (Haines a kol. 2006; Kulinska a kol. 2008). IncFrepB, IncFIC a IncI1 plazmidy byly u aeromonád detekovány pouze autory Moura a kol. (2012). Tyto plazmidy jsou často nalézány u enterobakterií ve spojení s geny rezistence k různým skupinám antibiotik (Carattoli 2009). IncQ plazmidy jsou mobilizovatelné, mají široké spektrum hostitelů a jejich velikost se pohybuje přibližně od 5,1 do 14,2 kb (Han a kol. 2012b). ColE plazmidy také patří mezi malé mobilizovatelné plazmidy (Han, a kol. 2012c).

1.6.3. Mechanismy horizontálního šíření genů rezistence

Horizontální přenos genů zahrnuje mechanismy konjugace, transformace a transdukce. Konjugace je jednosměrný přenos DNA plazmidů nebo integrativních konjugativních elementů z donorové buňky do buňky recipientní prostřednictvím F-pilu. Konjugativní přenos je obvykle zajištěn expresí genů nesených na plazmidech nebo na integrativních konjugativních elementech. Transformace spočívá v příjmu DNA z prostředí recipientní buňkou, následně je DNA začleněna do nukleoidu nebo stabilizována v autonomním stavu a exprimována. Transdukce je horizontální přenos genů zajištěný bakteriofágy (Thomas a Nielsen 2005; Kelly a kol. 2009).

30

2. Cíle studie A.

Zhodnocení významu okrasných ryb jakožto vektorů Aeromonas spp. s geny PMQR

zajišťujícími sníženou citlivost bakterií k fluorochinolonům a mobilních genetických elementů nesoucích tyto geny rezistence

B.

Charakterizace získaných izolátů Aeromonas spp. s PMQR z hlediska jejich

epidemiologické příbuznosti, tvorby biofilmu, profilu rezistence k různým skupinám antibiotik a struktury integronů

C.

Zhodnocení příbuznosti plazmidů s PMQR a jejich schopnosti horizontálního přenosu

31

3. Materiál a metody V následujících podkapitolách je uveden zdroj a původ analyzovaných izolátů Aeromonas spp., přehled chemikálií, antibiotik, kultivačních médií a dalšího materiálu použitého v rámci experimentální práce. Dále je zmíněn přehled metod, které byly provedeny k analýze získaných izolátů. Pro ucelený obraz provedené studie jsou v dalším textu uvedeny veškeré provedené metody. Podíl autorky této rigorózní práce na této studii zahrnuje stanovení epidemiologické příbuznosti izolátů pomocí pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a tvorbu dendrogramu, izolaci plazmidové DNA a transformace E. coli DH5α, průkaz genů rezistence k chinolonům u transformantů, stanovení profilu plazmidů u izolátů a příslušných transformantů pomocí běžné elektroforézy a PFGE, restrikční analýzu plazmidové DNA, Southernův přenos, hybridizaci se specificky značenými sondami a také analýzu genetického pozadí genu qnrS2. Z tohoto důvodu jsou tyto metody a postupy popsány do většího detailu. Ostatní metody byly provedeny dalšími spoluautory studie nebo spolupracovníky z Veterinární a farmaceutické univerzity Brno a jsou popsány pouze stručně pro doplnění.

3.1.Bakteriální izoláty Celkem bylo vyšetřeno 156 izolátů Aeromonas spp. se sníženou citlivostí k ciprofloxacinu. Osmdesát izolátů Aeromonas spp. bylo získáno ze stěrů žaber a kůže usmrcených kaprů koi (Cyprinus carpio koi) chovaných na sedmi různých farmách v České republice v letech 2005–2006 (Čížek a kol. 2010). Sedmdesát šest izolátů Aeromonas spp. bylo získáno ze stěrů kůže, žaber a tělních kavit různých druhů tropických okrasných ryb dovezených z Vietnamu, Thajska, Číny, Slovenska, Brazílie a Peru do ČR v letech 2005– 2007. Odběr vzorků byl proveden neprodleně po jejich dovozu do České republiky při veterinární prohlídce u velkoobchodního distributora těchto ryb. Před odběrem vzorků byly ryby uchovány v původní přepravní vodě v uzavřených pytlích v polystyrenových krabicích.

3.2.Spotřební materiál Seznam chemikálií a komerčních souprav použitých v rámci experimentální práce autorky je uveden v Tabulce 1, seznam kultivačních médií v Tabulce 2 a seznam restrikčních enzymů v Tabulce 3. Konkrétní výrobci a země původu jsou u dalšího použitého spotřebního materiálu uvedeny v textu.

32

Tabulka 1. Seznam použitých chemikálií a komerčních souprav.

chemikálie/komerční souprava

zkratka/ vzorec

výrobce

země původu

metodika/použití

agaróza ("Agarose for routine use")

-

Sigma-Aldrich

USA

elektroforéza

agaróza ("Seakem LE Agarose")

-

Lonza

USA

elektroforéza

agaróza ("Seakem Gold Agarose")

-

Lonza

USA

PFGE

ciprofloxacin

CIP

Fluka

Čína

destilovaná voda

dH2O

-

-

dihydrát citronanu sodného

-

Fluka

Belgie

dodecylsulfát sodný

SDS

Sigma-Aldrich

Japonsko

EDTA.Na2.2 H2O

EDTA

Sigma-Aldrich

Čína

kultivace, transformace příprava roztoků, médií, bakteriálních suspenzí Southernův přenos, hybridizace izolace plazmidů, hybridizace izolace plazmidů, PFGE

etanol

EtOH

Penta

Česká republika

izolace plazmidů

etidium bromid

EtBr

Top-Bio

Česká republika

elektroforéza

Evansova modř fenol–chloroform–izoamylalkohol 25 : 24 : 1 D-(+)-glukóza

-

Sigma-Aldrich

USA

příprava roztoků

-

Sigma-Aldrich

Velká Británie

izolace plazmidů

-

Sigma-Aldrich

Francie

glycerol

-

Sigma-Aldrich

Německo

izolace plazmidů příprava kryoprotektivního média, roztoků

hmotnostní standard ("1 Kb DNA ladder")

-

Central European Biosystems

Česká republika

elektroforéza

hmotnostní standard ("DNA fága λ štepená HindIII")

-

New England BioLabs

USA

elektroforéza

hmotnostní standard ("100 bp DNA ladder")

-

Central European Biosystems

Česká republika

elektroforéza

hydroxid sodný

NaOH

Sigma-Aldrich

Švédsko

chemiluminiscenční substrát CSPD

CSPD

Roche

Německo

izolace plazmidů, hybridizace hybridizace

chlorid sodný

NaCl

Fluka

Švýcarsko

hybridizace

kyselina boritá

-

Sigma-Aldrich

USA

PFGE

kyselina chlorovodíková (38%)

HCl

Sigma-Aldrich

Německo

úprava pH

lysozym

-

Fluka

USA

izolace plazmidů

N-lauroylsarkosin sodný

-

Sigma-Aldrich

Velká Británie

PFGE, hybridizace

octan sodný

-

Sigma-Aldrich

Japonsko

izolace plazmidů

PCR voda

-

Top-Bio

Česká republika

PCR

Combi PPP Master-Mix

-

Česká republika

PCR

proteináza K

-

Top-Bio SERVA Electrophoresis GmbH

Německo

PFGE

protilátka k digoxigeninu ("AntiDigoxigenin-AP")

-

Roche

Německo

hybridizace

RNáza A

-

Bio Basic Canada Inc.

Kanada

izolace plazmidů

Vysvětlivky: PFGE, pulzní gelová elektroforéza; RFLP, restrikční analýza.

33

Tabulka 1. Seznam použitých chemikálií a komerčních souprav - pokračování.

chemikálie/komerční souprava

zkratka/ vzorec

výrobce

země původu

metodika/použití

sonikovaná DNA spermatu lososa

-

Life Technologies

USA

hybridizace

souprava pro izolaci plazmidů („QIAGEN Plasmid Mini Kit“)

-

Qiagen

Německo

izolace plazmidů

-

Roche

Německo

hybridizace

souprava pufrů pro hybridizaci a detekci ("DIG wash and block buffer set") souprava pro přípravu sond značených digoxigeninem ("PCR DIG Probe Synthesis Kit") tris(hydroxymetyl)aminometan

-

Roche

Německo

hybridizace

Tris

Sigma-Aldrich

USA

PFGE, hybridizace

ustalovač

-

AGFA

Belgie

hybridizace

vývojka

-

AGFA

Belgie

hybridizace

Vysvětlivky: PFGE, pulzní gelová elektroforéza; RFLP, restrikční analýza. Tabulka 2. Seznam použitých kultivačních médií.

kultivační médium

zkratka výrobce země původu

metodika/použití

bakteriologický pepton

-

uchovávání kultur - součást kryoprotektivního média kultivace kultivace, transformace transformace

„Columbia blood agar base“ MPA Luria-Bertani agar LBA Luria-Bertani bujón LBB

Oxoid

Velká Británie

Oxoid Difco Difco

Velká Británie Francie Francie

Tabulka 3. Seznam použitých restrikčních enzymů.

restrikční enzym

výrobce

země původu

metodika

AluI HincII S1 nukleáza XbaI

New England Biolabs Thermo-Scientific Promega Takara

Kanada

RFLP RFLP PFGE PFGE

USA USA Japonsko

Vysvětlivky: PFGE, pulzní gelová elektroforéza; RFLP, restrikční analýza.

3.3.Charakterizace izolátů Aeromonas spp. V následujících podkapitolách jsou zmíněny metodiky izolace Aeromonas spp. z odebraných vzorků, identifikace bakteriálních izolátů, stanovení minimální inhibiční koncentrace chinolonů, detekce genů plazmidově kódované rezistence k chinolonům, stanovení profilu fenotypové rezistence k antibiotikům diskovou difúzní metodou, detekce genů rezistence k dalším skupinám antibiotik, integronů a genových kazet, tvorba biofilmu,

34

stanovení epidemiologické příbuznosti pulzní gelovou elektroforézou a detekce skupin inkompatibilit plazmidů.

3.3.1. Izolace, identifikace a uchovávání bakteriálních izolátů

Izoláty byly získány kultivací na Columbia agaru s 5 % ovčí krve 24–48 h při 28 °C. Izoláty byly zařazeny do skupiny druhů na základě fenotypové identifikace, která zahrnovala sledování morfologie analyzovaných kolonií, barvení dle Grama, test pohyblivosti, test produkce katalázy a oxidázy a stanovení rezistence k vibriostatickému agens O/129. Biochemické vlastnosti izolátů byly dále testovány pomocí komerční sady API 20E (bioMérieux, Francie). Dále byla u izolátů stanovena hydrolýza eskulinu a růst na TSI agaru (z angl., „triple sugar iron agar“). Identifikace izolátů byla provedena pomocí Aerokey II (Čížek a kol. 2010). Dále byl z každého vzorku analyzován pouze jeden izolát Aeromonas spp. Izoláty byly uchovávány v kryoprotektivním médiu (0,75 g bakteriologického peptonu, 70 ml dH2O, 30 ml glycerolu) v kryozkumavkách při -80 °C.

3.3.2. Stanovení minimální inhibiční koncentrace chinolonů

Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) chinolonů bylo provedeno agarovou diluční metodou. MIC byla stanovena u izolátů pro ciprofloxacin (0,015–128 mg/l), enrofloxacin (0,015-64 mg/l; Fluka, Čína), flumekvin (0,015-256 mg/l; Sigma, Itálie), kyselinu nalidixovou (0,015-512 mg/l; Sigma, Itálie) a kyselinu oxolinovou (0,015-128 mg/l; Sigma, Itálie). Jako kontrolní kmeny byly využity Escherichia coli ATCC 25922 a Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida ATCC 33658. Z dvacetičtyřhodinových kultur aeromonád a kontrolních kmenů byly připraveny bakteriální suspenze o zákalu 0,5 McFarlandovy stupnice (tj. ≈1–2∙108 CFU/ml) ve 2 ml sterilního fyziologického roztoku (0,9% NaCl). Po homogenizaci bakteriálních suspenzí bylo 200 µl těchto suspenzí pipetováno do příslušných jamek mikrotitrační destičky. Pomocí multiinokulátoru byl přenesen přibližně 1 µl těchto suspenzí (tj. ≈1∙105 CFU/ml), z mikrotitrační destičky na Mueller-Hinton agar (Oxoid, Velká Británie) bez chinolonů pro kontrolu růstu bakterií. Poté byly postupně inokulovány plotny MH agaru obsahující chinolony o koncentraci nejnižší po plotny s koncentrací chinolonů nejvyšší. Plotny byly inkubovány 24 h při 28 °C. MIC u izolátů odpovídá nejnižší koncentraci antibiotika, při které je inhibován viditelný růst bakterií (CLSI 2006b;

Čížek

a

kol.

2010).

Izoláty

Aeromonas

spp.

se

sníženou

citlivostí

k fluorochinolonům (MIC ciprofloxacinu ≥ 0,05 mg/l) byly zahrnuty do dalších analýz. 35

3.3.3. Detekce genů plazmidově kódované rezistence k chinolonům

Izolace DNA byla provedena teplotní lyzí. Suspenze bakterií v destilované vodě byly 10 min inkubovány při 100 °C v suché lázni. Po centrifugaci (13 200 ot./2 min) byl supernatant odpipetován do nové zkumavky a uchováván při -20 °C (Cattoir a kol. 2007). Genomová DNA izolátů byla testována na přítomnost genů plazmidově přenášené rezistence k chinolonům (qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, aac(6‘)-Ib, qepA, oqxAB) pomocí PCR. V případě testování qepA byl do PCR směsi přidán roztok dimetylsulfoxidu (Sigma-Aldrich, Velká Británie). Po odečtení výsledku elektroforézy byly amplikony přečištěny z PCR směsi (Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit, Geneaid, Taiwan) a sekvenovány Sangerovou metodou (Macrogen, Nizozemí). Sekvence primerů, podmínky PCR reakce, velikosti amplikonů a použité kontrolní kmeny jsou uvedeny v Tabulce 4. Do dalších analýz byly zahrnuty pouze izoláty, u kterých byly sekvenováním potvrzeny geny PMQR.

3.3.4. Stanovení profilu fenotypové rezistence k antibiotikům

Z dvacetičtyřhodinových kultur aeromonád s geny PMQR a kontrolních kmenů E. coli ATCC 25922 a A. salmonicida subsp. salmonicida ATCC 33658 byly připraveny bakteriální suspenze o zákalu 0,5 McFarlandovy stupnice ve 2 ml destilované vody (tj. ≈1–2∙108 CFU/ml).

Homogenizované

bakteriální

suspenze

byly

ředěny

v poměru

1:100

ve fyziologickém roztoku (0,9% NaCl) a následně sterilní Pasteurovou pipetou přeneseny na příslušné plotny Mueller-Hinton agaru. Po zaschnutí inokula byly na povrch ploten kladeny antibiotické disky pomocí dispenzoru. Diskovou difúzní metodou byla testována citlivost izolátů k osmi antibiotikům relevantním v akvakulturách včetně těch antibiotik, které by mohly být používány mimo schválenou indikaci: chloramfenikol (30 µg), gentamicin (10 µg), nitrofurantoin (300 µg), florfenikol (30 µg), oxytetracyklin (30 µg), sulfonamidy (300 µg), sulfametoxazol/trimetoprim (1,25 µg/23,75 µg) a trimetoprim (5 µg) (vše Oxoid, Velká Británie). Plotny byly inkubovány 24 h při 28 °C (CLSI 2006a). Vyhodnocení testu bylo provedeno pomocí standardizovaných metodik (CLSI 2011; CLSI 2013).

3.3.5. Detekce genů rezistence k dalším skupinám antibiotik, integronů a genových kazet

Na základě výsledků diskové difúzní metody byly u izolátů testovány geny rezistence pomocí PCR. Jednalo se o geny rezistence k tetracyklinům tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) a tet(E), geny rezistence k amfenikolům catA1, cmlA a floR, geny rezistence k sulfonamidům 36

sul1, sul2, a sul3, dále gen beta-laktamázy blaOXA-1. Na základě přítomnosti genů integráz I (intI1 a intI2) byla testována přítomnost integronů třídy 1 a 2 pomocí PCR. Profily genových kazet (aadA1, aadA2, aadA5, dfrA1, dfrA12, dfrA17, estX, sat) integronů byly testovány pomocí PCR, případně sekvenací celé struktury integronu. V Tabulce 4 je uveden seznam všech použitých primerů, podmínek amplifikace, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů pro testování genů rezistence, integronů a genových kazet.

Tabulka 4. Seznam použitých primerů, reakčních podmínek PCR, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů použitých při testování genů rezistence, integronů a při mapování genetického pozadí genu qnrS2.

gen qnrA qnrB qnrC qnrD qnrS

primer

sekvence primeru (5'-3')

qnrA-F

ATT TCT CAC GCC AGG ATT TG

qnrA-R

GAT CGG CAA AGG TTA GGT CA

qnrB-F

GAT CGT GAA AGC CAG AAA GG

qnrB-R

ATG AGC AAC GAT GCC TGG TA

qnrC-F

GGG TTG TAC ATT TAT TGA ATC G

qnrC-R

CAC CTA CCC ATT TAT TTT CA

qnrD-F

CGA GAT CAA TTT ACG GGG AAT A

qnrD-R

AAC AAG CTG AAG CGC CTG

qnrS-F

GCA AGT TCA TTG AAC AGG GT

qnrS-R

TCT AAA CCG TCG AGT TCG GCG ATG GAA ACC TAC AAT CAT ACA TAT CG TTA GTC AGG ATA AAC AAC AAT ACC C TTC GTG ATG CAA GTT TCC AA

qnrS1.seq1F qnrS2a

qnrS1.seq2R qnrS1.seq2F qnrS1.seq1R

aac(6')Ibb qepA oqxA

oqxB tet(A)

aac(6´)Ib-R

TTC GTT CCT ATC CAG CGA TT TTG CGA TGC TCT ATG AGT GGC TA CTC GAA TGC CTG GCG TGT TT

qepA-F

TGG TCT ACG CCA TGG ACC TCA

qepA-R

TGA ATT CGG ACA CCG TCT CCG

oqxAF

CTC GGC GCG ATG ATG CT

aac(6´)Ib-F

oqxAR

CCA CTC TTC ACG GGA GAC GA

oqxBs

TTC TCC CCC GGC GGG AAG TAC

oqxBa2

CTC GGC CAT TTT GGC GCG TA

tetA-F

GCT ACA TCC TGC TTG CCT TC

tetA-R

CAT AGA TCG CCG TGA AGA GG

Ta amplikon ( °C) (bp)

kontrolní kmen

reference/ GenBank

53

516

E. coli J53 pMG252

Robicsek a kol. 2006b

53

476

E. coli J53 pMG298

Kim a kol. 2009a

53

307

E. coli DH10B pHsII

Kim a kol. 2009a

57

582

E. coli TG1 p2007057

Cavaco a kol. 2009

53

428

E. coli J53 pMG306

Cattoir a kol. 2007

55

467

E. coli J53 pMG306

Dolejska a kol. 2011a

-

-

-

GQ336885

55

482

Salmonella Infantis 14

Park a kol. 2006

53

1136

E. coli 20III09

Périchon a kol. 2007

60

392

64

512

58

210

E. coli CSH26 RifR/pOLA52 E. coli CSH26 RifR/pOLA52 E. coli M148

Kim a kol. 2009b Kim a kol. 2009b Ng a kol. 1999

a

k amplifikaci genu qnrS2 pro stanovení primární struktury tohoto genu byly použity primery qnrS1.seq1F a qnrS1.seq2R, pro následnou sekvenaci PCR produktu byly použity primery qnrS1.seq1R, qnrS1.seq1F a qnrS1.seq2F b k sekvenaci aac(6‘)-Ib-cr byl použit primer aac(6´)Ib-F

37

Tabulka 4. Seznam použitých primerů, reakčních podmínek PCR, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů použitých při testování genů rezistence, integronů a při mapování genetického pozadí genu qnrS2 - pokračování.

gen tet(B) tet(C) tet(D) tet(E) catA1 cmlA floR sul1 sul2

sul3

primer

sekvence primeru (5'-3')

tetB-F

TTG GTT AGG GGC AAG TTT TG

tetB-R

GTA ATG GGC CAA TAA CAC CG

tetC-F

CTT GAG AGC CTT CAA CCC AG

tetC-R

ATG GTC GTC ATC TAC CTG CC

tetD-F

AAA CCA TTA CGG CAT TCT GC

tetD-R

GAC CGG ATA CAC CAT CCA TC

tetE-F

AAA CCA CAT CCT CCA TAC GC

tetE-R

AAA TAG GCC ACA ACC GTC AG

cat-F

CCT GCC ACT CAT CGC AGT

cat-R

CCA CCG TTG ATA TAT CCC

cmlA-F

TGT CAT TTA CGG CAT ACT CG

cmlA-R

ATC AGG CAT CCC ATT CCC AT

floR-F

GCG ATA TTC ATT ACT TTG GC

floR-R

TAG GAT GAA GGT GAG GAA TG

sul1-F

CTT CGA TGA GAG CCG GCG GC

sul1-R

GCA AGG CGG AAA CCC GCG CC

sul2-F

AGG GGG CAG ATG TGA TCG AC

sul2-R

GCA GAT GAT TTC GCC AAT TG

sul3-F

GAG CAA GAT TTT TGG AAT CG CAT CTG CAG CTA ACC TAG GGC TTT GGA TTC AAG CCA AAG GCA CGA TAG

sul3-R blaOXA-F

blaOXA

blaOXA-R

TCC GAG TTG ACT GCC GGG TTG

int1-F

CCT CCC GCA CGA TGA TC

int1-R

TCC ACG CAT CGT CAG GC

int2-F

CAC GGA TAT GCG ACA AAA AGG T

int2-R

GTA GCA AAC GAG TGA CGA AAT G

integron tř. 1

5´CS

GGC ATC CAA GCA GCA AG

integron tř. 2

Hep74

intI1 intI2

aadA1 aadA2 aadA5

3´CS

AAG CAG ACT TGA CCT GA

Hep51

CGG GAT CCC GGA CGG CAT GCA CGA TTT GTA GAT GCC ATC GCA AGT ACG AG

aadA1-F

CGA CTC AAC TAT CAG AGG TA

aadA1-R

CTT TTG TCA GCA AGA TAG CC

aadA2-F

CGG TGA CCA TCG AAA TTT CG

aadA2-R

CTA TAG CGC GGA GCG TCT CGC

aadA5-F

CAC TGG ACA CAA TCC ACC TG

aadA5-R

CCA AGG CAC TAC TTC GCT TC ACG GAT CCT GGC TGT TGG TTG GAC GC CGG AAT TCA CCT TCC GGC TCG ATG TC

dhfr1-F dfrA1 dhfr1-R

Ta amplikon ( °C) (bp)

kontrolní kmen

reference/ GenBank

58

659

E. coli M44

Ng a kol. 1999

55

418

E. coli D07

Ng. a kol. 1999

55

787

Aeromonas sp. A233

Ng a kol. 1999

55

278

Aeromonas sp. A233

Ng a kol. 1999

55

623

E. coli M44

Faldynova a kol. 2003

55

455

E. coli HR17

Sáenz a kol. 2004

50

425

E. coli R128

Faldynova a kol. 2003

68

417

E. coli M44

Zhao a kol. 2001

58

249

E. coli M44

Faldynova a kol.2003

55

789

E. coli H195

Perreten a Boerlin, 2003

58

702

Klebsiella pneumoniae KDO/3/OXA

Briñas a kol. 2002

58

280

E. coli M44

Zhao a kol. 2001

58

788

E. coli OP1

Sáenz a kol. 2004

58

variabilní

E. coli M2, M44, M66, M148

Faldynova a kol. 2003

58

variabilní

E. coli OP1

White a kol. 2001

55

384

E. coli M148

AY534545

55

249

E. coli M2

Faldynova a kol. 2003

55

218

E. coli M44

EF571855

55

254

E. coli M148

Gibreel a Sköld 1998

38

Tabulka 4. Seznam použitých primerů, reakčních podmínek PCR, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů použitých při testování genů rezistence, integronů a při mapování genetického pozadí genu qnrS2 - pokračování.

gen dfrA12 dfrA17 estX sat mpR

primer

sekvence primeru (5'-3')

dhfr12-F

ACT CGG AAT CAG TAC GCA

dhfr12-R

GTG TAC GGA ATT ACA GCT

dhfr17-F

GAT TTC TGC AGT GTC AGA

dhfr17-R

CTC AGG CAT TAT AGG GAA

estX-F

CCC ATG AAC CCA TTA TCC TG

estX-R

ATG AGC AGC TTC CAG ACC AT

sat-F

CCG ACC AAG GCT TTG AAC TA

sat-R

TCG CAA ATT CGA TGA GAC TG

mpR-F

CTT ACG ACG AAC TAC AGC GG

mpR-R

CAT CCA ACT GAT CCG ATA GTC

Ta amplikon ( °C) (bp)

kontrolní kmen

reference/ GenBank

55

462

E. coli M2

Guerra a kol. 2004

50

384

E. coli M44

Guerra a kol. 2004

55

227

E. coli OP1

DQ286459

55

234

E. coli OP1

DQ286459

53

variabilní

A. hydrophila 227

HE616910

3.3.6. Stanovení epidemiologické příbuznosti pulzní gelovou elektroforézou

Epidemiologická příbuznost izolátů Aeromonas spp. byla stanovena pomocí restrikčního štěpení genomové DNA enzymem XbaI a následnou separací fragmentů DNA pomocí pulzní gelové elektroforézy. Ve 2 ml pufru CSB (100 mM Tris-HCl, pH=8,0; 100 mM EDTA, pH 8,0) byly připraveny suspenze bakterií o optické hustotě (λ=600 nm) 1,3–1,4. Dvě stě mikrolitrů homogenizované suspenze bylo smícháno s 10 µl roztoku proteinázy K (20 mg/ml). Směs byla promíchána pipetováním a bylo k ní přidáno 200 µl 1,6% agarózového gelu temperovaného na 55 °C. Směs byla nanesena do formiček. Po utuhnutí byly bločky agarózového gelu inkubovány v roztoku pufru CLB (50 mM Tris-HCl, pH=8,0; 50 mM EDTA, pH 8,0; 1% N-lauroylsarkosin) a proteinázy K (0,1 mg/ml) za konstantního třepání 1,5–2 h při 54 °C. Následně byly bločky dvakrát promývány 15 ml dH2O temperované na 50 °C a poté čtyřikrát 15 ml TE pufru (10 mM Tris-HCl, pH=8,0; 1 mM EDTA, pH=8,0) taktéž temperovaným na 50 °C v desetiminutových intervalech. Mezi výměnami promývacích roztoků byly bločky inkubovány při 50 °C za stálého třepání. Bločky byly uchovávány v kryozkumavkách s TE pufrem (CDC 2004). Genomová DNA Salmonella Braenderup H9812 štěpená XbaI byla použita jako hmotnostní standard. Řezy bločků s genomovou DNA byly inkubovány 3 h v 1×restrikční směsi (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% BSA) enzymu XbaI (40 U/µl) při 37 °C. Poté byla restrikční směs odpipetována a bločky byly promyty ve 100 µl pufru 0,5×TBE (25 mM Tris-HCl; 25 mM kyselina boritá; 0,5 mM EDTA; pH=8,0). Dále byly řezy bločků pokladeny na hřeben a po mírném zaschnutí byly zality 1% agarózovým gelem temperovaným na 55 °C. Podmínky programu PFGE: počáteční pulzní 39

čas: 2,2 s, konečný pulzní čas: 54,2 s; poměr délek pulzních časů obou elektrických polí: 1,0; napětí: 200 V (6 V/cm); úhel: 120°; čas běhu: 24 h, chlazení: 14 °C. PFGE probíhala v 0,5× TBE (CDC 2004). Po ukončení programu PFGE byly agarózový gel barven v roztoku EtBr (1 mg/l) a odbarvován v chlazené dH2O. Poté byl pořízen snímek gelu pomocí fotodokumentačního systému. Makrorestrikční profily na snímku byly přeneseny do databáze BioNumerics (Applied Maths, Belgie). Izoláty byly hodnoceny pomocí metody shlukové analýzy UPGMA. Izoláty byly považovány za epidemiologicky příbuzné, pokud podobnost jejich makrorestrikčních profilů vykazovala Diceův koeficient ≥ 85 %. Izoláty náležející do skupiny epidemiologicky příbuzných izolátů byly označeny písmeny A–E.

3.3.7. Tvorba biofilmu

Izoláty Aeromonas spp. byly očkovány do zkumavek s 5 ml BHI (bujón „brain-heart infusion“, Oxoid, Velká Británie) a staticky kultivovány 24 h při 28 °C. Poté byly zkumavky centrifugovány (4 000 ot./10 min), supernatant odpipetován, pelety buněk byly resuspendovány ve 2 ml sterilního fyziologického roztoku (0,9% NaCl). Zákal homogenizovaných suspenzí byl upraven na 0,5 McFarlandovy stupnice (tj. ≈1–2∙108 CFU/ml). Do jamek mikrotitrační destičky bylo pipetováno 90 µl BHI bujónu, které byly posléze inokulovány 10 µl homogenizované bakteriální suspenze. Negativní kontrolu tvořil sterilní bujón. Všechny izoláty i negativní kontrola byly testovány ve třech opakováních. Mikrotitrační destičky překryté víčkem byly kultivovány 24 h při 28 °C. Po ukončení kultivace byl odpipetován bujón, jamky byly třikrát promyty 250 µl sterilního fyziologického roztoku. Adherované buňky byly 15 min fixovány 200 µl metanolu (Lachema, Česká republika) a po slití metanolu byla destička osušena. Adherované buňky v jamkách byly barveny 45 min 200 µl 0,1% roztoku krystalové violeti (Lachema, Česká republika), poté byly jamky pětkrát promyty 300 µl sterilní destilované vody. Po opětovném vysušení destičky bylo do jamek přidáno 150 µl 33% ledové kyseliny octové (Merck, Německo), čímž se krystalová violeť uvolnila do roztoku. K vyhodnocení tvorby biofilmu byla měřena optická hustota pomocí spektrofotometru (λ=492 nm) (Genevaux a kol. 1996). K hodnocení tvorby biofilmu byla využita hodnotící kritéria podle Stepanovic a kol. (2000). Na základě schopnosti adherence byly izoláty rozřazeny do čtyř kategorií: neadherující, slabě adherující, středně adherující, silně adherující.

40

3.3.8. Detekce skupin inkompatibilit plazmidů

Skupiny inkompatibility plazmidů (Inc) u izolátů Aeromonas spp. byly testovány pomocí PCR (Carattoli a kol. 2005; Cattoir a kol. 2008). Seznam použitých primerů, reakční podmínky, velikosti amplikonů a kontrolní kmeny jsou uvedeny v Tabulce 5.

Tabulka 5. Seznam použitých primerů, amplifikačních podmínek, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů využitých při testování skupin inkompatibilit plazmidů.

Inc A/C B/O FIA FIB FIC FIIA HI1 HI2 I1 K L/M N

P

primer

sekvence primeru (5'-3')

IncA/C-F

GAG AAC CAA AGA CAA AGA CCT GGA

IncA/C-R

ACG ACA AAC CTG RAT TGC YTC CTT

IncK-F

GCG GTC CGG AAA GYC AGA AAA C

IncB/O-R

TCT GCG TTC CGC CAA GTT CGA

IncFIA-F

CCA TGC TGG TTC TAG AGA AGG TG

IncFIA-R

GTA TAT CCT TAC TGG CTT CCG CAG

IncFIB-F

GGC TTT CTG GAA AAC GAA AAT TCA

IncFIB-R

CTC CCG TCG CTT CAG GGC ATT

IncFIC-F

GTG AAC TGG CAG ATG AGG AAG G

IncFIC-R

TTC TCC TCG TCG CCA AAC TAG AT

IncFII-F

CTG TCG TAA GCT GAT GGC

IncFII-R

CTC TGC CAY AAA CTT CAG C

IncHI1-F

GGA GCG ATG GAT TAC TTC AGT AC

IncHI1-R

TGC CGT TTC ACC TCG TGA GTA

IncHI2-F

GGC TCA CTA CCR TTG TCA YCC T

IncHI2-R

TTT CTC CTG AGT CAC CTG TTA ACA C

IncI1-F

CGA AAG CCG GAC GGC AGA A

IncI1-R

TCG TCK TTC CGC CAA GTT CGT

IncK-F

GCG GTC CGG AAA GYC AGA AAA C

IncK-R

CAC AAG CTG TCG CTT ATG G

IncL/M-F

GGA TGA AAA CTA TCA GCA TCT GAA G

IncL/M-R

GCT TTC AAG CCA GGA GAT G

IncN-F

GTC TAA CGA GCT TAC CGA AG

IncN-R

GTT TCA ACT CTG CCA AGT TC CTA TGG CCC TGC AAA CGC GCC AGA AA TCA CGC GCC AGG GCG CAG CC

IncP-F IncP-R

T U

W

IncT-F

TTG GCC TGT TTG TGC CTA AAC CAT

IncT-R

CGT TGA TTA CAC TTA GCT TTG GAC

IncU-F

CTG GCT GAA ATG CTG TTG CC

IncU-R

GCT TCA TAG GCT TCA CGC TC

IncW-F

CCT AAG AAC AAC AAA GCC CCC G

IncW-R

GGT GCG CGG CAT AGA ACC GT

Ta ( °C)

amplikon (bp)

kontrolní kmen

60

465

E. coli (IncA/C)

60

159

E. coli (IncB/O)

60

462

E. coli (IncFIA)

60

702

E. coli (IncFIB)

60

262

E. coli (IncFIC)

60

270

E. coli (IncFIIA)

60

471

E. coli (IncHI1)

60

644

E. coli (IncHI2)

60

139

E. coli (IncI1)

60

160

E. coli (IncK)

60

785

E. coli (IncL/M)

60

559

E. coli (IncN)

60

534

E. coli (IncP)

60

750

E. coli (IncT)

55

590

Aeromonas sp.CH10 (IncU)

60

242

E. coli (IncW)

reference

(Carattoli a kol. 2005)

(Cattoir a kol. 2008) (Carattoli a kol. 2005)

Vysvětlivky: Inc, skupina inkompatibility plazmidů. 41

Tabulka 5. Seznam použitých primerů, amplifikačních podmínek, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů využitých při testování skupin inkompatibilit plazmidů - pokračování.

Inc

primer IncX2-F

X2 IncX2-R IncY-F Y

IncY-R

sekvence primeru (5'-3') AAC CTT AGA GGC TAT TTA AGT TGC TGA T TGA GAG TCA ATT TTT ATC TCA TGT TTT AGC AAT TCA AAC AAC ACT GTG CAG CCT G GCG AGA ATG GAC GAT TAC AAA ACT TT

Ta ( °C)

amplikon (bp)

kontrolní kmen

60

376

E. coli (IncX2)

60

765

E. coli (IncY)

reference

(Carattoli a kol. 2005)

Vysvětlivky: Inc, skupina inkompatibility plazmidů.

3.4.Charakterizace plazmidů V následujících podkapitolách jsou zmíněny konkrétní metodiky konjugace, izolace plazmidů a transformace, stanovení velikosti a profilu plazmidů pomocí běžné a pulzní gelové elektroforézy, restrikční analýza plazmidů, Southernův přenos, příprava značených sond a hybridizace a analýza genetického pozadí genu qnrS2.

3.4.1. Konjugace

Horizontální přenos plazmidů byl testován konjugací na bakteriologických filtrech při 28 °C a 37 °C. Jako recipientní kmeny sloužily E. coli MT102 a A. sobria rezistentní k rifampicinu a azidu sodnému. Izoláty aeromonád, kontrolní kmen E. coli 11 (qnrS) a recipientní kmeny byly kultivovány 24 h za stálého třepání v 10 ml BHI bujónu s příslušnými antibiotiky a případně azidem sodným. Poté bylo přeneseno 100 µl inokula do 5 ml nového neselektivního BHI bujónu a kultivováno 3 h za kontinuálního třepání. Poté byly jednotlivé recipientní buňky a donorové buňky (tj. izoláty aeromonád nebo kontrolní kmen) smíchány v poměru 1:1. Bakteriální suspenze byly promíchány pipetováním a přeneseny na bakteriologický filtr (Millipore, USA) položený na plotně MPA. Po zaschnutí inokula byly plotny kultivovány přes noc. Poté byly filtry s nárůstem bakterií přeneseny do 5 ml sterilního fyziologického roztoku (0,9% NaCl) sterilní pinzetou a bakteriální kultury homogenizovány. Transkonjuganti byli selektováni na LBA s azidem sodným (100 mg/l; Penta, Česká republika), rifampicinem (25 mg/l; Sigma-Aldrich, Čína) a ciprofloxacinem (0,05 mg/l) a na chromogenním médiu („Brilliance™ E. coli/coliform Agar“, Oxoid, Velká Británie). Nárůst modré kultury na chromogenním médiu značil pozitivní růst pravděpodobného transkonjuganta E. coli MT102, růžový nárůst značil růst pravděpodobného 42

transkonjuganta A. sobria (Olesen a kol. 2004). DNA čtyř kolonií pravděpodobných transkonjugantů příslušných izolátů byla získána teplotní lyzí (Cattoir a kol. 2007). Úspěšný konjugativní přenos genů PMQR, genů rezistence k dalším skupinám antibiotik a integronů a zařazení přenesených plazmidů do skupiny inkompatibility bylo stanoveno pomocí PCR (Tabulka 4, Tabulka 5).

3.4.2. Izolace plazmidů a transformace

Plazmidy aeromonád byly izolovány pomocí alkalické extrakce. Bakteriální suspenze byly centrifugovány (12 000 ot./2 min/4 °C) a supernatant odpipetován. Pelety byly resuspendovány ve 100 µl roztoku lysozymu (25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 50 mM glukóza; pH 8,0; lysozym 4 mg/ml) a inkubovány 5 min při laboratorní teplotě. Ke směsi bylo přidáno 200 μl roztoku SDS (0,2 M NaOH, 1% SDS), směs byla promíchána převracením zkumavky a inkubována 5 min v ledové tříšti. Poté bylo přidáno 150 µl 3 M roztoku octanu sodného (pH=4,8), směs byla promíchána převracením a inkubována 10 min v ledové tříšti. Po centrifugaci (12 000 ot./10 min/4 °C) byl supernatant odpipetován do nové zkumavky a opět centrifugován (12 000 ot./5 min/4 °C). Supernatant byl odpipetován do nové zkumavky a bylo k němu přidáno 200 µl směsi fenol-chloroform-izoamylalkohol. Směs byla převracením promíchávána 3 min. Po centrifugaci (12 000 ot./3 min/4 °C) byla čirá vodná fáze obsahující plazmidovou DNA přenesena do nové zkumavky, do které bylo přidáno 700 µl 96% EtOH. Srážení plazmidové DNA probíhalo 24 h při -20 °C. Poté byla směs centrifugována (12 000 ot./10 min/4 °C) a supernatant dekantován. Do zkumavek bylo přidáno 500 µl 70% EtOH. Po opětovné centrifugaci (12 000 ot./5 min/4 °C) byl supernatant dekantován a do zkumavek bylo napipetováno 500 µl 96% EtOH. Po centrifugaci (12 000 ot./5 min/4 °C) byl supernatant opět dekantován, pelety byly sušeny 30 min při 37 °C. Pelety byly rozpuštěny v 15 µl TE pufru a RNAázy A (1 mg/ml). Zkumavky byly inkubovány 10 min při 37 °C (Birnboim a Doly, 1979). Plazmidová DNA byla uchovávána při -20 °C. Plazmidová DNA izolátů Aeromonas spp. byla použita pro transformaci chemicky kompetentních buněk E. coli DH5α. Dvacet mikrolitrů suspenze buněk E. coli DH5α s 1 µl plazmidové DNA příslušného izolátu Aeromonas spp. bylo inkubováno v ledové tříšti 1 h. Poté byly zkumavky inkubovány 45 s v suché lázni při 42 °C a poté 2 min v ledové tříšti. Po přidání 1 ml LBB do zkumavek byly bakterie kultivovány 1 h při 37 °C. Po centrifugaci zkumavek (5 000 ot./5 min) a dekantaci supernatantu byly pelety resuspendovány ve zbylém

43

objemu média, který nebyl dekantací odstraněn. Suspenze byly pipetovány na LBA s CIP (0,05 mg/l) a rozetřeny hokejkou po celém povrchu plotny. Plotny byly kultivovány 24 h při 37 °C (Dolejska a kol. 2011b). Ze čtyř kolonií pravděpodobných transformantů byla izolována DNA teplotní lyzí a přenos genů PMQR (Cattoir a kol. 2007), genů rezistence k dalším skupinám antibiotik a integronů, zařazení přenesených plazmidů do skupiny inkompatibility bylo stanoveno pomocí PCR (Tabulka 4, Tabulka 5). Jako pozitivní kontrola transformačních pokusů byl použit kmen E. coli 11 (qnrS).

3.4.3. Stanovení velikosti a profilu plazmidů pomocí běžné a pulzní gelové elektroforézy

Počet a přibližná velikost plazmidů (≤ 10 kb) byla stanovena běžnou elektroforézou plazmidové DNA po její izolaci pomocí komerční soupravy „Qiagen Plasmid Mini Kit“ (Qiagen). Elektroforéza plazmidové DNA probíhala v 0,8% agarózovém gelu v 0,5× TBE při 150 V/3 h za chlazení. Jako hmotnostní standardy byly použity "1 Kb DNA ladder" a DNA fága λ štepená HindIII. Počet a přibližná velikost plazmidů (≥ 10 kb) byla stanovena pomocí štěpení plazmidové DNA S1 nukleázou a následnou separací pomocí pulzní gelové elektroforézy (Barton a kol. 1995). Příprava bločků byla provedena identicky jako v podkapitole 3.3.6. Genomová DNA Salmonella Braenderup H9812 štěpená XbaI byla použita jako hmotnostní standard a byla zpracována identicky jako v podkapitole 3.3.6. Před restrikčním štěpením byly řezy bločků inkubovány 30 min ve 120 µl 1× reakčního pufru (50 mM octan sodný, 280 mM NaCl, 4,5 mM síranu zinečnatého) při laboratorní teplotě. Restrikční štěpení genomové DNA analyzovaných izolátů a transformantů v agarózových bločcích pomocí S1 nukleázy (10 U/µl) probíhalo 45 min při 37 °C. Po ukončení štěpení byly bločky dvakrát promyty 100 µl ledového TE pufru ve dvacetiminutových intervalech, v průběhu kterých byly bločky inkubovány při 8 °C (Barton a kol. 1995). Poté byly řezy bločků včetně bločků s hmotnostními standardy pokladeny na hřeben a po

mírném

zaschnutí

byly

zality

1%

agarózovým

gelem

temperovaným na 55 °C. Podmínky programu PFGE: počáteční pulzní

Obrázek 5. Hmotnostní standard - genomová DNA Salmonella Braenderup H9812 štěpená XbaI. Velikost fragmentů je uvedena v kb.

čas: 6,8 s, konečný pulzní čas: 38,4 s, poměr délek pulzních časů obou elektrických polí: 1,0; 44

napětí: 200 V (6 V/cm), optimální čas běhu: 13 h, chlazení: 14 °C. PFGE probíhala v 0,5× TBE. Po ukončení programu PFGE byl agarózový gel barven v roztoku EtBr (1 mg/l) a odbarvován v chlazené dH2O. Poté byl pořízen snímek gelu pomocí fotodokumentačního systému. Počet plazmidů u daných izolátů Aeromonas spp. a jejich transformantů odpovídal počtu fragmentů, tj. plazmidů linearizovaných S1 nukleázou, v jednotlivých bězích. Velikost plazmidů byla odečtena pomocí hmotnostního standardu genomové DNA Salmonella Braenderup H9812 štěpené XbaI (Obrázek 5).

3.4.4. Restrikční analýza plazmidů

Příbuznost plazmidů byla hodnocena pomocí restrikční analýzy plazmidové DNA (RFLP,

z angl.,

„restriction

fragment

lenght

polymorphism“).

Plazmidy

skupiny

inkompatibilty U (IncU) s geny PMQR byly štěpeny pomocí enzymu HincII (10 U/µl) v 10 µl 1× reakčního pufru (33 mM Tris-octan, pH 7,9; 10 mM octan hořečnatý; 66 mM octan draselný; 0,1 mg/ml BSA) 1 h při 37 °C. Malé netypovatelné plazmidy s geny PMQR byly štěpeny pomocí enzymu AluI (10 U/µl) v 10 µl 1× reakčního pufru (50 mM octan draselný, 20 mM Tris-octan, 10 mM octan hořečnatý, 1 mM DTT; pH 7,9) 1 h při 37 °C. Elektroforetická separace fragmentů plazmidové DNA probíhala v 1% agarózovém gelu v chlazeném 0,5× TBE 14 h při 67 V. Jako hmotnostní standardy byly použity "1 Kb DNA ladder" a DNA fága λ štepená HindIII. Pro odlišení restrikčních profilů bylo v případě IncU plazmidů použity písmena a-c, v případě malých netypovatelných plazmidů d-i.

3.4.5. Southernův přenos

Metoda Southernova přenosu byla využita k přenosu fragmentů plazmidové DNA štěpené HincII na pozitivně nabitou nylonovou membránu. Agarózové gely byly inkubovány v 200 ml denaturačního roztoku (0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl) 30 min za stálého třepání. Poté byly promývány 5 min v 200 ml dH2O za stálého třepání. Gely byly dvakrát promyty po 20 min v 200 ml neutralizačního roztoku (0,5 M Tris-HCl, pH=7,0; 1,5 M NaCl) za stálého třepání. Poté byly 5 min promývány v 200 ml dH2O za stálého třepání. Následně byly krátce promyty v 0,2×SSC za stálého třepání (Brown 2001). Aparatura pro přenos DNA na membránu byla tvořena vaničkou s 20×SSC (3 M NaCl; 300 mM citronan sodný; pH=5,3), přes kterou byl položen skleněný plát (Obrázek 6) Skleněný plát byl přemostěn dvěma dlouhými kusy Whatman® 3MM Chr papíru (GE 45

Healthcare, Čína), které byly ponořeny do vaničky s 20×SSC. Na dvou vrstvách Whatman® 3MM Chr papíru byl položen jeden kus Whatman® 3MM Chr papíru, jehož velikost odpovídala velikosti gelu. Na tento Whatman® 3MM Chr papír byl položen gel. Pod okraje gelu byly vloženy pruhy plastové folie pro zajištění vzlínání 20×SSC přes plochu gelu. Na gel byla pomocí pinzet položena nylonová membrána (Biodyne® B, Pall Corporation, USA) a dva kusy Whatman® 3MM Chr papíru o velikosti gelu. Případné vzduchové bubliny byly zahlazeny rolováním skleněné pipety. Na tuto aparaturu byl položen přibližně 20 cm vysoký sloupec přířezů buničité vaty, který byl překryt skleněným plátem a zatěžkán závažím. Přenos fragmentů DNA probíhal 16–18 h a v průběhu přenosu byly jedenkrát vyměněny vlhké přířezy buničité vaty za suché. Po ukončení přenosu byly membrány usušeny a skladovány při laboratorní teplotě (Brown 2001).

Obrázek 6. Schéma aparatury Southernova přenosu (Brown, 2001).

3.4.6. Příprava značených sond a hybridizace

Příprava

sond

značených

digoxigeninem,

DIG-11-dUTP,

byla

provedena

podle návodu výrobce soupravy „PCR DIG Probe Synthesis Kit“ (Roche). Pomocí PCR byly připraveny sondy qnrS2, aac(6')-Ib-cr a gen rep IncU. Amplifikační podmínky a použité primery jsou uvedeny v Tabulce 4 a Tabulce 5. DNA izolátu A. sobria CH10, získaného v této studii, byla použita jako templát pro syntézu sond značených digoxigeninem. Membrána byla inkubována v 20 ml prehybridizačního roztoku [5×SSC; 1% N-lauroylsarkosin, 0,2% SDS, 1×blokovací roztok (Roche), 75 µg/ml denaturovaná sonikovaná DNA spermatu lososa] 2 h při 68 °C. Před koncem prehybridizace membrány byla příslušná sonda denaturována 10 min při 100 °C v suché lázni a poté inkubována 46

v ledové tříšti. V lahvi s membránou bylo ponecháno 10 ml prehybridizačního roztoku a bylo přidáno 10 µl denaturované sondy. Hybridizace probíhala při 68 °C přes noc. Po ukončení hybridizace byl hybridizační roztok se sondou odpipetován a uchován při -20 °C pro další použití. Membrána byla čtyřikrát krátce promyta promývacím roztokem A (2×SSC; 0,1% SDS) temperovaném na 68 °C a poté byla dvakrát promyta stejným roztokem při 68 °C po 5 min. Dále byla membrána dvakrát promyta promývacím roztokem B (0,1×SSC; 0,1% SDS) temperovaném na 68 °C po 15 min při 68 °C. Detekce hybridizace byla provedena pomocí roztoků komerční soupravy „DIG Wash and Block Buffer Set“ (Roche). Membrána byla vytažena pomocí pinzet z lahve a byla promývána ve 100 ml 1×promývacího pufru (Roche) 5 min při laboratorní teplotě za stálého třepání. Dále byla membrána inkubována 30 min ve 100 ml 1×blokovacího roztoku (1×kyselina maleinová; 1×blokovací roztok; Roche) za stálého třepání při laboratorní teplotě. Poté byla membrána inkubována 30 min v 10 ml 1×blokovacího roztoku, který obsahoval protilátku k digoxigeninu konjugovanou s alkalickou fosfatázou, „anti-DIG-AP“ (0,75 U/µl), za stálého třepání při laboratorní teplotě. Následně byla membrána dvakrát po 15 min promyta ve 100 ml 1×promývacího pufru (Roche) za stálého třepání při laboratorní teplotě. Dále byla membrána inkubována 3 min v 20 ml 1×detekčního pufru (Roche) za stálého třepání při laboratorní teplotě. Po krátkém osušení membrány na Whatman® 3MM Chr papíru byla membrána přenesena pomocí pinzet do plastové folie a po jejím povrchu byl rozprostřen roztok 1×detekčního pufru s 1×CSPD. Folie s membránou byla inkubována 5 min při laboratorní teplotě a 15 min při 37 °C v temnu. Poté byla membrána pomocí pinzet přenesena do připravené folie v kazetě. Fotografický film (Amersham HyperfilmTM MP, GE Healthcare, Japonsko) byl exponován 1–5 min v temné komoře a vyvolán pomocí vývojky a ustalovače. Membrány byly uchovávány při 8 °C. Při opětovném použití membrány byla navázaná sonda denaturována a odstraněna. Membrána byla krátce promyta ve 150 ml dH2O, dvakrát po 5 min promyta v denaturačním roztoku (0,2 M NaOH; 0,1% SDS) a dále krátce promyta v 2×SSC. Membrána byla přemístěna pomocí pinzet do plastové folie v kazetě. V temné komoře byl fotografický film exponován 1–2 h a vyvolán pro ověření odstranění vazby sondy.

3.4.7. Analýza genetického pozadí genu qnrS2

Začlenění genu qnrS2 do genu domnělé zinkové metaloproteázy mpR bylo mapováno pomocí PCR za využití kombinace primerů qnrS-F a mpR-R, mpR-F a qnrS-R (Tabulka 4). 47

Sekvence plazmidu P2G1 Aeromonas sp. (GenBank HE616910) byla použita pro návrh primerů mpR-F, mpR-R. Amplikony byly přečištěny z PCR směsi (Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit, Geneaid, Taiwan), sekvenovány Sangerovou metodou (Macrogen, Nizozemí) a výsledky byly vyhodnoceny pomocí software MEGA 6.06 (http://www.megasoftware.net/), Geneious

7.1.2

(Biomatters

Ltd.,

Nový

Zéland)

a

on-line

nástroje

BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Pro vyhodnocení výsledků byla využita sekvence p37 A. punctata (GenBank EU439940).

3.5.Statistická analýza výsledků pomocí Chí-kvadrát testu Výsledky byly statisticky hodnoceny Chí-kvadrát testem pomocí MS Excel (MS Office). Rozdíly v získaných výsledcích byly hodnoceny jako statisticky významné, pokud výsledkem testu byla hodnota p ≤ 0,05.

48

4. Výsledky 4.1.Aeromonas spp. nesoucí geny PMQR Ze vzorků kůže, žaber a tělních kavit importovaných okrasných ryb a kaprů koi chovaných v České republice byly kultivací získány izoláty, které byly pomocí fenotypových metod identifikace zařazeny do skupin druhů rodu Aeromonas. U těchto izolátů byla stanovena minimální inhibiční koncentrace ciprofloxacinu k získání izolátů se sníženou citlivostí k fluorochinolonům (MIC ciprofloxacinu ≥ 0,05 mg/l), které by potenciálně mohly nést geny plazmidově kódované rezistence k chinolonům. Celkem třicet šest izolátů Aeromonas spp. (45 %, n=80) pocházejících z kaprů koi chovaných v České republice a sedmdesát šest izolátů (100 %, n=76) pocházejících z importovaných okrasných ryb mělo MIC ciprofloxacinu ≥ 0,05 mg/l. Rozdíl v četnosti izolátů s MIC ciprofloxacinu ≥ 0,05 mg/l pocházejících z České republiky a z importovaných ryb byl statisticky významný (p < 0,001). Izoláty Aeromonas spp. se sníženou citlivostí k fluorochinolonům byly pomocí PCR a Sangerova sekvenování testovány na přítomnost genů PMQR. Celkem 15 izolátů Aeromonas spp. (19 %, n=80) z kaprů koi a 18 (24 %, n=76) izolátů z importovaných okrasných ryb neslo alespoň jeden gen PMQR. U 21 izolátů Aeromonas spp. byl detekován gen qnrS2 samostatně, u 11 izolátů v kombinaci s genem aac(6‘)-Ib-cr a u jednoho izolátu byla kombinace genů qnrS2+aac(6‘)-Ib-cr detekována současně s genem qnrB17 (Tabulka 6, Tabulka 9). Rozdíl v četnosti izolátů s PMQR pocházejících z České republiky a z importovaných ryb nebyl statisticky významný (p > 0,05). Patnáct izolátů s PMQR pocházejících z České republiky bylo získáno na třech farmách (farma A-C) ze sedmi, na kterých byly odebrány vzorky kaprů koi. Osmnáct izolátů Aeromonas spp. s PMQR z importovaných

tropických

okrasných

ryb

pocházelo

převážně

z asijských

zemí

a ze Slovenské republiky. Konkrétně 11 izolátů pocházelo z Vietnamu, 4 z Thajska, 2 ze Slovenské republiky a 1 ze Singapuru. Druhy ryb, ze kterých byly tyto izoláty získány, jsou uvedeny v Tabulce 9. Izoláty s prokázanou přítomnosti genů PMQR náležely do skupin druhů: A. hydrophila (17 izolátů), A. sobria (15), Aeromonas sp. (1) (Tabulka 7). U posledního zmíněného izolátu Aeromonas sp. (CH36) nebylo možné na základě použitých metod identifikace izolát jednoznačně zařadit do skupiny druhů a pravděpodobně patřil buď do skupiny druhů A. hydrophila, nebo A. sobria.

49

Tabulka 6. Zastoupení genů PMQR u izolátů Aeromonas spp. pocházejících z kaprů koi a importovaných ryb.

Aeromonas spp. geny PMQR kapři koi (ČR) okrasné ryby (A+SR) qnrS2 10 (67 %) 11 (61 %) qnrS2+aac(6')-Ib-cr 5 (33 %) 6 (33 %) qnrS2+aac(6')-Ib-cr+qnrB17 0 1 (6 %) PMQR-pozitivní izoláty celkem 15 (100 %) 18 (100 %) Vysvětlivky: A+SR, Asie a Slovenská republika. Tabulka 7. Zastoupení PMQR genů u izolátů jednotlivých skupin druhů rodu Aeromonas z obou souborů.

geny PMQR qnrS2 qnrS2+aac(6')-Ib-cr qnrS2+aac(6')-Ib-cr+qnrB17 PMQR-pozitivní izoláty celkem

skupina druhů A. hydrophila A. sobria Aeromonas sp. 12 8 1 5 6 0 0 1 0 17 15 1

4.2.Epidemiologická příbuznost izolátů Aeromonas spp. Epidemiologická příbuznost izolátů byla stanovena pomocí štěpení XbaI a pulzní gelové elektroforézy. Pomocí metody shlukové analýzy UPGMA byly izoláty rozděleny na základě podobnosti jejich makrorestrikčních profilů do skupin A–E. Izoláty, jejichž makrorestikční profily měly Diceův koeficient ≥ 85 %, byly považovány za příbuzné (Obrázek 7). U dvaceti pěti izolátů se podařilo získat makrorestrikční profily, a proto byly tyto izoláty zaneseny do dendrogramu, který popisuje příbuznost mezi izoláty a skupinami izolátů. Genomová DNA osmi izolátů (7 izolátů A. sobria, 1 izolát A. hydrophila) byla v průběhu pulzní gelové elektroforézy degradována, a proto tyto izoláty do dendrogramu zaneseny nebyly. Příbuzné izoláty A. hydrophila a Aeromonas sp. byly získány z kaprů koi i importovaných okrasných ryb (skupina A). Ostatní izoláty z kaprů koi i okrasných ryb tvořily samostatné skupiny příbuzných izolátů (B-D). Izolát A. hydrophila 227 z kaprů koi měl unikátní makrorestriční profil a jako jediný byl zařazen do skupiny E. V rámci skupin A, B a D byly získány izoláty s identickým makrorestrikčním profilem a s odlišnou zemí původu, ve skupině A – č. CH26/a (Thajsko) a č. CH31 (Vietnam), ve skupině B – č. CH44, CH45 (Vietnam) a č. CH47 (Slovenská republika) a ve skupině D – č. CH11 (Vietnam) a č. CH12 (Thajsko). U souboru izolátů z kaprů koi nebyly detekovány izoláty s identickými makrorestrikčními profily z různých farem v České republice.

50

Obrázek 7. Dendrogram Aeromonas spp. s PMQR. Izoláty byly rozděleny do skupin (A–E) epidemiologicky příbuzných izolátů, pokud Diceův koeficient jejich makrorestrikčních profilů byl ≥ 85 %.

4.3.Minimální inhibiční koncentrace chinolonů u Aeromonas spp. Minimální inhibiční koncentrace chinolonů u izolátů Aeromonas spp. s PMQR byla stanovena agarovou diluční metodou. Hodnoty MIC ciprofloxacinu se pohybovaly v rozmezí 0,25– >128 mg/l. Izoláty z importovaných ryb měly MIC ciprofloxacinu vyšší (32– >128 mg/l) než izoláty z kaprů koi (0,25–8 mg/l). Podle metodiky CLSI (2006c) citované autory Aravena-Román a kol. (2012) hodnota MIC ciprofloxacinu ≥ 1 mg/l určuje hranici rezistence u Aeromonas spp. Čtrnáct izolátů Aeromonas spp. z kaprů koi (93 %, n=15) a 18 izolátů (100 %) z importovaných okrasných ryb mělo MIC ≥ 1 mg/l a mohou být tedy zařazeny mezi izoláty rezistentní (Obrázek 8, Tabulka 9). Rozmezí hodnot MIC dalších testovaných chinolonů (kyselina oxolinová, flumekvin, enrofloxacin) byla také u izolátů z importovaných okrasných ryb vyšší ve srovnání s rozmezím MIC izolátů z kaprů koi z českých chovů (Tabulka 8). Hraniční hodnoty MIC kyseliny oxolinové, flumekvinu a enrofloxacinu, které určují rezistenci k těmto chinolonům u Aeromonas spp., autorka této rigorózní práce neměla k dispozici. Rozmezí hodnot MIC kyseliny nalidixové se u izolátů z obou souborů přibližně překrývají (Tabulka 8, Obrázek 9). Podle metodiky CLSI (2006c) citované autory Aravena51

Román a kol. (2012) hodnota MIC kyseliny nalidixové ≥ 16 mg/l je hraniční hodnotou pro rezistenci ke kyselině nalidixové u Aeromonas spp. Podle tohoto hodnotícího kritéria byly všechny izoláty Aeromonas spp. z kaprů koi z českých chovů (100 %) i importovaných okrasných ryb (100 %) rezistentní ke kyselině nalidixové.

MIC ciprofloxacinu 14

počet izolátů

12 12

10 8 6

7

6

4 2

00

00

00

00

01

00

01

00

1

2

0

0

00

10

30

20

16

32

64

128 >128

0

0 0,015 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5

4

8

MIC (mg/l) Aeromonas spp. (okrasné ryby, A+SR), n=18

Aeromonas spp. (kapři koi, ČR), n=15

Obrázek 8. Rozložení hodnot MIC ciprofloxacinu u Aeromonas spp. z obou souborů. Vysvětlivky: A+SR, Asie a Slovenská republika, zeleně - MIC ciprofloxacinu ≥ 1 mg/l, hraniční koncentrace určující rezistenci k ciprofloxacinu u izolátů Aeromonas spp. [CLSI, (2006c) citovaná Aravena-Román a kol. (2012)].

MIC kyseliny nalidixové 10 počet izolátů

8 6 4 2 0 1

2

4

8

16

32

64

128

256

512

>512

MIC (mg/l) Aeromonas spp. (okrasné ryby, A+SR), n=18

Aeromonas spp. (kapři koi, ČR), n=15

Obrázek 9. Rozložení hodnot MIC kyselina nalidixové u Aeromonas spp. z obou souborů. Vysvětlivky: A+SR, Asie a Slovenská republika. zeleně - MIC kyseliny nalidixové ≥ 16 mg/l, hraniční koncentrace určující rezistenci ke kyselině nalidixové u izolátů Aeromonas spp. [CLSI (2006c) citovaná Aravena-Román a kol. (2012)].

52

Tabulka 8. Rozmezí MIC testovaných chinolonů u Aeromonas spp. z obou souborů.

Rozmezí MIC (mg/l) u Aeromonas spp. okrasné ryby (A+SR) kapři koi (ČR) kyselina nalidixová 256– >512 128–512 kyselina oxolinová 32– >128 4–64 flumekvin 64– >256 4–64 ciprofloxacin 32– >128 0,25–8 enrofloxacin 16– >64 1–16 Vysvětlivky: A+SR, Asie a Slovenská republika. chinolon

4.4.Detekce fenotypu rezistence k různým skupinám antibiotik u Aeromonas spp. Fenotypová rezistence k osmi antibiotikům byla u Aeromonas spp. s PMQR z obou souborů stanovena pomocí diskové difúzní metody a zařazení izolátů mezi rezistentní bylo provedeno na základě hraničních hodnot uvedených v metodikách CLSI (2011; 2013). Izoláty z importovaných okrasných ryb vykazovaly obecně vyšší zastoupení fenotypové rezistence ve srovnání se souborem izolátů z kaprů koi. Sedmnáct izolátů Aeromonas spp. (94 %, n=18) z importovaných okrasných ryb bylo multirezistentních [podle definice dle Magiorakos a kol. (2012) je multirezistence získaná necitlivost bakterií k alespoň jednomu antibiotiku ze třech a více různých skupin antibiotik]. U 10 izolátů (56 %, n=18) z importovaných okrasných ryb byla detekována fenotypová rezistence k chloramfenikolu, florfenikolu, oxytetracyklinu, sulfonamidům, potencovaným sulfonamidům a trimetoprimu. Pouze 4 izoláty (27 %, n=15) z kaprů koi byly multirezistentní a nejčastěji byla detekována fenotypová rezistence k oxytetracyklinu, sulfonamidům včetně potencovaných a trimetoprimu (Obrázek 10, Tabulka 9). Šest izolátů (40 %, n=15) z kaprů koi bylo citlivých ke všem testovaným antibiotikům (Tabulka 9). U izolátů z importovaných ryb byla detekována nejčastěji rezistence k oxytetracyklinu, sulfonamidům včetně potencovaných a trimetoprimu (17 izolátů), dále chloramfenikolu (15) a florfenikolu (13). U izolátů z kaprů koi byla detekována nejčastěji rezistence k oxytetracyklinu (8 izolátů). Žádný izolát z importovaných ryb nebo kaprů koi nebyl fenotypově rezistentní k nitrofurantoinu (Obrázek 11, Tabulka 9).

53

profil fenotypové rezistence

Profily fenotypové rezistence u izolátů Aeromonas spp. C,FFC,OT,S3,SXT,T OT,S3,SXT,T OT C,CN,OT,S3,SXT,T C,CN,FFC,OT,S3,SXT,T C,FFC,S3,SXT,T C,OT,S3,SXT,T OT,S3,SXT C,OT S3

10 2 3

2 1 2 2 1 1 1 1 1 0

2

4

6

8

10

12

Počet izolátů Aeromonas spp. (okrasné ryby, A+SR), n=18

Aeromonas spp. (kapři koi, ČR), n=15

Obrázek 10. Profily fenotypové rezistence u izolátů Aeromonas spp. z obou souborů k jednotlivým antibiotikům. Vysvětlivky: C, chloramfenikol; CN, gentamicin; FFC, florfenikol; F, nitrofurantoin; OT, oxytetracyklin; S3, sulfonamidy; SXT, sulfametoxazol/trimetoprim; T, trimetoprim; A+SR, Asie a Slovenská republika. Šest izolátů Aeromonas spp. z kaprů koi bylo citlivých ke všem testovaným antibiotikům.

počet izolátů

Zastoupení fenotypové rezistence u izolátů k jednotlivým antibiotikům 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

17

17

17

17

15 13

8 2 C

4

0

0

CN

FFC

4

0 0 F

OT

SXT

5 3 S3

T

antibiotika Aeromonas spp. (okrasné ryby, A+SR), n=18 Aeromonas spp. (kapři koi, ČR), n=15

Obrázek 11. Zastoupení fenotypové rezistence u izolátů Aeromonas spp. z obou souborů. Vysvětlivky: C, chloramfenikol, CN, gentamicin, FFC, florfenikol, OT, oxytetracyklin, S3, sulfonamidy, SXT, sulfametoxazol/trimetoprim, T, trimetoprim; A+SR, Asie a Slovenská republika. Šest izolátů Aeromonas spp. z kaprů koi bylo citlivých ke všem testovaným antibiotikům.

54

4.5.Detekce genů rezistence a integronů u Aeromonas spp. Geny rezistence, integrony a genové kazety byly testovány pomocí PCR. Izoláty Aeromonas spp. z importovaných okrasných ryb měly obecně variabilnější profily genů rezistence včetně struktur integronů třídy 1 než izoláty z kaprů koi. U všech izolátů z importovaných okrasných ryb byl detekován alespoň jeden gen rezistence. Gen rezistence k chloramfenikolu a florfenikolu floR byl detekován u 13 izolátů ze souboru importovaných okrasných ryb. U 17 izolátů byly zjištěny geny rezistence k tetracyklinům tet. Gen tet(B) byl nalezen nejčastěji, konkrétně u 12 izolátů samostatně a u 1 izolátu současně s genem tet(E). Gen tet(D) byl detekován u 3 izolátů a tet(E) samostatně u 1 izolátu. U všech 17 izolátů fenotypově rezistentních k sulfonamidům byly nalezeny geny sul. Dvanáct izolátů neslo gen sul1 samostatně a pět izolátů současně s genem sul2. Gen blaOXA-1 byl detekován u dvou izolátů (Obrázek 12, Tabulka 9). Osm z patnácti izolátů z kaprů koi neslo alespoň jeden gen rezistence. U dvou izolátů fenotypově rezistentních k chloramfenikolu nebyl zjištěn žádný z testovaných genů rezistence. Sedm izolátů neslo gen rezistence k tetracyklinům tet. Gen tet(E) byl detekován u 4 izolátů, tet(D) u dvou, tet(A) a tet(B) každý u jednoho izolátu. K sulfonamidům bylo fenotypově rezistentních 5 izolátů, z nichž 4 nesly gen sul1 (Obrázek 12, Tabulka 9). U šesti izolátů fenotypově citlivých ke všem testovaným antibiotikům nebyl zjištěn žádný gen rezistence.

Zastoupení genů rezistence u Aeromonas spp. 14

počet izolátů

12

13 12

10

12

8 6 4 2

5 4 0

0 1

1

3 2

1

4 1 0

0

2 0

0

geny rezistence Aeromonas spp. (okrasné ryby, A+SR), n=18

Aeromonas spp. (kapři koi, ČR), n=15

Obrázek 12. Zastoupení genů rezistence u Aeromonas spp. z obou souborů. Vysvětlivky: A+SR, Asie a Slovenská republika. U sedmi izolátů Aeromonas spp. z kaprů koi nebyl detekován žádný gen rezistence.

55

U izolátů Aeromonas spp. z obou souborů byly detekovány pouze integrony třídy 1. U 16 izolátů (89 %, n=18) z importovaných okrasných ryb a u 4 izolátů (27 %, n=15) byl detekován alespoň jeden integron třídy 1. Nejčastěji byl detekován integron třídy 1 obsahující genové kazety dfrA12-aadA2. V souboru Aeromonas spp. z kaprů koi byl tento integron detekován u 2 izolátů. U 9 izolátů z importovaných okrasných ryb byl tento integron přítomen samostatně a u 5 izolátů z tohoto souboru se vyskytoval současně s dalšími integrony třídy 1, nejčastěji s arr-3-aacA4-dfrA1-orf (Obrázek 13). U integronů dfrA12-aadA2 detekovaných u obou dvou izolátů z kaprů koi a u pěti izolátů z importovaných okrasných ryb bylo možné pomocí použitých metod stanovit velikost integronu (2 kb). U devíti izolátů z importovaných tropických ryb se celou strukturu integronu s kazetami dfrA12 a aadA2 nepodařilo amplifikovat pomocí primerů nasedajících do konzervativních oblastí 5‘-CS a 3‘-CS. Přítomnost těchto kazet ve struktuře integronu byla prokázána dílčími PCR, ve kterých byly kombinovány primery nasedající do konzervativní oblasti integronu 5‘-CS a sekvencí příslušných genových kazet. Výsledky PCR zahrnující primery nasedající do konzervativních oblastí integronu 3‘-CS a sekvencí příslušných genových kazet byly negativní (Tabulka 9).

Zastoupení integronů třídy 1 u Aeromonas spp. bez integronu

2

11

struktura integronu

dfrA12-aadA2

9

arr-3-aacA4-dfrA1-orf; dfrA12-aadA2

2

3

arr-3-dfrA27; dfrA12-aadA2

1

dfrA22; dfrA12-aadA2

1

arr3-aacA4-dfrA1-orf

1

dfrB1-aadA1

1

orf-aadA1

1

qacD2-orf

1 0

2

4

6

8

10

12

14

počet izolátů Aeromonas spp. (okrasné ryby, A+SR), n=18

Aeromonas spp. (kapři koi, ČR), n=15

Obrázek 13. Struktury integronů třídy 1 u Aeromonas spp. z obou souborů. Vysvětlivky: A+SR, Asie a Slovenská republika. Zeleně jsou vyznačeny kombinace 2 odlišných struktur integronů třídy 1, které byly detekovány u jednoho izolátu.

56

4.6.Tvorba biofilmu Ke kvantitativnímu hodnocení schopnosti tvorby biofilmu u izolátů Aeromonas spp. byl využit modifikovaným postup Christensenovy zkumavkové metody - kultivace izolátů v mikrotitrační destičce, obarvení adherovaných buněk krystalovou violetí, uvolnění barviva do roztoku a měření optických hustot. Podle kritérií vytvořených autory Stepanovic a kol. (2000) mohou být izoláty rozděleny do čtyř kategorií na základě schopnosti adherovat: neadherující, slabě adherující, středně adherující, silně adherující. Izoláty Aeromonas spp. byly na základě měření optických hustot zařazeny do kategorií slabě a středně adherujících. Sedm izolátů (39 %, n=18) z importovaných okrasných ryb a 9 izolátů (60 %, n=15) bylo zařazeno do kategorie slabě adherujících. Jedenáct izolátů (61 %, n=18) z importovaných okrasných ryb a 6 izolátů (40 %, n=15) z kaprů koi bylo zařazeno do kategorie středně adherujících.

4.7.Horizontální přenos plazmidů Konjugativní přenos plazmidů s geny PMQR z obou souborů Aeromonas spp. do recipientních kmenů E. coli a A. sobria byl neúspěšný při 28 °C i 37 °C. Horizontální přenos plazmidů s geny PMQR transformací do chemicky kompetentních buněk E. coli DH5α byl úspěšný u 11 izolátů Aeromonas spp. (61 %, n=18) z importovaných ryb a všech 15 izolátů Aeromonas spp. (100 %, n=15) z kaprů koi. Celkem bylo získáno 26 transformantů příslušných izolátů Aeromonas spp. (Tabulka 9). U těchto transformantů byl zjištěn počet a přibližná velikost plazmidů pomocí štěpení S1-nukleázou a PFGE a izolací plazmidů a běžnou elektroforézou plazmidové DNA (Obrázek 14). K charakterizaci plazmidů byli dále využiti pouze transformanti s jedním plazmidem. Celkem bylo získáno 17 transformantů s jedním plazmidem, konkrétně 10 transformantů z importovaných okrasných ryb a 7 transformantů z kaprů koi (Tabulka 10).

Obrázek 14. Běžná elektroforéza plazmidové DNA z transformantů příslušných izolátů Aeromonas spp. z obou souborů. 3, CH10-TF 1; 4, CH11-TF 3; 5, CH12-TF 1; 8, CH21TF 1; 9, CH26/a TF 1; 10, CH31 TF-1; 1, 6, 11, hmotnostní standard „1 Kb DNA ladder“; 2, 7, hmotnostní standard DNA fága λ štěpená HindIII.

57

4.8.Charakteristika plazmidů s PMQR u Aeromonas spp. Plazmidy mohou být tříděny podle skupiny inkompatibility. Skupina inkompatibility u plazmidů všech 17 transformantů byla testována pomocí PCR. U deseti transformantů byly zjištěny plazmidy skupiny inkompatibity U (IncU), u zbylých sedmi se skupina inkompatibility pomocí použitých metod nepodařila zjistit (Tabulka 10). Velikost IncU plazmidů se pohybovala od ≈20–40 kb. Celkem 8 IncU plazmidů o přibližné velikosti 20 kb bylo na základě výsledků použitých metod identických. Tyto IncU plazmidy měly shodný profil genů PMQR (qnrS2, aac(6‘)-Ib-cr), shodný restrikční profil a sondy pro geny qnrS2, aac(6‘)-Ib-cr i rep IncU se vázaly na identické fragmenty restrikčního identické

profilu

(Obrázek

IncU

z nepříbuzných

15).

plazmidy

izolátů

Tyto

pocházely

Aeromonas

spp.

z obou testovaných souborů. Konkrétně čtyři z těchto

plazmidů

z A. hydrophila

byly

z kaprů

izolovány

koi

chovaných

na farmě A v České republice. Čtyři z těchto plazmidů

byly

z tropických

získány

okrasných

z A.

ryb,

sobria

dovezených

z Vietnamu nebo Thajska. Dva IncU plazmidy měly velikost větší (35 a 40 kb), restrikční profil odlišný od IncU plazmidů o přibližné velikosti

20

kb

i

od

sebe

navzájem

a z testovaných genů PMQR nesly pouze qnrS2. IncU plazmid (35 kb) pocházel z A. sobria (CH21) z tropické okrasné ryby z Thajska. Na tomto plazmidu se vyskytoval gen rezistence k sulfonamidům a integron tř. 1 (0,75 kb: dfrA22). IncU plazmid (40 kb) pocházel z A. hydrophila (227) z kaprů koi chovaných na farmě A (Tabulka 10). Velikost sedmi plazmidů, u kterých se nepodařilo zjistit skupinu inkompatibility,

Obrázek 15. Restrikční profily IncU plazmidů (štěpení HincII). 2, N42-TF 1; 3, CH10-TF 1; 4, CH11-TF 3; 5, CH12TF 1; 7, 6-TF1; 8, 7-TF1; 9, CH21/1-TF1; 10, 227-TF 1; 12, 4-TF 2; 10-TF1; 1, 6, 11, hmotnostní standard „1 Kb DNA ladder“. Vazba hybridizační sondy značené DIG-11-dUTP je naznačena šipkou a přislušným písmenem označujícím konkrétní sondu: a, vazba hybridizační sondy qnrS2; b, vazba hybridizační sondy aac(6‘)-Ib-cr; c, vazba hybridizační sondy rep IncU. Gen domnělého iniciačního proteinu replikace rep IncU v sekvenci obsahuje cílové místo pro HincII, a proto se sonda pro tento gen váže na dva fragmenty restrikčního profilu. Plazmidy 2-5, 7-8, 1213 mají identický restrikční profil (a). Plazmidy 9, 10 mají unikátní restrikční profil (b,c).

58

byla menší než 20 kb. U všech sedmi byl zjištěn pouze gen qnrS2 z testovaných PMQR. Pět těchto netypovatelných plazmidů bylo získáno z příbuzných izolátů Aeromonas spp. pocházejících z okrasných tropických ryb z Vietnamu (4 izoláty) nebo Thajska (1). Dva tyto malé netypovatelné plazmidy pocházely z A. sobria z kaprů koi chovaných na farmách A a C v České republice. Tyto malé netypovatelné plazmidy měly unikátní restrikční profily s výjimkou dvou plazmidů (z izolátů č. CH36 a CH26/a), které pocházely z příbuzných izolátů Aeromonas spp. z Vietnamu a Thajska (Tabulka 10).

4.9.Genetické pozadí genu qnrS2 U transformantů s IncU plazmidy bylo mapováno genetického pozadí genu qnrS2 pomocí PCR a sekvenování. Na IncU plazmidech izolátů č. CH21 a 227 byla mobilní inzerční kazeta s qnrS2 vložena do genu domnělé zinkové metaloproteázy mpR a získané sekvence vykazovaly 100% shodu se sekvencemi této oblasti IncU plazmidů p37 A. punctata (GenBank EU439940) a p42 A. media (GenBank EU439941). U ostatních 8 transformantů s IncU plazmidy se podařilo amplifikovat pouze oblast 3‘ konce této struktury (např. č. CH10), která byla 100% shodná se sekvencemi p37 a p42. Oblast 5‘ konce se u těchto IncU plazmidů nepodařilo amplifikovat pomocí zvolených primerů (Obrázek 16).

Identita

Obrázek 16. Srovnání sekvencí genetického pozadí genu qnrS2 u IncU plazmidů izolátů č. CH10 (A. sobria), č. 227 (A. hydrophila) a referenční sekvence. Vysvětlivky: p37, p37 A. punctata (GenBank EU439940) izolovaná ve Francii (černá linie p37 zobrazuje sekvenci struktury vytvořené inzercí mic s qnrS2 do mpR, 2 107 bp); CH10, IncU plazmid izolátu č. CH10 získaný v této studii (černá linie CH10 zobrazuje 3’konec struktury vytvořené inzercí mic s qnrS2 do mpR, 1 108 bp); 227, IncU plazmid izolátu č. 227 získaný v této studii (černá linie 227 zobrazuje sekvenci struktury vytvořené inzercí mic s qnrS2 do mpR, 1 739 bp). Identita sekvencí - 100 %, vyznačena zeleně. Otevřené čtecí rámce zobrazené jako šipky; DR (CCTCC) (modře), sekvence přímé repetice; IRL, IRR (červeně), nedokonalé obrácené repetice (22 bp) mobilní inzerční kazety; qnrS2 CDS, sekvence DNA kódující qnrS2; mpR, gen domnělé zinkové metaloproteázy.

59

IMPORTOVANÉ!OKRASNÉ!RYBY

KAP•I KOI

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. sobria

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

CH36

CH38

CH39

CH40

CH44

CH45

CH47

CH48

CH59

4

6

7

60

Aeromonas sp.

A. sobria

CH20

A. hydrophila

A. sobria

CH13

CH31

A. sobria

CH12

A. sobria

A. sobria

CH11

A. hydrophila

A. sobria

CH10

CH21

A. sobria

N42

CH26/a

skupina druh•a

izolát

Cyprinus carpio koi

Cyprinus carpio koi

Cyprinus carpio koi

Botia striata

Poecilia velifera gold leopard Xiphophorus maculatus Xiphophorus maculatus

Poecilia sphenops

Xiphophorus maculatus Pterygoplichthys gibbiceps Xiphophorus maculatus Xiphophorus maculatus Xiphophorus maculatus

Colisa lalia

Labeo bicolor

Xiphophorus maculatus Xiphophorus maculatus Kryptopterus bicirrhis Kryptopterus bicirrhis Xiphophorus maculatus

Poecilia sphenops

zdroj

A (2005) A (2005) A (2005)

Singapur

SR

SR

Vietnam

Vietnam

Vietnam

Vietnam

Vietnam

Vietnam

Vietnam

Thajsko

Thajsko

Vietnam

Thajsko

Thajsko

Vietnam

Vietnam

Vietnam

p•vodb

A4

A4

A5

NT

D3

B1

B1

B1

B2

A3

A3

A2

A1

A1

NT

NT

NT

D1

D1

D2

NT

PFGEc

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

128

128

128

256

256

>512

>512

>512

>512

512

512

>512

512

512

512

256

qnrS2

256

qnrS2, aac(6')-Ib-cr, qnrB17

512

512

512

512

NA

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

PMQR geny

16

16

16

64

32

>128

>128

>128

>128

128

>128

>128

32

32

32

32

32

128

128

64

64

OA

32

64

32

128

64

256

256

256

256

256

256

>256

128

128

128

128

128

128

128

128

128

UB

4

4

4

64

16

>64

>64

>64

>64

>64

>64

>64

32

32

32

64

64

>64

>64

>64

64

ENR

MIC (mg/l)d

Tabulka 9. Izoláty Aeromonas spp. s PMQR z importovaných okrasných ryb a kapr• koi z "eských chov•.

8

8

8

>128

32

>128

>128

>128

>128

>128

>128

>128

64

64

64

128

128

>128

>128

>128

>128

CIP

-

-

-

C,FFC,OT,S3,SXT,T

OT,S3,SXT,T

OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

OT

C,FFC,S3,SXT,T

C,CN,FFC,OT,S3,SXT,T

C,CN,FFC,OT,S3,SXT,T

C,CN,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,FFC,OT,S3,SXT,T

C,CN,OT,S3,SXT,T

fenotyp

e

-

-

-

sul1, tet(B), tet(E), floR sul1, sul2, tet(B), floR sul1, tet(B), blaOXA-1

sul1, tet(B), floR

sul1, tet(B), floR

sul1, tet(B), floR

sul1

tet(E)

sul1, tet(D), floR

sul1, tet(D), floR

sul1, tet(D), floR

sul1, tet(B)

sul1, sul2,tet(B), floR sul1, sul2,tet(B), floR sul1, sul2, tet(B),floR sul1,tet(B), floR,blaOXA-1 sul1, sul2, tet(B), floR

sul1, tet(B)

geny

rezistence!k!dalším!skupinám!antibiotik

-

-

-

-

2

-; 1.3

2; 2.4

2; 2.4

2; 2.4

-

-

2.4

2

2

0.75; -

-

-

-

-

-

-

velikost (kb)f

-

-

-

dfrA12-aadA2

orf-aadA1

dfrA12-aadA2; arr-3aacA4-dfrA1-orf dfrA12-aadA2; arr-3aacA4-dfrA1-orf dfrA12-aadA2; arr-3aacA4-dfrA1-orf dfrA12-aadA2; arr-3dfrA27

-

-

arr-3-aacA4-dfrA1-orf

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA22; dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

genové!kazety

integron!t"ídy!1

+

+

+

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

TFg

A. sobria

A. sobria

A. hydrophila

A. hydrophila

233

236

240

250

Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi Cyprinus carpio koi

zdroj

B (2006)

B (2006)

A (2006)

A (2006)

A (2006)

A (2006)

A (2006)

A (2006)

A (2006)

A (2006)

C (2005)

A (2005)

p•vodb

A6

C5

C4

C1

C1

C2

C3

E

NT

NT

NT

A5

PFGEc

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2, aac(6')-Ib-cr

PMQR geny

256

512

512

512

512

128

512

512

256

128

128

128

NA

16

8

64

16

16

8

8

16

8

8

4

16

OA

32

32

32

64

64

32

32

64

32

32

4

32

UB

1

4

16

16

16

2

4

16

16

4

1

4

ENR

MIC (mg/l)d

1

4

8

4

4

4

4

8

8

4

0.25

4

CIP

-

OT

C,OT, S3,SXT,T

OT, S3,SXT,T

OT, S3,SXT,T

OT, S3,SXT

OT

C,OT

-

S3

OT

-

fenotyp

e

-

-

sul1, tet(E)

sul1, tet(D)

sul1, tet(D)

tet(E)

tet(E)

tet(E)

-

sul1, tet(A)

tet(B)

-

geny

rezistence k dalším skupinám antibiotik

-

-

1.6

2

2

-

-

-

-

1

-

-

velikost (kb)f

-

-

dfrB1-aadA1

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

-

-

-

-

qacD2-orf

-

-

genové kazety

integrony t!ídy 1

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

TFg

61

b

Izoláty byly za•azeny do skupiny druh• pomocí fenotypových metod identifikace (!ížek a kol. 2010). Izolát ". CH36 se nepoda•ilo za•adit do konkrétní skupiny druh•. P•vod vzork•. U p•íslušných izolát• z importovaných okrasných ryb je uvedena zem# p•vodu; SR, Slovenská republika. U p•íslušných izolát• z kapr• koi jsou uvedeny farmy (A–C), na kterých byli kap•i chováni, a v závorce je uveden rok odb#ru vzork•. c P•íbuznost izolát• byla stanovena pomocí XbaI-PFGE. Izoláty byly za•azeny do p•íslušné skupiny p•íbuzných izolát• (A–E), pokud Dice•v koeficient podobnosti jejich makrorestrik"ních profil• byl $ 85 %. NT, izolát netypovatelný metodou PFGE. Unikátní makrorestrik"ní profily v rámci jednotlivých skupin jsou ozna"eny indexem (A1, A2, atd.). d MIC, minimální inhibi"ní koncentrace. NA, kyselina nalidixová; OA, kyselina oxolinová; UB, flumekvin; ENR, enrofloxacin; CIP, ciprofloxacin. e Fenotypová rezistence k dalším skupinám antibiotik. C, chloramfenikol; CN, gentamicin, FFC, florfenikol, OT, oxytetracyklin, S3 sulfonamidy; SXT, sulfametoxazol/ trimetoprim; T, trimetoprim. f Velikost integronu byla stanovena pomocí amplifikace s využitím primer•, které jsou komplementární k sekvencím konzervativních oblastí 5‘-CS a 3‘-CS integron• t•ídy 1. U n#kterých izolát• byly tyto reakce negativní, a proto byla struktura integronu mapována pomocí díl"ích reakcí za využití primer• komplementárních se sekvencemi 5‘-CS a p•íslušných genových kazet. -, amplifikace za využití primer• 5‘-CS a 3’-CS byla negativní a velikost integronu nebylo možné stanovit. g Transformace chemicky kompetentních E. coli DH5•. +, úsp#šný p•enos plazmidu s PMQR; -, neúsp#šný p•enos plazmidu s PMQR.

a

A. sobria

A. hydrophila

227

232

A. hydrophila

225

A. sobria

A. sobria

224

231

A. sobria

93

A. sobria

A. hydrophila

10

228

skupina druh•a

izolát

Tabulka 9. Izoláty Aeromonas spp. s PMQR z importovaných okrasných ryb a kapr• koi z "eských chov• - pokra"ování.

KAP•I KOI

Poecilia sphenops (Vietnam)

A. sobria

A. sobria

A. sobria

A. sobria

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

N42

CH10

CH11

CH12

4

6

7

10

A. hydrophila

Aeromonas sp.

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. sobria

227

CH31

CH36

CH26/a

CH38

CH39

93

Labeo bicolor (Thajsko)

Cyprinus carpio koi (farma C)

Xiphophorus maculatus (Vietnam)

Xiphophorus maculatus (Vietnam)

Colisa lalia (Thajsko)

Pterygoplichthys gibbiceps (Vietnam)

Xiphophorus maculatus (Vietnam)

Cyprinus carpio koi (farma A)

NT

A3

A3

A1

A2

A1

E

NT

A5

A4

A4

A5

D1

D1

D2

NT

PFGEc

NT (<20 kb): qnrS2

NT (<20 kb): qnrS2

NT (<20 kb): qnrS2

NT (<20 kb): qnrS2

NT (<20 kb): qnrS2

NT (<20 kb): qnrS2

IncU (40 kb): qnrS2

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr IncU (35 kb): qnrS2, sul1, integron t•. 1 (0,75 kb): dfrA22

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr

IncU (•20 kb): qnrS2, aac(6')-Ib-cr

lokalizace!gen•!PMQR!a!gen•!rezistence!k!dalším!antibiotik•md

h

g

f

e

e

d

c

b

a

a

a

a

a

a

a

a

RFLPe

62

a

224 A. sobria Cyprinus carpio koi (farma A) NT NT (<20 kb): qnrS2 i Izoláty byly za•azeny do skupiny druh! na základ" fenotypových metod identifikace (#ížek a kol. 2010). Izolát $. CH36 se na základ" použitých metod identifikace nepoda•ilo za•adit do konkrétní skupiny druh!. b Zdroj a p!vod vzork!, u p•íslušných izolát! z importovaných okrasných ryb je uveden druh okrasné ryby, ze které byl izolát získán a v závorce je uvedena zem" p!vodu. Izoláty z druhého souboru pocházely z Cyprinus carpio koi a v závorce jsou uvedeny farmy (A, C), na kterých byli kap•i koi chováni. c P•íbuznost izolát! byla stanovena pomocí XbaI-PFGE. Izoláty byly za•azeny do p•íslušné skupiny p•íbuzných izolát! (A–E), pokud Dice!v koeficient podobnosti jejich makrorestrik$ních profil! byl % 85 &. NT, izolát netypovatelný metodou PFGE. Unikátní makrorestrik$ní profily v rámci jednotlivých skupin p•íbuzných izolát! jsou ozna$eny indexem (A1, A2, atd.). d Lokalizace gen! rezistence k chinolon!m a dalším antibiotik!m na p•íslušné plazmidy. IncU, plazmidy skupiny inkompatibility U; NT, netypovatelné plazmidy. V závorce je uvedena velikost plazmid! (kb). Integron t•. 1, charakteristika integronu t•ídy 1 zahrnovala stanovení velikosti (kb) a obsahu genových kazet. e RFLP, z angl., „restriction framgment lenght polymorphism“. Restrik$ní profily IncU plazmid! byly stanoveny št"pením HincII, netypovatelných plazmid! byly stanoveny št"pením AluI. Restrik$ní profily jsou u IncU plazmid! ozna$eny a–c, u netypovatelných plazmid! d–i.

A. sobria

A. hydrophila

CH21

Cyprinus carpio koi (farma A)

Cyprinus carpio koi (farma A)

Cyprinus carpio koi (farma A)

Cyprinus carpio koi (farma A)

Kryptopterus bicirrhis (Thajsko)

Xiphophorus maculatus(Vietnam)

Xiphophorus maculatus(Vietnam)

zdroj!(p•vod)b

izolát

skupina druh•a

Tabulka 10. Plazmidy s geny PMQR z izolát• Aeromonas spp. z obou soubor•.

5. Diskuze 5.1.Importované okrasné ryby jakožto vektory rezistentních bakterií Okrasné ryby představují velmi výnosné artikly mezinárodního obchodu s rybami. Okrasné ryby jsou do států Evropy, Spojených států amerických a dalších rozvinutých zemí dováženy především z jihovýchodní Asie (Verner-Jeffreys a kol. 2009; Lucas a Southgate 2012; Rose a kol. 2013). Jedním z hlavních problémů chovů ryb je vznik a rozšíření bakteriálních a parazitárních onemocnění. Prevence a léčba těchto onemocnění je v chovech ryb spojena s častým používáním různých dezinfekčních látek a léčiv obzvláště v případech, při kterých nejsou v chovech udržovány dobré hygienické podmínky (Weir a kol. 2012). Antibiotická praxe v chovech okrasných ryb v Asii je do značné míry nezmapovaná a je odhadováno, že spotřeba antibiotik v těchto chovech je značná (Alday a kol. 2006; Weir a kol. 2012). Navíc do vody, ve které jsou ryby přepravovány, jsou rutinně přidávána antibiotika, aby ryby snadněji překonaly stres z přepravy a aby u nich byl potlačen vznik infekčních onemocnění (Weir a kol. 2012). Mikrobiální flóra okrasných ryb i vodního prostředí tedy může být vystavena téměř kontinuálnímu selekčnímu tlaku antibiotik. V těchto podmínkách dochází k přežívání rezistentních mikroorganismů, a proto okrasné ryby mohou představovat významné vektory rezistentních bakterií. Rozšíření bakterií rezistentních k antibiotikům nebo mobilních genetických

elementů

s geny

rezistence

k antibiotikům

a

dezinfekčním

látkám

do autochtonních mikroorganismů v životním prostředí může představovat riziko pro zdraví člověka i zvířat po celém světě.

5.2.Používání antibiotik a rozvoj rezistence k antibiotikům u Aeromonas spp. Navzdory faktu, že aeromonády patří mezi autochtonní mikroorganismy vodního prostředí a mohou tedy představovat indikátory zatížení vodního prostředí antibiotiky (Naviner a kol. 2011), tyto bakterie nepatří mezi často studované mikroorganismy. Vzhledem k velkému významu chinolonů pro léčbu infekcí vyvolaných Gramnegativními bakteriemi je zachování jejich účinnosti jednou ze zásadních záležitostí současného lékařství. V této studii byl fenotyp snížené citlivosti k fluorochinolonům (MIC ciprofloxacinu ≥ 0,05 mg/l) zjištěn u 36 izolátů Aeromonas spp. (45 %, n=80) pocházejících z kaprů koi z českých chovů a 76 izolátů (100 %, n=76) pocházejících z okrasných ryb dovezených převážně z asijských zemí. 63

Rozdíl v četnosti izolátů se sníženou citlivostí k fluorochinolonům mezi oběma soubory aeromonád byl v této studii statisticky významný, z čehož lze usuzovat, že aeromonády izolované z těl dovezených okrasných ryb byly s nejvyšší pravděpodobností vystaveny většímu selekčnímu tlaku antibiotik, který vznikl v důsledku jejich častějšího používání (Gillings 2013). Naviner a kol. (2011) sledovali vliv podávání flumekvinu v chovu pstruha duhového (Onchorhyncus mykiss) na rozvoj rezistence k chinolonům u aeromonád. Podávání flumekvinu rybám bylo spojeno s přechodným nárůstem v zastoupení izolátů Aeromonas spp. rezistentních k chinolonům, přičemž 15 dní po ukončení podávání flumekvinu rybám byly rezistentní aeromonády detekovány především na kůži ryb a v biofilmu rybníku. Většina těchto izolátů Aeromonas spp. byla multirezistentní a některé z těchto multirezistentních izolátů vykazovaly schopnost dlouhodobé perzistence v prostředí tohoto chovného rybníku. Snížená citlivost bakterií k chinolonům, případně rezistence bakterií k chinolonům, může být spojena se změnami ve strukturách buněčné stěny a cytoplasmatické membrány, které zajišťují příjem a odčerpávání antibiotik, v důsledku mutací v chromozomálně kódovaných genech. Tyto mechanismy snížené citlivosti nebo rezistence bakterií k antibiotikům obvykle nejsou specifické k dané skupině antibiotik a uplatňují se při obraně proti různým skupinám antibiotik (Delcour 2009). U 21 izolátů Aeromonas spp. (26 %, n=80) z kaprů koi z českých chovů a 58 izolátů (76 %, n=76) z importovaných okrasných ryb byla zjištěna snížená citlivost k fluorochinolonům, ale nebyl u nich prokázán žádný gen plazmidově kódované rezistence k chinolonům. Z tohoto důvodu je možné u těchto izolátů předpokládat přítomnost nespecifických mechanismů rezistence zahrnutých v příjmu antibiotik a jejich aktivního odčerpávání.

5.3.Aeromonas spp. z okrasných ryb jakožto vektor genů rezistence k chinolonům Snížená citlivost bakterií k fluorochinolonům může být spojena s expresí genů plazmidově kódované rezistence k chinolonům. V této studii byla plazmidově kódovaná rezistence k chinolonům prokázána u 15 izolátů (19 %, n=80) Aeromonas spp. z kaprů koi z českých chovů a 18 izolátů (24 %, n=76) z dovezených okrasných ryb. U téměř dvou třetin z celkového počtu izolátů s PMQR z obou souborů byl detekován gen qnrS2 samostatně a přibližně

u

jedné

třetiny

izolátů

v kombinaci

s genem

aac(6‘)-Ib-cr

nebo

aac(6‘)-Ib-cr+qnrB17. Verner-Jeffreys a kol. (2009) také prokázali qnrS2 jakožto dominantně zastoupenou alelu genu PMQR u Aeromonas spp. z okrasných ryb a jejich přepravní vody, 64

které pocházely z především ze Singapuru, Guyany, Kolumbie a také Velké Británie. Gen qnrS2 byl také detekován u 4 klinických izolátů Aeromonas spp. (18 %, n=22) získaných z nemocných okrasných ryb v Koreji (Han a kol. 2012d). Gen qnrS2 je obvykle nalézán v souvislosti s vodním prostředím a vodními živočichy u Aeromonas spp., nicméně byl detekován i u izolátů některých druhů čeledi Enterobacteriaceae (např. E. coli, K. pneumoniae, Salmonella enterica), Pseudomonadaceae (Pseudomonas sp.), Pseudoalteromonadaceae (Pseudoalteromonas sp.), Vibrionaceae (Vibrio parahaemolyticus, GenBank NZ_DS180779.1) a dalších (Cattoir a kol. 2008; Verner-Jeffreys a kol. 2009; Pérez-Moreno a kol. 2011; Zhao a Dang 2012; Marti a kol. 2014; Xu a kol. 2014; Wasyl a kol. 2014). Z genů qnr byla u izolátů Aeromonas spp. doposud nejčastěji nalézána alela qnrS2, pouze u jednoho izolátu A. sobria byla detekována varianta qnrS5. Vzhledem k ubikvitnímu výskytu mohou aeromonády sloužit jako vektory plazmidově přenášené rezistence k chinolonům (Han a kol. 2012d). Jak již bylo zmíněno, u přibližně jedné třetiny izolátů Aeromonas spp. s geny PMQR v této

studii

byla

detekována

kombinace

genů

qnrS2

a

aac(6‘)-Ib-cr,

popř.

aac(6‘)-Ib-cr+qnrB17. Verner-Jeffreys a kol. (2009) také zjistili kombinaci genů qnrS2 a aac(6‘)-Ib u 3 izolátů z okrasných ryb dovezených ze Singapuru a Kolumbie. Nicméně nespecifikovali, zda se jednalo o mutantní variantu genu aac(6‘)-Ib-cr. Kombinace genů qnrS2 a aac(6‘)-Ib-cr u Aeromonas spp. byla však prokázána u 11 environmentálních izolátů Aeromonas spp. (79 %, n=14) v sedimentu nebo biofilmu v přítoku, odtoku čistírny odpadních vod i v samotné čistírně odpadních vod ve Španělsku (Marti a kol. 2014). AAC(6‘)-Ib-cr způsobuje

rezistenci

jednak

k chinolonům

(ciprofloxacin

a

norfloxacin),

ale

také

k aminoglykosidům (kanamycin a tobramycin), z tohoto důvodu je rozšíření genu aac(6‘)-Ib-cr závažným problémem (Robicsek a kol. 2006a). Gen qnrB17 byl doposud detekován pouze u zástupců čeledi Enterobacteriaceae – E. coli (GenBank KJ136494.1) izolované na jatkách z drůbeže v Polsku a C. freundii (GenBank AM919398.1), což může poukazovat na propojenost

různých

ekosystémů

dosud

neznámými

cestami

přenosu

bakterií

nebo mobilních genetických elementů s geny rezistence.

5.4.Rezistence Aeromonas spp. k chinolonům Cílovou strukturou pro chinolony je topoizomeráza II, která začala relaxovat nadšroubovicové vinutí molekuly DNA. Vazba chinolonů na komplex topoizomeráza II-DNA pravděpodobně zabraňuje opětovnému spojení zlomu DNA (Cheng a kol. 2011). Rezistence 65

bakterií k chinolonům je způsobena vznikem bodových mutací v genech podjednotek topoizomeráz II. Tyto bodové mutace vznikají v homologických oblastech genů podjednotek topoizomeráz II v tzv. oblastech určujících rezistenci k chinolonům (QRDR). Vznik bodových mutací je spojen s výrazným nárůstem MIC chinolonů (Yoshida a kol. 1990; Goñi-Urriza a kol. 2002; Arias a kol. 2010; Alcaide a kol. 2010). Plazmidově kódovaná rezistence způsobuje rezistenci ke kyselině nalidixové (1. generace chinolonů). Nicméně oproti mutacím v genech topoizomeráz II geny plazmidově kódované rezistence k chinolonům pouze snižují citlivost bakterií k fluorochinolonům (2.–4. generace chinolonů), a tedy hodnoty MIC fluorochinolonů zvyšují pouze mírně z hlediska hraničních hodnot rezistence uvedených v metodikách CLSI (Martínez-Martínez a kol. 1998; Strahilevitz a kol. 2009). Přítomnost genů PMQR, které zajišťují odlišný mechanismus rezistence k chinolonům, má aditivní vliv na zvýšení MIC izolátů a usnadňuje vznik mutací v genech topoizomeráz II (Robicsek a kol. 2006a). Z epidemiologického hlediska je velice významnou vlastností plazmidově kódované rezistence k chinolonům možnost jejího horizontálního přenosu (Martínez-Martínez a kol. 1998; Strahilevitz a kol. 2009). V této studii bylo zjištěno, že izoláty Aeromonas spp. s geny PMQR z importovaných okrasných ryb měly MIC ciprofloxacinu vyšší (32– >128 mg/l) než izoláty z kaprů koi (0,25–8 mg/l), což může poukazovat na intenzivnější expozici těchto bakterií z importovaných okrasných ryb selekčnímu tlaku antibiotik. Nízké koncentrace chinolonů (ng/l) byly detekovány v odpadních i povrchových vodách. Chinolony patří mezi antibiotika dlouhodobě perzistující v prostředí, ochotně adsorbují na sediment ve vodním prostředí, což snižuje jejich biodegradaci. Nízké koncentrace chinolonů v prostředí mohou ovlivnit udržování genů, které způsobují sníženou citlivost k fluorochinolonům a představují tak výhodu v takovém prostředí (Baquero a kol. 2008; Strahilevitz a kol. 2009; Marti a kol. 2014). Hodnota MIC ciprofloxacinu ≥ 1 mg/l je u izolátů aeromonád považována za hraniční koncentraci rezistence k ciprofloxacinu [CLSI (2006c) citovaná Aravena-Román a kol. (2012)]. Na základě tohoto kritéria patřilo 14 izolátů Aeromonas spp. z kaprů koi (93 %, n=15) a 18 izolátů (100 %) z importovaných okrasných ryb mezi izoláty rezistentní. Vysoké hodnoty minimální inhibiční koncentrace ciprofloxacinu jsou obvykle u bakterií spojeny se vznikem mutací v genech topoizomeráz II (Strahilevitz a kol. 2009). U aeromonád je alespoň jedna mutace v QRDR detekována u izolátů s MIC ciprofloxacinu ≥ 0,125 mg/l (nejčastěji Ser83→Ile v GyrA), přítomnost dvou mutací byla detekována u většiny izolátů s MIC

66

ciprofloxacinu ≥ 0,38 mg/l (nejčastěji Ser83→Ile v GyrA, Ser80→Ile v ParC) (Alcaide a kol. 2010). V naší studii však sekvence QRDR qyrA a parC stanoveny nebyly, nicméně je možné přítomnost substitucí v primární struktuře topoizomeráz II u těchto izolátů předpokládat vzhledem k faktu, že majorita těchto izolátů vykazovala rezistenci podle hraničních hodnot CLSI. Nicméně na zvýšení hodnoty MIC chinolonů se u aeromonád mohou významnou měrou podílet i další mechanismy chromozomálně kódované rezistence, např. zvýšené odčerpávání antibiotik efluxními pumpami (Alcaide a kol. 2010). Verner-Jeffreys a kol. (2009) zjistili také vysoké zastoupení izolátů Aeromonas spp. rezistentních k chinonům, které byly získány z tropických okrasných ryb a jejich přepravní vody ze Singapuru, Guyany a Kolumbie. Celkem 85 % těchto izolátů Aeromonas spp. bylo fenotypově rezistentních k flumekvinu a 63 % izolátů bylo rezistentních k ciprofloxacinu. Han a kol. (2012d) stanovili MIC ciprofloxacinu u izolátů Aeromonas spp. převážně z nemocných okrasných, ale také konzumních ryb. Dvacet izolátů (83 %, n=24) Aeromonas spp. bylo zařazeno mezi senzitivní izoláty a 4 izoláty (17 %, n=24) byly zařazeny mezi rezistentní. Nicméně přítomnost mutací v genech podjednotek topoizomeráz II u všech izolátů Aeromonas spp. nekorespondovala se změřenými hodnotami MIC ciprofloxacinu (Han a kol. 2012d). Lze tedy předpokládat, že na zvýšení hodnoty MIC chinolonů se u těchto izolátů mohly podílet další mechanismy rezistence (Alcaide a kol. 2010).

5.5.Rezistence k dalším skupinám antibiotik u Aeromonas spp. Při srovnání profilu fenotypové rezistence bylo multirezistentních [podle definice dle Magiorakos (2012) je multirezistence získaná necitlivost bakterií k alespoň jednomu antibiotiku ze třech a více různých skupin antibiotik] 17 izolátů Aeromonas spp. (94 %, n=18) z importovaných okrasných ryb a pouze 4 izoláty (27 %, n=15) z kaprů koi z České republiky. Multirezistentní izoláty Aeromonas spp. z kaprů koi z českých chovů navíc pocházely pouze z jednoho chovu ze třech, ve kterých byly získány izoláty Aeromonas spp. s geny PMQR, což mohlo být pravděpodobně spojeno s použitím antibiotik. Nicméně konkrétní data o spotřebě antibiotik na této farmě nebyla k dispozici. Dále šest izolátů (40,0 %, n=15) z kaprů koi z českých chovů bylo citlivých ke všem testovaným antibiotikům. Tento rozdíl v zastoupení rezistentních a multirezistentních izolátů mohl být opět spojen intenzivnější expozicí importovaných okrasných ryb různým skupinám antibiotik. Deset mutirezistentních izolátů pocházelo z Vietnamu. Spotřeba antibiotik ve vietnamských chovech okrasných ryb není 67

dokumentována,

nicméně

ve

vietnamských

akvakulturách

konzumních

ryb

patří

k nejpoužívanějším antibiotikům enrofloxacin, florfenikol, sulfametoxazol, trimetoprim, doxycyklin,

amoxicilin

a

cefalexin

(Rico

a

Van

den

Brink

2014).

U

těchto

10 multirezistentních izolátů (56 %, n=18) Aeromonas spp. z vietnamských okrasných ryb byla detekována fenotypová rezistence k chloramfenikolu (10 izolátů), sulfonamidům včetně potencovaných a trimetoprimu (10), florfenikolu (9) a oxytetracylinu (9). V thajských akvakulturách okrasných ryb jsou používány enrofloxacin, oxytetracyklin a chloramfenikol (Jongjareanjai a kol. 2009; Saejung a kol. 2014). Nicméně izoláty Aeromonas spp. z thajských i singapurských okrasných ryb měly profil fenotypové rezistence v podstatě podobný jako izoláty z vietnamských akvakultur. Celkem u 4 multirezistentních izolátů (22 %, n=18) z vietnamských (2 izoláty) a thajských (2) okrasných ryb byla detekována navíc i rezistence ke gentamicinu. U izolátů Aeromonas spp. s geny PMQR z kaprů koi z České republiky a ze slovenských

okrasných

ryb

byla

nejčastěji

detekována

fenotypová

rezistence

k oxytetracyklinu, sulfonamidům včetně potencovaných a trimetoprimu. Obecně patří chinolony, tetracykliny, nitrofurany a aminoglykosidy k nejčastěji nejpoužívaným antibiotikům v akvakulturách (Weir a kol. 2012). V České republice je v akvakulturách dovoleno používání pouze oxytetracyklinu a flumekvinu, nicméně v chovech kaprů koi nebo jiných okrasných ryb není spotřeba antibiotik regulována (Čížek a kol. 2010). Vysoké zastoupení multirezistence u Aeromonas spp. izolovaných z okrasných ryb zjistili také Verner-Jeffreys a kol. (2009). Celkem 64 % testovaných izolátů (n=94) Aeromonas spp. bylo rezistentních k sedmi a více strukturně nepříbuzným skupinám antibiotik. Podobně jako v naší studii, byla u izolátů zastoupena nejčastěji rezistence k oxytetracyklinu (91 % izolátů) a tetracyklinu (85 %), chloramfenikolu (56 %), sulfametoxazol/trimetoprimu (67 %) a aminoglykosidům (spektinomycin, tobramycin, streptomycin, neomycin, gentamicin; 31–77 %). Tito autoři navíc zjistili vysoké zastoupení rezistence k cefalosporinům I. až III. generace – cefazolinu (83 %), cefoxitinu (83 %) a ceftiofuru (40 %). Fenotypová rezistence k cefalosporinům u Aeromonas spp. v naší studii stanovena nebyla.

5.6.Geny rezistence k dalším skupinám antibiotik u Aeromonas spp. Izoláty Aeromonas spp. z dovezených okrasných ryb měly obecně variabilnější profily genů rezistence včetně struktur integronů třídy 1 než izoláty z kaprů koi. U sedmi izolátů z kaprů koi nebyl detekován žádný z testovaných genů rezistence. Jak již bylo zmíněno, tento rozdíl může být ovlivněn intenzivnější expozicí dovezených okrasných ryb antibiotiky. 68

Gen floR byl detekován u 13 izolátů Aeromonas spp. z dovezených okrasných ryb. Verner-Jeffreys a kol. (2009) také detekovali u importovaných okrasných ryb i v jejich přepravní vodě tento gen rezistence. Používání chloramfenikolu u potravinových zvířat bylo zakázáno z důvodu možných negativních důsledků na konzumenta, ale u okrasných ryb je jeho používání v některých zemích stále dovoleno (Chanda a kol. 2011). Geny rezistence k tetracyklinům, vzhledem k častému používání této skupiny antibiotik v akvakulturách, patří k nejrozšířenějším (Weir a kol. 2012; Yanong 2013). U izolátů z dovezených okrasných ryb byl nejčastěji detekován gen rezistence tet(B) (13 izolátů) a v menší míře geny tet(D) (3) a tet(E) (2). U izolátů z České republiky byl naopak zjištěn nejčastěji gen tet(E) (4) a v menší míře geny tet(D) (2), tet(A) (1) a tet(B) (1). Verner-Jeffreys a kol. (2009) detekovali nejčastěji geny tet(E) a tet(D), oproti výsledkům naší studie detekovali také geny tet(C) a tet(G), nikoliv však gen tet(B). Han a kol. (2012a) také u okrasných ryb z Koreje detekoval nejčastěji gen tet(E) a nikoliv gen tet(B), což je v rozporu s našimi výsledky. Sulfonamidy patřily také k často využívaným antibiotikům, nicméně rezistence k této skupině antibiotik se u bakterií výrazně rozšířila. Potencované sulfonamidy jsou stále v praxi využívány (Lewbart 2001; Chanda a kol. 2011; Yanong 2013). Dvanáct izolátů fenotypově rezistentních k sulfonamidům z importovaných ryb neslo gen sul1 samostatně a pět izolátů v kombinaci s genem sul2. Čtyři izoláty fenotypově rezistentní k sulfonamidům z kaprů koi nesly gen sul1. Verner-Jeffreys a kol. (2009) detekovali pouze gen sul1 u izolátů aeromonád z dovezených okrasných ryb i ryb z Velké Británie.

5.7.Integrony u Aeromonas spp. Integrony patří mezi genetické elementy, jejichž vliv na rozvoj multirezistence je zásadního významu. Integrony mohou ve své struktuře nést variabilní sestavu genových kazet, kterým zajišťují expresi z jednoho promotoru. Tyto genetické elementy nejsou mobilní, nicméně mohou být spřaženy mobilními genetickými elementy – transpozony, nebo mohou být neseny na plazmidech, a tak mohou být integrony přenášeny mezi různými genofory bakteriální buňky nebo mezi různými buňkami (Partridge 2011; Lupo a kol. 2012). Navíc se uvažuje, že míra rozšíření integronů u bakterií vodního prostředí může být spojena s úrovní znečištění daného vodního prostředí (Lupo a kol. 2012).

69

Izoláty Aeromonas spp. z této studie nesly pouze integrony třídy 1. U 16 izolátů (89 %, n=18) z importovaných okrasných ryb a 4 izolátů (27 %, n=15) z kaprů koi byl detekován alespoň jeden integron třídy 1. U všech izolátů byl detekován gen rezistence k sulfonamidům sul1, který bývá součástí nejrozšířenějšího, tzv. „klinického“, integronu třídy 1 (Partridge 2011). Nejčastěji byl detekován integron třídy 1 obsahující genové kazety dfrA12-aadA2. Verner-Jeffreys a kol. (2009) detekoval u 50 % izolátů z importovaných okrasných ryb intergony třídy 1 a u těchto izolátů byly také nejčastěji detekovány genové kazety různých variant genu dihydrofolátreduktázy dfrA a aminoglykosidové (3“) adenylyltransferázy aadA. Podobně jako v naší studii Lukkana a kol. (2012) také zjistili u klinických izolátů A. hydrophila z různých jedinců tlamouna nilského (Oreochromis niloticus) chovaného v Thajsku nejčastěji integron třídy 1 obsahující dfrA12-aadA2 (2 kb). U 7 izolátů z naší studie se podařilo stanovit velikost tohoto integronu (2 kb) pomocí použitých metod. U 9 devíti izolátů se velikost tohoto integronu nepodařilo stanovit pomocí amplifikace celého úseku integronu za využití primerů komplementárních ke konzervativním oblastem integronu 5‘-CS a 3‘-CS. Reakce amplifikující část oblasti 3’-CS a genových kazet byly negativní, nicméně dílčí PCR amplifikující oblast 5‘-CS a příslušné genové kazety byly pozitivní. Pravděpodobně tedy došlo k přestavbě 3‘-CS konzervativního úseku u těchto izolátů. Dále je možné, že tyto integrony obsahovaly ještě další genové kazety, které nebyly detekovány. Lukkana a kol. (2012) také u klinických izolátů A. hydrophila detekovali integrony s netypickou strukturou 3‘-CS oblasti. Pět izolátů Aeromonas spp. z importovaných okrasných ryb neslo dva integrony třídy 1. Nejčastěji byla u těchto izolátů detekována kombinace integronů se sestavou kazet dfrA12-aadA2 a arr-3-aacA4-dfrA1-orf. Gen dfrA kóduje rezistenci k trimetoprimu, arr-3 k rifampicinu, aadA k aminoglykosidům a aacA4 (alternativní pojmenování aac(6‘)-Ib) také k aminoglykosidům a mutantní varianta –cr zajišťuje navíc sníženou citlivost bakterií k fluorochinolonům. Integron s touto strukturou vykazoval ≥ 99 % homologii k integronu u Vibrio cholerae (GenBank AB219236). Rifampicin je v kombinaci s dalšími antibiotiky využíván při léčbě mykobakterióz vyvolaných Mycobacterium marinum. M. marinum vyvolává onemocnění u ryb, obojživelníků a sporadicky i u člověka. M. marinum u člověka vyvolává infekce kůže a zdrojem těchto bakterií pro člověka může být právě chov okrasných ryb (Bonamonte a kol. 2013). Rozšíření genů rezistence k rifampicinu může představovat závažný terapeutický problém.

70

5.8.Příbuznost izolátů Aeromonas spp. s geny PMQR Počet získaných izolátů Aeromonas spp. s geny PMQR byl z obou zdrojů poměrně nízký, i přes to mohou být na tomto souboru pozorovány dva principy šíření a rozvoje rezistence k antibiotikům: šíření rezistentních klonů a horizontální přenos genů rezistence. Ačkoliv povaha těchto principů je odlišná, v prostředí se mohou uplatňovat současně a přispívat k rozšíření rezistence. Konkrétně např. určitý úspěšný klon může představovat významný zdroj plazmidů s geny rezistence. Plazmidy s geny rezistence tohoto klonu mohou být přeneseny do mikrobiální flóry v prostředí. Může však také dojít k tomu, že tento úspěšný klon může z prostředí nebo mikrobiální flóry daného prostředí přijmout plazmidy s geny rezistence a dále fungovat jako jejich vektor (Woodford a kol. 2011). Izoláty Aeromonas spp. s PMQR byly pomocí shlukové analýzy rozděleny do 5 skupin příbuzných izolátů (A–E; Diceův koeficient podobnosti makrorestrikčních profilů ≥ 85 %), přičemž do skupiny E byl zařazen pouze jeden izolát A. hydrophila (227). Následující odstavce jsou soustředěny na skupiny A–D, které zahrnují větší počet izolátů. Skupina příbuzných izolátů D zahrnovala izoláty z Vietnamu (2 izoláty), Thajska (1) a Slovenské republiky (1). Izoláty z Vietnamu a Thajska měly identický profil genů PMQR (qnrS2, aac(6‘)-Ib-cr), identický profil fenotypové rezistence, genů rezistence i struktury integronů. Rozdílný původ izolátů může poukazovat na úspěšné šíření určitých klonů skupiny druhů A. sobria mezi různými oblastmi. Pojem „klon“ zahrnuje izoláty, které pocházely z různých

oblastí

světa,

byly

získány

z různého

zdroje

a

v jiném

období.

I přes odlišný zdroj a původ mají tyto izoláty společnou celou řadu fenotypových a genotypových vlastností. Nejpravděpodobnější vysvětlení této shody je společný původ těchto izolátů (Orskov a Orskov 1983). Pro zařazení izolátů k určitým sekvenčním typům, a tedy pro mezilaboratorní porovnání izolátů získaných z okrasných ryb v rámci naší studie by bylo možné sekvenovat vybrané esenciální geny metodou „multilocus sequence typing“ (Martino a kol. 2011). Nicméně tato metoda u izolátů z naší studie provedena nebyla. Skupina B zahrnovala izoláty z Vietnamu (3) a Slovenské republiky (1). Izoláty z Vietnamu měly shodný profil fenotypové rezistence, genů rezistence včetně struktury integronů. Izolát ze Slovenské republiky měl podobný profil fenotypové rezistence, podobnou sestavu genů rezistence, navíc nesl gen tet(E). Integron (dfrA12-aadA2) ze slovenského izolátu měl odlišnou strukturu oblasti 3‘-CS ve srovnání s izoláty z Vietnamu, u nichž byla struktura 3‘-CS oblasti obvyklá. Druhý integron slovenského izolátu nesl jako první arr-3, tato kazeta byla jako první byla detekována i u integronů z vietnamských izolátů. Další sestava kazet se 71

lišila u izolátů z Vietnamu i Slovenské republiky, což by mohlo poukazovat na rozdíly v zastoupení jednotlivých genů rezistence v daných lokalitách (Woodford a kol. 2011). Skupina příbuzných izolátů A zahrnovala Aeromonas spp. původem z Vietnamu (4), České republiky (5) a Thajska (1). Všechny izoláty z České republiky (farma A, B) byly v této skupině citlivé ke všem testovaným antibiotikům a nesly kombinaci genů qnrS2 a aac(6‘)-Ibcr. Oproti tomu všechny izoláty z Vietnamu a Thajska nesly pouze gen qnrS2, měly rozmanité profily rezistence včetně sestavy genů rezistence a různých integronů. Skupina C zahrnovala výhradně izoláty z kaprů koi, které byly izolovány na farmě A (5 izolátů) a B (1) v roce 2006. Společnou charakteristikou těchto izolátů byla přítomnost genu qnrS2, nicméně se lišily profilem genů rezistence i strukturou integronů. Tyto rozdíly v zastoupení genů rezistence a integronů mohou poukazovat význam horizontálního přenosu genů pro šíření genů rezistence v prostředí se selekčním tlakem antibiotik (Lupo a kol. 2012; Gillings 2013).

5.9.Schopnost tvorby biofilmu u Aeromonas spp. a horizontální přenos plazmidů s geny PMQR Všechny izoláty Aeromonas spp. z obou souborů tvořily biofilm. Podle kritérií vytvořených autory Stepanovic a kol. (2000) mohou být izoláty rozděleny do čtyř kategorií na základě schopnosti adherovat: neadherující, slabě adherující, středně adherující, silně adherující. Izoláty Aeromonas spp. v této studii patřily do kategorií slabě a středně adherujících, konkrétně 16 izolátů (48 %, n=33) adherovalo slabě a 17 izolátů (52 %, n=33) adherovalo středně. Tvorba biofilmu v prostředí může být indukována subinhibiční koncentrací antibiotik. Schopnost tvorby biofilmu je výhodnou vlastností, protože zvyšuje pravděpodobnost přežití bakterií v přirozených vodních ekosystémech. Navíc matrix biofilmu představuje vhodné prostředí pro horizontální přenos genů konjugací i transformací (Lupo a kol. 2012; Gillings 2013). Selekční tlak antibiotik navíc zvyšuje frekvenci rekombinace, horizontálního přenosu genů rezistence a usnadňuje stabilní udržování mobilních genetických elementů s geny, které zajišťují selekční výhodu v daném prostředí (Gillings 2013). Konjugativní přenos plazmidů z Aeromonas spp. s geny PMQR do recipietních kmenů E. coli a A. sobria se v naší studii nepodařilo prokázat. Nízkou schopnost konjugativního přenosu plazmidů z Aeromonas spp. pozoroval také Cattoir a kol. (2008); Han a kol. (2012d). Nicméně Cantas a kol. (2012) prokázali na modelu infekce dánia pruhovaného (Danio rerio) bakteriemi A. hydrophila výrazné zvýšení exprese genů tra pRAS1 (IncU plazmid), který 72

kóduje rezistenci k tetracyklinu, trimetoprimu a sulfonamidům, při použití subinhibiční koncentrace flumekvinu, nebo za použití tetracyklinu a trimetoprimu. Oproti tomu se celkem u 26 izolátů (79 %, n=33) podařilo prokázat úspěšný horizontální přenos plazmidů s geny PMQR transformací E. coli DH5α. Aeromonády patří mezi přirozeně transformovatelné mikroorganismy. Ve studii autorů Huddleston a kol. (2013) bylo prokázáno, že 73 % izolátů Aeromonas spp. mohlo představovat recipientní buňky pro DNA pocházející z jiných environmentálních aeromonád divokého typu a 100 % izolátů Aeromonas spp. mohlo představovat donorové buňky DNA k transformaci aspoň některých dalších aeromonád.

5.10.

Charakteristika plazmidů s geny PMQR z Aeromonas spp.

K analýze plazmidů bylo využito celkem 17 transformantů, do kterých byl přenesen pouze jeden plazmid s geny PMQR z izolátů Aeromonas spp. Deset transformantů neslo plazmidy skupiny inkompatibity U (IncU), u sedmi se skupinu inkompatibility pomocí použitých metod nepodařilo zjistit. U aeromonád byly doposud detekovány plazmidy skupiny inkompatibility A/C, U, FrepB, FIC, I1, Q, a také ColE (Cattoir a kol. 2008; Verner-Jeffreys a kol. 2009; Moura a kol. 2012; Han a kol. 2012b,c). Výsledky transformace poukázaly na skutečnost, že přenesené plazmidy s geny PMQR nenesly geny rezistence k dalším skupinám

antibiotik

(tetracyklinům,

sulfonamidům,

amfenikolům,

aminoglykosidům

a trimetoprimu) až na výjimku IncU plazmidu izolátu č. CH21. Geny rezistence k dalším skupinám antibiotik mohly být lokalizovány na jiných plazmidech. Například Han a kol. (2012a) detekovali v sekvenci plazmidu rodiny ColE2 označeném pAHH01 (8 979 bp) z A. hydrophila pouze gen rezistence tet(E). IncU plazmidy patří u aeromonád k nejrozšířenějším a byly detekovány u izolátů v řekách, jezerech a odpadních vodách nemocnice (Rhodes a kol. 2004; Cattoir a kol. 2008; Picão a kol. 2008). IncU plazmidy detekované v naší studii lze rozdělit do tří skupin na základě velikosti, profilu genů rezistence, restrikčního profilu a výsledků hybridizace se specificky značenými sondami komplementárními ke genům domnělého iniciačního proteinu replikace rep IncU a genům PMQR. Na základě tohoto srovnání IncU plazmidů detekovaných v naší studii a ve studiích dalších autorů lze předpokládat velkou variabilitu těchto plazmidů, která nebyla doposud zmapovaná (Kulinska a kol. 2008). IncU plazmid (40 kb) z A. hydrophila (227) z kaprů koi nesl pouze gen qnrS2 a měl unikátní restrikční profil. IncU plazmid (35 kb) 73

z A. sobria (CH21) z thajské ryby nesl gen qnrS2, sul1 a integron třídy 1 (0,75 kb) s genovou kazetou dfrA22 a měl také unikátní restrikční profil. Osm IncU plazmidů (≈20 kb) mělo shodný profil genů PMQR (qnrS2, aac(6‘)-Ib-cr), identický restrikční profil a lokalizaci genů PMQR a rep IncU na identických fragmentech. Tyto IncU plazmidy pocházely z nepříbuzných izolátů A. hydrophila z kaprů koi a A. sobria z Vietnamu a Thajska. Tento výsledek poukazuje na široké rozšíření IncU plazmidů u různých skupin druhů rodu Aeromonas ve vodních ekosystémech v různých oblastech světa a na význam horizontálního přenosu genů při rozšíření rezistence k chinolonům. IncU plazmidy mají široké spektrum hostitelů a mohou být stabilně udržovány v buňkách E. coli (Cattoir a kol. 2008). Další rozšíření IncU plazmidů s geny PMQR může představovat potenciální riziko pro zdraví člověka a zvířat. U sedmi plazmidů (< 20 kb) s genem qnrS2 z Aeromonas spp. z obou souborů se nepodařilo

použitými

metodami

zjistit

skupinu

inkompatibility.

Gen

qnrS2

byl

u Aeromonas spp. detekován na malých mobilizovatelných plazmidech IncQ a ColE (Han a kol. 2012b,c). Doposud nebyla vytvořena metodika průkazu těchto skupin plazmidů pomocí PCR. Moura a kol. (2012) identifikovali známou skupinu inkompatibility pomocí PCR pouze u 8 izolátů (17 %) z celkového počtu 48 testovaných izolátů aeromonád. Malé netypovatelné plazmidy získané v naší studii měly unikátní restrikční profily s výjimkou plazmidů izolátů č. CH36 a CH26/a, které pocházely z příbuzných izolátů z Vietnamu a Thajska. Z tohoto důvodu se pravděpodobně nejednalo o skupinu příbuzných plazmidů.

5.11.

Genetické pozadí genu qnrS2 na IncU plazmidech

Na IncU plazmidech izolátů č. CH21 z importovaných ryb a č. 227 z kaprů koi byla detekována inzerce mobilní inzerční kazety s genem qnrS2 do genu domnělé zinkové metaloproteázy mpR. Tato struktura vykazovala 100% shodu se sekvencemi této oblasti IncU plazmidů p37 A. punctata a p42 A. media (Cattoir a kol. 2008). Identická struktura byla pozorována i na IncU plazmidu p34 izolátu A. allosaccharophila, který byl získán z jezera Lugano ve Švýcarsku (Picão a kol. 2008). U dalších osmi transformantů s IncU plazmidy se podařilo amplifikovat pouze oblast 3‘ konce této struktury, která vykazovala 100% shodu se sekvencemi p37 a p42 (Cattoir a kol. 2008). Oblast 5‘ konce se u těchto IncU plazmidů nepodařilo amplifikovat pomocí zvolených primerů. Lze tedy předpokládat, že v oblasti 5‘ konce této struktury mohlo dojít k přestavbám, delecím nebo inzercím mobilních genetických elementů. Marti a Balcázar (2012) také 74

detekovali identickou sekvenci oblasti 3‘ konce struktury qnrS2-mpR jako u p37, p42 a p34, nicméně v oblasti 5‘ konce struktury mpR-qnrS2 detekovali inzerci ISKpn9 v sekvenci IncU plazmidu pP2G1.

75

6. Závěr Chov okrasných ryb je rozvíjejícím se lukrativním oborem podnikání, který je spojen s přepravou velkého množství živočichů na velké vzdálenosti. Vznik bakteriálních infekčních onemocnění je jedním z nejzávažnějších problémů chovů okrasných ryb. Prevence a léčba bakteriálních onemocnění je v chovech ryb spojena s častým používáním různých skupin antibiotik, které vytváří selekční tlak na populace bakterií mikroflóry ryb i vodního prostředí. Spotřeba antibiotik v chovech okrasných ryb není v mnohých zemích dokumentována, ani regulována. Chinolony patří mezi nejvýznamnější skupiny antibiotik humánní i veterinární medicíny a jsou často používány také v akvakulturách, proto rozšiřování genů rezistence k této skupině antibiotik je závažným problémem. Vodní prostředí je považováno v kontextu vzniku, rozvoje a rozšíření rezistence za centrum, ve kterém dochází k interakci mobilních genetických elementů a horizontálnímu přenosu genů mezi bakteriemi patogenními a komenzálními a bakteriemi z prostředí. V této studii byly z importovaných okrasných ryb i kaprů koi chovaných v České republice získány izoláty Aeromonas spp. s geny plazmidově kódované rezistence k chinolonům. Většina izolátů Aeromonas spp. s geny PMQR z dovezených okrasných ryb byla multirezistentní a měla variabilnější profily genů rezistence i integronů ve srovnání s izoláty z kaprů koi z České republiky, což může poukazovat na větší selekční tlak, kterému byly tyto populace aeromonád pravděpodobně vystaveny. Geny plazmidově kódované rezistence k chinolonům byly detekovány na identických i nepříbuzných IncU plazmidech u nepříbuzných izolátů Aeromonas spp. pocházejících z různých oblastí. Tyto výsledky poukazují na význam horizontálního přenosu genů pro rozšíření rezistence a také na dosud neznámé cesty přenosu těchto plazmidů a neprozkoumanou diverzitu plazmidů u Aeromonas spp. Na základě výsledků zjištěných v této studii tedy importované okrasné ryby mohou představovat významný vektor rezistentních bakterií rodu Aeromonas i mobilních genetických elementů s geny rezistence k chinolonům. Výsledky této studie poukazují na nutnost regulace spotřeby antibiotik v chovech okrasných ryb pro zachování účinnosti klinicky nejvýznamnějších antibiotik a pro snížení zastoupení rezistentních bakterií ve vodním prostředí. Neméně podstatné je i zavádění nových technik čištění vod, které by zabránily dalšímu šíření bakterií rezistentních k antibiotikům i mobilních genetických elementů nesoucích geny rezistence. Snížení zastoupení rezistentních bakterií v prostředí je zásadním předpokladem pro snížení rizik pro zdraví člověka a zvířat.

76

7. Seznam obrázků Obrázek 1. A. hydrophila (krevní agar). ..................................................................................... 17 Obrázek 2. Aeromonas caviae kmen Sch3N (snímek z transmisního elektronového mikroskopu, Parker a Shaw 2011) ................................................................................................................... 18 Obrázek 3. Struktura farmakoforu chinolonů.. ........................................................................... 21 Obrázek 4. Struktura proteinu QnrB1 (Vetting a kol. 2011). ..................................................... 26 Obrázek 5. Hmotnostní standard - genomová DNA Salmonella Braenderup H9812 štěpená XbaI. ............................................................................................................................................ 44 Obrázek 6. Schéma aparatury Southernova přenosu (Brown, 2001). ......................................... 46 Obrázek 7. Dendrogram Aeromonas spp. s PMQR. ................................................................... 51 Obrázek 8. Rozložení hodnot MIC ciprofloxacinu u Aeromonas spp. z obou souborů.…….....52 Obrázek 9. Rozložení hodnot MIC kyselina nalidixové u Aeromonas spp. z obou souborů…..52 Obrázek 10. Profily fenotypové rezistence u izolátů Aeromonas spp. z obou souborů k jednotlivým antibiotikům. ........................................................................................................ 54 Obrázek 11. Zastoupení fenotypové rezistence u izolátů Aeromonas spp. z obou souborů. ...... 54 Obrázek 12. Zastoupení genů rezistence u Aeromonas spp. z obou souborů ............................. 55 Obrázek 13. Struktury integronů třídy 1 u Aeromonas spp. z obou souborů.............................. 56 Obrázek 14. Běžná elektroforéza plazmidové DNA z transformantů příslušných izolátů Aeromonas spp. z obou souborů. ................................................................................................ 57 Obrázek 15. Restrikční profily IncU plazmidů (štěpení HincII). ............................................... 58 Obrázek 16. Srovnání sekvencí genetického pozadí genu qnrS2 u IncU plazmidů izolátů č. CH10 (A. sobria), č. 227 (A. hydrophila) a referenční sekvence……………………...…….59

77

8. Seznam tabulek Tabulka 1. Seznam použitých chemikálií a komerčních souprav. .............................................. 33 Tabulka 2. Seznam použitých kultivačních médií. ..................................................................... 34 Tabulka 3. Seznam použitých restrikčních enzymů. .................................................................. 34 Tabulka 4. Seznam použitých primerů, reakčních podmínek PCR, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů použitých při testování genů rezistence, integronů a při mapování genetického pozadí genu qnrS2. ................................................................................................. 37 Tabulka 5. Seznam použitých primerů, amplifikačních podmínek, velikosti amplikonů a kontrolních kmenů využitých při testování skupin inkompatibilit plazmidů........................... 41 Tabulka 6. Zastoupení genů PMQR u izolátů Aeromonas spp. pocházejících z kaprů koi a importovaných ryb. .................................................................................................................. 50 Tabulka 7. Zastoupení PMQR genů u izolátů jednotlivých skupin druhů rodu Aeromonas z obou souborů. ........................................................................................................................... 50 Tabulka 8. Rozmezí MIC testovaných chinolonů u Aeromonas spp. z obou souborů. .............. 53 Tabulka 9. Izoláty Aeromonas spp. s PMQR z importovaných okrasných ryb a kaprů koi z českých chovů. ......................................................................................................................... 60 Tabulka 10. Plazmidy s geny PMQR z izolátů Aeromonas spp. z obou souborů……….......... 62

78

9. Bibliografie Abbott, S. L., Cheung, W. K. W., & Janda, J. M. (2003). The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. J. Clin. Microbiol., 41(6), stránky 2348–2357. Alcaide, E., Blasco MD, M. D., & Esteve, C. (2010). Mechanisms of quinolone resistance in Aeromonas species isolated from humans, water and eels. Res. Microbiol., 161(1), stránky 40-5. Alday, V., Guichard, B., Smith, P., & Uhland, C. (2006). Towards a risk analysis of antimicrobial use in aquaculture. Joint FAO/WHO/OIE expert consultation on antimicrobial use in aquaculture and antimicrobial resistance, Seoul, Korea. 144 stránek. Andersson, M. I., & MacGowan, A. P. (2003). Development of the quinolones. J. Antimicrob. Chemother., 51 (Suppl 1), stránky 1-11. Aoki, T., Egusa, S., Ogata, Y., & Watanabe, T. (1971a). Detection of resistance factors in fish pathogen Aeromonas liquefaciens. J. Gen. Microbiol., 65(3), stránky 343-9. Aoki, T., Egusa, S., Kimura, T., & Watanabe, T. (1971b). Detection of R factors in naturally occurring Aeromonas salmonicida strains. Appl. Microbiol., 22(4), stránky 716–717. Aravena-Román, M., Inglis, T. J. J., Henderson, B., Riley, T. V., & Chang, B. J. (2012). Antimicrobial susceptibilities of Aeromonas strains isolated from clinical and environmental sources to 26 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents. Chemother., 56(2), stránky 1110-2. Arias, A., Seral, C., Gude, M. J., & Castillo, F. J. (2010). Molecular mechanisms of quinolone resistance in clinical isolates of Aeromonas caviae and Aeromonas veronii bv. sobria. Int. Microbiol., 13(3), stránky 135-41. Arthur, J. R., Lavilla-Pitogo, C. R., & Subasinghe, R. P. (eds.) (1996). Use of chemicals in aquaculture in Asia. Tigbauan, Iloilo, Filipíny: Southeast Asian Fisheries Development Center. Baquero, F., Martínez, J. L., & Cantón, R. (2008). Antibiotics and antibiotic resistance in water environments. Curr. Opin. Biotechnol., 19(3), stránky 260-5. Barton, B. M., Harding, G. P., & Zuccarelli, A. J. (1995). A general method for detecting and sizing large plasmids. Anal. Biochem., 226(2), stránky 235-40. Birnboim, H. C., & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic. Acids Res., 7(6), stránky 1513-23. Bonamonte, D., De Vito, D., Vestita, M., Delvecchio, S., Ranieri, L. D., Santantonio, M., Angelini, G. (2013). Aquarium-borne Mycobacterium marinum skin infection. Report of 15 cases and review of the literature. Eur. J. Dermatol., 23(4), stránky 510-6. 79

Briñas, L., Zarazaga, M., Sáenz, Y., Ruiz-Larrea, F., & Torres, C. (2002). Beta-lactamases in ampicillin-resistant Escherichia coli isolates from foods, humans, and healthy animals. Antimicrob. Agents Chemother., 46(10), stránky 3156-63. Brown, T. (2001). Southern Blotting. V: Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc. 00:IV:2.9A:2.9.1–2.9.20. Cantas, L., Midtlyng, P. J., & Sørum, H. (2012). Impact of antibiotic treatments on the expression of the R plasmid tra genes and on the host innate immune activity during pRAS1 bearing Aeromonas hydrophila infection in zebrafish (Danio rerio). BMC Microbiol., 12, č. článku 37. Carattoli, A. (2009). Resistance plasmid families in Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother., 53(6), stránky 2227-2238. Carattoli, A., Bertini, A., Villa, L., Falbo, V., Hopkins, K. L., & Threlfall, E. J. (2005). Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. J. Microbiol. Methods, 63(3), stránky 219–28. Cardoza, L. A., Knapp, C. W., Larive, C. K., Belden, J. B., Lydy, M., & Graham, D. W. (2005). Factors affecting the fate of ciprofloxacin in aquatic field systems. Water, Air, and Soil Pollution, 161(1-4), stránky 383-98 . Cattoir, V., Poirel, L., Rotimi, V., Soussy, C. J., & Nordmann, P. (2007). Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing enterobacterial isolates. J. Antimicrob. Chemother, 60(2), stránky 394-7. Cattoir, V., Poirel, L., Aubert, C., Soussy, C. J., & Nordmann, P. (2008). Unexpected occurrence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants in environmental Aeromonas spp. Emerg. Infect. Dis., 14(2), stránky 231–37. Cavaco, L. M., Hasman, H., Xia, S., & Aarestrup, F. M. (2009). qnrD, a novel gene conferring transferable quinolone resistance in Salmonella enterica serovar Kentucky and Bovismorbificans strains of human origin. Antimicrob. Agents Chemother., 53(2), stránky 603-608. CDC (2004). One-day (24–28 h) standardized laboratory protocol for molecular subtyping of Escherichia coli O157:H7, non-typhoidal Salmonella serotypes, and Shigella sonnei by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). V The National Molecular Network for Foodborne Disease Surveillance CDCP (str. 15). Atlanta, Georgia, USA: Center for Disease Control and Prevention. Chanda, M., Paul, M., Maity, J., Dash, G., & Gupta, S. S. (2011). The use of antibiotics and disinfectants in ornamental fish farms of West Bengal, India. J. Nat. Sci. Biol. Med., 2(2), stránky 139–140. Cheng, G., Hao, H., Dai, M., Liu, Z., & Yuan, Z. (2011). Antibacterial action of quinolones: From target to network . Eur. J. Med. Chem., 66, stránky 555-562. 80

Čížek, A., Dolejská, M., Sochorová, R., Strachotová, K., Piačková, V., & Veselý, T. (2010). Antimicrobial resistance and its genetic determinants in aeromonads isolated in ornamental (koi) carp (Cyprinus carpio koi) and common carp (Cyprinus carpio). Vet. Microbiol, 142(3-4), stránky 435-9. CLSI. (2006a). Methods for antimicrobial disk susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals: Approved Guideline. CLSI document M42-A. Wayne, Pennsylvania, USA: Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI. (2006b). Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals: Approved Guideline. CLSI document M49-A. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI. (2006c). Methods for the antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria, 2nd ed, M45-A2. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI. (2011). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty First Informational Supplement, M100-S21. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI. (2013). Performance Standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; Second international supplement. CLSI document VET01-S2. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute. Delcour, A. H. (2009). Outer membrane permeability and antibiotic resistance. Biochim. Biophys. Acta, 1794(5), stránky 808–816. Department of Veterinary Disease Biology, (2011). WWW University of Copenhagen. Získáno 28. 6 2014, URL: http://pictures.life.ku.dk/atlas/microatlas/food/bacteria/Aeromonas_hydrophila/ Dobiasova, H., Kutilova, I., Piackova, V., Vesely, T., Cizek, A., & Dolejska, M. (2014). Ornamental fish as a source of plasmid-mediated quinolone resistance genes and antibiotic resistance plasmids. Vet. Microbiol., 171(3-4), stránky 413-21. Dolejska, M., Duskova, E., Rybarikova, J., Janoszowska, D., Roubalova, E., Dibdakova, K., Maceckova, G., Kohoutova, L., Literak, I., Smola, J., Cizek, A.. (2011a). Plasmids carrying blaCTX-M-1 and qnr genes in Escherichia coli isolates from an equine clinic and a horseback riding centre. J. Antimicrob. Chemother., 66(4), stránky 757-64. Dolejska, M., Frolkova, P., Florek, M., Jamborova, I., Purgertova, M., Kutilova, I., Cizek, A., Guenther, S., Literak, I.. (2011b). CTX-M-15-producing Escherichia coli clone B2O25b-ST131 and Klebsiella spp. isolates in municipal wastewater treatment plant effluents. J. Antimicrob. Chemother., 66(12), stránky 2784-90. Emmerson, A. M., & Jones, A. M. (2003). The quinolones: decades of development and use. J. Antimicrob. Chemother., 51( Suppl 1), stránky 13-20. 81

Faldynova, M., Pravcova, M., Sisak, F., Havlickova, H., Kolackova, I., Cizek, A., Karpiskova, R., Rychlik, I.. (2003). Evolution of antibiotic resistance in Salmonella enterica serovar typhimurium strains isolated in the Czech Republic between 1984 and 2002. Antimicrob. Agents Chemother., 47(6), stránky 2002-5. FDA. (2011). Chapter 11. Aquaculture drugs. V: Fish and fishery products hazards and controls guidance. WWW FDA. Získáno 9. září 2014, URL: http://www.fda.gov/downloads/food/guidanceregulation/ucm251970.pdf Fernández, L., & Hancock, R. E. (2012). Adaptive and mutational resistance: role of porins and efflux pumps in drug resistance. Clin. Microbiol. Rev, 25(4), stránky 661–681. Fonseca, É. L., dos Santos Freitas, F., Vieira, V. V., & Vicente, A. C. P. (2008). New qnr gene cassettes associated with superintegron repeats in Vibrio cholerae O1. Emerg. Infect. Dis., 14(7), stránky 1129–1131. Frade, V. M. F., Dias, M., Teixeira, A. C. S. C., & Palma, M. S. A. (2014). Environmental contamination by fluoroquinolones. Braz. J. Pharm. Sci., 50(1), stránky 41-54. Fricke, W. F., Welch, T. J., McDermott, P. F., Mammel, M. K., LeClerc, J. E., White, D. G., Cebula, T. A.; Ravel, J. (2009). Comparative genomics of the IncA/C multidrug resistance plasmid family. J. Bacteriol., 191(15), stránky 4750-7. Garrity, G., Brenner, D. J., Krieg, N. R., & Staley, J. R (eds.). (2005). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 2: The Proteobacteria, Part B: The Gammaproteobacteria. USA: Springer. Genevaux, P., Muller, S., & Bauda, P. (1996). A rapid screening procedure to identify miniTn10 insertion mutants of Escherichia coli K-12 with altered adhesion properties. FEMS Microbiol. Lett., 142(1), stránky 27-30. Gibreel, A., & Sköld, O. (1998). High-level resistance to trimethoprim in clinical isolates of Campylobacter jejuni by acquisition of foreign genes (dfr1 and dfr9) expressing drug-insensitive dihydrofolate reductases. Antimicrob. Agents Chemother., 42(12), stránky 3059-64. Giguère, S., Prescott, J. F., & Dowling, P. M. (eds.) (2013). Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine, Fifth Edition. USA: John Wiley & Sons, Inc. Gillings, M. R. (2013). Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol., 4, č. článku 4. Giraud, E., Blanc, G., Bouju-Albert, A., Weill, F. X., & Donnay-Moreno, C. (2004). Mechanisms of quinolone resistance and clonal relationship among Aeromonas salmonicida strains isolated from reared fish with furunculosis. J. Med. Microbiol., 53(Pt 9), stránky 895-901.

82

Goñi-Urriza, M., Arpin, C., Capdepuy, M., Dubois, V., Caumette, P., & Quentin, C. (2002). Type II topoisomerase quinolone resistance-determining regions of Aeromonas caviae, A. hydrophila, and A. sobria complexes and mutations associated with quinolone resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 46(2), stránky 350–359. Guerra, B., Junker, E., Miko, A., Helmuth, R., & Mendoza, M. C. (2004). Characterization and localization of drug resistance determinants in multidrug-resistant, integroncarrying Salmonella enterica serotype Typhimurium strains. Microb. Drug Resist., 10(2), stránky 83-91. Haines, A. S., Cheung, M., & Thomas, C. M. (2006). Evidence that IncG (IncP-6) and IncU plasmids form a single incompatibility group. Plasmid, 55(3), stránky 210-5. Han, J. E., Kim, J. H., Choresca, C. H. Jr., Shin, S. P., Jun, J. W., Chai, J. Y., Park, S. C. (2012a). Prevalence of tet gene and complete genome sequencing of tet gene-encoded plasmid (pAHH01) isolated from Aeromonas species in South Korea. J. Appl. Microbiol., 112(4), stránky 631-8. Han, J. E., Kim, J. H., Choresca, C. H., Shin, S. P., Jun, J. W., Chai, J. Y., Park, S. C. (2012b). A small IncQ-type plasmid carrying the quinolone resistance (qnrS2) gene from Aeromonas hydrophila. Lett. Appl. Microbiol., 54(4), stránky 374-6. Han, J. E., Kim, J. H., Choresca, C. H. Jr., Shin, S. P., Jun, J. W., Chai, J. Y., Park, S. C. (2012c). First description of ColE-type plasmid in Aeromonas spp. carrying quinolone resistance (qnrS2) gene. Lett. Appl. Microbiol., 55(4), stránky 290-4. Han, J. E., Kim, J. H., Cheresca, C. H. Jr., Shin, S. P., Jun, J. W., Chai, J. Y., Han, S. Y.; Park, S. C. (2012d). First description of the qnrS-like (qnrS5) gene and analysis of quinolone resistance-determining regions in motile Aeromonas spp. from diseased fish and water. Res. Microbiol., 163(1), stránky 73-9. Hansen, L. H., Jensen, L. B., Sørensen, H. I., & Sørensen, S. J. (2007). Substrate specificity of the OqxAB multidrug resistance pump in Escherichia coli and selected enteric bacteria. J. Antimicrob. Chemother., 60(1), stránky 145-7. Hata, M., Suzuki, M., Matsumoto, M., Takahashi, M., Sato, K., Ibe, S., Sakae, K. (2005). Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in Shigella flexneri 2b. Antimicrob. Agents Chemother., 49(2), stránky 801–803. Hernould, M., Gagné, S., Fournier, M., Quentin, C., & Arpin, C. (2008). Role of the AheABC efflux pump in Aeromonas hydrophila intrinsic multidrug resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 52(4), stránky 1559–1563. Hooper, D. C. (1998). Clinical applications of quinolones. Biochim. Biophys. Acta, 1400(1-3), stránky 45-61.

83

Huddleston, J. R., Brokaw, J. M., Zak, J. C., & Jeter, R. M. (2013). Natural transformation as a mechanism of horizontal gene transfer among environmental Aeromonas species. Syst. Appl. Microbiol., 36(4), stránky 224-34. Jacoby, G. A., Walsh, K. E., Mills, D. M., Walker, V. J., Oh, H., Robicsek, A., Hooper D. C. (2006). qnrB, another plasmid-mediated gene for quinolone resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 50(4), stránky 1178–1182. Janda, J. M., & Abbott, S. L. (2010). The genus Aeromonas: taxonomy, pathogenicity, and infection. Clin. Microbiol. Rev., 23(1), stránky 35-73 . Jongjareanjai, M., Assawawongkasem, N., & Chansue, N. (2009). In vitro antibiotic susceptibility of Aeromonas hydrophila isolated from disease ornamental fish. Thai J. Vet. Med., 39(3), stránky 225-229. Kelly, B. G., Vespermann, A., & Bolton, D. J. (2009). The role of horizontal gene transfer in the evolution of selected foodborne bacterial pathogens. Food Chem. Toxicol., 47(5), stránky 951-68. Kim, H. B., Park, C. H., Kim, C. J., Kim, E. C., Jacoby, G. A., & Hooper, D. C. (2009a). Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants over a 9-year period. Antimicrob. Agents Chemother., 53(2), stránky 639–645. Kim, H. B., Wang, M. H., Park, C. H., Kim, E. C., Jacoby, G. A., & Hooper, D. C. (2009b). oqxAB encoding a multidrug efflux pump in human clinical isolates of Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother., 53(8), stránky 3582-3584. Kulinska, A., Czeredys, M., Hayes, F., & Jagura-Burdzy, G. (2008). Genomic and functional characterization of the modular broad-host-range RA3 plasmid, the archetype of the IncU group. Appl. Environ. Microbiol., 74(13), stránky 4119–4132. Lesher, G. Y., Froehlich, E. J., Gruett, M. D., Bailey, J. H., & Brundage, R. P. (1962). 1,8-naphthyridine derivatives - a new class of chemotherapeutic agents. J. Med. Pharm. Chem., 91, stránky 1063-1065. Lewbart, G. A. (2001). Bacteria and ornamental fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine, 10(1), stránky 48-56 . Li, J., Wang, T., Shao, B., Shen, J., Wang, S., & Wu, Y. (2012). Plasmid-mediated quinolone resistance genes and antibiotic residues in wastewater and soil adjacent to swine feedlots: potential transfer to agricultural lands. Environ. Health Perspect., 120(8), stránky 1144–1149. Li, X. Z., & Nikaido, H. (2009). Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update. Drugs, 69(12), stránky 1555–1623. Lucas, J. S., & Southgate, P. C. (eds.) (2012). Aquaculture: Farming Aquatic Animals and Plants (2nd Edition). Velká Británie: Willey-Blackwell. 84

Lukkana, M., Wongtavatchai, J., & Chuanchuen, R. (2012). Class 1 integrons in Aeromonas hydrophila isolates from farmed Nile tilapia (Oreochromis nilotica). J. Vet. Med. Sci., 74(4), stránky 435-40. Lupo, A., Coyne, S., & Berendonk, T. U. (2012). Origin and evolution of antibiotic resistance: the common mechanisms of emergence and spread in water bodies. Front. Microbiol., 3, str. č. článku 18. Magiorakos, A. P., Srinivasan, A., Carey, R. B., Carmeli, Y., Falagas, M. E., Giske, C. G., Harbarth, S.; Hindler, J. F.; Kahlmeter, G.; Olsson-Liljequist, B.; Paterson, D. L.; Rice, L. B., Stelling, J.; Struelens, M. J.; Vatopoulos, A.; Weber, J. T.; Monnet, D. L. (2012). Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect., 18(3), stránky 268-81. Marti, E., & Balcázar, J. L. (2012). Multidrug resistance-encoding plasmid from Aeromonas sp. strain P2G1. Clin. Microbiol. Infect., 18(9), stránky E366-8. Marti, E., Huerta, B., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D., Jofre, J., & Balcázar, J. L. (2014). Characterization of ciprofloxacin-resistant isolates from a wastewater treatment plant and its receiving river. Water Res. 2014, 61, stránky 67-76. Martinez, J. L., Fajardo, A., Garmendia, L., Hernandez, A., Linares, J. F., Martínez-Solano, L., Sánchez, M. B. (2009). A global view of antibiotic resistance. FEMS Microbiol. Rev., 33(1), stránky 44-65. Martinez, M., McDermott, P., & Walker, R. (2006). Pharmacology of the fluoroquinolones: A perspective for the use in domestic animals. Veterinary journal, 172(1), stránky 1028 . Martínez-Martínez, L., Pascual, A., & Jacoby, G. A. (1998). Quinolone resistance from a transferable plasmid. Lancet, 351(9105), stránky 797-9. Martino, M. E., Fasolato, L., Montemurro, F., Rosteghin, M., Manfrin, A., Patarnello, T., Novelli, E.; Cardazzo, B. (2011). Determination of microbial diversity of Aeromonas strains on the basis of multilocus sequence typing, phenotype, and presence of putative virulence genes. Appl. Environ. Microbiol., 77(14), stránky 4986-5000. Miranda, C. D., Tello, A., & Keen, P. L. (2013). Mechanisms of antimicrobial resistance in finfish aquaculture environments. Front. Microbiol. 2013, 4, č. článku 233. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., & Correia, A. (2012). Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett., 330(2), stránky 157-64. Naviner, M., Gordon, L., Giraud, E., Denis, M., Mangion, C., Le Bris, H., Ganière, P. (2011). Antimicrobial resistance of Aeromonas spp. isolated from the growth pond

85

to the commercial product in a rainbow trout farm following a flumequine treatment. Aquaculture, 315(3-4), stránky 236–241. Ng, L K.., Mulvey, M. R., Martin I., Peters, G. A., & Johnson, W. (1999). Genetic characterization of antimicrobial resistance in Canadian isolates of Salmonella serovar Typhimurium DT104. Antimicrob. Agents Chemother., 43(12), stránky 3018-21. Nifty, J., & Hatha, A. A. M. (2012). Prevalence, distribution and drug resistance of motile aeromonads in freshwater ornamental fishes. Indian. J. Fish., 59(2), stránky 161-164. Novick, R. P. (1987). Plasmid incompatibility. Microbiol. Rev., 51(4), stránky 381–395. Olesen, I., Hasman, H., & Aarestrup, F. M. (2004). Prevalence of beta-lactamases among ampicillin-resistant Escherichia coli and Salmonella isolated from food animals in Denmark. Microb Drug Resist., 10(4), stránky 334-40. Orskov, F., & Orskov, I. (1983). From the national institutes of health. Summary of a workshop on the clone concept in the epidemiology, taxonomy, and evolution of the enterobacteriaceae and other bacteria. J. Infect. Dis., 148(2), stránky 346-57. Pallo-Zimmerman, L. M., Byron, J. K., & Graves, T. K. (2010). Fluoroquinolones: then and now. Compend. Contin. Educ. Vet., 32(7), stránky E1-9. Park, C. H., Robicsek, A., Jacoby, G. A., Sahm, D., & Hooper, D. C. (2006). Prevalence in the United States of aac(6′)-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme. Antimicrob. Agents Chemother., 50(11), stránky 3953-3955. Parker, J. L., & Shaw, J. G. (2011). Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. J. Infect. 2011, 62(2), stránky 109-18. Partridge, S. R. (2011). Analysis of antibiotic resistance regions in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev., 35(5), stránky 820-55. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., & Iredell, J. R. (2009). Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev, 33(4), stránky 757-84. Pérez-Moreno, M. O., Centelles-Serrano, M. J., Cortell-Ortolá, M., Fort-Gallifa, I., Ruiz, J., Llovet-Lombarte, M. I., Picó-Plana, E; Jardí-Baiges, A. M. (2011). Molecular epidemiology and resistance mechanisms involved in reduced susceptibility to amoxicillin/clavulanic acid in Klebsiella pneumoniae isolates from a chronic care centre. Int. J. Antimicrob. Agents., 37(5), stránky 462-6. Périchon, B., Courvalin, P., & Galimand, M. (2007). Transferable resistance to aminoglycosides by methylation of G1405 in 16S rRNA and to hydrophilic fluoroquinolones by QepA-mediated efflux in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother., 51(7), stránky 2464-9.

86

Perreten, V., & Boerlin, P. (2003). A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrob. Agents Chemother., 47(3), stránky 1169-1172. Picão, R. C., Poirel, L., Demarta, A., Silva, C. S., Corvaglia, A. R., Petrini, O., Nordmann, P. (2008). Plasmid-mediated quinolone resistance in Aeromonas allosaccharophila recovered from a Swiss lake. J. Antimicrob. Chemother, 62(5), stránky 948-50. Quesada, S. P., Paschoal, J. A., & Reyes, F. G. (2013). Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolonesa review. J. Food Sci., 78(9), stránky R1321-R1333. Rhodes, G., Parkhill, J., Bird, C., Ambrose, K., Jones, M. C., Huys, G., Swings, J.; Pickup, R W. (2004). Complete nucleotide sequence of the conjugative tetracycline resistance plasmid pFBAOT6, a member of a group of IncU plasmids with global ubiquity. Appl. Environ. Microbiol., 70(12), stránky 7497-510. Rico, A., & Van den Brink, P. J. (2014). Probabilistic risk assessment of veterinary medicines applied to four major aquaculture species produced in Asia. Sci. Total. Environ., 468469, stránky 630-41. Robicsek, A., Strahilevitz, J., Jacoby, G. A., Macielag, M., Abbanat, D., Park, C. H., Bush, K; Hooper, D. C. (2006a). Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nat. Med., 12(1), stránky 83-8. Robicsek, A., Strahilevitz, J., Sahm, D. F., Jacoby, G. A., & Hooper, D. C. (2006b). qnr prevalence in ceftazidime-resistant Enterobacteriaceae isolates from the United States. Antimicrob. Agents Chemother., 50(8), stránky 2872–2874. Rose, S., Hill, R., Bermudez, L. E., & Miller-Morgan, T. (2013). Imported ornamental fish are colonized with antibiotic-resistant bacteria. J. Fish. Dis., 36(6), stránky 533-542. Saejung, C., Hatai, K., & Sanoamuang, L. (2014). The in-vitro antibacterial effects of organic salts, chemical disinfectants and antibiotics against pathogens of black disease in fairy shrimp of Thailand. J. Fish. Dis., 37 (1), stránky 33-41. Sáenz, Y., Briñas, L., Domínguez, E., Ruiz, J., Zarazaga, M., Vila, J., a další. (2004). Mechanisms of resistance in multiple-antibiotic-resistant Escherichia coli strains of human, animal, and food origins. Antimicrob. Agents Chemother, 48(10), stránky 3996-4001. Sárközy, G. (2001). Quinolones: a class of antimicrobial agents. Vet. Med. - Czech, 46(9-10), stránky 257-274. Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., & de la Cruz, F. (2010). Mobility of plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 74(3), stránky 434-452.

87

Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., & Svabic-Vlahovic, M. (2000). A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods., 40(2), stránky 175-179. Strahilevitz, J., Jacoby, G. A., Hooper, D. C., & Robicsek, A. (2009). Plasmid-mediated quinolone resistance: a multifaceted threat. Clin. Microbiol. Rev, 22(4), stránky 664-89. Suzuki, S., & Hoa, P. T. P. (2012). Distribution of quinolones, sulfonamides, tetracyclines in aquatic environment and antibiotic resistance in Indochina. Front. Microbiol., 3, č. článku 67. Thomas, C. M., & Nielsen, K. M. (2005). Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nat. Rev. Microbiol., 3, stránky 711-21. Tlusty, M. (2002). The benefits and risks of aquacultural production for the aquarium trade. Aquaculture, 205 (3-4), stránky 203-219 . Vashist, J., Vishvanath, Kapoor, R., Kapil, A., Yennamalli, R., Subbarao, N., Rajeswari, M. R. (2009). Interaction of nalidixic acid and ciprofloxacin with wild type and mutated quinolone-resistance-determining region of DNA gyrase A. Indian J. Biochem. Biophys., 46(2), stránky 147-53. Verner-Jeffreys, D. W., Welch, T. J., Schwarz, T., Pond, M. J., Woodward, M. J., Haig, S. J., Rimmer, G. S. E.; Roberts, E.; Morrison, V.; Baker-Austin, C. (2009). High prevalence of multidrug-tolerant bacteria and associated antimicrobial resistance genes isolated from ornamental fish and their carriage water. PLoS One, 4(12), č. článku e8388. Vetting, M. W., Hegde, S. S., Wang, M., Jacoby, G. A., Hooper, D. C., & Blanchard, J. S. (2011). Structure of QnrB1, a plasmid-mediated fluoroquinolone resistance factor. J. Biol. Chem., 286(28), stránky 25265–25273. Wang, M., Guo, Q., Xu, X., Wang, X., Ye, X., Wu, S., Hooper, D. C, Wang, M.. (2009). New plasmid-mediated quinolone resistance gene, qnrC, found in a clinical isolate of Proteus mirabilis. Antimicrob. Agents Chemother., 53(5), stránky 1892-7. Wasyl, D., Hoszowski, A., & Zając, M. (2014). Prevalence and characterisation of quinolone resistance mechanisms in Salmonella spp. Vet. Microbiol., 171(3-4), stránky 307-14. Weir, M., Rajić, A., Dutil, L., Cernicchiaro, N., Uhland, F. C., Mercier, B., Tuševljak, N. (2012). Zoonotic bacteria, antimicrobial use and antimicrobial resistance in ornamental fish: a systematic review of the existing research and survey of aquaculture-allied professionals. Epidemiol. Infect., 140(2), stránky 192-206. White, P. A., McIver, C. J., & Rawlinson, W. D. (2001). Integrons and gene cassettes in the Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother., 45(9), stránky 2658-61.

88

Whittington, R. J., & Chong, R. (2007). Global trade in ornamental fish from an Australian perspective: the case for revised import risk analysis and management strategies. Prev. Vet. Med., 81(1-3), stránky 92-116. Woodford, N., Turton, J. F., & Livermore, D. M. (2011). Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance. FEMS Microbiol. Rev., 35(5), stránky 736-55. Xia, R., Guo, Y., Zhang, Y., & Xu, H. (2010). qnrVC-like gene located in a novel complex class 1 integron harboring the ISCR1 element in an Aeromonas punctata strain from an aquatic environment in Shandong Province, China. Antimicrob. Agents Chemother., 54(8), stránky 3471–3474. Xu, X., Cui, S., Zhang, F., Luo, Y., Gu, Y., Yang, B., Li, F.; Chen, Q.; Zhou, G.; Wang, Y.; Pang, L.; Lin, L. (2014). Prevalence and characterization of cefotaxime and ciprofloxacin co-resistant Escherichia coli isolates in retail chicken carcasses and Ground Pork, China. Microb. Drug Resist., 20(1), stránky 73-81. Yamane, K., Wachino, J., Suzuki, S., Kimura, K., Shibata, N., Kato, H., Shibayama, K.; Konda, T.; Arakawa, Y. (2007). New plasmid-mediated fluoroquinolone efflux pump, QepA, found in an Escherichia coli clinical isolate. Antimicrob. Agents Chemother., 51(9), stránky 3354–3360. Yanong, J. P. (2013). Use of antibiotics in ornamental fish aquaculture. Circular 84, University of Florida, USA. Získáno 25. 6. 2014. URL: http://edis.ifas.ufl.edu/fa084. Yoshida, H., Bogaki, M., Nakamura, M., & Nakamura, S. (1990). Quinolone resistancedetermining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother., 34(6), stránky 1271–1272. Zhao, J. Y., & Dang, H. (2012). Coastal seawater bacteria harbor a large reservoir of plasmidmediated quinolone resistance determinants in Jiaozhou Bay, China. Microb. Ecol., 64(1), stránky 187-99. Zhao, S., White, D. G., Ge, B., Ayers, S., Friedman, S., English, L., Wagner, D.; Gaines, S.; Meng, J. (2001). Identification and characterization of integron-mediated antibiotic resistance among Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates. Appl. Environ. Microbiol., 67(4), stránky 1558-64.

89

10.

Seznam příloh

Příloha č. 1: Plný text publikace (Dobiasova a kol. 2014).

90

Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421

Contents lists available at ScienceDirect

Veterinary Microbiology journal homepage: www.elsevier.com/locate/vetmic

Ornamental fish as a source of plasmid-mediated quinolone resistance genes and antibiotic resistance plasmids Hana Dobiasova a,b, Iva Kutilova a, Veronika Piackova c, Tomas Vesely d, Alois Cizek b,e, Monika Dolejska a,b,* a

Department of Biology and Wildlife Diseases, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackeho tr. 1/3, 612 42 Brno, Czech Republic b CEITEC VFU, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackeho tr. 1/3, 612 42 Brno, Czech Republic c South Bohemian Research Center of Aquaculture and Biodiversity of Hydrocenoses, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Zatisi 728/II, 389 25 Vodnany, Czech Republic d Veterinary Research Institute, Hudcova 296/70, 621 00 Brno, Czech Republic e Department of Infectious Diseases and Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences, Brno, Czech Republic

A R T I C L E I N F O

A B S T R A C T

Keywords: Aeromonas Ornamental fish Quinolone resistance Plasmids

Growing ornamental fish industry is associated with public health concerns including extensive antibiotic use accompanied by increasing antibiotic resistance. The aim of this study was to analyze Aeromonas isolates from imported tropical ornamental fish and coldwater koi carps bred in the Czech Republic to assess the potential risk of ornamental fish as a source of plasmid-mediated quinolone resistance genes (PMQR) and antibiotic resistance plasmids. A collection of Aeromonas spp. with reduced susceptibility to ciprofloxacin (MIC  0.05 mg/L) was selected for the detection of PMQR genes. Isolates harbouring PMQR genes were further analyzed for the additional antibiotic resistance, integron content, clonality, biofilm production and transferability of PMQR genes by conjugation and transformation. Comparative analysis of plasmids carrying PMQR genes was performed. Fifteen (19%, n = 80) isolates from koi carps and 18 (24%, n = 76) isolates from imported ornamental fish were positive for qnrS2, aac(60 )-Ib-cr or qnrB17 genes. PMQR-positive isolates from imported ornamental fish showed higher MIC levels to quinolones, multiresistance and diverse content of antibiotic resistance genes and integrons compared to the isolates from the carps. Related IncU plasmids harbouring qnrS2 and aac(60 )-Ib-cr genes were found in Aeromonas spp. from imported ornamental fish and koi carps from various geographical areas. Ornamental fish may represent a potential source of multiresistant bacteria and mobile genetic elements for the environment and for humans. ß 2014 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction

* Corresponding author at: Department of Biology and Wildlife Diseases, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackeho tr. 1/3, 612 42 Brno, Czech Republic. Tel.: +420 541 562 643; fax: +420 541 562 631. E-mail address: [email protected] (M. Dolejska). http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.02.011 0378-1135/ß 2014 Elsevier B.V. All rights reserved.

Intensive fish farming has resulted in increasing problems of bacterial diseases leading to the subsequent heavy use of antibiotics (Cabello et al., 2013). Over 1 billion ornamental fish are traded globally each year (Whittington and Chong, 2007). Several public health concerns have

414

H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421

been associated with the ornamental fish industry such as the transmission of zoonotic pathogens to humans and terrestrial animals, antimicrobial use practices and antibiotic resistance (Lupo et al., 2012; Weir et al., 2012). The ornamental fish producers tend to administer antibiotics for a prophylactic or preventive treatment in order to decrease the bacterial disease outbreaks while fish are recovering from harvesting and handling and to increase their survival during shipment. Excessive or incorrect use of a prophylactic treatment can increase selection and facilitate the spread of antibiotic-resistant bacteria (Weir et al., 2012). Specific antibiotics as nitrofurans, quinolones and oxytetracycline are commonly used in the ornamental fish trade. Quinolones are broad-spectrum antimicrobial agents widely used in both human and veterinary medicine and they are among the most widely used antibiotics in the aquacultures (Smith, 2008). Their extensive use has been associated with worldwide increasing quinolone resistance. Resistance to quinolones is mediated by specific chromosomal mutations or by plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes that play an important role in dissemination of quinolone resistance via horizontal gene transfer (HGT; Strahilevitz et al., 2009). PMQR determinants include Qnr proteins, aac(60 )-Ib-cr and efflux pumps and confer high level of resistance to nalidixic acid and low level fluoroquinolone resistance in bacteria according to CLSI breakpoints. However, the presence of PMQR can facilitate the emergence of high level fluoroquinolone resistance via mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV genes gyrA and parC (Cattoir et al., 2008; Verner-Jeffreys et al., 2009; Han et al., 2012a,b). Aeromonads are suitable indicator bacteria for studying the incidence and development of antibiotic resistance in aquacultures (Naviner et al., 2011). These bacteria are interconnected within the water ecosystem, colonize fish and can cause various infections. Antibiotic resistance in Aeromonas spp. from imported ornamental fish is of high concern for public health (Verner-Jeffreys et al., 2009; Sreedharan et al., 2012). Aeromonas spp. have been proven to cause human infections (Parker and Shaw, 2011). The greatest potential public health risk linked with extensive antimicrobial use in aquaculture is the development of reservoirs of antibiotic resistance genes in aquatic ecosystems from where such genes can be spread by HGT to other bacteria including human pathogens (Lupo et al., 2012). There is limited information on mobile genetic elements transferring quinolone-resistance genes in Aeromonas from ornamental fish (Verner-Jeffreys et al., 2009; Han et al., 2012a,b). The aim of this study was to analyze Aeromonas isolates from imported tropical ornamental fish and coldwater koi carps bred in the Czech Republic to assess the potential risk of ornamental fish as a source of plasmid-mediated quinolone resistance genes and antibiotic resistance plasmids. 2. Material and methods 2.1. Bacterial isolates A collection of 156 Aeromonas spp. isolates originating from tropical freshwater ornamental fish (76 isolates) and

coldwater ornamental (koi) carps (80 isolates) was analyzed in this study. Koi carp isolates were gained from gills and skin swabs of euthanized healthy fish on 7 farms in 2005 and 2006 (Cizek et al., 2010). Tropical freshwater ornamental fish were sampled in a wholesale distributor (Hodonin, Czech Republic) during their health inspection after they arrived to the Czech Republic from Vietnam, Thailand, China, Slovakia, Brazil and Peru between 2005 and 2007. Fish were kept and transported in their original carriage water in sealed bags in polystyrene boxes. The samples were obtained from skin, gills and body cavity swabs of diseased fish. All samples were cultivated on Columbia agar (CM331; Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) supplemented with 5% sheep blood and suspect Aeromonas cultures were identified as described elsewhere (Cizek et al., 2010). Susceptibility to ciprofloxacin (0.015– 128 mg/L) of all Aeromonas isolates was determined by agar dilution method in accordance with Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 2006, 2008). Quality control was done using reference strains Escherichia coli ATCC 25922 and Aeromonas salmonicida spp. salmonocida ATCC 33658. 2.2. Detection of PMQR genes and characterization of PMQRpositive isolates Isolates with minimum inhibitory concentration (MIC) to ciprofloxacin 0.05 mg/L were selected for the detection of PMQR genes (qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, aac(60 )-Ib-cr, qepA, oqxAB) using PCR followed by sequencing (Literak et al., 2012). Isolates positive for PMQR genes were further characterized. Susceptibility to 8 antibiotics (chloramphenicol, gentamicin, nitrofurantoin, florfenicol, oxytetracycline, sulfonamides cp., sulfamethoxazole/trimethoprim, trimethoprim) was determined by disc diffusion method (CLSI, 2006). The selection of the tested antibiotics is based on their approved common use (e.g. tetracycline) or offlabel use (e.g. chloramphenicol) in food or ornamental fish farming. The isolates were tested for tetracycline resistance genes tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E), chloramphenicol resistance genes catA1, cmlA and floR, sulfonamide resistance genes sul1, sul2, sul3, beta-lactamase gene blaOXA-1, the class 1 and class 2 integrase genes intI1 and intI2, respectively, the variable region of class 1 integrons and gene cassettes inside the integron structure (Wilkerson et al., 2004; Dolejska et al., 2007). Clonality of the isolates was examined by XbaI digestion and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Restriction profiles were analyzed using BioNumerics fingerprinting software (Applied Maths, Belgium). Cluster analysis of the dice similarity indices was done to generate a dendrogram describing the relationships among PFGE profiles. Isolates were considered to be related and to belong to the same PFGE cluster if their Dice similarity indices were 85%. Letters were used to discriminate PFGE patterns assigned to the same cluster. Biofilm production was tested using crystal violet biofilm assay (Genevaux et al., 1996) and all tested isolates were assigned to one of the four categories based on their adherence capabilities (non-adherent, weakly, moderately and strongly adherent strains) according to Stepanovic´ et al. (2000). MICs to nalidixic acid (NA), oxolinic acid (OA), flumequine (UB) and enrofloxacin (ENR) were determined by agar dilution method (CLSI, 2006, 2008).

H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421

2.3. Transferability of PMQR genes Conjugative transfer of plasmids carrying PMQR genes was tested. Plate-mating experiments were performed using plasmid-free, rifampicin- and sodium azide-resistant E. coli and Aeromonas sp. recipient strains at 28 8C and 37 8C. Plasmid DNA from Aeromonas strains was isolated by the alkaline extraction procedure and introduced to competent E. coli DH5a (Invitrogen, USA) by chemical transformation followed by selection of transformants on Luria Bertani agar (Difco, USA) supplemented with ciprofloxacin (0.05 mg/L). The presence of the relevant PMQR gene in transformants was confirmed by PCR. Cotransfer of other antibiotic resistance genes and integrons was tested. The sizes of plasmids carrying PMQR genes in donors and transformants were determined by S1 nuclease-PFGE. 2.4. Analysis of plasmids harbouring PMQR genes Only PMQR-positive transformants carrying a single plasmid were further analyzed. Plasmids were replicontyped (Carattoli et al., 2005; Cattoir et al., 2008). Plasmid DNA from transformants was transferred to a positively charged nylon membrane (Biodyne1 B, Pall Corporation, USA) by Southern blot and hybridized with qnrS2, aac(60 )-Ibcr and IncU rep gene probes labelled with DIG-11-dUTP by PCR using PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Germany). Detection of hybridizations was performed using the DIG Wash and Block Buffer Set (Roche Diagnostics). All plasmids were analyzed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) using the HincII (Takara, Otsu, Japan) or AluI (Takara) restriction enzymes. Digested fragments were separated by electrophoresis in a 1% agarose gel for 14 h at 67 V/cm. Letters were used to discriminate RFLP patterns. Restricted plasmids belonging to IncU were transferred by Southern blot and hybridized with qnrS2, aac(60 )-Ib-cr and IncU rep gene probes. PCR screening and sequencing were used to determine the surrounding region of the qnrS2 gene using primers targeting qnrS (qnrS FW 50 GCAAGTTCATTGAACAGGGT-30 ; qnrS RV 50 -TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG-30 ) and a putative zinc-metalloprotease gene mpR (mpR FW 50 -CTTACGACGAACTACAGCGG-30 ; mpR RV 50 -CATCCAACTGATCCGATAGTC-30 ). IncU plasmid P2G1 (GenBank accession no. HE616910) from Aeromonas spp. harbouring qnrS2 was used as a reference sequence to design the primers targeting the mpR gene. 2.5. Data analysis The results obtained were statistically evaluated by chisquare test using MS Excel software with the Analyze-it module. Differences with p  0.05 were considered as significant. 3. Results and discussion 3.1. Antimicrobials in ornamental fish farming The use of antibiotics in aquacultures in developed countries has been restricted to avoid potential selection

415

of human pathogens resistant to antimicrobials effective in clinical practices (Cabello, 2006). In the Czech Republic oxytetracycline and flumequine are permitted for therapeutic usage in aquacultures. However, the situation is more problematic in countries where such regulations are less stringent or even missing and various antimicrobial substances are used in aquacultures in uncontrolled manner. Some of these countries include important world producers of ornamental fish. The Czech Republic imports live ornamental fish from sources as diverse as Vietnam, Indonesia, Malaysia, China, Singapore, Thailand, Nigeria and Peru. Given the stress during air transport, antimicrobials and chemical additives are routinely added to the transport water to prevent the growth of potential pathogens (Cole et al., 1999). Considering the widespread use of quinolones in aquacultures and their importance for human health, Aeromonas spp. harbouring plasmid-mediated quinolone resistance originated from imported ornamental fish and koi carps bred in the Czech Republic were the focus of this study. 3.2. Aeromonas from ornamental fish shows high prevalence of qnrS2 gene Thirty-six (45%, n = 80) Aeromonas isolates from koi carps and 76 (n = 76, 100%) from imported ornamental fish showed decreased susceptibility to ciprofloxacin (MIC  0.05 mg/L). These isolates were selected for detection of PMQR genes using PCR followed by sequencing. Fifteen (19%, n = 80) isolates from koi carps and 18 (24%, n = 76) isolates from imported ornamental fish were positive for at least one PMQR gene. The gene qnrS2 was the most prevalent followed by aac(60 )-Ib-cr and qnrB17 (Table 1). Twelve isolates contained two or three PMQR genes and the combination of qnrS2 + aac(60 )-Ib-cr was frequently observed. No significant difference in prevalence of PMQR genes between carps and imported ornamental fish was observed (p  0.05). All PMQR-positive isolates were identified as species complexes based on phenotypic testing criteria (Cizek et al., 2010): Aeromonas hydrophila (17 isolates), Aeromonas sobria (15) and one isolate belonged to A. hydrophila/sobria. Clonal relatedness of all 33 Aeromonas isolates carrying PMQR genes was tested by XbaI-PFGE. The isolates were divided into 5 clusters (AE) based on their restriction profiles. Clonally related isolates from tropical ornamental fish and koi carps were found (Table 1). The gene qnrS2 in quinolone-resistant Aeromonas isolates from ornamental fish has been identified previously (Han et al., 2012a,b; Verner-Jeffreys et al., 2009). High (37%) prevalence of qnrS2 gene was reported in Aeromonas spp. from imported cold- and warmwater ornamental fish and their carriage water in UK (VernerJeffreys et al., 2009). Aeromonas harbouring qnrS2 is isolated from diverse aquatic environment (Cattoir et al., 2008; Pica˜o et al., 2008) but also from human infections (Arias et al., 2010) indicating the wide distribution of this gene in population of aeromonads in different sources and geographical areas.

Tropical fish

A. sobria

A. sobria

A. sobria

A. sobria

A. sobria

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila/ sobria A. hydrophila A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. hydrophila

A. sobria

CH10

CH11

CH12

CH13

CH20

CH21

CH26/1

CH31

CH36

CH38 CH39

CH40

CH44

CH45

CH47

CH48

CH59

Species complexa

A. sobria A. sobria

N42

Isolate

Singapore

Slovakia

Slovakia

Vietnam

Vietnam

Vietnam

Vietnam Vietnam

Vietnam

Vietnam

Thailand

Thailand

Vietnam

Thailand

Thailand

Vietnam

Vietnam

Vietnam

Originb

NT

D3

B1

B1

B1

B2

A3 A3

A2

A1

A1

NT

NT

NT

D1

D1

D2

NT

PFGEc

qnrS2, aac(60 )-Ib-cr

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2 qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2

qnrS2, qnrB17, aac(60 )-Ib-cr qnrS2

qnrS2, aac(60 )-Ib-cr

qnrS2, aac(6 )-Ib-cr

0

qnrS2, aac(60 )-Ib-cr

qnrS2, aac(60 )-Ib-cr qnrS2, aac(60 )-Ib-cr

PMQR genes

128 128

512 256

128

512

256 64 128

256 256

256

64

32

>128

>128

>128

>128

256

256

>128 128

>128

32

32

32

32

32

128

128

64

64

OA

256 256

>512

>512

>512

>512

512 512

>256

128

512

>512

128

512

128

128

512

256

128

128

UB

512

512

NA

MIC (mg/mL)d

Table 1 Aeromonas isolates from imported tropical ornamental fish and koi carps harbouring PMQR genes.

64

16

>64

>64

>64

>64

>64 >64

>64

32

32

32

64

64

>64

>64

>64

64

ENR

>128

32

>128

>128

>128

>128

>128 >128

>128

64

64

64

128

128

>128

>128

>128

>128

CIP

C, FFC, OT, S3, SXT, T

OT, S3, SXT, T

OT, S3, SXT, T

C, FFC, OT, S3, SXT, T

C, FFC, OT, S3, SXT, T

C, CN, OT, S3, SXT, T C, FFC, OT, S3, SXT, T C, FFC, OT, S3, SXT, T C, FFC, OT, S3, SXT, T C, FFC, OT, S3, SXT, T C, FFC, OT, S3, SXT, T C, CN, OT, S3, SXT, T C, CN, FFC, OT, S3, SXT, T C, CN, FFC, OT, S3, SXT, T C, FFC, S3, SXT, T OT C, FFC, OT, S3, SXT, T C, FFC, OT, S3, SXT, T

Antibiotic resistance phenotypee

sul1, tet(B), tet(E), floR sul1, sul2, tet(B), floR sul1, tet(B), blaOXA-1

sul1, tet(B), floR

sul1, tet(B), floR

sul1, tet(B), floR

tet(E) sul1

sul1, tet(D), floR

sul1, tet(D), floR

sul1, tet(D), floR

sul1, sul2, tet(B), floR sul1, sul2, tet(B), floR sul1, sul2, tet(B), floR sul1, tet(B), floR, blaOXA-1 sul1, sul2, tet(B), floR sul1, tet(B)

sul1, tet(B)

Additional antibiotic resistance genes

–

2

–; 1.3

2; 2.4

2; 2.4

2; 2.4

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2; arr3-aacA4dfrA1-orf dfrA12-aadA2; arr3-aacA4dfrA1-orf dfrA12-aadA2; arr3-aacA4dfrA1-orf dfrA12-aadA2; arr3-dfrA27 orf-aadA1

arr3-aacA4dfrA1-orf – –

2.4 – –

dfrA12-aadA2

dfrA22; dfrA12-aadA2 dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

dfrA12-aadA2

Gene cassettes

2

2

0.75; –

–

–

–

–

–

–

Integron size (kb)f

ÿ

ÿ

ÿ

ÿ

ÿ

ÿ

+ +

+

+

+

+

ÿ

+

+

+

+

+

TFg

416 H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421

4 6 7 10 93 224 225 227 228 231 232 233 236 240 250

A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A.

hydrophila hydrophila hydrophila hydrophila sobria sobria hydrophila hydrophila sobria sobria sobria sobria sobria hydrophila hydrophila

A (2005) A (2005) A (2005) A (2005) C (2005) A (2006) A (2006) A (2006) A (2006) A (2006) A (2006) A (2006) A (2006) B (2006) B (2006)

A5 A4 A4 A5 NT NT NT E C3 C2 C1 C1 C4 C5 A6 qnrS2, qnrS2, qnrS2, qnrS2, qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2 qnrS2, aac(60 )-Ib-cr

aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr

128 128 128 128 128 128 256 512 512 128 512 512 512 512 256

32 64 32 32 4 32 32 64 32 32 64 64 32 32 32

16 16 16 16 4 8 8 16 8 8 16 16 64 8 16

4 4 4 4 1 4 16 16 4 2 16 16 16 4 1

8 8 8 4 0.25 4 8 8 4 4 4 4 8 4 1

– – – – OT S3 – C, OT OT OT, S3, SXT OT, S3, SXT, T OT, S3, SXT, T C, OT, S3, SXT, T OT –

– – – – tet(B) sul1, tet(A) – tet(E) tet(E) tet(E) sul1, tet(D) sul1, tet(D) sul1, tet(E) – –

– – – – – 1 – – – – 2 2 1.6 – –

– – – – – qacD2-orf – – – – dfrA12-aadA2 dfrA12-aadA2 dfrB1-aadA1 – –

+ + + + + + + + + + + + + + +

b

Identification as species complexes based on phenotypic testing criteria (Cizek et al., 2010). Aeromonas isolates originated from 7 koi carp farms in the Czech Republic designed as A-G. Isolates positive for PMQR genes were found only in three farms A, B and C. The year of the isolation is indicated in brackets. c Isolates were considered to be related and to belong to the same PFGE cluster designed by letter A-E if their Dice similarity indices were 85%. Isolates that belonged to the same cluster but showed one or more band differences in PFGE pattern were distinguished by numbers (e.g. A1, A2, etc.). NT, isolates non-typeable by XbaI-PFGE. d MIC, minimal inhibitory concentration; NA, nalidixic acid; UB, flumequine; OA, oxolinic acid; ENR, enrofloxacin; CIP, ciprofloxacin. e C, chloramphenicol; CN, gentamicin; FFC, florfenicol; OT, oxytetracycline; S3, sulfonamides cp.; SXT, sulfamethoxazole/trimethoprim; T, trimethoprim. f Size of variable region amplified using primers 50 CS and 30 CS (Dolejska et al., 2007) targeting 50 - and 30 -conservative region of class 1 integrons is indicated in kb. Some class 1 integrons showed negative results of PCR amplification but PCR mapping using primers targeting 50 -conservative region and variable region (gene cassettes dfrA12 and aadA2) was positive. ÿ, conservative region of class 1 integron was not detected by PCR using 5’CS and 3’CS primers. g TF, transfer of PMQR genes to E. coli recipients using chemical transformation; +, positive; ÿ, negative.

a

Koi carps

H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421 417

418

H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421

3.3. Multiresistance and diverse integrons in Aeromonas from imported ornamental fish Isolates showed variable MIC levels to ciprofloxacin (0.25 – >128 mg/L); those from tropical ornamental fish showed higher MIC levels (64 – >128 mg/L) than isolates from koi carps (0.25–8 mg/L). These MIC levels exceeding CLSI breakpoints might indicate the presence of chromosomal mutations in topoisomerase genes (Strahilevitz et al., 2009). PMQR-positive Aeromonas spp. from imported ornamental fish showed higher MIC levels to all tested quinolones, multiresistance phenotypes, more diverse set of antibiotic resistance genes and integrons in contrast to koi carp isolates (Table 1). The results may indicate that various antibiotics in more extensive manner are used in imported ornamental fish than koi carps that were bred in the Czech Republic and therefore subjected to antibiotic use restriction applied in this country. Additional resistance to chloramphenicol, florfenicol, oxytetracycline, sulfamethoxazole and trimethoprim was common in isolates from imported ornamental fish which are antimicrobials commonly used in fish farming, especially in developing countries. Relevant genes conferring resistance to these antimicrobials were detected (Table 1). Most (89%) isolates from imported tropical ornamental fish contained a variable set of class 1 integrons with antibiotic resistance gene cassettes and five of them harboured two different types of class 1 integrons (Table 1). Similarly, Verner-Jeffreys et al. (2009) have demonstrated that 50% Aeromonas isolates from imported ornamental fish in UK possessed class 1 integrons. In our study, all integron-positive isolates contained sulfonamide resistance gene sul1 as an

essential part of class 1 integrons. Gene cassettes dfrA12 and aadA2 were the most prevalent and were identified in 16 isolates. These gene cassettes are commonly reported in Aeromonas from aquatic environments but also from humans (Lee et al., 2008; Lukkana et al., 2012). In nine isolates positive for dfrA12 and aadA2 genes PCR reaction using primers targeting 50 and 30 conservative region of class 1 integron (50 CS and 30 CS primers) was negative. PCRs using combination of primers targeting 50 conservative region of class 1 integron with dfrA12 or aadA2 gene cassettes were positive. The results indicate a mutation in 30 region of these integrons. Such atypical integrons have been previously reported in aeromonads from ornamental fish in Thailand (Lukkana et al., 2012). Integrons with unusual structure harbouring rifampicin resistance gene arr3 along with aminoglycoside and trimethoprim resistance gene cassettes aacA4 and dfrA1, respectively, were identified in isolates from imported ornamental fish. These integrons showed 99% homology to an integron described in Vibrio cholerae (AB219236). Rifampicin is commonly used for the treatment of mycobacterial infections in humans including the cases of Mycobacterium marinum infection associated with ornamental fish exposure (Tigges et al., 2009). The presence of rifampicin resistance genes in ornamental fish may represent a possible risk for public health. 3.4. Biofilm formation and the role of horizontal gene transfer in aquatic environments All Aeromonas isolates carrying PMQR genes from both imported ornamental fish and koi carps examined in our study showed ability to form biofilm. According to the

Table 2 Characterization of PMQR-harbouring plasmids in transformants from Aeromonas isolates originating from imported tropical ornamental fish and koi carps. Isolate N42 CH10 CH11 CH12 4 6 7 10 CH21 227 CH31 CH36 CH26/1 CH38 CH39 93 224 a

Species complexa

Originb

PFGEc

Location of PMQR and AR genesd

RFLPe

A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A.

Tropical fish (Vietnam) Tropical fish (Vietnam) Tropical fish (Vietnam) Tropical fish (Thailand) Koi carp (farm A) Koi carp (farm A) Koi carp (farm A) Koi carp (farm A) Tropical fish (Thailand) Koi carp (farm A) Tropical fish (Vietnam) Tropical fish (Vietnam) Tropical fish (Thailand) Tropical fish (Vietnam) Tropical fish (Vietnam) Koi carp (farm C) Koi carp (farm A)

NT D2 D1 D1 A5 A4 A4 A5 NT E A1 A2 A1 A3 A3 NT NT

IncU (20 kb): qnrS2, IncU (20 kb): qnrS2, IncU (20 kb): qnrS2, IncU (20 kb): qnrS2, IncU (20 kb): qnrS2, IncU (20 kb): qnrS2, IncU (20 kb): qnrS2, IncU (20 kb): qnrS2, IncU (35 kb): qnrS2, IncU (40 kb): qnrS2 NT (<20 kb): qnrS2 NT (<20 kb): qnrS2 NT (<20 kb): qnrS2 NT (<20 kb): qnrS2 NT (<20 kb): qnrS2 NT (<20 kb): qnrS2 NT (<20 kb): qnrS2

a a a a a a a a b c d e e f g h i

sobria sobria sobria sobria hydrophila hydrophila hydrophila hydrophila sobria hydrophila hydrophila hydrophila/sobria hydrophila hydrophila hydrophila sobria sobria

0

aac(6 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr aac(60 )-Ib-cr sul1, Int 0.75 kb: dfrA22

Identification as species complexes based on phenotypic testing criteria (Cizek et al., 2010). Isolates were obtained from Tropical fish (country of origin is given in the brackets) and Koi carp farm A and C in the Czech Republic. c Isolates were considered to be related and to belong to the same PFGE cluster designed by letter A-E if their Dice similarity indices were 85%. Isolates that belonged to the same cluster but showed one or more band differences in PFGE pattern were distinguished by numbers (e.g. A1, A2, etc.). NT, isolates non-typeable by XbaI-PFGE. d PMQR and other antibiotic resistance genes were located on IncU and non-typeable plasmids. Size of plasmids (in kb) is shown in the brackets; AR, antibiotic resistance; Int, class 1 integron including the size of variable region and a gene cassette. e RFLP, restriction fragment length polymorphism profiles of plasmid DNA obtained by HincII (IncU plasmids) and AluI (NT, non-typeable plasmids) digestion. Identical RFLP paterns of IncU plasmids are indicated by letters a–c. RFLP profiles of non-typeable plasmids are differentiated by letters d–i. b

H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421

419

classification proposed by Stepanovic´ et al. (2000), 48% (n = 16) and 52% (n = 17) Aeromonas isolates were weakly and moderately adherent, respectively. Biofilm matrix with high density of bacteria concentrated in a limited place may represent a suitable environment for HGT processes in aquatic ecosystems (Lupo et al., 2012). HGT and recombination of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements between different bacterial species are promoted under selective pressure including residual and subinhibitory antimicrobial concentrations of tetracyclines and quinolones in sediments (Kruse and Sørum, 1994). Quinolones are slowly degraded and are well-known inducers of mutagenesis and antimicrobial tolerance (Blazquez et al., 2012). In our study, PMQR genes from 79% Aeromonas isolates were transferred to recipient E. coli cells by chemical transformation. Despite the method used, Huddleston et al. (2013) demonstrated that Aeromonas spp. belong to naturally transformable bacteria and 73% and 100% of tested aeromonads could act as a recipients and donors of DNA, respectively. Aeromonas may play an important role in the dissemination of antibiotic resistance genes and resistance plasmids in aquatic environment. Conjugative transfer to recipient cells of Aeromonas spp. and E. coli was not successful. Low conjugative ability of Aeromonas plasmids has been demonstrated (Cattoir et al., 2008). 3.5. IncU plasmids as vectors of quinolone resistance in aquatic environment A total of 17 transformants harbouring a single plasmid were obtained for further comparative analyses (Table 2). In seven transformants the gene qnrS2 was presented on small plasmids of different RFLP profiles designed as untypeable by the methods used. Small IncQ and ColE-type plasmids have been demonstrated to be involved in the dissemination of qnrS2 gene in Aeromonas isolates in aquatic environments (Han et al., 2012a,b). However, any PCR-based typing scheme for IncQ and ColE plasmids from aquatic bacteria has not been proposed up to now. In most transformants PMQR genes were found to be associated with plasmids of IncU family. IncU plasmids of 20 kb in size harbouring qnrS2 and aac(60 )-Ib-cr genes showing identical RFLP patterns were identified in Aeromonas strains from both koi carps from the Czech Republic and ornamental fish imported from Vietnam and Thailand (Table 2, Fig. 1). Hybridization experiments of these plasmids showed the location of qnrS2, aac(60 )-Ib-cr and IncU rep gene on particular DNA fragments. Two strains (CH21, 227) contained 35 and 40 kb IncU plasmids that showed differences in PMQR gene content, RFLP patterns and location of IncU rep and qnrS2 gene compared to the 20-kb IncU plasmids (Table 2, Fig. 1). PCR mapping of the qnrS2 surrounding regions was performed in all transformants harbouring IncU plasmids. The gene qnrS2 in isolates was inserted within the mpR gene encoding a putative zincmetalloprotease as found in p37 and p42 IncU plasmids from Aeromonas punctata (EU439940) and Aeromonas media (EU439941), respectively. In transformants of tropical ornamental fish and koi carp (isolates no. CH21 and 227) the qnrS2 region showed 100% identity to the

Fig. 1. HincII restriction profiles of IncU plasmids. Letters used at the heading of the picture represent particular RFLP patterns of IncU plasmids (a–c). Plasmids showing identical RFLP patterns are designed by the same letter. Restriction fragments identified by DIG-11-dUTP-labelled probes used for hybridization experiments are indicated with arrows in representative plasmids showing different RFLP patterns a–c. Probes targeted sequences of qnrS2, aac(60 )-Ib-cr and IncU rep genes. Two restriction fragments were expected for the hybridization with IncU rep probe, since this gene contains an internal HincII restriction site. Plasmid DNA of E. coli transformants of respective Aeromonas isolates on the gel: lane 1, N42; lane 2, CH10; lane 3, CH11; lane 4, CH12; lane 6, 6; lane 7, 7; lane 8, CH21; lane 9, 227; lane 11, 4; lane 12, 10. Lanes 5, 10, HighRanger Plus 100 bp DNA ladder (Norgen Biotek).

reference sequences p37 and p42. In the remaining IncU plasmids, PCR mapping of the region flanking the 50 end of the qnrS2 failed while the region surrounding the qnrS2 at 30 end showed 100% homology to p37 and p42. The results indicate a different structure of qnrS2 upstream region in these plasmids such as an insertion of other genes separating qnrS2 from 50 end of mpR gene and resulting in failure of PCR amplification. Members of the IncU plasmid group are implicated particularly in the dissemination of antibiotic resistance in Aeromonas strains associated with fish and aquatic environments (Sørum et al., 2003; Cattoir et al., 2008).

420

H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421

Aeromonas isolates harbouring qnrS2 and/or aac(60 )-Ib-cr genes on IncU plasmids have been reported in river and lake water (Cattoir et al., 2008; Pica˜o et al., 2008). In our study, restriction and hybridization analysis of IncU suggested that transfer of related plasmids qnrS2 ÿ aac(60 )-Ib-cr-harbouring plasmids may have occurred between Aeromonas species in various aquatic environments and geographical locations. We demonstrate that IncU plasmids are important vectors of clinical relevant quinolone resistance in ornamental fish with the ability to be transferred and replicated in E. coli. It has been described that treatment of A. hydrophila infection in ornamental fish with ineffective concentrations of quinolones or the ineffective antimicrobials such as tetracycline and trimethoprim strongly induced expression of genes mediating conjugative transfer of the IncU plasmid (Cantas et al., 2012). 4. Conclusion Multiresistant phenotype, diverse antibiotic resistance genes and integrons were identified in quinolone-resistant aeromonads associated with ornamental fish. Related IncU plasmids carrying PMQR genes were found in Aeromonas spp. from various geographical areas. More studies including whole plasmid sequencing need to be done to understand the epidemiology and evolution of plasmids disseminating quinolone resistance in aquatic environments. Considering the rapid growth of aquaculture industry, efforts are needed to prevent development and spread of antimicrobial resistance in aquaculture to reduce the risk for human health. Conflict of interest Nothing to declare. Acknowledgements This study was funded by National Agency for Agricultural Research (project no. QJ1210237), Ministry of Agriculture of the Czech Republic (MZE 0002716202) and ‘CEITEC – Central European Institute of Technology’ (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) of the European Regional Development Fund. The study was partially supported by CENAKVA (CZ.1.05/2.1.00/01.0024) and The Project LO1205 with a financial support from the MEYS of the Czech Republic under the NPU I program. Monika Dolejska was supported by the Operational Programme ‘‘Education for Competitiveness’’ (CZ.1.07/2.3.00/30.0014) from the European Social Fund. We thank to Marie Slavikova, Jana Kucerova and Dagmar Tausova for excellent laboratory work. References Arias, A., Seral, C., Gude, M.J., Castillo, F.J., 2010. Molecular mechanisms of quinolone resistance in clinical isolates of Aeromonas caviae and Aeromonas veronii bv sobria. Int. Microbiol. 13, 135–141. Blazquez, J., Couce, A., Rodriguez-Beltran, J., Rodriguez-Rojas, A., 2012. Antimicrobials as promoters of genetic variation. Curr. Opin. Microbiol. 15, 561–569.

Cabello, F.C., 2006. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment. Environ. Microbiol. 8, 1137–1144. Cabello, F.C., Godfrey, H.P., Tomova, A., Ivanova, L., Do¨lz, H., Millanao, A., Buschmann, A.H., 2013. Antimicrobial use in aquaculture re-examined: its relevance to antimicrobial resistance and to animal and human health. Environ. Microbiol. 15, 1917–1942. Cantas, L., Midtlyng, P.J., Sørum, H., 2012. Impact of antibiotic treatments on the expression of the R plasmid tra genes and on the host innate immune activity during pRAS1 bearing Aeromonas hydrophila infection in zebrafish (Danio rerio). BMC Microbiol. 12, 37. Carattoli, A., Bertini, A., Villa, L., Falbo, V., Hopkins, K.L., Threlfall, E.J., 2005. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. J. Microbiol. Methods 63, 219–228. Cattoir, V., Poirel, L., Aubert, C., Soussy, C.J., Nordmann, P., 2008. Unexpected occurrence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants in environmental Aeromonas spp. Emerg. Infect. Dis. 14, 231–237. Cizek, A., Dolejska, M., Sochorova, R., Strachotova, K., Piackova, V., Vesely, T., 2010. Antimicrobial resistance and its genetic determinants in aeromonads isolated in ornamental (koi) carp (Cyprinus carpio koi) and common carp (Cyprinus carpio). Vet. Microbiol. 142, 435–439. CLSI, 2006. Methods for antimicrobial disk susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals. In: Approved Guideline M42-A. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania, USA. CLSI, 2008. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Eighteenth Informational Supplement M100-S18. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania, USA. Cole, B., Tamaru, C.S., Bailey, R., 1999. Shipping Practices in the Ornamental Fish Industry. Center for Tropical and Subtropical Aquaculture, USA, pp. 25 Publication No. 131. Dolejska, M., Cizek, A., Literak, I., 2007. High prevalence of antimicrobialresistant genes and integrons in Escherichia coli isolates from Blackheaded gulls in the Czech Republic. J. Appl. Microbiol. 103, 11–19. Genevaux, P., Muller, S., Bauda, P., 1996. A rapid screening procedure to identify mini-Tn10 insertion mutants of Escherichia coli K-12 with altered adhesion properties. FEMS Microbiol. Lett. 142, 27–30. Han, J.E., Kim, J.H., Choresca Jr., C.H., Shin, S.P., Jun, J.W., Chai, J.Y., Park, S.C., 2012a. A small IncQ-type plasmid carrying the quinolone resistance (qnrS2) gene from Aeromonas hydrophila. Lett. Appl. Microbiol. 54, 374–376. Han, J.E., Kim, J.H., Choresca Jr., C.H., Shin, S.P., Jun, J.W., Chai, J.Y., Park, S.C., 2012b. First description of ColE-type plasmid in Aeromonas spp. carrying quinolone resistance (qnrS2) gene. Lett. Appl. Microbiol. 55, 290–294. Huddleston, J.R., Brokaw, J.M., Zak, J.C., Jeter, R.M., 2013. Natural transformation as a mechanism of horizontal gene transfer among environmental Aeromonas species. Syst. Appl. Microbiol. 36, 224–234. Kruse, H., Sørum, H., 1994. Transfer of multiple drug resistance plasmids between bacteria of diverse origins in natural microenvironments. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4015–4021. Lee, M.F., Peng, C.F., Lin, Y.H., Lin, S.R., Chen, Y.H., 2008. Molecular diversity of class 1 integrons in human isolates of Aeromonas spp. from Southern Taiwan. Jpn. J. Infect. Dis. 61, 343–349. Literak, I., Micudova, M., Tausova, D., Cizek, A., Dolejska, M., Papousek, I., Prochazka, J., Vojtech, J., Borleis, F., Guardone, L., Guenther, S., Hordowski, J., Lejas, C., Meissner, W., Marcos, B.F., Tucakov, M., 2012. Plasmid-mediated quinolone resistance genes in fecal bacteria from rooks commonly wintering throughout Europe. Microb. Drug Resist. 18, 567–573. Lukkana, M., Wongtavatchai, J., Chuanchuen, R., 2012. Class 1 integrons in Aeromonas hydrophila isolates from farmed Nile tilapia (Oreochromis nilotica). J. Vet. Med. Sci. 74, 435–440. Lupo, A., Coyne, S., Berendonk, T.U., 2012. Origin and evolution of antibiotic resistance: the common mechanisms of emergence and spread in water bodies. Front. Microbiol. 3, 18. Naviner, M., Gordon, L., Giraud, E., Denis, M., Mangion, C., Le Bris, H., Ganiere, J.P., 2011. Antimicrobial resistance of Aeromonas spp. isolated from the growth pond to the commercial product in a rainbow trout farm following a flumequine treatment. Aquaculture 315, 236– 241. Parker, J.L., Shaw, J.G., 2011. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. J. Infect. 62, 109–118. Pica˜o, R.C., Poirel, L., Demarta, A., Silva, C.S., Corvaglia, A.R., Petrini, O., Nordmann, P., 2008. Plasmid-mediated quinolone resistance in Aeromonas allosaccharophila recovered from a Swiss lake. J. Antimicrob. Chemother. 62, 948–950. Smith, P., 2008. Antimicrobial resistance in aquaculture. Rev. Sci. Tech. 27, 243–264.

H. Dobiasova et al. / Veterinary Microbiology 171 (2014) 413–421 Sørum, H., L’Abe´e-Lund, T.M., Solberg, A., Wold, A., 2003. Integron-containing IncU R plasmids pRAS1 and pAr-32 from the fish pathogen Aeromonas salmonicida. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 1285– 1290. Sreedharan, K., Philip, R., Singh, I.S., 2012. Virulence potential and antibiotic susceptibility pattern of motile aeromonads associated with freshwater ornamental fish culture systems: a possible threat to public health. Braz. J. Microbiol. 43, 754–765. Stepanovic´, S., Vukovic´, D., Dakic´, I., Savic´, B., Svabic´-Vlahovic´, M., 2000. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods 40, 175–179. Strahilevitz, J., Jacoby, G.A., Hooper, D.C., Robicsek, A., 2009. Plasmidmediated quinolone resistance: a multifaceted threat. Clin. Microbiol. Rev. 22, 664–689. Tigges, F., Bauer, A., Hochauf, K., Meurer, M., 2009. Sporotrichoid atypical cutaneous infection caused by Mycobacterium marinum. Acta Dermatovenerol. Alp. Panonica Adriat. 18, 31–34.

421

Verner-Jeffreys, D.W., Welch, T.J., Schwarz, T., Pond, M.J., Woodward, M.J., Haig, S.J., Rimmer, G.S.E., Roberts, E., Morrison, V., Baker-Austin, C., 2009. High prevalence of multidrug-tolerant bacteria and associated antimicrobial resistance genes isolated from ornamental fish and their carriage water. PLoS ONE 4, e8388. Weir, M., Rajic´, A., Dutil, L., Cernicchiaro, N., Uhland, F.C., Mercier, B., Tusˇevljak, N., 2012. Zoonotic bacteria, antimicrobial use and antimicrobial resistance in ornamental fish: a systematic review of the existing research and survey of aquaculture-allied professionals. Epidemiol. Infect. 140, 192–206. Whittington, R.J., Chong, R., 2007. Global trade in ornamental fish from an Australian perspective: the case for revised import risk analysis and management strategies. Prev. Vet. Med. 81, 92–116. Wilkerson, C., Samadpour, M., van Kirk, N., Roberts, M.C., 2004. Antibiotic resistance and distribution of tetracycline resistance genes in Escherichia coli O157:H7 isolates from human and bovines. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 1066–1067.