Od sekvencí k chromozómům: výzkum repetitivní DNA rostlin v Laboratoři molekulární cytogenetiky BC AVČR

ENBIK 2014

Od sekvencí k chromozómům: výzkum repetitivní DNA rostlin v Laboratoři molekulární cytogenetiky BC AVČR

Jiří Macas Biologické centrum AVČR Ústav molekulární biologie rostlin České Budějovice

Biology Centre ASCR, České Budějovice, Czech Republic

Rostliny se liší velikostí svých jaderných genomů Brachyscome dichromo-somatic a 2n = 4

Fritillaria sp. 2n = 24

Myriophyllum spicatum 2n =1 4

Selaginella kraussiana 2n = 40

Equisetum variegatum 2n ~ 216

Rostliny se liší velikostí svých jaderných genomů

A. thaliana 130 Mbp Genlisea nigrocaulis 86 Mbp

Fritillaria (lilie) >100,000 Mbp

rýže 420 Mbp

bob 13,000 Mbp hrách 4,100 Mbp

ječmen 4,800 Mbp

člověk (3,200 Mbp)

Geny tvoří jen malou část genomu; většinu jaderné DNA představují opakující se sekvence (repetitivní DNA)

Podíl repetitivní DNA roste s velikostí genomu rostlin Proportion of transposable elements (TE) in plant genomes differing in size

Tenaillon, Hollister and Gaut (2010)

Vlivem repetic jsou genomy rostlin velké a z velké části neznámé

?

Repetitivní DNA

Tandemové repetice

Mobilní elementy (transpozóny)

Repetitivní DNA Sekvence, které se v genomu opakují v desítkách až milionech kopií Repetitivní DNA tvoří podstatnou část genomů vyšších rostlin (až > 90% jaderné DNA) a způsobuje většinu rozdílů ve velikostech genomů Na základě uspořádání v genomu se repetice dělí na tandemové a rozptýlené Nejde o zcela náhodně vznikající sekvence, ale o skupiny genetických elementů sdílejících určité mechanizmy vzniku a množení v genomu

Tandemové repetice

Mobilní elementy (transpozóny)

Má repetitivní DNA v genomu nějakou funkci ?


selfish elements, parasitic DNA ?


selfish elements, parasitic DNA ? structural / functional regions of chromosomes telomeres centromeres

telomere Pisum sativum

Centromeric repeats in rice (Oryza sativa)

(Macas et al., 2007) CentO CRR chromosome CentO (satellite)

CRR (retrotransposon)

(Cheng et al., 2002)


selfish elements, parasitic DNA ? structural / functional regions of chromosomes telomeres centromeres generation of allelic diversity knockout of genes by transposon insertion

Cell 60: 115-122, 1990

changes in gene expression patterns

Ac/Ds transposon

Feschotte (2008) Nat.Rev. Genet.

SBEI gene

Vlivem repetic jsou genomy rostlin velké a z velké části neznámé

?

Sekvenování genomů rostlin

klasické sekvenování


= Nová generace sekvenačních technologií drasticky zlevnila a zrychlila sekvenování


Analýza dat Nová generace sekvenačních technologií drasticky zlevnila a zrychlila sekvenování

Laboratoř molekulární cytogenetiky rostlin, BC AVČR Bioinformatics:

Development of novel tools for repeat analysis from NGS data

Bioinformatics: Next generation sequencing:

Repeat analysis in various genomes

Illumina 454/Roche PacBio Petr Novák Jiří Macas Pavel Neumann

Jiří Macas Petr Novák Pavel Neumann

Repetitive DNA Cytogenetics:

Centromeres:

In situ hybridizations and immunodetection

Sequence composition; epigenetics; determination

Wet-lab techniques:

Pavel Neumann Jasper Manning Iva Fuková

Verification of bioinformatic results; cloning, plant transformation, etc... Andrea Koblížková Iva Fuková

Iva Fuková Jasper Manning Pavel Neumann

RepeatExplorer pipeline Bioinformatics:


Petr Novák Jiří Macas Pavel Neumann







Charakterizace repetitivní DNA v různých druzích rostlin Repeat type:

Ty3/gypsy Ty1/copia Satellite DNA rDNA other/unknown

cluster size (% of reads)

pea (Pisum sativum)

1C = 4,300 Mb


soybean (Glycine max) 1C = 1,115 Mb

Macas et al. (2007) BMC Genomics 8: 427.

cumulative % of reads




pea (Pisum sativum)

1C = 4,300 Mb

Prospero autumnale

1C = 4,400 Mb




Genlisea hispidula

1C = 1,550 Mb

Genlisea nigrocaulis 1C =

In collaboration with I. Schubert, IPK Gatersleben

86 Mb








Cytogenetics: In situ hybridizations and immunodetection


Pohlavní a B-chromozómy rostlin Silene latifolia (2n = 22A + XX/XY)

Relative proportions of reads in repeat clusters (Illumina WGS reads from male + female plants)

XY (male)

equal proportions

XX (female)

Macas et al. (2011) PLoS ONE 6

Laboratoř molekulární cytogenetiky rostlin, BC AVČR

Centromerická varianta histonu H3 (CENH3)

Centromeres:



Identifikace centromerických repetic pomocí ChIP-seq Illumina seq. (36 nt reads)

Outline of the experiment Pisum sativum Isolation of nuclei, digestion with micrococcal nuclease

Chromatin immunoprecipitation with CenH3 antibody

DNA isolation (“ChIP”)

DNA isolation (“INPUT”)

Sequencing 9.5 mil. reads

Sequencing 20 mil. reads

Mapping reads to clusters of long (>100nt) reads, calculating ratio of ChIP / INPUT Cluster = repeat family

Identifikace centromerických repetic pomocí ChIP-seq Illumina seq. (36 nt reads)

Outline of the experiment Pisum sativum Isolation of nuclei, digestion with micrococcal nuclease

Chromatin immunoprecipitation with CenH3 antibody

DNA isolation (“ChIP”)

DNA isolation (“INPUT”)

Sequencing 9.5 mil. reads

Mapping reads to clusters of long (>100nt) reads, calculating ratio of ChIP / INPUT

Sequencing

Cluster = repeat family

20 mil. reads

100.00

ChIP / input

10.00

1.00

Satellites ●

TR_11 PisTR-B

●

0.10 0

100

200

300 cluster no.

400

500

600







http://w3lamc.umbr.cas.cz Cytogenetics:

Centromeres:

In situ hybridizations and immunodetection


Wet-lab techniques:


Verification of bioinformatic results; cloning, plant transformation, etc... Andrea Koblížková Iva Fuková


Od sekvencí k chromozómům: výzkum repetitivní DNA rostlin v Laboratoři molekulární cytogenetiky BC AVČR

Recommend Documents