Základy cytogenetiky S postupem rozvoje nauky o buňce (cytologie) v 2. pol. 19. století a nástupem genetiky počátkem století 20. dochází ke vzniku samostatné vědní discipliny - cytogenetiky. Zatímco cytologie se zabývá především studiem struktury, funkce, vývoje, reprodukce a životního cyklu buněk - buněčnou biologií, studuje cytogenetika především morfologii a funkci chromozómů. Vlastní klinická cytogenetika se přitom soustřeďuje na studium změny tvaru, počtu a funkce chromozómů, které vedou ke vzniku onemocnění. Z funkčního hlediska jsou chromozómy buněčné útvary, které zprostředkují přenos genetické informace z buňky na buňku (proces reprodukce buněk) a z rodičů na potomstvo (proces gametogenese a oplození). Živé organismy jako takové jsou v moderní biologii klasifikovány do dvou velkých kategorií: eukaryontní organismy (jaderné) a organismy prokaryontní (bezjaderné). Mezi prokaryonty patří bakterie a sinice, všechny ostatní organismy jsou eukaryontní. Mnoho buněčných komponentů je přímo nebo nepřímo spojeno s genetickými procesy (jádro, chromozómy, ribozómy, centrioly aj.). Další organely se podílí na procesech syntézy nebo rozkladu látek. Buňka (obr.č. 1) sestává ze dvou základních částí – cytoplazmy a jádra. Jádro se skládá z jaderné membrány, chromatinu, jadérka a matrix. Jaderná membrána je tvořena dvojicí paralelně uspořádaných membrán oddělených úzkým prostorem. V místech splynutí vnitřního a vnějšího listu jsou okrouhlé otvory – jaderné póry, které zprostředkují spojení mezi jádrem a cytoplazmou. Chromatin je složen především ze svinutých řetězců DNA vázaných na bazické proteiny (histony). Základní strukturální jednotkou chromatinu je nukleozóm, který sestává ze čtyř typů histonů ovinutých DNA. Sousední nukleozómy jsou spojeny menšími segmenty DNA a celá struktury připomíná „korálky navlečené na sňůrce“. Chromatinová DNA tvoří nejvyšší podíl DNA v buňce a nese tedy většinu genetické informace. V jádrech buněk individuí ženského pohlaví se také často nachází charakteristický heterochromatin nazývaný sex chromatin, představovaný jedním z dvojice X chromozómů.
Obr. č 1: Schéma živočišné buňky
Ten zůstává pevně spiralizován a můžeme ho pozorovat i během interfáze, zatímco druhý z páru je rozvinut, a proto je neviditelný. Jadérko je kulovitá struktura bohatá na obsah RNA a proteinů. Jaderná matrix je tvořena především proteiny, metabolity a ionty, a ve formě amorfní substance vyplňuje prostor mezi chromatinem a nukleoly (jadérky). Součástí matrix je i fibrózní lamina jaderného obalu. Cytoplazma je tvořena základní hmotou (matrix), v níž jsou zanořeny jednotlivé organely a depozita cukrů, tuků a pigmentů. Od zevního prostředí buňky je oddělena plazmatickou membránou. Nejdůležitější organely, které můžeme v buňce nalézt, jsou mitochondrie, ribozómy, endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát. Z genetického hlediska jsou nejdůležitější ribozómy. Je to komplex RNA a proteinů. Nachází se ve všech buňkách a skládají se ze dvou podjednotek. Podjednotky opouštějí jádro jadernými póry a pronikají do cytoplazmy, spojí se s informační (mediátorovou) RNA a probíhá v nich syntéza bílkovin. Zpráva nesená mRNA obsahuje kód pro sekvenci aminokyselin v proteinu. Ribozómy jsou buď nasedlé na endoplazmatické retikulum, nebo jsou v cytoplazmě volně. Další buněčné struktury se podílí na buněčném metabolismu. Mitochondrie jsou kulovité nebo vláknité organely. Fylogeneticky jsou endosymbiotickými bakteriemi, proto mají vlastní DNA a významně se podílí na mimojaderné dědičnosti. Endoplazmatické retikulum je místem syntézy lipidů a sacharidů, dochází zde k segregaci proteinů z cytoplazmy a k jejich posttranslační úpravě. Drsné endoplazmatické retikulum má připojené ribozómy, jemné endoplazmatické retikulum ribozómy nemá.
Golgiho aparát je tvořen systémem cisteren, váčků a vakuol, dokončuje se zde posttranslační modifikace syntetizovaných proteinů. Genetické aspekty dělení buněk a gametogeneze Dělení buněk má z genetického hlediska specifický význam pro uchování a přenos dědičné informace mezi buňkami jedince a mezi generací rodičů a potomků. Amitóza - proces nerovnoměrného rozdělení genetické informace Je proces přímého dělení buněk, při kterém se nediferencují chromozómy a buňka se dělí prostým protažením a zaškrcováním. Výsledkem je nerovnoměrné rozdělení genetické informace, což jako evolučně nevýhodný proces vedlo ke vzniku dokonalejších mechanismů. U člověka se amitóza vyskytuje výjimečně, např. u buněk nádorových. Mitóza - proces dělení se zachováním rodičovského počtu chromozómů Je proces, který vede při dělení somatické buňky k zachování stejné genetické informace v buňkách dceřinných. Každá buňka má svůj generační čas - buněčný cyklus, který zahrnuje období jejího růstu a dělení. Obr. 2.: Schéma mitózy Profáze – spiralizace chromatinových vláken a diferenciace chromozómů. V závěru dochází k rozpuštění jaderné membrány. Na chromozómech je patrné podélné zdvojení na dvě chromatidy. 1. profáze 2. metafáze 3. anafáze 4. telofáze Metafáze - chromozómy se seskupují v ekvatoriální rovině buňky. Je nejvhodnějším obdobím mitózy pro cytogenetická vyšetření. Anafáze - rozdělení centromér a tím oddělení chromatid, které jsou uchyceny vždy k vláknům vycházejícím od opačného pólu dělícího vřeténka. Chromatidy jsou dceřinné chromozómy, které jsou přitahovány k opačným pólům buňky. Telofáze - nahloučení chromozómů u buněčných pólů, jejich postupná despiralizace, vytváření jaderných membrán, vznik dceřinných buněk. Výsledkem období růstu je zdvojení genetického materiálu jádra, který se v následujícím procesu dělení přesně rozdělil do dceřinných buněk. Po mitóze buňka vstupuje opět do fáze G1, tj. do období růstu a realizace genetické informace a dalšího opakování celého buněčného cyklu, nebo se z něj naopak stahuje, jako některé již terminálně diferencované buňky, které se již nedělí, pouze stárnou, degenerují a odumírají.
Meióze - proces redukce počtu rodičovských chromozómů U vyšších rostlin a živočichů existuje za normálních okolností každý chromozóm ve dvou kopiích - homologních chromozómech. Tato evolučně vzniklá existence dvou identických chromozómových sad v buněčném jádře somatických buněk se nazývá diploidie. Diploidní počet chromozómů se obecně označuje symbolem 2n a je nutným předpokladem pro pohlavní rozmnožování při němž dochází ke splynutí dvou pohlavních buněk za současného udržení konstantního počtu chromozómů. Haploidní počet chromozómů (n) je v pohlavních buňkách vznikajících v gametogenezi. Dochází při ní k redukci chromozomálního počtu na polovinu, tj. každá buňka nese pouze jeden z páru homologních chromozómů. Realizaci tohoto procesu zajišťuje tzv. redukční dělení, meioze. Meioze je zvláštní druh buněčného dělení uplatňující se výhradně při vzniku pohlavních buněk ve specializovaných tkáních. Meiotické dělení, jehož úkolem je zajistit redukci, rekombinaci a segregaci genetické informace (viz dále), zahrnuje vždy dvě po sobě následující dělení - heterotypické (vlastní redukční dělení rozdílné od mitózy) a homeotypické (ekvační dělení shodné s mitózou). Obr. 3.: Střídání diplo-haploidní fáze ve sledu generací Rodičovský organismus
Pohlavní buňky
Oplození Zygota
Pohlavní buňky
Obr. 4.: Schéma meiozy I. redukční dělení (heterotypické): 1. leptotene, 2. zygotene, 3. pachytene, 4. diplotene, 5.diakineze, 6. metafáze, 7. anafáze, 8. telofáze
II. redukční dělení (homeotypické): 1. metafáze, 2. anafáze, 3. vznik gamet
Heterotypické , neboli I. redukční dělení se podstatně odlišuje od mitózy, zejména v profázi, ktrá je proti mitotické profázi podstatně složitější a rozčleňuje se do jednotlivých stádií, viz obrázek č. 4. Homeotypické (ekvační), neboli II. redukční dělení je prakticky shodné s mitózou, probíhá však pouze při haploidní chromozómové sestavě. Následuje bezprostředně po dělení heterotypickém. Celkovým výsledkem meiotického dělení jedné buňky, tj. gametogeneze je u mužů vznik čtveřice haploidních spermií, u žen jednoho haploidního vajíčka, jejichž chromozómy jsou již jen jednochromatidové. Gametogeneze - proces tvorby pohlavních gamet Je mechanismem zvyšujícím genetickou variabilitu, který se vyvinul jako fylogeneticky výhodný jev doprovázející pohlavní rozmnožování.
Pohlavní rozmnožování lze charakterizovat střídáním jaderných fází - diploidní, která je výsledkem splývání jader - haploidní, která následuje po redukčním dělení Obě fáze mají řadu genetických aspektů, které zdůvodňují výhodnost pohlavního rozmnožování (segregace vloh, rekombinace a kombinace vloh). To umožňuje vyšší genetickou proměnlivost, která je výhodná z hlediska evolučního. Nepohlavní rozmnožování je geneticky konzervativnější, protože nový jedinec vzniká ze somatické buňky, což značně omezuje vznik genetické různorodosti. Je časté u rostlin. Chromozómy a jejich struktura Chromozómy (ř. chroma - barva, soma - tělo) jsou specifické útvary, přítomné v buněčném jádru, nesou genetickou informaci, tj. molekulu DNA. Morfologie chromozómů Morfologie chromozómu (obr. 5) je nejlépe pozorovatelná ve stádiu metafáze nebo rané anafáze. Obr. 5: Morfologie chromozómu Satelit Sekundární konstrikce Krátké rameno - p Primární konstrikce (centromera) Dlouhé rameno - q
Tvar chromozómu je dán polohou centromery (obr. č. 6). Obr. č. 6 : Tvary chromozómů (dle lokalizace centroméry)
2
a) metacentrický
a
b
c
d
b) submetacentrický
P
c) akrocentrický
q
d) telocentrický
1 1 2 3
Každý chromozom nese označení číslem. Pro označení určitého místa na chromozomu se dále používá symbolu pro rameno (p krátké, q dlouhé), oblast na rameni, jejichž počet bývá zpravidla 1 – 3 a číslo úseku (při pruhovacích metodách pruhu) v dané oblasti. Např. 2q33
znamená chromozóm č. 2, 3. proužek ve 3. oblasti delšího ramene q. Např. lokus pro určitý typ dědičně podmíněné, autosomálně recesívní hluchoty má lokalizaci 2p23 až 2p22. Protože před vlastním dělením buňky dochází ke zdvojení genetické informace (S fáze buněčného cyklu), tvoří tělo chromozómu podélně tvoří dvě sesterské chromatidy. Ultrastruktura chromozomů Každý chromozóm nese určitý úsek (u člověka asi 2 m dlouhé) molekuly DNA. Ta je jen jednou částí chromozómu, další součástí jsou proteiny, které tvoří nejen jakousi kostru chromozómu, ale plní i řadu dalších funkcí spojených s regulací genové činnosti. Jaderný chromatin Základem chromatinu je nukleohistonové vlákno, ve kterém je molekula DNA obtočena okolo shluků histonových molekul. V průběhu profáze dochází ke spiralizaci jaderného chromatinu a vzniku viditelných útvarů - chromozómů. Po skončení mitózy dochází k despiralizaci nukleohistonových vláken a přeměně chromozómů zpět do formy jaderného chromatinu. V některých oblastech chromozómů zůstávají nukleohistonová vlákna trvale spiralizována i v interfázi, tyto úseky tvoří tzv. heterochromatin, narozdíl od úseků plně despiralizovaných, označovaných jako euchromatin. Heterochromatinová je vždy oblast okolo centroméry (konstitutivní heterochromatin). Heterochromatinové úseky vyskytující se na jiných místech chromozómů mohou v určitých fázích ontogenetického vývoje jedince přecházet v euchromatin a naopak (fakultativní heterochromatin). Struktura chromatinu a jeho velmi specifické uspořádání v různých částech určuje, které geny se budou realizovat a které naopak v buňkách dané tkáně nikoliv. Diferencovaný stav chromatinu je buď vratný (nastavený jen pro daný čas vývoje buňky) nebo nevratný, nastavený natrvalo pro diferencovaný typ buněk (imprinting). Imprinting je v podstatě jev, který představuje trvalou inaktivaci některé genetické informace a umožnění aktivace genetické informace jiné. Příkladem imprintingu je rozdílná realizace genetické informace nesené na otcovském nebo mateřském homologním chromozomu. Např. vývoj plodových obalů savců je řízen geny z otcovského chromozomu. Chromozomální počet Počet chromozómů je všech buňkách relativně stálý a pro jednotlivé druhy živočichů i rostlin charakteristický. Somatické buňky obsahují diploidní (dvojnásobný) počet chromozómů (2n), pohlavní buňky jejich haploidní (poloviční) počet (n). Splynutím dvou pohlavních buněk, spermie a vajíčka, vznikne zygota s diploidním počtem chromozómů. Dva stejné chromozómy se označují jako chromozómy párové (homologní).
Tab. č. 1.: Počet chromozómů v somatických buňkách významných živočichů a rostlin Druh
2n
Druh
2n
Plasmodium malariae
2
Kůň - Equus caballus
66
Nezmar – Hydra vulgaris
32
Šimpanz – Anthropopitheus troglodytes
48
Klíště – Ixodes ricinus
28
Člověk - Homo sapiens
46
Včela – Apis mellifica
16,32 Řepa - Beta vulgaris
18
Muška – Drosophila melanogaster
8
Angrešt - Ribes grossularia
16
Kur domácí - Gallus gallus
78
Hrušeň - Pyrus communis
34,68
Myš – Mus musculus
40
Jetel - Trifolium pratense
14
Pes – Canis familiaris
78
Akát - Robinia pseudacacia
20
Kočka – Felis domestica
38
Chmel - Humulus lupulus
20
Skot – Bos taurus
60
Brambor - Solanum tuberosum
48
Ovce – Ovis aries
54
Pšenice - Triticum vulgare
42
Prase – Sus scropha
38
Ječmen - Hordeum vulgare
14
Osel – Equus asinus
66
Oves - Avena sativa
42
Karyotypy a jejich stanovení Soubor chromozómů určitého druhu je konstantní nejen co do počtu, ale i jejich velikosti a tvaru. Je druhovým znakem a označuje se jako karyotyp (obr. č. 7). Obr. 7: Karyotyp člověka
Na rozdíl od karyotypu, který představuje skutečný, opticky zjištěný tvar a počet chromozomů u konkrétní buňky je tzv. idiogram (obr. č. 8) schematické, ideální znázornění karyotypu určitého organismu.
Obr. 8: Idiogram člověka
Variabilita chromozomálního počtu, tvaru a struktury chromozomů Ačkoliv je počet chromozomů, jejich struktura i tvar konstantním druhovým znakem, je možnost jeho změny nepostradatelným faktorem evolučního vývoje druhů. Některé chromozomální změny jsou z hlediska genetické variability podstatně významnější než změny genů. Změny v počtu a tvaru chromozomů označujeme jako chromozomové mutace nebo aberace, jsou důsledkem působení mutagenních faktorů a chyb v průběhu reprodukce buněk. U zvířat a člověka jsou příčinou vrozených poruch zdraví. Variabilita chromozomálního počtu V české terminologii jsou změny v chromozomálním počtu (zmnožení chromozomů nebo ztráta některých členů chromozomového souboru) označovány jako tzv. genomové mutace. Rozlišujeme dva typy genomových mutací – aneuploidii a polyploidii.
Aneuploidie je stav, kdy působením mutagenů v průběhu mitózy dochází k chybám při rozdělování chromozómů do dceřinných buněk, tj. některé homologní páry jsou zastoupeny jiným počtem chromozómů než dva. Aneuploidie se projevuje celou řadou defektů, nazývaných syndromy. Nejznámější aneuploidií u člověka je trizómie chromozomu č. 21, tzv. Downův syndrom, který se vyskytuje v průměru jednou na 700 porodů. Ve fenotypu se projevuje celou řadou anomálií, zejména tzv. mongoloidním vzhledem, psychomotorickou retardací aj. Polyploidie je důsledkem zmnožení celých chromozomových sad bez následného rozdělení buněčného jádra. Důsledkem tohoto typu genomových mutací je vznik polyploidních organismů s více než dvojnásobkem haploidního počtu chromozomů, tj. 3n, 4n, 5n atd. U živočichů je polyploidie výjimkou. U rostlin je však jevem zcela běžným a jejich vývoj byl spojem se změnou ploidie – s polyploidií. Odhaduje se že planá flóra naší planety je složena asi z 50% diploidních a 50% polyploidních druhů. Variabilita struktury a tvaru chromozomů Druhá hlavní třída chromozomových anomálií představujících změny ve struktuře a tvaru chromozómů je označována jako chromozomové aberace. Jde o strukturální přestavby chromozomů k jejichž vzniku dochází tak, že mutagenní faktor způsobí zlom v určitém místě chromozomu, výsledkem je vznik fragmentu(ů) nesoucího v něm lokalizovanou genetickou informaci. Problémy a diskuzní otázky 1. Charakterizujte rozdíl mezi jednotlivými druhy buněčného dělení a jejich význam pro dědičnost a proměnlivost. 2. Vymezte rozdíly mezi oogenezí a gametogenezí a vyvoďte důsledky pro vznik chromozómových aberací u člověka. 3. Uveďte faktory zvyšujících genetickou variabilitu a jejich roli negativní a pozitivní. 4. Definujte a diferencujte mezi následujícími páry termínů: monozómie - polyzómie mitotická - meiotická profáze aneuploidie - polyploidie karyotyp - idiogram metacentrický - telocentrický 5. Pro druh s diploidním chromozomálním počtem 16 určete, kolik chromozómů budou mít přítomných v haploidních, triploidních, tetraploidních, trizómických a monozómických buňkách. Řešení vybraných problémů 5. Haploidní - 8, triploidní - 24, tetraploidní - 32, trizómické - 17, monozómické - 15.
