Zvýraznění buněk rodu Bacillus negativním barvením (nefixovaný preparát, pozorování v jasném poli) Pozorování bakteriálních endospor rodu Bacillus v nativním preparátu (nefixovaný preparát, fázový kontrast) Zvýraznění pouzder rodu Azotobacter negativním barvením (nefixovaný preparát, pozorování v jasném poli) Otázky k zamyšlení: Jaké výhody poskytuje negativně barvený a nativní preparát pro pozorování morfologie bakteriálních buněk? Jakými mikroskopickými technikami se pozorují? K čemu slouží posouzení různého tvaru a umístění endospor u různých druhů rodu Bacillus? Kolik endospor může být přítomno v jedné bakteriální buňce? Proč je jejich barvení problematické? Jsou negativním barvením obarveny buňky? Buněčné formy bakterií: Jaké buněčné formy v doménách Bacteria a Archaea rozeznáváme? Kromě rostoucích a dělících se vegetativních buněk zde nacházíme i struktury dovolující přežití nepříznivých podmínek - endospory. Endospory jsou odolnými klidovými stadii s několika výjimečnými charakteristikami: oproti doméně Eucarya je v buňce přítomna pouze jedna endospora peptidoglykan v kortexu spory je zcela odlišného charakteru než peptidoglykan samotné buňky vytvářející sporu makromolekuly ve spoře jsou stabilizovány přítomností specifických bílkovin, snížením množství vody a zvýšením obsahu vápníku (vápník je ve spoře vázán v kyselině dipikolinové, která je v přírodě přítomna pouze uvnitř bakteriálních endospor) spory jsou díky četným obalům různého charakteru odolné k působení UV a γ záření, vysoušení, lysozymu, teplotním změnám, nedostatku živin a působení mnoha dezinfekčních prostředků (v etanolu mohou přežívat několik měsíců) jsou prostředkem šíření bakterií i na značné vzdálenosti a v různém prostředí tvorba spory není odpovědí na vnější prostředí
Obrázek: Binární dělení vegetativní buňky vedle procesu vzniku endospory asymetrickým dělením bakteriální buňky. Zdroj: www.nature.com.
1
Bakteriální endospory Klinicky, farmaceuticky a technologicky významné jsou termostabilní spory zejména rodů Bacillus a Clostridium. Bakteriální spory jsou významným prostředkem bioterorizmu (př. Bacillus anthracis - anthrax). Některé bakteriální druhy však tvoří endospory, které jsou s výhodou používány jako biopesticidy (Bt toxin = bílkovina spor Bacillus thuringiensis var. israelensis). Spory obsahují na svém povrchu určité proteiny, peptidy či enzymy, které se využívají jako specifické sondy nebo mají biokatalytickou funkci. Modifikované spory B. subtilis se používají jako vehikula vakcín a jiných farmak. Příkladem jsou povrchové proteiny spor B. subtilis obsahující fragment C (TTFC) tetanového toxinu či alfa toxin Cl. perfrigens (fúzovaný s genem pro glutation-S-transferázu a exprimovaný na povrchu pláště spory) používané pro orální a nazální imunizaci člověka i zvířat. V tomto ohledu nabízí spory jakožto transportéry farmak teplotní stabilitu, modifikovatelnost – flexibilitu pro genetické modifikace a v neposlední řadě také nenákladný proces přípravy. Zatímco toxiny sporulujících druhů jsou většinou termolabilní (inaktivace nejčastěji již po 5 minutách při teplotě 60 °C), spory jsou velmi odolné. U bakteriálního druhu Clostridium botulinum sporulující buňky odolávají 90 minut teplotě 100 °C oproti buňkám nesporulujícím, které hynou po 30' při 70 °C. Spory Clostridium tetani (původce tetanu) jsou inaktivovány po 20' při 121 °C vodní páry při 2 atm (0,2 Mpa) a po 90´ - 180' při 160 - 200 °C suchého tepla, vysoce termorezistentní, přežijí až pětihodinový var. Sporicidních látek je málo a jsou většinou nákladné. Příkladem je ethylenoxid, betapropionlakton, koncentrované louhy a kyseliny, formaldehyd při prodloužené expozici, kyselina peroctová – Persteril, jodové preparáty, chloramin. Stavba zralé bakteriální spory jádro obsahuje sporoplast neboli protoplast: stroma spóry představuje gelovou matrix, tvořenou bakteriálním jaderným ekvivalentem – nukleoidem, ribozomy, kalcium dipikolinátem (CDPA; až 10 % sušiny spory) nebo pyridin-2,6dikarboxylovou kyselinou, jež nahrazuje vodu při udržování kvarterní struktury při vazbách, dále SASPs - small acid-soluble proteins, které jsou pevně svázány s nukleovou kyselinou a zabezpečují její kondenzaci a rezistenci vůči UV záření a DNA-ničících chemických látek, dále jsou přítomny polyaminy, aminokyseliny a 3fosfoglycerát; v jádru spory jsou dále u některých bakteriálních druhů přítomny specifické látky ve formě krystalků, toxinů; refrakční index protoplastu činí 1,54. jádro je obaleno vnitřní membránou intinou z lipoproteinů, která brání prostupu chemických látek z prostředí zbytky původní buněčné stěny mateřské bakteriální buňky; tyto zbytky původního peptidoglykanu budou základem nové buněčné stěny klíčící endospory kortex sestává z vnitřního kortexu (20 %) a zevního kortexu (80 % kortexu); zajišťuje nepropustnost (nebarvitelný!) a po dehydrataci jádra termorezistenci; refrakční index kortexu činí 1,47; kortex je tvořen peptidoglykany - 20-30 % peptidoglykanových jednotek je shodných s jednotkami peptidoglykanu buněčné stěny, zbylých 50-60 % jednotek představuje N-acetylmuramovou kyselinu modifikovanou na Nacetylmuramyl–laktam, dalších 18-20 % kyseliny N-acetylmuramové je spojeno s Lalaninem namísto tetrapeptidu; tyto modifikace jsou zajišťovány enzymy membránově vázané Glu-mesoDmp hydrolázy a cytosolové Ac-Ala-Glu-mesoDmp lyázy perikortikální vnější membrána extina z lipoproteinů pláště složené z proteinů bohatých na cystein (a podobných keratinu), zajišťují odolnost spór k působení chemikálií
2
exosporium - není přítomno u všech taxonů; uděluje buňce odolnost vůči chemickým látkám a enzymům
Obrázek: struktura bakteriální endospory – jádro (DNA, RNA, proteiny, SASPs, DPA, Ca2+), membrány (intina, extina) a obaly spory (kortex – modifikovaný peptidoglykan, exosporium – glykoproteiny).Zdroj: http://www.spandidos-publications.com/
Endospory jsou vytvářeny malým počtem převážně G+ bakterií rodů Bacillus (aerobní tyčky), Clostridum, Thermoactinomyces, Desulfotomaculum (anaerobní tyčky), Sporosarcina (aerobní koky), Sporolactobacillus, Oscillospira, Thermoactinomyces. Výjimečně však endospory nacházíme i u některých G- bakterií (Př: Coxiella burnetii, původce Q-horečky). Význam pozorování tvaru a umístění bakteriálních endospor Jaký je význam pozorování bakteriálních endospor (v podobě barveného či nativního preparátu) sporulujících zástupců? Diagnostické Gramovo barvení určí G+ a G- typ buněčné stěny; souběžné pozorování spor u sporulujících druhů, případně nativní preparát pozorovaný fázovým kontrastem prokáže tvar a umístění spory v buňce, což je charakteristickým znakem napomáhajícím identifikaci. Příkladem jsou vždy oválné spory Bacillus anthracis, B. cereus, Clostridium botulinum, kulaté spory Clostridium tetani či B. sphaericus, cylindrické či elipsoidní spory dalších druhů. Případně hodnotíme, zda a ve kterém místě vyklenuje buňku. Uložení v buňce: terminální = na konci tyčinky (C. tetani - paličky, B. stearotermophilus) centrální (C. histolyticum, C. novyi, C. septicum, B. anthracis, B. cereus) subterminální = paracentrálně = mezi středem a pólem buňky, nejčastější (C. botulinum, C. sporogenes, B. brevis)
Obrázek: Možné umístění endospory a případné vyklenutí buňky jako identifikační znak. Zdroje: Copyright © Dr. R. E. Hurlbert, 1999
3
Typy preparátů pro pozorování bakteriálních endospor a pouzder Pozorovat neobarvené endospory můžeme fázovým (pozorujeme zářící spory; možné až po vzniku kortexu, který udává světlolomnost) a Nomarského kontrastem (pozorujeme plastický povrch buňky); jednoduchým barvením nevidíme spory samotné ale vyklenutí buňky způsobené přítomností spor (obarvíme pouze buněčnou stěnu). Přímé obarvení endospory je možné při vzniku prospory – je pro barvivo propustná; po vzniku kortexu je přímé barvení možné pouze za horka a za použití koncentrovaných barviv. Strukturální barvení se používá k identifikaci a studiu bakteriálních struktur, kupříkladu endospor, pouzder, bičíku, inkluzí. Bakteriální spory špatně přijímají barvivo i po fixaci preparátu vzhledem k rigidnímu špatně propustnému kortexu, proto se obarví až během varu pomocí koncentrovaných barviv nebo mořidel (stejně jako např. acidorezistentní bakterie – Mycobacterium, které bychom Gramovým barvením neobarvili vzhledem k obsahu mykolových kyselin v buněčné stěně). Příkladem jsou Wirtz-Conklinova a Schaeffer-Fultonova metoda barvení spor. Takto obarvené spory se těžko odbarvují kyselinami a jinými sloučeninami (např. alkoholem). Barvitelnost spor závisí na vývojovém stádiu sporulující buňky, je tedy podmíněna stářím kultury, kvalitou živné půdy, individuálními vlastnostmi mikrobů, a proto nelze barvících metod používat schematicky. Barvitelnost spor se také (podobně jako u plísní) zlepší použitím sporulačních médií (s přídavkem manganu).
Obrázek: Barvení endospory malachitovou zelení a barvení buněk safraninem. Zdroj: Copyright © Dr. R. E. Hurlbert, 1999
Obrázek: Barvení endospory malachitovou zelení a barvení buněk safraninem. Spory se v preparátu vyskytují uvnitř i vně buněk. Zdroj: http://www.austincc.edu/microbugz/endospore_stain.php
4
Nativní preparát – pozorovaný fázovým či Nomarského kontrastem. Umožňuje pozorování skutečného tvaru a struktury buněk neporušených fixací a barvením, dále pozorování růstu, množení a pohybu bakterií. V diagnostické praxi má význam při studiu světlolomných buněčných útvarů, které se obtížně barví (např. zde spory) Princip: Použitá mikroskopická technika nativního preparátu je fázový kontrast - využívá odlišné světlolomnosti částic v pozorovaném objektu – různé struktury buňky mají různé indexy lomu světla a vznikající obraz je výsledkem složení obrazů vln s pozunutou fází a vln odkloněných od preparátu.
Obrázek: fázový kontrastu - autor Steve Durr, Copyright © Dr. R. E. Hurlbert, 1999
Barvení buněčné stěny jednoduchým barvením pro zvýraznění jejího vyklenutí a přítomnosti endospory vyklenující buňku. Sporulace - proces vzniku (endo)spory ke studiu sporulace je používáno bakteríií rodu Bacillus, hlavně B. subtillis sporulace probíhá i při dostatku živin, hlavně však ve stacionární fázi během sporulace modelového mikroorganizmu B. subtillis můžeme rozlišit 7 fází (I – VII), jež lze charakterizovat morfologicky a na molekulárně biologické úrovni; za proces vzniku endospory zodpovídá 50 genů a trvá průměrně 6 – 7 hodin proces začíná ve fázi G1, v průběhu vzniku přepážky (na konci G1) je již jasné, zda vznikne vegetativní buňka nebo spora, buňka přechází od binárního dělení k dělení asymetrickému v místě přepážky se dvojitě vchlípí cytoplazmatická membrána prospora se utváří v tzv. sporogenní zóně primárně se přepisují geny, které připraví prostor pro sporu, zvyšuje se kvantum volutinu (= první známka sporulace, zvýšené množství volutinu zjistíme jeho nabarvením) druhým signálem sporulace je zvýšení množství enzymů; buňka zvyšuje spotřebu acetátu, zvýšení počtu enzymů Krebsova cyklu a hydroláz na procesu sporulace se podílí amylázy, proteázy, fosfatázy, DNázy
5
Fáze I Mateřská vegetativní buňka (sporangium) přechází z binárního k asymetrickému dělení. Fáze II Tvorba axiálních filament k rozbalení nukleoidu do dlouhého vlákna a replikaci. Fáze III Vytváří se septum, které postupně rozdělí buňku na dvě nestejné části. Je ukončena replikace buněčného genetického materiálu, a ten je rozestoupen u pólů buňky. Končí invaginace cytoplazmatické membrány. DNA spory již není aktivní. Sporogenní zóna je homogenizovaná a zahuštěná. Má vždy jinou hustotu než zbylý obsah buňky. Fáze IV Charakterizuje ji další proliferace cytoplazmatické membrány kolem obou částí buňky, u prespory dochází k zaobalení dvěma membránami – intina a extina (vchlípením cytoplazmatické membrány). Do prespory se vkládá mnoho vápníku a syntetizuje se v ní kyselina dipikolinová, vzniká prospora. Ubývá volutinu. Prospora není světlolomná (refraktilní), nesvítí při mikroskopii ve fázovém kontrastu. Proces sporulace je již nevratný. Fáze V Tvoří se kortex spóry (tvoří jej aktivní chromozom mateřské buňky) s peptidoglykanem o složení líšícím se od peptidoglykanu buněčné stěny. Při vzniku kortexu jev obsah volutinu již minimální. Ve spóře je obsažena kyselina dipikolinová (syntetizována mateřskou buňkou, její 6
množství je regulováno). Kalcium dipikolinát je charakteristická složka přítomná pouze v endosporách bakterií. Endospora je již světlolomná, se vznikem kortexu je nepropustná pro barvivo, obarvitelná až při výstupu par. Fáze VI Probíhá syntéza dvouvrstevného pláště; u příslušníků rodu Bacillus vzniká exosporium složené z deseti proteinů, polysacharidů a lipidů. Unikátnost bílkovin pláště je sledována chemotaxonomickými metodami. Fáze VII Maturace endospory a lýza mateřské buňky, uvolnění zralých spór
Obrázek: fáze sporulace bakteriální buňky rodu Bacillus. Zdroj: Pasteur Institut.
Následuje kryptobiotická fáze volné zralé spory, která ve vhodných podmínkách může a nemusí klíčit. Její vnější architektura, počet a tvar plášťů je druhově specifická.
Germinace bakteriální spory Germinací rozumíme rychlý proces klíčení spory. Začíná spontánní aktivací spory. Aktivace začíná destabilizací pláště, v laboratorních podmínkách při působení teploty 70-85 °C po 5 – 10 minutách, dalšími aktivátory jsou malé organické molekuly – aminokyseliny, vitaminy, zvýšení počtu bazí, L-Ala, Ado a Ino. Aktivovaná spora přijímá vodu a ztrácí rezistenci – bílkovinné stabilizátory jako vnitřní součásti se začínají rozkládat, vzniklé aminokyseliny slouží jako stavební kameny nových proteinů. Nejprve ovlivněna proteosyntéza (hlavně degradační enzymy – proto ve spoře dostatek Mg). V momentě, kdy buňka tvoří energii, začíná fungovat regulační aparát chromozomu (ATP = signál aktivace chromozomu). Prvními funkčními enzymy jsou glykosidázy – metabolizování kortexu, poté rozklad extiny (fosfolipidy+bílkovina+polysacharid). Lytický enzym: p68 => p29 (kortikohydroláza) – depolymerizuje kortex pro nástupný průnik vody. Po dvou hodinách po germinaci spory následuje dělení vegetativní buňky. Podle lokalizace klíčení spory rozeznáváme germinaci terminální (na pólech buňky) a centrální. Germinaci je možné inhibovat přítomností aminokyseliny D-Ala, MgCl2, inhibitorem proteáz - fenylmetylsulfonylfluoridem PMSF.
7
Obrázek: Klíčení spory C. pectinovorum. Zdroj: Copyright © The McGrow-Hill Companies, Inc.
Bakteriální pouzdra Polysacharidové či bílkovinné pouzdro lemuje bakteriální buňku a v prostředí ji chrání proti vysychání a jedům, v živočišném těle bakterii dokonale maskuje před imunitní odpovědí makroorganizmu. Bakterie tvořící pouzdra na první pohled na misce rozeznáme podle charakteristického mohutně slizovitého vzhledu, velké kolonie téměř splývají na médiu a za kličkou se táhnou. Jak v preparátu rozpoznat sliz od pouzdra? Pouzdro je jasně oddělené od prostředí, sliz je naopak více rozptýlen kolem buňky. Lze tvorbu pouzdra podpořit? Vysoké množství sacharidů v médiu či prostředí zintenzivňuje tvorbu pouzdra (do média přidáváme cukry). Může buňka ztratit schopnost pouzdro tvořit? Schopnost tvorby pouzdra je možné ztratit (mutací) – z původní mukózní M formy se stává R forma (reverzibilní, drsná) až S forma, která již pouzdro není schopna tvořit. Je možné pouzdro jednoduše nabarvit? Stejně jako spory, i zde bychom museli buňky s pouzdry povařit v barvivu. Chceme-li ale pouzdro zvýraznit, nemusíme jej barvit, stačí, když v preparátu nabarvíme buňku a okolí buňky. Pouzdro je pak v preparátu nezbarveno a je výrazně světlé.
Pomůcky a použité mikroorganizmy: Bakteriální kmeny rodů Bacillus (více druhů rodu Bacillus – sbírkové kultury) a Azotobacter (izolát z půdy i sbírková kultury – porovnejte mohutnost pouzder) podložní a krycí skla, bakteriologická klička střička s vodou filtrační papír sterilní destilovaná voda nigrosin (negativní barvení) 8
kahan pinzeta mikroskop (Z 1000x)
Postup A. Negativní barvení buněk bacilů nigrosinem NEFIXOVANÝ PREPARÁT Negativním barvením obarvíme okolí buněk, nikoli buňky samotné. Využívá se pro měření přesné velikosti bakteriální buňky. Nabarví se pozadí (sklíčko), nikoli buňka samotná. Tím není velikost buňky deformována fixací ani barvivem. Barvivo: roztok nigrosinu nebo kongo červeň. Důležité je vytvořit pouze tenký film barviva s dostatečně zředěnými buňkami. asepticky přeneseme 1 kličku bakteriálních buněk do malé kapky destilované vody, vedle se přidá malá kapka nigrosinu kapky se rozmíchají kličkou a rozetřou se jemným tahem druhého sklíčka (přiloženého pod úhlem 45˚ po celé ploče podložního skla), druhé sklíčko ožíhneme bez oplachování se nechá zaschnout na vzduchu důležité: vytvořit jen tenký film barviva s dostatečně zředěnými buňkami. pozorujeme pod imerzí (Z 1000x) Pozorování: neobarvené buňky na šedém pozadí – porovnejte mezi preparáty tvar a velikost buněk různých druhů jednoho bakteriálního rodu. Výsledek ovlivňuje tloušťka vrstvy barviva (silný nános může po zaschnutí praskat) a koncentrace barviva.
Obrázek: Bacillus cereus CCM 2010, negativní barvení nigrosinem
9
B. Negativní barvení pouzder rodu Azotobacter NEFIXOVANÝ PREPARÁT I – negativní barvení buněk azotobaktera a pozadí (sklíčka) nigrosinem
do větší kapky vody přeneseme vyžíhanou kličkou malé množství buněk ze slizovité kolonie kapku smícháme s kapkou barviva nigrosinu a suspenzi přikryjeme krycím sklíčkem zbytek tekutiny odsajeme a pozorujeme pod objektivem 60x nebo 100x bez imerze se silným zacloněním irisové clonky šedavé buňky jsou obklopeny bílými pouzdry a pozadí je tmavé (nigrosin nabarví buňky a pozadí, nikoli pouzdra – ta jsou takto nebarvitelná)
II – negativní barvení pouzder azotobaktera a dobarvení buněk jiným barvivem než nigrosinem 1) barvení buněk metylenovou modří, barvení sklíčka nigrosinem rozmícháme kapku nigrosinu s kapkou vody, do suspenze přeneseme malé množství buněk azotobaktera a rozetřeme po plošce sklíčka zaschlý nátěr pokryjeme na 3 min roztokem methylenové modře (R 6), opláchneme a osušíme pozorujeme zvětšením 1000x pod imerzí modré buňky (nabarveny methylenovou modří) jsou obklopeny světlými pouzdry a pozadí je díky nigrosinu tmavé 2) obarvíme methylenovou modří buňky a sklíčko kongo červení, ale nikoli pouzdra – ta nezbarvena
na sklíčko kápneme Kongo červeň a resuspendujeme v ní kulturu, suspenzi rozetřeme a necháme dobře zaschnout převrstvíme na několik sekund HCl, kyselinu slijeme, neoplachujeme, pouze dosušíme filtračním papírem na 3 minuty převrstvíme metylenovou modří R6, slijeme a usušíme volně na vzduchu pozorujeme pod imerzí modré buňky, světlá pouzdra a modré pozadí
III) přímé barvení pouzder horkým karbolfuchsinem – výpary jsou však jedovaté, nebudeme dělat C. Nativní preparát pozorovaný fázovým kontrastem – pro pozorování tvaru a umístění spor rodu Bacillus Aseptická práce při nanášení buněk na sklíčko
dobře očištěné podložní sklíčko vyjmeme z alkoholu a protáhneme jej plamenem doprostřed sklíčka naneseme kapku sterilní destilované vody
10
ožehnutou a vychladlou očkovací kličkou vneseme do kapky nepatrné množství kultury a pečlivě rozmícháme kultury nesmíme nanést do kapky mnoho, aby preparát nebyl hustý kapka se neroztírá, překrývá se krycím sklíčkem, a to tak, aby v preparátu nebyly vzduchové bublinky (nepřikládáme svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačujeme) pokud pozorujeme buňky z tekutého média - bujonu, pozorujeme přímo v bujonu, bez ředění v kapce vody ihned mikroskopujeme FÁZOVÝM KONTRASTEM (objektiv 60x nebo 100x – celkové zvětšení tedy 600x nebo 1000x), protože takto připravený preparát rychle vysychá
Pozorujeme: aktivní pohyb buněk (pokud mají bičíky) či pasivní pohyb unášením – Brownův pohyb; aktivní pohyb sledujeme u mladých kultur (př: 18h Bacillus subtilis) z kapalné půdy - pozor - skleněná tyčinka láme bičíky. Po přikápnutí desinfekce (př: 0,5% ajatin) pohyb buněk ustává D. Postup barvení spor malachitovou zelení - Schaeffer-Fultonova metoda a WirtzConklinova metoda FIXOVANÝ PREPARÁT
uschlý nátěr buněk na sklíčko fixujeme trojím protažením v plameni převrstvíme malachitovou zelení zahříváme 3 -4x do výstupu par po dobu 5 minut, doplňujeme barvivo opláchneme vodou dobarvíme kontrastním barvivem kongo červení (převrstvením 1 – 3 minuty bez zahřívání) opláchnout vodou, usušit, pozorujeme pod imerzí, Z 1000x Pozorování: Pozorujeme zelené spory uvnitř červených buněk a můžeme hodnotit tvar a umístění spor uvnitř buněk i uvolněných spor.
Obrázek: Barvení endospor Bacillus sphaericus CCM 1615 malachitovou zelení a barvení buněk safraninem. Terminální umístění kulaté spory, vyklenutí buňky. Z 1000×. Zdroj: vlastní preparát.
11
Obrázek: Barvení endospor Bacillus cereus CCM 2010 malachitovou zelení a barvení buněk safraninem. Centrálně umístěné oválné spory. Bez vyklenutí buňky. Z 1000x. Zdroj: vlastní preparát.
Obrázek: Barvení endospor B. megaterium malachitovou zelení a barvení buněk safraninem. Spory se v preparátu vyskytují uvnitř (zvýrazněno šipkami) i vně buněk. Vyklenutí buněk. Z 1000x. Zdroj: vlastní preparát.
Zdroje https://micro.cornell.edu http://textbookofbacteriology.net (© Kenneth Todar, Ph.D.) Songer, J. G. (2010). Clostridia as agents of zoonotic disease. Veterinary Microbiology, 140(3-4), 399-404 Seznam proteinů zahrnutých do procesu sporulace lze nalézt na adrese http://www.uniprot.org/uniprot/?query=sporulation&sort=score.
12
