OBECNÝ METABOLISMUS ENZYMY
Enzymy - základní terminologie • Katalyzátor
je látka, která zvyšuje rychlost chemické reakce, ale nemění chemickou rovnováhu
• Enzymy
jsou katalyzátory biologických systémů umožňující chemické přeměny
• Při reakcích se molekula enzymů nespotřebovává • Katalytická síla enzymu je definována jako poměr rychlosti reakce katalyzované enzymem a rychlosti reakce nekatalyzované
• Enzymy
jsou makromolekulární látky, jejichž základem jsou bílkoviny (globulární)
• Katalytickou aktivitu může katalyzátory - ribozymy)
mít i RNA (pravděpodobně nejranější
Příklady enzymů Porovnání rychlostních konstant spontánní a katalyzované reakce a katalytické síly Enzym
Nekatalyzovaná reakce (knoncat s-1)
Katalysovaná reakce (kcat s-1)
Poměr (kcat/knoncat)
Orotidinmonofosfátdekarboxylasa
2,8 x 10-16
39
1,4 x 1017
Stafylokokální nukleasa
1,7 x 10-13
95
5,6 x 1014
AMP nukleosidasa
1,0 x 10-11
60
6,0 x 1012
Karboxypeptidasa A
3,0 x 10-5
578
1,9 x 1011
Ketosteroidisomerasa
1,7 x 10-7
66 000
3,9 x 1011
Triosafosfátisomerasa
4,3 x 10-6
4 300
1,0 x 109
Chorismátmutasa
2,6 x 10-5
50
1,9 x 106
Karbonáthydratasa
1,3 x 10-1
1 x 106
7,7 x 106
Enzymy - základní terminologie • Katalýza
se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném aktivní místo
• Vedle bílkovinné složky mohou enzymy obsahovat součást
i nebílkovinnou
• Látka jejíž přeměnu enzym katalyzuje se nazývá substrát Enzymy lze dělit na: 1. Jednoduché – obsahují jen bílkovinnou část (např. hydrolasy – pepsin, trypsin, ribonukleasa)
• enzymy monomerní, tvořené jedinou podjednotkou • oligomerní, tvořené z více podjednotek
Struktura enzymů 2. Složené enzymy – obsahují i nebílkovinou složku → kofaktor vázanou na bílkovinnou součást apoenzym (apoprotein – bílkovina)
APOENZYM + KOFAKTOR
HOLOENZYM
• Ionty kovů • Organická skupina či sloučenina Pevně (většinou kovalentně) vázaná – prostetická skupina (širší význam) – odstranění – ztráta aktivity - na téže enzymové bílkovině, je pevně vázáná Volně vázaná – koenzym – vratně disociuje – disociuje z dané enzymové bílkoviny a může se regenerovat v jiné enzymové reakci - druhý substrát
Struktura enzymů
Koenzym x prostetická skupina
Koenzym x prostetická skupina
Prostetická skupina
Koenzym
Vitamíny
Kofaktor
Funkce, reakce
Onemocnění
B1 thiamin
Thiamindifosfát
Přenos aldehydické skupiny
Beri-beri
B2 riboflavin
FMN, FAD
Oxidačně redukční
Dermatis
B2 nikotinová kyselina
NAD+.NADP+
Oxidačně redukční
Pelagra
B2 kyselina pantothenová
CoA
Přenos acylové skupiny
Hypertense
B2 kyselina listová
Tetrahydrofolát
Přenos C1 skupiny
Megaloblastická anemie
B6 pyridoxin
Pyridoxalfosfát
Přenos aminoskupiny
Deprese
B12 kobalamin
Kobalamin
izomerace
Chudokrevnost
H biotin
Biocytin
Přenos –COOH skupiny
Není známo
C kyselina askorbová
Kyselina askorbová
Hydroxylace donor vodíku
Skorbut
Kovový ion – metaloenzymy
Chemické katalyzátory
• látky urychlující chemické reakce • nemění přitom rovnováhy chemických reakcí • snižují aktivační energii • „nemění“ se při reakci Biokatalyzátory - enzymy • urychlují ustanovení rovnováhy chemické reakce • neovlivňují rovnovážnou konstantu • jsou specifické ve smyslu katalyzované reakce (specifita účinku) a ve smyslu výběru substrátu (substrátová specifita) • snižují aktivační energii reakce, tvoří komplex se substrátem • rychlost musí být přesně regulována podle potřeb organismu
Biokatalyzátory se liší od běžných chemických katalyzátorů 1) Vyšší reakční rychlostí 2) Mírnějšími podmínkami reakce – T, pH, tlak 3) Vyšší specifitou 4) Schopností regulace
Rozklad peroxidu vodíku
Principy enzymové katalýzy
Principy enzymové katalýzy
Energetika enzymových reakcí • Změna
volné (Gibbsovy) energie je termodynamická funkce vedoucí k pochopení katalytického účinku enzymů.
1. Reakce probíhá samovolně, když má D G negativní znaménko. 2. Systém je v rovnováze, když je DG = 0. 3. Reakce neprobíhá samovolně, když je DG pozitivní. Musí být dodána volná energie.
• Negativní
DG neznamená, že proběhne dostatečně
reakce rychle. Rychlost reakce závisí na volné aktivační energii DG*.
Typy terciární struktury • fibrilární (vláknitý tvar) - „skleroproteiny“ převládá jedna sekundární struktura; př. -keratin, -keratin • globulární (kulovitý tvar) - „sferoproteiny“ rovnoměrné zastoupení obou sekundárních struktur • membránové
Orientace zbytků AK
• Vodné prostředí - polární ven – hydrofobní dovnitř • Orientace zbytků AK u membránových proteinů je opačná
Aktivní místo • oblast v molekule enzymu, kde se váží substráty, případně kofaktory
• tvoří vedlejší řetězce nesousedních aminokyselin polypeptidového řetězce, tzv. katalytické. • tvoří třídimenzionální strukturu do které vstupuje substrát
• tvoří malou část celkového objemu enzymu • interakce substrátu a enzymu v aktivním místě vede ke tvorbě přechodového stavu
• substráty se váží do aktivního místa řadou slabých interakcí • vytváří se komplex enzym – substrát (ES). • specificita vazby enzym – substrát je založena na přesně uspořádaných atomech v aktivním místě • při tvorbě komplexu ES se uvolňuje vazebná energie přispívající ke snížení energie aktivační a tvorbě přechodového stavu
Specificita enzymů pyruvát
laktát
200 000x hůře
u živočichů substrátová specifita: • absolutní – ureasa • skupinová - karboxypeptidasa
u bakterií
Model interakce substrátu s enzymem • Zámku a klíče
• Indukovaného
přizpůsobení,
postupné změny konformace
Třídění klasifikace IUB – 1961, 6 tříd podle typu katalyzované reakce 1. třída oxidoreduktasy – oxidačně redukční reakce – nejpočetnější třída - laktátdehydrogenasa
2. třída transferasy – přenos skupin - aspartátaminotransferasa 3. třída hydrolázy – hydrolyticky (za účast H2O) štěpí vazby – početná skupina - ureasa 4. třída lyasy – nehydrolyticky (bez účast H2O) štěpí vazby, eliminace i adice - karbonátdehydratasa 5. třída izomerasy – intramolekulární přesuny atomů či skupin glukosa-6-fosfátizomerasa 6. třída ligasy – vznik energeticky náročných vazeb nejčastěji za spotřeby ATP - asparaginsyntethasa
Názvosloví enzymů Triviální • Názvy souvisely s místem výskytu nebo funkcí – ptyalin (sliny), trypsin, pepsin, starý žlutý enzym Jednoduché • Název substrátu nebo reakce + koncovka –asa: amylasa, ureasa, oxidasa, hydrolasa, transaminasa Systematické názvosloví • Odráží reakční specificitu – základ systematického třídění Regulérní • Substráty:produkty-reakce, typické pro jednotlivé třídy • L-Glu:NAD+-oxidoreduktasa (deaminující) Zjednodušené • Substrát + reakce + -asa • glukosa-6-fosfátdehydrogenasa
Názvosloví enzymů - tvorba Třída / % zastoupení
Tvorba názvu
Příklad systematického názvu
EC 1. Oxidoreduktasy Donor:akceptor25,6 oxidoreduktasa
(S)-malát:NAD+-oxidoreduktasa
EC 2. Transferasy 27,6
Donor:akceptorpřenášená skupinatransferasa
ATP:glycerol-3-fosfotransferasa
EC 3. Hydrolasy 22,9
Substrát hydrolasy, Adenosinaminohydrolasa odstraňovaná substrátová Triacylglycerolacylhydrolasa skupina-hydrolasa
EC 4. Lyasy 13,1
Substrát, odstraňovaná substrátová skupina
ATP-difosfolyasa
EC 5. Isomerasy 5,3
1.Substrát-isomerasa 2.Substrát-racemasa 3.Substrát-epimerasa 4.Substrát-mutasa
Xylosa-ketolisomerasa Alaninracemasa Glukosaepimerasa Methylmalonyl-CoA-mutasa
EC 6. Ligasy 5,5
1.molekula-2.molekula spojení ligasou
Alanyl:tRNA ligasa (AMP) Pyruvát:CO2-ligasa(ADP)
Třídění klasifikace http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html EC a.b.c.d
Např. alkohol:NAD:oxidoreduktasa (alkoholdehydrogenasa) EC 1.1.1.1 EC 1 – oxidoreduktasy EC 1.1. – skupina CHOH EC 1.1.1. – kofaktor NAD
EC 1.1.1.1 – číslo uvnitř skupiny
Rychlost reakce Určující charakteristika
• dc/dt
Enzymové jednotky Aktivita enzymu = rychlost enzymem katalysované reakce
Stanovení počáteční rychlosti v0 1. Smluvní jednotky – např. u amylasy - množství enzymu, které rozštěpilo za 30 min při 40 oC dané množství škrobu, aby ten nedával reakci s jodem 2. Mezinárodní jednotka (IU) množství enzymu, které katalysuje přeměnu 1 mmolu substrátu (tvorby produktu) za 1 minutu při 30°C (za optimálních podmínek, pufr, pH, koncentrace substrátu, kofaktor) 3. Jednotka SI (rok 1973) katal (kat) množství enzymu, které katalysuje přeměnu 1 molu substrátu (tvorby produktu) za 1 sekundu při 30°C (za optimálních podmínek, pufr, pH, koncentrace substrátu, kofaktor). Používají se mkat (10-6 kat) a nkat (10-9 kat). 1 kat = 1 mol/s = 6,107 IU 1 IU = 16,67 nkat
Vyjadřování katalytické účinnosti enzymů Specifická aktivita aktivita vztažená na celkové množství (koncentraci) vztažného parametru( bílkoviny) – např. nkat/mg
Číslo přeměny látkové množství substrátu (mol) přeměněné molem enzymu za časovou jednotku (s) – k [s-1] Aktivita se měří za optimálních podmínek – teplota, pH a iontová síla roztoku.
Metody stanovení aktivity enzymu • Stanovení změny [P] nebo [S] v čase: –dc/dt • Výhodnější [P], ale záleží na možnostech metody • Spektrální – absorpční, fluorescenční aj., chemické, elektrochemické (amperometrie), enzymové (spřažené reakce)
POZOR - vliv prostředí
Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymů
Warburgův optický test
Stanovení glukosy
Vliv prostředí na rychlost enzymové reakce Optimální podmínky • In vivo – fysiologické prostředí • In vitro – napodobení fyziologických podmínek
Vliv pH • Většina enzymů je aktivní pouze v úzkém rozmezí pH. Spočívá to ve vlivu pH na kombinaci faktorů: A) Vazba substrátu na enzym
B) Stav ionizace substrátu C) Ionizační stavy vedlejších řetězců aminokyselin v aktivním místě
• Většina
enzymových reakcí vytváří zvonovou křivku závislosti reakční rychlosti na pH.
• Hodnotu pH, při které dochází k nejvyšší rychlosti enzymové reakce nazýváme pH optimum.
Vliv pH
Vliv teploty • Teplotní stabilita enzymů závisí na řadě faktorů jako je pH, iontová síla prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost ligandů.
• Substráty obecně • Nízkomolekulární
chrání enzymy před tepelnou denaturací.
enzymy s jednoduchým polypeptidovým řetězcem obsahující disulfidové vazby, jsou obvykle teplotně stabilnější než vysokomolekulární oligomerní enzymy.
• Obecně, se zvyšující se teplotou roste aktivita enzymů. • Enzymy jsou proteiny, u kterých se terciární a kvarterní struktura udržuje slabými interakcemi jako jsou vodíkové vazby, iontové interakce atd.
• Závislost
rychlosti na teplotě obvykle vykazuje vrchol, který označujeme jak teplotní optimum.
• Při dalším zvyšování teploty obvykle dochází k denaturaci proteinu. • Pro práci s enzymy je doporučována IUB teplota 30 oC.
Vliv teploty
Kinetika enzymové reakce
Časový průběh enzymové reakce – prestacionární a stacionární stav
Rovnice Michaelise a Mentenové Kinetický popis aktivity enzymu
• Reakční rychlost vo se obvykle vyjadřuje jako počet molů produktu vytvořených za sekundu.
Podmínky pro odvození kinetické rovnice Michaelise a Mentenové
• Tvorba komplexu enzym-substrát [ES]. • Měříme počáteční rychlost vo, kdy
se nenahromadilo takové množství produktu, že by ovlivňovalo zpětnou reakci.
• Ustálený
stav – koncentrace [ES] se nemění i když koncentrace substrátu a produktu se mění. Rychlost tvorby [ES] je shodná s rychlostí rozpadu [ES].
v0 = f([S]) Rovnice Michaelise-Mentenové v0 = (vmax [S]) / (KM + [S]) Hyperbolický průběh
[S] ◄ KM [S] ► KM [S] = KM
v0 = Vlim / 2
Maximální rychlost vmax = kcat [E]t
Vlim Počáteční reakční rychlost [vO]
Speciální případy
Vlim
Vlim / 2
Km Koncentrace substrátu [S]
Stanovení kinetických parametrů Linearizace tzv. vynesení dle Lineweavera a Burka 1/v0 = 1/f([S]) Vlim [S]
vO = 1
vO 1
vO 1
vO
Rovnice Michaelise a Mentenové
Km + [S] =
=
=
Km + [S] Vlim [S] Km Vlim [S] Km Vlim [S]
+
+
[S]
Vlim [S] 1
Sklon = Km /Vlim
Vlim
Průsečík = 1/Vlim
Dvojnásobně reciproká rovnice Lineweavera a Burka
Stanovení kinetických parametrů Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / vo proti 1 / [S] dle Lineweavera a Burka 1 / vo = KM / Vlim . 1 / [S] + 1 / Vlim 1 / [vO] Sklon = Km / Vlim
Průsečík = -1/Km Průsečík = -1/Vlim 0
1 / [S]
Význam konstant KM je mírou afinity substrátu k enzymu
• KM = (k2
+ kcat ) / k1 je vztah mezi KM a rychlostními konstantami enzymové reakce ve smyslu rovnice Michaelise a Mentenové. • Formálně disociační konstantou komplexu [ES] • Není závislá na katalytickém množství (aktivitě enzymu) v pokusu, pokud pracujeme v oblasti lineární závislosti v na [E] • Lze ji tabelovat a užít jako srovnávací parametr • Mění se s externími parametry (pH, iontová síla…) • Liší se pro různé substráty téhož enzymu • Kosubstráty – NAD+ apod. (LDH) • Vztah k metabolickým hotovostem – „pool“. Koncentrace substrátu, při které je substrátem obsazena polovina aktivních míst enzymu. Odpovídá koncentraci substrátu in vivo.
Význam konstant KM je mírou afinity substrátu k enzymu
• V případě, že k2 je mnohem větší než kcat to znamená, že ES komplex disociuje na E a S mnohem rychleji, než se tvoří produkt. • Vztah se zjednoduší na KM = k2 / k1. Disociační konstanta komplexu ES je: KES = [E] [S] / [ES] = k2 / k1
• Jinými slovy: KM je v tomto případě rovno disociační konstantě komplexu ES.
• Vysoké hodnoty KM ukazují na slabou afinitu substrátu k enzymu, a naopak nízké hodnoty na vysokou afinitu.
Význam konstant Vlim je ukazatelem aktivity enzymu
• Závisí na katalytickém množství enzymu v experimentu
• Dá
se užít k vyjádření katalytické účinnosti a čistoty enzymu. V těchto případech se vypočítá tzv. specifická aktivita jako poměr Vlim a množství enzymu (typicky v mg bílkoviny neznáme-li jeho Mr nebo pracujeme se směsí – homogenát, krevní sérum apod.)
• Známe-li
látkové množství enzymu, pak specifickou aktivitu vztaženou na látkové množství enzymu nazýváme číslem přeměny (TN): Vlim / [E] [mol.s-1/mol] = TN [s-1] = kcat [s-1]
Obvyklá chyba studentů • Uvažují,
že rychlostní konstanta kcat nemůže být větší než k1 neboť by to znamenalo, že se komplex ES se rozpadá rychleji než se tvoří.
• Pozor:
konstanty mají různé jednotky a proto nemohou být srovnávány !!
• Konstanta k1 má jednotky M-1. s-1 nebo (min)-1, konstanta kcat má jednotky s-1 nebo min-1.
• Nejsou to rychlosti, ale rychlostní konstanty prvního a druhého řádu !!!
• Rychlost tvorby [ES] je k1 [E][S] • Rychlost rozpadu [ES] na E + P je kcat[ES]. Může nastat stav, kdy kcat >>k2 !!! V tom případě se KM redukuje na kcat / k1 !!!
Číslo přeměny enzymu • Definujeme jako počet molekul substrátu převedených na produkt enzymovou molekulou za časovou jednotku při plné saturaci enzymu substrátem.
• Nazývá se také katalytická konstanta kcat. Enzym
Číslo přeměny enzymu
Karbonáthydratasa
600 000
3-ketosteroidisomerasa
280 000
Acetylcholinesterasa
25 000
Penicilinasa
2 000
Laktatdehydrogenasy
1 000
Chymotrypsin
100
DNApolymerasa
15
Lysozym
0,5
Konstanta specificity • Kinetická dokonalost enzymové aktivity poměr kcat / KM • kcat (vyšší – účinnější katalýza) a KM (nižší – větší afinita enzymu k substrátu)
• Spolehlivější
ukazatel substrátové specificity – preference
substrátů
•V
případě, že koncentrace substrátu je mnohem vyšší než KM rychlost enzymové reakce je dána kcat, což je číslo přeměny
• Za fyziologických podmínek enzym nebývá substrátem nasycen Poměr [S] / KM je mezi 0,01 až 1,0.
• Za situace, kdy je [S] < < KM je rychlost enzymové reakce mnohem menší než kcat, protože je mnoho aktivních míst neobsazeno
Konstanta specificity
• Existuje
nějaké číselné měřítko, které by charakterizovalo enzym za podmínek v buňce? • Pomocí tohoto kriteria můžeme porovnávat preferenci enzymu pro různé substráty. • Horním limitem je rychlost difúze substrátu do aktivního místa enzymu. Ester aminokyseliny
Vedlejší řetězec
kcat /KM (s-1M-1)
Glycin
-H
1,3 x 10-1
Valin
isopropyl
2,0
Norvalin
n-propyl
3,6 x 102
Norleucin
n-butyl
3,0 x 103
Fenylalanin
benzyl
1,0 x 105
Nejdokonalejším substrátem je fenylalanin
Dvousubstrátové reakce Sekvenční - náhodný mechanismus (bi – bi)
• nezáleží
na tom, který z obou substrátů se váže jako první na
enzym
• příklad: kreatinkinasa ATP Kreatin
Fosfokreatin ADP
Enzyme
Enzyme E (kreatin) (ATP) Kreatin ATP
E (fosfokreatin) (ADP) ADP Fosfokreatin
Dvousubstrátové reakce Sekvenční - uspořádaný mechanismus (bi – bi)
• substráty se váží do aktivního místa v určitém pořadí • příklad: alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa
(nejdříve se
váže koenzym NADH a poté druhý substrát)
NADH Pyruvát Enzyme E (NADH) (pyruvát)
Laktát NAD+
E (laktát) (NAD+)
Enzyme
Dvousubstrátové reakce Pingpongový mechanismus • enzym přechází mezi dvěma stálými formami • po vazbě prvního substrátu se tvoří substituovaný enzymový meziprodukt - modifikovaný enzym • první produkt se uvolní a poté se váže na modifikovaný enzym druhý substrát a odštěpí se druhý produkt • příklad: aspartátaminotransferasa Aspartát
Oxaloacetát
E (aspartát)
(E-NH3+ ) (oxaloacetát)
Enzyme
-Oxoglutarát
(E-NH+ ) 3
(oxaloacetát)
(E-NH+ ) 3 (-oxoglutarát)
Glutamát Enzyme E (glutamát)
Regulační aspekty Michaelisovská kinetika
•
vliv [S] na rychlost
Alosterické enzymy
• •
oligomerní
•
neřídí se kinetikou Michaelise a Mentenové.
kooperativita - efektivní regulace
Aspartáttranskarbomoylasa (ATCasa) • ATCasa katalyzuje první krok biosyntézy pyrimidinových nukleotidů. • ATCasa je inhibována produktem – cytidintrifosfátem (CTP). • Tento typ inhibice se nazývá – zpětnovazebná inhibice nebo inhibice konečným produktem. Vždy je inhibován první reakční krok.
• CTP je strukturně odlišný od substrátu a váže se proto na jiné místo enzymu než substrát. Taková místa se nazývají allosterická (z řečtiny allos jiná a steros struktura, místo).
• ATCasa
je složena ze dvou katalytických podjednotek (každá obsahuje tři řetězce) a tří regulačních podjednotek (každá obsahuje dva řetězce).
• ATP je allosterický aktivátor, CTP je allosterický inhibitor.
Modulace rychlosti enzymové reakce Metabolický význam – in situ
• Regulace metabolismu Studium metabolismu – in vitro
• Objasnění mechanizmu působení enzymů • Součást regulací jako celku Způsoby – účinek metabolitů, modifikace apoenzymu
• Modulátory, efektory • Positivní – aktivátory • Negativní - inhibitory
Inhibice enzymové aktivity Typy inhibitorů Ireversibilní
• Vážou
se pevně a nevratně. Blokují nevratně enzymovou aktivitu tím, že vytváří s enzymem velmi pevný kovalentní komplex enzym – inhibitor
Reversibilní
• Interagují s enzymem vratně • Dají se odstranit např. dialýzou, gelovou chromatografií • Typy reversibilních inhibicí ‐ Kompetitivní ‐ Nekompetitivní ‐ Akompetitivní
Ireverzibilní inhibice CH3 H CH3 OH
Ser
+
F O
CH3 H CH3
O O
P
O
O
H
CH3
CH3
DIPF
Acetylcholinesterasa
H
O
+
P
F
-
+
+
H
O CH3
CH3
Inaktivovaný enzym
Příklad: Inhibice cholinesterasy a proteinas diisopropylfluorfosfátem, který se kovalentně váže na Ser v aktivním místě nebo
• •
Organofosfáty, těžké kovy Lze využít jako modifikační činidla pro studium aktivního centra
Ireverzibilní inhibice • SH-inhibitory - inaktivace cysteinového řetězce enzymu jodacetamidem
O
O SH
Cys
+
I
C H2
C
NH2
S
C H2
C
Jodacetamid
Enzym
Inaktivovaný enzym
• Alkylační činidla, rtuťnaté sloučeniny (PCMB)
NH2
+
I
-
+
+
H
Reverzibilní inhibice Inhibitor lze odstranit (dialýza, gelová filtrace) Kompetitivní • Inhibitor se váže do aktivního místa • Strukturní podobnost se substrátem • Soutěžení inhibitoru se substrátem Nekompetitivní • Inhibitor se váže jinak • Substrát neovlivní vazbu inhibitoru Akompetitivní • Inhibitor se váže na komplex ES Alosterická • Vazba na jinou podjednotku
Schéma kompetitivní inhibice Kompetitivní inhibice Klasická kompetitivní inhibice S
I Enzym
S Enzym
I
Enzym
Neklasická kompetitivní inhibice S
S Enzym
I Enzym
I
Enzym
Buďto vstoupí substrát do aktivního místa enzymu a zamezí vstupu inhibitoru nebo naopak.
Kompetitivní inhibice Kompetitivní inhibitor
• Reaguje
s volným enzymem a soutěží se substrátem
• Vazné místo v aktivním centru • Může se navázat pouze na volný enzym
•V
reakční směsi se pak vyskytuje mimo E, S a ES ještě EI (komplex enzym-inhibitor), který se tvoří vratně mezi volným enzymem a inhibitorem
• Zvýšení KM (zdánlivá hodnota) • Vlim se nemění
Kompetitivní inhibice
Grafické vyjádření této závislosti vidíme na vynesení dle Lineweavera a Burka
Kompetitivní inhibice Inhibice SDH malonátem
• Jantaran (sukcinát) je substrátem enzymu sukcinátdehydrogenasy (vzniká fumarát) (enzym citátového cyklu)
• Malonát je kompetitivním inhibitorem SDH (nelze ho dehydrogenovat)
• Strukturní podobnost, někdy bývá méně názorná (el. hustoty)
• Určení typu inhibice kineticky
-
COO
HC
CH2 -
Sukcinátdehydrogenasa OOC
CH2
-
COO
CH
+
2 H
-
COO
Sukcinát
Fumarát
-
COO CH2
-
COO
Malonát
Kompetitivní inhibitor
E + I
EI
Ki = [E] [I] / [EI]
Potlačení intoxikace ethylenglykolem – ethanolem
Tvorba oxalové kyseliny z ethylenglykolu je inhibována ethanolem: H2C
OH
Alkoholdehydrogenasa
H2C
OH
Inhibováno ethanolem
Ethylenglykol HO
+
CH2 CH3
Ethanol
O
H C H2C
COOH OH
Aldehyd
COOH
Ethandiová kyselina, oxaláty
Schéma nekompetitivní inhibice Nekompetitivní inhibice S
S Enzym
I Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Nekompetitivní inhibice •
Inhibitor není podobný substrátu
• Váže se jak na volný E tak na komplex ES
• Vytváří komplex EI • [EI] nezávisí na [S], ale pouze [I]
• Vlim se snižuje • KM se nemění
Nekompetitivní inhibice
Grafická analýza dle Lineweavera a Burka
Kompetitivní a nekompetitivní inhibice
Kompetitivní a nekompetitivní inhibice
Oranžová – nekompetice Zelená - kompetice
Schéma akompetitivní inhibice
Akompetitivní inhibice S
S Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Akompetitivní inhibice Stejné množství substrátu a inhibitoru: E + S
ES + I
30
Akompetitivní inhibice
E + P
1/vi =
Km Vlim [S]
+
( 1
Vlim
1+
[I]
Ki
)
1 / [vO]
20
EIS Nadbytek substrátu: S S S E + S S + S I S
Bez inhibice 1/vO =
10
ES
Km Vlim [S]
+
1
Vlim
ESI Km se mění Vlim se mění
Nadbytek substrátu neovlivní reakci.
ES + I
Nemění se sklon
ESI
Ki = [ES] [I] / [ESI]
0
100
200
300
1 / [S], M-1
400
500
Tabulka typů inhibice a příslušných konstant
Inhibice Kompetitivní I se váže jen na E Nekompetitivní I se váže jak na E tak na ES
Konstanty Roste KM, Vlim se nemění
Akompetitivní I se váže jen na ES
Klesá Vlim a KM Poměr Vlim / KM se nemění
Klesá Vlim, KM se nemění
Inhibitory enzymu – princip účinku řady léčiv Látka Inhibovaný enzym Acetylsalicylová Cyklooxygenasa - zajištuje kys., ibuprofen přeměnu kyseliny arachidonové na prostaglandiny Statiny HMG-CoA reduktasa
Pozn. zmírňují rozvoj zánětu, bolestivost a snižují teplotu
Neostigmin
acetylcholinesterasa
Rivastigmin, galantamin
Mozková acetylcholinesterasa
nervosvalové choroby, pooperační atonie střev Alzheimerova choroba
hypolipidemika, snižují hladinu cholesterolu
Inhibitory enzymů bakterií – antibiotika
Látka
Inhibovaný enzym
Penicilíny Tetracyklíny, makrolidy, chloramfenikol Fluorované chinolony
Transpeptidasa (výstavba buněčné stěny) Inhibice proteosyntézy Topoisomerasa II (rozplétání DNA během replikace)
Isoenzymy Stejná aktivita • Katalyzují stejnou reakci • Liší se strukturou apoenzymu (primární struktura) a/nebo postranslačními úpravami • Liší se fyzikálně-chemickými vlastnostmi (odlišná afinita k substrátu, KM, citlivost k inhibitorům) • Často rozdílná subcelulární /tkáňová dustribuce • Podjednotkové složení • Úloha stáří organismu • Orgánová specificita
Příklad LDH
Isoenzymy Kreatinkinasa (CK) je dimer a tvoří tři izoenzymy Izoenzym
Výskyt
CK-MM
svaly
Procento Zvýšení celkové aktivity 94-96% Svalové trauma
CK-MB CK-BB
srdce mozek
do 6% stopy
Infarkt Poranění mozku
Zymogeny - proenzymy • Neaktivní formy • Posttranslační modifikace • Význam – proteasy
Organizace enzymů Efektivita reakcí
• katabolické – jednodušší • anabolické – význam organizovanosti Typy
• enzymy volně rozpuštěné (cytoplasma – glykolýza) • multienzymové komplexy (zvl. pro anabolické pochody – syntéza MK, ale i katabolické pochody – využití energie)
• membránově vázané enzymy (organizovanost, vektoriální průběh reakcí – využití energie – oxidační a fotosyntetická fosforylace)
Využití enzymů v lékařství 1. Enzymy jako indikátory patologického stavu
2. Enzymy jako analytická činidla v diagnostice v klinické biochemii 3. Enzymy jak léčiva Ad 1. Při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině Enzym ALT (alaninaminotransferasa) CK (kreatinkinasa)
Referenční hodnoty
Interpretace zvýšení
do 0,9 mkat/l
hepatopatie
do 4 mkat/l
myopatie, infarkt myokardu
Využití enzymů v lékařství Ad 2. Enzymy jako analytická činidla v diagnostice v klinické biochemii Enzym
Glukosaoxidasa Peroxidasa Lipasa Cholesteroloxidasa Urikasa Bilirubinoxidasa Ureasa Laktátdehydrogenasa Taqpolymerasa
Stanovení
glukosa glukosa triacylglyceroly cholesterol kyselina močová bilirubin močovina ALT, AST PCR metoda
Využití enzymů v lékařství Ad 2. Enzymy jako analytická činidla v diagnostice v klinické biochemii
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Diagnostika místa a rozsahu tkáňového postižení –
• stanovení aktivit enzymů v tělesných tekutinách (nejčastěji – plazma)
• prognostický přínos - na základě změn hladin příslušných enzymů v čase 1) Enzymy specifické pro plazmu – např. srážecí faktory 2) Sekreční enzymy, v různé míře se dostávají do krve – např. pankreatická amylasa či lipasa 3) Intracelulární enzymy – do krve pronikají při poškození buněk příslušné tkáně
• Některé enzymy jsou orgánově specifické. Typicky se jedná o různé druhy izoenzymů či izoforem enzymů. Např. izoenzymy kreatinkinázy – CK-MB typická pro myokard a CK-MM pro kosterní sval.
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Játra
a) Markery poškození hepatocytů: 1. ALT (alaninaminotransferasa) v cytoplazmě
–
lokalizovaná
převážně
2. AST (aspartátaminotransferasa) – lokalizovaná převážně v mitochondriích - dochází k jejímu uvolnění až při těžším poškození jaterních buněk b) Markery cholestázy: 1. ALP (alkalická fosfatasa)
2. 2GGT (γ-glutamyltransferasa) – zvýšená aktivita u chronického alkoholického postižení jater
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Pankreas
a) Pankreatická amylasa – méně specifická pro postižení pankreatu než pankreatická lipasa b) Pankreatická lipasa Svalová tkáň K odlišení místa poškození se měří aktivity izoenzymů kreatinkinasy: a) CK-MM – lokalizovaná v kosterním svalstvu b) CK-MB – lokalizovaná v myokardu c) CK-BB – lokalizovaná v mozku
Využití enzymů v diagnostice onemocnění Kostní tkáň a) ALP (alkalická fosfatasa) – lokalizovaná v osteoblastech – tzv. kostní frakce, může ale pocházet i z jater (tzv. jaterní frakce), GIT či z ledvin b) ACP (kyselá fosfatasa) – lokalizovaná v osteoklastech, může pocházet i z prostaty Dále se stanovují také: 1) Izoenzymy laktátdehydrogenasy (LD, LDH) a) LD-1 – lokalizovaná v buňkách myokardu a erytrocytech b) LD-2 – lokalizovaná v RES c) LD-3 – lokalizovaná v plicích d) LD-4 – lokalizovaná v ledvinách, pankreatu a placentě e) LD-5 – lokalizovaná v játrech a kosterním svalu
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace dýchacího řetězce a aerobní fosforylace 1. Dostupnost O2, který je finálním akceptorem elektronů 2. Poměr NADH / NAD+ a FADH2 / FAD 3. Dostupnost ADP pro syntézu ATP 4. UCP (uncoupling proteins – odpřahovače DŘ od aerobní fosforylace → snížení protonového gradientu) Regulace Krebsova cyklu Regulačními body (enzymy) Krebsova cyklu jsou: 1. Citrátsyntasa 2. Isocitrátdehydrogenasa - hlavní regulační enzym 3. α-ketoglutarátdehydrogenasa
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulačními faktory Krebsova cyklu jsou: Poměr NADH / NAD+ a FADH2 / FAD – respirační kontrola Hromadí-li se NADH a FADH2 → dojde k isocitrátdehydrogenasy a α-ketoglutarátdehydrogenasy.
inhibici
Poměr ATP / (ADP a AMP) – energetická kontrola Dostatek energie inhibuje isocitrátdehydrogenasu a α-ketoglutarátdehydrogenasu – ATP je inhibitor, ADP a AMP jsou aktivátory. Dostupnost substrátů Krebsova cyklu – substrátová kontrola
Na úrovni citrátsyntasy, která produkuje tolik citrátu, kolik jí dodáme oxaloacetátu a acetyl-CoA. Dostupnost O2 – těsný vztah respiračním řetězcem
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace oxidační dekarboxylace pyruvátu 1. Interkonverze pyruvátdehydrogenasového komplexu (PDH)
• fosforylace snižuje aktivitu komplexu • defosforylace ji naopak zvyšuje. • inzulin prostřednictvím defosforylace aktivuje komplex 2. Kompetitivní inhibice produkty • acetyl-CoA a zvýšený poměr NADH / NAD+ způsobují inhibici.
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace glykolýzy Enzymy katalyzující nevratné exergonní reakce: 1. Hexokinasa / glukokinasa 2. 6-fosfofrukto-1-kinasa (PFK-1) - hlavní allosterický regulační enzym 3. Pyruvátkinasa • Zvýšení poměru ATP / AMP vede k inhibici glykolýzy • Citrát inhibuje glykolýzu • Regulace přes fruktóza-2,6-bisfosfát (Fru-2,6-P) • Glykolýzu aktivuje inzulin a inhibují ji kontraregulační hormony • Inhibice kyselým pH
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace glukoneogeneze Aktivace během hladovění nebo za patologických stavů (stres v důsledku infekce, polytraumata apod.) Regulační enzymy obcházejí nevratné reakce glykolýzy 1. Pyruvátkarboxylasa: aktivuje ji acetyl-CoA pocházející například z β-oxidace mastných kyselin 2. Fosfoenolpyruvátkarboxykinasa 3. Fru-1,6-bisfosfatasa 4. Glc-6-fosfatasa: regulují je stejné vlivy jako reakce glykolýzy, pouze v opačném směru. Hladina substrátů daných enzymů • vznikají např. proteolýzou či lipolýzou Kontraregulační hormony • glukokortikoidy, glukagon či katecholaminy glukoneogenezi zesilují • inzulin ji naopak inhibuje
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace syntézy glykogenu Hlavním regulačním enzymem je glykogensyntasa 1. Aktivita je regulována pomocí fosforylace • pokud je enzym fosforylován, inaktivuje se
• defosforylace naopak vede k aktivaci enzymu 2. Fosforylaci ovlivňuje poměr inzulin / glukagon (např. skrze intracelulární koncentraci cAMP) • zvýšení poměru aktivuje syntézu glykogenu (inzulin je anabolický hormon) • snížení poměru či katecholaminy ji naopak inhibují
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace degradace glykogenu Hlavním regulačním enzymem je glykogenfosforylasa 1. Kovalentní modifikací molekuly 2. Glykogenolýzu aktivují kontraregulační hormony • glukagon, katecholaminy a glukokortikoidy (např. kortizol) • inzulin ji oproti tomu inhibuje
3. Změna koncentrace Ca2+ iontů
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace pentózového cyklu Dostupností koenzymu NADP+
Regulace lipolýzy 1. Regulační enzym lipolýzy - hormon-senzitivní lipasa 2. Hormonálně • inzulin jako anabolický hormon vyvolává její inhibici • kontraregulační hormony (glukagon, katecholaminy) či hormony štítné žlázy ji naopak aktivují
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace β-oxidace
1. Na úrovni vstupu mastných kyselin do mitochondrie → na úrovni karnitinového přenašeče → na úrovni karnitinacyltransferasy I • inhibice meziproduktem malonyl~CoA
tvorby
mastných
2. Hormonálně • inzulin β-oxidaci inhibuje • kontraregulační hormony naopak aktivují
kyselin
–
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace ketogeneze Regulace ketogeneze probíhá na čtyřech stupních: 1. Hormon-senzitivní lipasa – lipolýza v tukové tkáni 2. Karnitinacyltransferasa I – vstup mastných kyselin do mitochondrie, kde proběhne jejich β-oxidace 3. Směřování AcCoA z β-oxidace do ketogeneze a ne do Krebsova cyklu 4. Mitochondriální HMG-CoA-syntasa • Vysoká hladina ketolátek v krvi signalizuje přítomnost velkého množství AcCoA • Jejím následkem je inhibice lipolýzy
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace syntézy mastných kyselin 1. Dostatek substrátů i dostatkem energie. 2. Klíčovou regulační roli hraje AcCoA-karboxylasa: • inzulin aktivuje karboxylasu • glukagon a adrenalin ji naopak inhibují (skrze fosforylaci) • citrát ji aktivuje - znak dostatku stavebních jednotek a energie • palmitoyl-CoA (obecně acyl-CoA) inhibuje karboxylasu feedback inhibice • AMP ji inhibuje
Regulace jednotlivých metabolických drah Regulace močovinového cyklu 1. Hlavní regulační enzym ornitinového cyklu: • Karbamoylfosfátsyntetasa I 2. Transkripce enzymů močovinového cyklu se zvyšuje u vysokoproteinové diety či u narůstajícího proteokatabolismu ve stavech zvýšené nabídky aminokyselin 3. Protože močovinový cyklus patří mezi protonproduktivní reakce, nastává jeho útlum při poklesu pH - acidóze
Regulace syntézy hemu 1. Hlavní regulační enzym • ALA-syntasa (δ-aminolevulová kyselina = ALA) • inhibice konečným produktem celé dráhy – hem (negativní zpětná vazba)
