Oxidoredukční enzymy

ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1. LF UK

Oxidoredukční enzymy Praktické cvičení z lékařské biochemie Všeobecné lékařství

Jiří Kraml, Jiřina Crkovská

2010/2011 1

Většina energie v živočišném organismu pochází z oxidoredukčních pochodů. Oxidační produkty reakce mají menší obsah energie než výchozí reagující látky a energie je uvolňována jako teplo nebo je transformována na jiné druhy využitelné energie, např. na energii chemické vazby. Četné oxidace jsou spojeny s tvorbou „makroergických“ fosfátových esterů anhydridové povahy (ATP, ADP), jež mají zvláštní důležitost při konzervaci a přenosu energie. Vytvářejí se z energie uvolněné v buňce při oxidačních reakcích. Oxidoredukce mohou probíhat anaerobně, např. v glykolýze, nebo aerobně, např. při oxidaci substrátů citrátového (Krebsova) cyklu nebo -oxidací mastných kyselin v mitochondriích. Cukry, lipidy a bílkoviny představují zdroje energie v organismu, ale oxidace neprobíhají většinou přímo s molekulárním kyslíkem ani při aerobních oxidoredukcích (s výjimkou tzv. oxygenas). Při oxidoredukčních pochodech v mitochondriích je přenášen vodík ze substrátů na kyslík řadou přenašečů, jež vytvářejí mezi sebou přesně navazující systém enzymů. Tento řetěz oxidoredukčních pochodů (buněčné dýchání) probíhá ve dvou stupních: 1.

Přenos vodíku účinkem dehydrogenas, jež obsahují jako koenzym pyridin- a flavinnukleotidy.

2.

Přenos

elektronů

zejména

prostřednictvím

cytochromů

(v

mitochondriích).

Významný je poslední stupeň, kde autooxidabilní cytochromoxidasa reaguje přímo s molekulárním kyslíkem za tvorby vody. Oxidoredukční sled reakcí probíhá ve vnitřní mitochondriální membráně v tzv. dýchacím (respiračním) řetězu, který je velmi schematicky vyjádřen jako dvouelektronový přenos,

neboť

molekulám

organických

substrátů

jsou

elektrony

prostřednictvím

dehydrogenasových koenzymů při biologických oxidacích odnímány v párech. Na úrovni cytochromů je však přenos jednoelektronový a na úrovni cytochromoxidasy při redukci molekuly O2 čtyřelektronový (viz dále úlohu 3). 2

Při

dvouelektronovém

přenosu

ze

substrátů

(nejčastěji)

citrátového

cyklu

na molekulární kyslík se současně vytvářejí molekuly ATP - tzv. aerobní (oxidativní) fosforylace. Akceptorem elektronů však nemusí být vždy kyslík. Některé dehydrogenasy odevzdávají elektrony i jiným akceptorům, např. pyruvátu (laktátdehydrogenasa) nebo in vitro i arteficiálním akceptorům, jako methylenová modř (flavinové dehydrogenasy). Jde tu o anaerobní oxidoredukce. V našem cvičení bude modelově demonstrována oxidoredukce glukosy vzdušným kyslíkem za katalýzy methylenovou modří, která bude fungovat jako dočasný akceptor elektronů. Její redukovaná forma (leukobáze) je bezbarvá, ale je autooxidabilní a třepáním se vzduchem opět přechází v barevnou oxidovanou formu. Z

dehydrogenas,

xanthinoxidoreduktasou

kromě

laktátdehydrogenasy,

(xanthinoxidasou,

EC

bude

1.17.3.2,

ukázána EC

dehydrogenace

1.17.1.4)

z mléka

(Schardingerův enzym), kde substrátem bude formaldehyd a akceptorem elektronů methylenová modř. Z respiračních mitochondriálních enzymů bude sledováno enzymové působení preparátu obsahujícího cytochromoxidasu (cytochrom c-oxidasa, EC 1.9.3.1), kde donorem elektronů pro cytochrom c, obsažený v preparátu, bude 1,4-fenylendiamin (1,4diaminobenzen), jehož oxidovaná forma je barevná. Vedle dehydrogenas a cytochromů patří k oxidoreduktasam (kromě jiných) také peroxidasa (EC 1.11.1.7) a katalasa (EC 1.11.1.6) rozkládající H2O2 tak, že peroxidasa katalyzuje oxidaci vhodného substrátu AH2 + H2O2  2 H2O + A,

3

kdežto katalasa uvolňuje molekulární kyslík při reakci 2 H2O2  2 H2O + O2. V naší úloze bude ukázáno působení peroxidasy z brambor, kde donorem elektronů bude derivát benzidinu (4,4´-diaminobifenylu), který se oxiduje na oxidovaný barevný produkt (modrý). Současně budeme prokazovat pseudoperoxidasové působení krevního barviva a katalasu v krvi.

Úloha 1:Oxidace glukosy vzdušným kyslíkem (modelový pokus) Princip: Tento pokus je modelem oxidoredukčního systému, kde akceptorem vodíku je autooxidabilní barvivo, methylenová modř, donorem redukčních ekvivalentů je glukosa, která se oxiduje. Methylenová modř je ve stavu oxidovaném modrá, redukcí přechází v bezbarvou "leukoformu". Vzdušným kyslíkem (třepáním) opět zmodrá.

Reagencie: 1)

glukosa 2,5 g/l

2)

methylenová modř 0,5 g/l

3)

hydroxid sodný 80 g/l

4

Pracovní postup: a.

1 ml roztoku glukosy smíchejte ve zkumavce s 50 μl roztoku methylenové modři, přidejte 3 kapky roztoku NaOH a zahřejte se na vroucí vodní lázni. Modrý roztok methylenové modři (M.m.) je hydrogenován na bezbarvou leukoformu (M.m.H2).

b.

Pro kontrolu se totéž učiní s 1 ml H2O.

c.

Zkumavky ochlaďte a protřepejte na vzduchu (oxidace).

d.

Porovnejte průběh reakce v obou zkumavkách a vysvětlete rozdíl.

Úloha 2: Dehydrogenace xanthinoxidoreduktasou (xanthinoxidasou) Princip: Xanthinoxidasa (EC 1.17.3.2) je relativně nespecifická dehydrogenasa obsažená např. v mléce (Schardingerův enzym), jež kromě hypoxanthinu, xanthinu, purinů a pterinů oxiduje i jednoduché aldehydy (má tedy i aktivitu aldehydoxidasy EC 1.2.3.1). Je to flavinový enzym, jehož koenzymem je flavinadenindinukleotid (FAD), avšak v aktivním centru obsahuje též atomy kovů (Mo, Fe). Dehydrogenací substrátu vzniká FADH2, který může být reoxidován molekulárním kyslíkem (autooxidace) za vzniku H2O2, nebo arteficiálním akceptorem (methylenová modř). Enzym není inhibován kyanidem, ale varem se ničí. V savčích játrech a jiných tkáních za fyziologických okolností in vivo existuje xanthinoxidasa převážně v dehydrogenasové D-formě (EC 1.17.1.4) s koenzymem NAD+. Jeho působením vzniká v organismu z purinů kyselina močová. Za patologických okolností a též za denaturujících podmínek in vitro je konvertována na oxidasovou O-formu (EC 1.17.3.2), která NAD+ neváže. Jako nespecifický substrát použijeme v našem pokuse roztok forma1dehydu, jako akceptor elektronů pro reoxidaci FADH2 methylenovou modř a jako zdroj enzymu nepasteurované kravské mléko.

5

Reagencie: 1) mléko nesvařené (nepasteurované) 2) mléko svařené 3) methylenová modř 0,5 g/l 4) roztok formaldehydu 4 g/l 5) KCN 10 g/l Pracovní postup: a.

Do 3 zkumavek připravte reakční směs podle tohoto schématu: 1

2

3

Čerstvé mléko

5ml

-

5 ml

Svařené mléko

-

5 ml

-

Methylenová modř

50 µl

50 µl

50 µl

KCN (pozor-jed!)

-

-

0,2 ml

250 µl

250 µl

250 µl

Formaldehyd

Obsah zkumavek dobře promíchat Parafinový olej * (převrstvit ihned po namíchání)

1 ml

1 ml

1 ml

Pozn. * Parafinový olej má zabránit autooxidaci (zajistit anaerobní průběh reakce) b.

Zkumavky vložte do suchého bloku, inkubujte při 37 °C a kontrolujte průběh reakce každé 2 minuty, až zkumavka č. 1 je zcela odbarvená.

c.

Zkumavku č. 1 protřepejte se vzduchem a mléko opět zmodrá, neboť probíhá reakce:

6

d.

Po vložení zpět do lázně se methylenová modř opět odbarví.

Vyhodnocení: Srovnejte a popište výsledky ve zkumavce č. 2 a 3 a srovnejte se zkumavkou č. 1. Vysvětlete výsledky.

Úloha 3: Cytochromoxidasa Princip: Cytochrom c-oxidasa (EC 1.9.3.1) oxiduje redukovaný cytochrom c a je posledním stupněm řetězového oxidačního pochodu ve vnitřní mitochondriální membráně. Reaguje přímo s molekulou kyslíku O2, přenáší na ni postupně 4 elektrony ze čtyř molekul redukovaného cytochromu c a redukované kyslíkové atomy vázané na aktivní centra enzymu (hem a3 a CuB) reagují s H+ ionty poskytovanými z mitochondriální matrix za vzniku 2 molekul H2O. Cytochromoxidasa je enzymový komplex (komplex IV respiračního řetězce) vázaný ve vnitřní mitochondriální membráně a sestávající ze 13 podjednotek, jejichž syntéza je řízena jednak jadernou, jednak mitochondriální DNA (3 podjednotky). Obsahuje 2 centra obsahující 3 ionty mědi (CuA/CuA a CuB) a dvě prostetické skupiny hemového typu a (a + a3) s koordinačně vázaným železem. Enzym je inhibován kyanidem a oxidem uhelnatým, které reagují s hemem a3 a CuB. Oba hemy jsou strukturou totožné. Rozdílné chemické a spektrální vlastnosti jim propůjčuje jejich okolí v aktivním centru enzymu. Celý komplex IV funguje současně jako jeden ze tří druhů protonových pump v respiračním řetězci vnitřní mitochondriální membrány (spolu s komplexem I a komplexem III) a redukce O2

na H2O je provázena vypuzením

4 protonů

z mitochondriální

matrix

do

mezimembránového prostoru. V našem modelovém pokusu slouží 1,4-fenylendiamin jako donor elektronů pro redukci cytochromu c, který je vlastním substrátem cytochromoxidasy. Cytochrom c je

7

obsažen v enzymovém extraktu z hovězího srdce spolu s cytochromoxidasou, která je velmi specifická a může přijímat elektrony pouze od redukovaného cytochromu c. Oxidovaná forma 1 ,4-fenylendiaminu dává s další molekulou hnědočervené barvivo. Jako donor elektronů pro cytochrom c by bylo možno užít i kyselinu askorbovou nebo jiné redukční činidlo. Aktivitu cytochromoxidasy je možno přímo měřit na základě oxidace redukovaného cytochromu c spektrofotometricky. V naší úloze však budeme sledovat aktivitu cytochromoxidasy pouze kvalitativně (podle oxidace 1,4-fenylendiaminu). Bude též ukázána inhibice cytochromoxidasy kyanidem.

Reagencie: 1) enzymový extrakt z hovězího srdce 2) kyanid draselný 10 g/l (pozor jed!) 3) 1,4-fenylendiamin (1,4-diaminobenzen) 1 g/l Pracovní postup: a.

Reakční směs připravte podle tohoto schématu:

pozn. * ve zkumavce 4 vzorek naředěný deionizovanou vodou povařte 5 min ve vroucí vodní lázni a ochladťe. Až po ochlazení přidejte 1,4-fenylendiamin 1 2 3 4 Enzymový extrakt

(ml)

0,4

0,4

0,4

0,4*

Neionizovaná voda

(ml)

2,4

2,2

2,0

2,2*

KCN (jed!)

(ml)

-

-

0,2

-

1,4-fenylendiamin

(ml)

-

0,2

0,2

0,2

8

b.

Vložte do vodní lázně při 37°C a za 10 minut se zhodnoťte zabarvení.

Vyhodnocení: Výsledek ve zkumavce č. 2 popište a srovnejte s výsledky ve zkumavce 1,3 a 4. Vysvětlete výsledky.

Úloha 4: Peroxidasa a katalasa Princip: Peroxid vodíku při oxidačních pochodech v buňce je rozkládán enzymy zvanými peroxidasy a katalasy. Patří do skupiny heminových enzymů (hemoproteinů). Průběh reakce je u obou enzymů rozdílný. Peroxidasy katalyzují oxidaci substrátu účinkem peroxidu vodíku za vzniku vody (viz teoretický úvod). Peroxidasy (EC 1.11.1.7) jsou obsaženy v rostlinných i živočišných organismech. Katalasa (EC 1.11.1.6) jednak rozkládá peroxid vodíku na vodu a molekulární kyslík, jednak má peroxidasový účinek. Vyskytuje se ve větším nebo menším množství ve všech tkáních (v tzv. peroxisomech) a v tekutinách organismu. Význam tkví hlavně v rozkladu H2O2 škodlivého pro organismus. V tomto cvičení bude prokazována peroxidasová reakce kvalitativně oxidací derivátu benzidinu na modré barvivo. Dříve se používal benzidin (4,4´-diaminobifenyl), který je však kancerogenní. Současně bude ukázána pseudoperoxidasová aktivita moči obsahující krevní barvivo (nespecifický vliv železa v hemu). Dále bude prokazován kvalitativně účinek katalasové aktivity krve na H2O2 za vývoje O2.

9

Tetrametylbenzidin. In WikiSkripta [online]. Praha : MEFANET, 2008- [cit. 2012-01-05]. Dostupné z WWW: . ISSN 1804-6517.

Reagencie: 1) extrakt z brambor obsahující peroxidasu 2) moč s krví 3) krev zředěná vodou 1 : 50 4) tetramethylbenzidin (3,3´,5,5´-tetramethylbenzidin) 30 g/l v ledové kyselině octové (nebo roztok tolidinu – 3,3´-dimethylbenzidinu) 5) peroxid vodíku 30 g/l 6) KCN 10 g/l (pozor jed !)

4.1 Důkaz peroxidasy benzidinovou reakcí Princip: Derivát benzidinu (tetramethylbenzidin) se působením peroxidasy a peroxidu vodíku oxiduje na barevný oxidovaný produkt Pracovní postup: a.

Reakční směsi se připraví do 4 zkumavek takto:

pozn. * ve zkumavce 4 vzorek povařte 5 min ve vroucí vodní lázni a ochladťe.

10

1

2

3

4

1,0 ml

-

-

1,0 ml

Extrakt z brambor povařený

-

1,0 ml*

Deionizovaná H2O

-

-

1,0 ml

100 µl

H2O2

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

Tetramethylbenzidin v kyselin octové

100 µl

100 µl

100 µl

-

Extrakt z brambor

Vyhodnocení: Porovnejte výsledek ve zkumavce č. 1 se zkumavkami č. 2, 3 a 4. Vysvětlete rozdíly.

4.2 Pseudoperoxidasová reakce Princip: Krev v moči katalyzuje oxidaci tetramethylbenzidinu peroxidem vodíku i po povaření. To ukazuje na to, že jde o nespecifický vliv železa v hemu, nikoli o enzymovou aktivitu. Pracovní postup: a.

Moč obsahující krev se rozdělte na 2 části.

b.

Jeden díl se zahřejte na vroucí vodní lázni k varu.

c.

Obě moče přefiltrujte.

d.

Na filtrační papír dejte několik kapek roztoku tetramethylbenzidinu a poté peroxid vodíku.

Vyhodnocení: Srovnejte výsledek obou zkoušek s pokusem 7.1. V čem spočívá rozdíl obou pokusů a co tento rozdíl ukazuje? 11

4.3 Důkaz katalasy Pracovní postup: a)

Reakční směs připravte podle tohoto schématu:

Ředěná krev 1 : 50

1

2

3

2 ml

2 ml

-

Povařená ředěná krev 1 : 50

2 ml

KCN 1 g/l (jed 1)

-

0,5 ml

-

H2O2

1 ml

1 ml

1 ml

Vyhodnocení: Porovnejte výsledek ve zkumavce č. 1 s výsledky ve zkumavkách č. 2 a 3, proveďte rozbor pokusu a vysvětlete.

Úloha 5: Stanovení katalytické aktivity laktátdehydrogenasy v séru Warburgovým optickým testem (výpočet). Princip: Laktátdehydrogenasu (EC 1.1.1.27) – ve zkratce LD je možno stanovovat kineticky, tj. kontinuálním sledováním změny absorbance NADH zapisujícím spektrofotometrem v UV oblasti při 340 nm. Reakce probíhá podle rovnice:

CH3-CHOH-COOH + NAD+ CH3-CO-COOH + NADH + H+ laktát

pyruvát

12

Aktivita enzymu se projeví v kyvetě zapisujícího spektrofotometru s UV-zdrojem, která obsahuje reakční směs s enzymem, substrátem a NADH, plynulým poklesem absorbance při 340 nm, který by se na registračním papíru zapisovače s časovým posunem zobrazil jako klesající přímka (kinetika nultého řádu). Při znalosti molárního absorpčního koeficientu NADH při této vlnové délce a přepočtu na ředění a časový interval jedné sekundy je možné vyjádřit aktivitu LD v séru v kat/l. Není-li k dispozici zapisovač s časovým posunem, je možné provádět měření v kyvetě s reakční směsí diskontinuálně, např. měřením poklesu absorbance při 340 nm v intervalech po 1 minutě (A340 nm), a přepočíst na interval 1 s. Reagencie: 1.

činidlo 1:

Tris pufr 127 mmol/l, pH 7,2, pyruvát 2,5 mmol/l

2.

činidlo 2:

Tris pufru 127 mmol/l, pH 7,2 NADH 1,25mmol/l

3.

sérum

4.

činidlo 3:

Tris pufr 127 mmol/l pH 7,2

Postup: a.

Do kyvety připravte slepý vzorek:

800 μl činidla 1 (Tris pufr a pyruvát) 200 μl činidla 3 (Tris pufr) 20 μl séra.

b.

Promíchejte.

c.

Podle pracovního návodu pro spektrofotometr Lightwave II+ nastavte oblast meření 260 – 450 nm ( Lightwave II+ - zjednodušený návod).

d.

Vynulujte fotometr na slepý vzorek.

e.

Do druhé kyvety napipetujte:

800 μl činidla 1 (Tris pufr a pyruvát) 200 μl činidlo 2 (NADH v Tris pufru) 20 μl séra.

f. g.

Dobře promíchejte a přesně za 2 minutu změřte A pro vlnovou délku 340 nm. Měření opakujte ještě 4x v přesně jednominutových intervalech.

13

Vyhodnocení: Z naměřených hodnot absorbance A vypočteme rozdíly absorbance za minutu ( A340) a z rozdílů absorbance vypočítáme průměrnou hodnotu. Získanou průměrnou hodnotu A340 použijeme pro výpočet katalytické aktivity LD vztažené na 1 l neředěného séra a interval 1 s při aplikaci molárního absorpčního koeficientu koenzymu NADH pro 340 nm. Vysvětlení výpočtu: Při výpočtu enzymové aktivity vycházíme z Lambert-Beerova zákona :

1

A   d  c

c

A  d

c 

A  d

 2

Předpokladem stanovení enzymové aktivity je zachování kinetiky nultého řádu, tj. průběh reakce je lineární (úbytek substrátu nebo přírůstek produktu za jednotku času je konstantní). Při kinetických stanoveních enzymové aktivity přepočítáme změnu koncentrace substrátu nebo NADH (mol . l-1) na časový interval 1 s a objem 1 l neředěného séra.

katalytická aktivita enzymu 1l séra



A 1 V    106   d 60 v

mol  l1  s1

3 

Pro změnu koncentrace použijeme výraz z rovnice 2, 1/60 je přepočet z minuty na sekundy a V/v vyjadřuje ředění séra. Jednotkou enzymové aktivity je kat = mol . s-1. V klinickobiochemických stanoveních se používají µkataly (1 kat = 106µkat). Při stanovení konkrétního enzymu, v našem případě laktátdehydrogenasy dosadíme do rovnice 3 resp. 4 konkrétní údaje.

14

katalytická aktivita LD 

 A340 1 V    10 6   d 60 v

4

mol  l1  s 1

 A340 1,02  103 106 katalytická aktivita LD  3,41103  60  0,02 10 3

5 

mol  l1  s 1

6

katalytická aktivita LD   A 340  249,3 kat  l1

symbol

jednotka

konkrétní údaje pro LD a použitou metodu

V

celkový objem vzorku v kyvetě

l

1,02 . 10-3

v

objem přidaného séra

l

0,02 . 10-3



molární

koeficient l . mol-1 . cm- 3,41 . 103

absorpční

1

(pro NADH při 340 nm) d

šířka vrstvy v kyvetě

106

převod z mol na μmol

106

60

převod z min na sec

60

cm

1

první tři údaje (vytištěné tučně)se mění se stanovovaným enzymem a použitou

pozn.

metodou, další tři - šířka vrstvy v kyvetě, převod z mol na μmol, převod z min na sec jsou zpravidla stejná pro všechna kinetická stanovení enzymových aktivit. Příklad: V tabulce jsou uvedeny výsledky měření Δ A340

minuta

A340

1.

0,882

2.

0,864

0,018

3.

0,847

0,017

4.

0,830

0,017

5.

0,812

0,018

Průměr:

0,0175

15

Výpočet: LD (kat/l) = 249,3 . 0,0175 = 4,36 kat/l Referenční hodnoty LD v séru (37 0C) : 2,9 – 8,6 kat/l

16