Základy biochemie KBC / BCH
ENZYMY – enzymová katalýza. Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
• Enzymy jsou katalyzátory biologických systémů umožňující chemické přeměny. Umožňují také transformaci jedno druhu energie na druhý. • Pro enzymy je charakteristická katalytická síla a specifita. • Katalytická síla enzymu je definována jako poměr rychlosti reakce katalyzované enzymem a rychlosti reakce nekatalyzované. • Katalýza se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném aktivní místo. • Látka jejíž přeměnu enzym katalyzuje se nazývá SUBSTRÁT. • Téměř všechny známé enzymy jsou proteiny (RNA jsou pravděpodobně nejranější katalyzátory - ribozymy).
UREASA z fazolu • Ureasa EC 3.5.1.5; systematický název: urea (močovina): amidohydrolasa; • Enzym obsahuje Ni2+; katalyzuje hydrolýzu močoviny na oxid uhličitý a amonné ionty. • Při teplotě 20oC je rychlostní konstanta ureasou katalyzované reakce 3 x 104.sec-1. • Nekatalyzovaná reakce má rychlostní konstantu 3 x 10-10. sec-1. • Poměr rychlostních konstant: 1014. • Katalytická síla ureasy je 1014.
• Enzymy urychlují ustanovení rovnováhy chemické reakce. Neovlivňují rovnovážnou konstantu. • Např. karbonátanhydratasa může katalyzovat hydrataci milionu molekul CO2 za sekundu. • Enzymy jsou specifické ve smyslu katalyzované reakce (specifita účinku) a ve smyslu výběru substrátu (substrátová specifita). • Enzymy snižují aktivační energii reakce. Tvoří komplex se substrátem.
• Součástí enzymů jsou malé molekuly – kofaktory. • Proteinová část enzymu – apoenzym. • Katalyticky aktivní enzym – holoenzym. • Apoenzym + kofaktor = holoenzym. • Kofaktory rozumíme neproteinové částice, obvykle nízké molekulové hmotnosti, které jsou nezbytné pro aktivitu enzymů. Kofaktory, jako např. kovové ionty různé ionty solí, které zvyšují aktivitu enzymů se nazývají aktivátory. Organické molekuly, které se dají od apoenzymu oddělit (např. hydrolýzou) se nazývají koenzymy. • Kofaktory kovalentně vázané na apoenzym se označují jako prosthetická skupina.
Enzymové kofaktory: •
Kofaktory
Enzymy
• • • • • • • • •
Koenzymy Thiaminpyrofosfát (TPP) Flavinadenindinukleotid (FAD) Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) Pyridoxalfosfát Koenzym A (CoA) Biotin 5'- Deoxyadenosylkobalamin Tetrahydrofolát
Pyruvátdehydrogenasa Monoaminoxidasa Laktátdehydrogenasa Glykogenfosforylasa Acetyl CoAkarboxylasa Paruvátkarboxylasa Methylmalonylmutasa Thymidylátsynthasa
• • • • • • • • •
Kovy Zn2+ Zn2+ Mg2+ Ni2+ Mo Se Mn2+ K+
Karbonátanhydrasa Karboxypeptidasa Hexokinasa Ureasa Nitrátreduktasa Glutathionperoxidasa Superoxiddismutasa Propionyl CoA karboxylasa
Proteolytické enzymy (proteasy, proteinasy):
• Enzymy druhově nespecifické – specifické na štěpenou vazbu. • Mnohé katalyzující také reakce štěpení esterů což se využívá ke sledování jejich aktivity. • Trypsin štěpí peptidovou vazbu v místě, kde je na straně karboxylu Lys nebo Arg nenásleduje-li Pro. • Thrombin, enzym podílející se na procesu srážení krve štěpí pouze vazbu Arg-Gly.
Vazebné místo peptidu štěpené trypsinem: Místo hydrolytického štěpení
Lysin nebo Arginin
R
N H
H C
C O
H N
O C H
C R2
Vazebné místo peptidu štěpené thrombinem: Místo hydrolytického štěpení Arginin
R
N H
H C
C O
H N
O C H
C H Glycin
Názvosloví enzymů • Triviální názvy – např. ureasa, trypsin, pepsin. • Systematické – popis chemické reakce, kterou enzym katalyzuje, koncovka –asa. • Např. alkoholdehydrogenasa katalyzuje reakci (oxidaci alkoholu na aldehyd): •
Ethanol + akceptor elektronů = acetaldehyd + redukovaný akceptor
•
V tomto případě je akceptorem NAD+, který se redukuje na NADH + H+ (proton se uvolňuje do prostředí).
•
NAD+ je nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma)
Systematická klasifikace enzymů dle enzymové komise (EC): • EC x. y. z. p. čtyřciferný kód • Příklad: Alkoholdehydrogenasa, EC 1.1.1.1 • Systematický název: Alkohol:NAD+ oxidoreduktasa • • • •
1. oxidoreduktasy (oxidačně-redukční reakce) 1. 1 Působí na CH-OH skupinu donoru 1. 1. 1 Akceptor NAD+ nebo NADP+ 1. 1. 1. 1(pořadí enzymu v podpodtřídě)
Enzymové třídy • •
Třídy enzymů Třída
• • • • • • •
1. Oxidoreduktasy 2. Transferasy 3. Hydrolasy 4. Lyasy
• • • • • • • •
Katalyzovaná reakce
5. Isomerasy Podřídy:
6. Ligasy
5. 1 5. 2 5. 3 5. 4 5. 5 5. 6
Příklad
Oxidačně-redukční Alkoholdehydrogenasa Přenos skupin Proteinkinasy Štěpení vazeb za účasti vody Trypsin Adice na dvojnou vazbu nebo odštěpení skupin za tvorby dvojné vazby Fumarasa Izomerace (geometrické a strukturní změny uvnitř molekuly) Glukosafosfátmutasa racemasy nebo epimerasy cis-trans-isomerasy intramolekulaární oxidoreduktasy intramolekulární transferasy (mutasy) intramolekulární lyasy ostatní isomerasy Spojení dvou substrátů Karbamoylfosfátza spotřeby ATP synthetasy
Energetika enzymových reakcí • Změna volné(Gibbsovy) energie je termodynamická funkce vedoucí k pochopení katalytického účinku enzymů. • 1. Reakce probíhá samovolně, když má ∆ G negativní znaménko. • 2. Systém je v rovnováze, když je ∆G = 0. • 3. Reakce neprobíhá samovolně, když je ∆G pozitivní. Musí být dodána volná energie. • Negativní ∆G neznamená, že reakce proběhne dostatečně rychle. Rychlost reakce závisí na volné aktivační energii ∆G*.
Standardní volná energie a její vztah k rovnovážné konstantě reakce. • A + B
C + D
∆G = ∆Go + RT ln [C] [D] / [A] [B] ∆Go = změna standardní volné energie • Standardní podmínky: všechny reaktanty jsou přítomny v koncentracích 1, 0 M. • V biochemii: standardní stav pH = 7. Aktivita H+ a vody je rovna 1. • Označení: ∆Go´.
Rovnovážná konstanta za standardních podmínek: • Keq´ = [C] [D] / [A] [B] o´
∆G
= - 2, 303 RT log10 Keq´ o´ / (2, 303 RT)
• Keq´ = 10- ∆G • Při 25oC
o´ / 1, 36
• Po zjednodušení: Keq´ = 10- ∆G
Enzymy snižují aktivační energii – volnou energii aktivace Přechodový stav, S
Volná energie
∆G (nekatalyzovaná)
∆G (katalyzovaná)
Substrát ∆G reakce
Produkt Směr reakce
Závislost reakční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu. Reakce dosahuje limitní rychlosti, dříve označované jako maximální (Vlim).
Reakční rychlost [vO]
Limitní rychlost (Vlim)
Koncentrace substrátu [S]
Model zámek a klíč (lock and key)
Substrát
+
a
Aktivní místo
a
b
Enzym
b
Komplex ES
c
c
Model indukovaného přizpůsobení (induced fit)
Substrát
+
a
Aktivní místo
Komplex ES
a b
Enzym
b
c
c
Rovnice Michaelise a Mentenové: • Kinetický popis aktivity enzymu. • Reakční rychlost vo se obvykle vyjadřuje jako počet molů produktu vytvořených za sekundu. • Podmínky pro odvození kinetické rovnice Michaelise a Mentenové: • Tvorba komplexu enzym-substrát [ES] • Měříme počáteční rychlost vo , kdy se nenahromadilo takové množství produktu, že by ovlivňovalo zpětnou reakci. • Ustálený stav – koncentrace [ES] se nemění i když koncentrace substrátu a produktu se mění. Rychlost tvorby [ES] je shodná s rychlostí rozpadu [ES].
E + S
k1 k2
ES
kcat
E + P
Ustálený stav Tvorba [ES] = Rozpad [ES]
[ET] = [E] + [ES]
k1 [E][S] = k2 [ES] + kcat [ES]
[E] = [ET] - [ES]
k1 ([ET] - [ES]) [E] = k2 [ES] + kcat [ES] k1 [ET] [S] - k1 [ES] [S] = k2 [ES] + kcat [ES] k1 [ET] [S] = k2 [ES] + kcat [ES] + k1 [ES] [S] k1 [ET] [S] = [ES] (k2 + kcat + k1 [S]) k1 [ET] [S] [ET] [S] [ET] [S] = [ES] = = (k2 + kcat + k1 [S]) (k2 + kcat + k1 [S]) (k2 + kcat) / k1 + [S] [ES] =
k1
[ET] [S]
k1 Km = (k2 + kcat) / k1
Km + [S]
dP/dt = vO = kcat [ES] dP/dt = vO =
vO =
Vlim [S] Km + [S]
kcat [ET] [S] Km + [S]
Vlim = kcat [ET]
Rovnice Michaelise a Mentenové
Vlim [S]
vO = 1
vO 1
vO 1
vO
Rovnice Michaelise a Mentenové
Km + [S] =
=
=
Km + [S] Vlim [S] Km Vlim [S] Km Vlim [S]
+
+
[S]
Vlim [S] 1
Sklon = Km /V lim
Vlim
Průsečík = 1/V lim
Dvojnásobně reciproká rovnice Lineweavera a Burka
Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu (hyperbola):
Vlim
Počáteční reakční rychlost [vO]
Vlim
Vlim / 2
Km Koncentrace substrátu [S]
Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / vo proti 1 / [S] dle Lineweavera a Burka 1 / vo = Km / Vlim . 1 / [S] + 1 / Vlim 1 / [vO] Sklon = Km / Vlim
α Průsečík = -1/Km Průsečík = -1/Vlim 0
1 / [S]
Obvyklá chyba studentů. • Uvažují, že rychlostní konstanta kcat nemůže být větší než k1 neboť by to znamenalo, že se komplex ES se rozpadá rychleji než se tvoří. • Pozor: konstanty mají různé jednotky a proto nemohou být srovnávány !! • Konstanta k1 má jednotky M-1 x s-1 nebo (min)-1, konstanta kcat má jednotky s-1 nebo min-1. • Nejsou to rychlosti, ale rychlostní konstanty prvního a druhého řádu !!! • Rychlost tvorby [ES] je k1 [E][S] a rychlost rozpadu [ES] na E + P kcat[ES]. • Může nastat stav, kdy kcat >>k2 !! V tom případě se Km redukuje na kcat / k1 !
Význam hodnot Km a Vlim (max) • Michaelisova konstanta: • Závisí na typu substrátu a podmínkách, jako jsou pH, teplota (doporučuje se 30oC) a iontová síla roztoku. • Dva základní významy Km : • a) Koncentrace substrátu při které je substrátem obsazena polovina aktivních míst enzymu. Odpovídá koncentraci substrátu in vivo. • b) Km = (k2 + kcat ) / k1 je vztah mezi Km a rychlostními konstantami enzymové reakce ve smyslu rovnice Michaelise a Mentenové.
• V případě, že k2 je mnohem větší než kcat to znamená, že ES komplex disociuje na E a S mnohem rychleji, než se tvoří produkt. • Vztah se zjednoduší na Km = k2 / k1. Disociační konstanta komplexu ES je: KES = [E] [S] / [ES] = k2 / k1 • Jinými slovy: Km je v tomto případě rovno disociační konstantě komplexu ES. • Vysoké hodnoty Km ukazují na slabou afinitu substrátu k enzymu, a naopak nízké hodnoty na vysokou afinitu.
Hodnoty Km některých vybraných enzymů a substrátů: • • • • • • • • • • • •
Enzym Trypsin Pyruvátkarboxylasa
Substrát
N-Benzoyl-Arg ethyester
Km ( µM.L-1)
Pyruvát HCO3ATP
3 000 400 1 000 60
Penicillinasa Karbonátanhydratasa β-Galaktosidasa Hexokinasa
Benzylpenicilin CO2 Laktosa D-Glukosa ATP
50 8 000 4 000 32 1 200
Glukokinasa
D-glukosa ATP
340 250
Číslo přeměny enzymu
• Maximální nebo nověji nazvaná limitní rychlost enzymové reakce je číslo přeměny enzymu. • Definujeme jako počet molekul substrátu převedených na produkt enzymovou molekulou za časovou jednotku při plné saturaci enzymu substrátem. Nazývá se také katalytická konstanta kcat.
Čísla přeměny (turnover numbers) některých enzymů:
• Enzym • • • • • •
Karbonátanhydrasa Acetylcholinesterasa Penicilinasa Laktátdehydrogenasa Chymotrypsin Tryptofansynthetasa
Číslo přeměny (sec) 600 000 25 000 2 000 1 000 100 2
Kinetická dokonalost enzymové katalýzy. Kriterium kcat / Km. • V případě, že koncentrace substrátu je mnohem vyšší než Km je rychlost enzymové reakce rovna kcat což je číslo přeměny. • Za fyziologických podmínek enzym nebývá substrátem nasycen. Poměr [S] / Km je mezi 0, 01 až 1, 0. • Za situace, kdy je [S] < < Km je rychlost enzymové reakce mnohem menší než kcat, protože je mnoho aktivních míst neobsazeno.
• Existuje nějaké číselné měřítko, které by charakterizovalo enzym za podmínek v buňce ? • • Za podmínek, kdy je [S] < < Km závisí rychlost enzymové reakce na kcat /Km a na celkovém množství enzymu [ E ]T. • • Pomocí tohoto kriteria můžeme porovnávat preferenci enzymu pro různé substráty. • Horním limitem je rychlost difůze substrátu do aktivního místa enzymu.
Estery aminokyselin jako substráty chymotrypsinu dle rostoucí hodnoty kcat / Km : Ester aminokyseliny Glycin Valin Norvalin Norleucin Fenylalanin
Vedlejší řetězec kcat /Km (s-1M-1) -H isopropyl n-propyl n-butyl benzyl
Nejdokonalejším substrátem je fenylalanin.
1, 3 x 10-1 2, 0 3, 6 x 102 3, 0 x 103 1, 0 x 105
L-norleucin a L-norvalin. Neproteinogenní α-aminokyseliny.
COO
C H2
H +
H2 C
CH3 C H2
COO
NH3
H
C H2
+ NH3
H2 C CH3
Enzymy pro které je hodnota kcat / Km blízko difůzí kontrolované rychlosti vstupu substrátu do aktivního místa. Enzym Acetylcholinesterasa Karbonátanhydratasa Katalasa Fumarasa Triosafosfátisomerasa β-Laktamasa Superoxiddismutasa
kcat / Km (s-1M-1) 1,6 x 108 8,3 x 107 4,0 x 107 1, 6 x 108 2,4 x 108 1,0 x 108 7,0 x 109
Jednotky enzymové aktivity
• 1 katal (1 kat) je aktivita enzymu, který katalyzuje přeměnu jednoho molu substrátu za jednu sekundu. • Používají se µkat (10-6 kat) a nkat (10-9 kat). • Aktivita se měří za optimálních podmínek – teplota, pH a iontová síla roztoku. • Specifická aktivita: Aktivita enzymu vztažená na množství proteinu v jednotce objemu (např. nkat/mg – vše v jednom mL).
Dvousubstrátové reakce • Sekvenční: • A) Náhodný mechanismus (bi – bi) • B) Uspořádaný mechanismus (bi – bi) • Pingpongový mechanismus
Náhodný mechanismus
• Je takový mechanismus enzymové reakce, kdy nezáleží na tom, který z obou substrátů se váže jako první na enzym. Příklad: kreatinkinasa
Náhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa):
O
-
C O
H2 C
+
NH2 N
C
CH3
Kreatin
+ NH2
+ ATP
O
-
C O
H2 C
N CH3
NH2
O
C
P
N H
Fosfokreatin
-
O
O
-
+ ADP
Clelandovo schéma - náhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa):
ATP Kreatin
Fosfokreatin ADP
Enzyme
Enzyme E (kreatin) (ATP) Kreatin ATP
E (fosfokreatin) (ADP) ADP Fosfokreatin
Uspořádaný mechanismus
• Vyznačuje se tím, že substráty se váží do aktivního místa v určitém pořadí. • Příklad: alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa (nejdříve se váže koenzym NAD+ a poté druhý substrát)
Uspořádaný sekvenční mechanismus (laktátdehydrogenasa):
O
O
C C
O
O + CH3
Pyruvát
NADH
+
H+
HO
C
O
C CH3 Laktát
H
+
NAD+
Clelandovo schéma uspořádaného sekvenčního mechanismu (laktátdehydrogenasa):
NADH Pyruvát Enzyme E (NADH) (pyruvát)
Laktát NAD+
E (laktát) (NAD+)
Enzyme
Pingpongový mechanismus • Vyznačuje se tím, že enzym přechází mezi dvěma stálými formami. • Po vazbě prvního substrátu se tvoří substituovaný enzymový meziprodukt, modifikovaný enzym. • První produkt se uvolní a poté se váže na modifikovaný enzym druhý substrát a odštěpí se druhý produkt. • Příklad: aspartátaminotransferasa.
Pingpongový mechanismus (aspartátaminotransferasa):
-
OOC
COO
+
OOC COO
-
H H3N
-
COO
Aspartát
+ -
COO
H
-
O
α-Oxoglutarát
+
H3N
COO
Glutamát
+ -
-
COO
-
O
Oxaloacetát
Clelandovo schéma pingpongového mechanismu (aspartátaminotransferasa):
Aspartát Enzyme E (aspartát)
Oxaloacetát
(E-NH3+ ) (oxaloacetát)
α-Oxoglutarát
(E-NH3+ ) (oxaloacetát)
(E-NH3+ ) (α-oxoglutarát)
Glutamát Enzyme E (glutamát)
Allosterické enzymy • Allosterické enzymy se neřídí kinetikou Michaelise a Mentenové. • Skládají se z podjednotek (kvarterní struktury). Mají více aktivních míst a míst do kterých se váže inhibitor nebo aktivátor. • Závislost rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu má sigmoidní charakter.
Reakční rychlost [vO]
Koncentrace substrátu [S]
Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa). • ATCasa katalyzuje první krok biosyntézy pyrimidinových nukleotidů. • ATCasa je inhibována produktem – cytidintrifosfátem (CTP). • Tento typ inhibice se nazývá – zpětnovazebná inhibice nebo inhibice konečným produktem. Vždy je inhibován první reakční krok. • CTP je strukturně odlišný od substrátu a váže se proto na jiné místo enzymu než substrát. Taková místa se nazývají allosterická (z řečtiny allos jiná a steros struktura, místo). • ATCasa je složena ze dvou katalytických podjednotek (každá obsahuje tři řetězce) a tří regulačních podjednotek (každá obsahuje dva řetězce). • ATP je allosterický aktivátor, CTP je allosterický inhibitor.
Aspartáttranskarbamoylasa
Rychlost tvorby N-karbamoylaspartátu
Aspartáttranskarbamoylasa jako příklad allosterického enzymu. Přidavek allosterického inhibitoru – CTP.
+ 0.4 mM CTP
10
20
[Aspartát], mM
Rychlost tvorby N-karbamoylaspartátu
Aspartáttranskarbamoylasa. Přídavek allosterického aktivátoru ATP.
+ 2 mM ATP
10
20
[Aspartát], mM
Rychlost enzymové reakce závisí na pH, teplotě a iontové síle prostředí. • Většina enzymů je aktivní pouze v úzkém rozmezí pH. Spočívá to ve vlivu pH na kombinaci faktorů: • A) Vazba substrátu na enzym • B) Stav ionizace substrátu • C) Ionizační stavy vedlejších řetězců aminokyselin v aktivním místě • Většina enzymových reakcí vytváří zvonovou křivku závislosti reakční rychlosti na pH. Např. fumarasa. • Hodnotu pH, při které dochází k nejvyšší rychlosti enzymové reakce nazýváme pH optimum.
Rychlost
Fumarasa (enzym cyklu trikarboxylových kyselin).
0
5
6
7
8
pH
9
Vliv teploty na stabilitu a aktivitu enzymů. •
•
• • •
Teplotní stabilita enzymů závisí na řadě faktorů jako je pH, iontová síla prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost ligandů. Substráty obecně chrání enzymy před tepelnou denaturací. Nízkomolekulární enzymy s jednoduchým polypeptidovým řetězcem obsahující disulfidové vazby, jsou obvykle teplotně stabilnější než vysokomolekulární oligomerní enzymy. Obecně, se zvyšující se teplotou roste aktivita enzymů. Enzymy jsou proteiny u kterých se terciární a kvarterní struktura udržuje slabými interakcemi jako jsou vodíkové vazby, iontové interakce atd. Závislost rychlosti na teplotě obvykle vykazuje vrchol, který označujeme jak teplotní optimum. Při dalším zvyšování teploty obvykle dochází k denaturaci proteinu. Závislost mezi rychlostní konstantou reakce a aktivační energií se vyjadřuje exponenciální Arrheniovou rovnicí. Vliv teploty na rychlost reakce se také vyjadřuje termínem teplotní koeficient Q10. Q10 je faktor kterým vzroste rychlost enzymové reakce při růstu teploty o 10 oC. Pro teplotní oblast mezi 25 až 35 oC je tímto faktorem číslo 2. Pro práci s enzymy je doporučována IUB teplota 30 oC.
Inhibice enzymové aktivity Ireversibilní
Reversibilní a. Kompetitivní b. Nekompetitivní c. Akompetitivní
Ireversibilní inhibice
• Ireversibilní inhibitory blokují nevratně enzymovou aktivitu tím, že vytváří s enzymem velmi pevný kovalentní komplex enzym – inhibitor. • Příklad: Inhibice cholinestearasy a proteinas diisopropylfluorfosfátem, který se kovalentně váže na Ser v aktivním místě nebo reakce enzymů s ionty těžkých kovů.
Ireversibilní inhibice acetylcholinesterasy (enzym přenosu nervového vzruchu) diisopropylfosfofluoridem (DIPF):
CH3 H CH3 OH
Ser
+
F O H
CH3 H CH3
O O
P
O
O CH3
CH3
DIPF
Acetylcholinesterasa
H
O
+
P
F
-
+
+
H
O CH3
CH3
Inaktivovaný enzym
Inaktivace cysteinového řetězce enzymu jodacetamidem:
O
O SH
Cys
+
I
C H2
C
NH2
S
C H2
C
Jodacetamid
Enzym
Inaktivovaný enzym
NH2
+
I
-
+
+
H
Reversibilní inhibice • Vytváří se reversibilní komplex mezi inhibitorem a enzymem nebo mezi inhibitorem, enzymem a substrátem. • Rozeznáváme tři typy reversibilních inhibicí: • A) Kompetitivní – soutěží substrát a inhibitor o aktivní místo. • B) Nekompetitivní – inhibitor se váže na molekulu enzymu do jiného místa než substrát, ale brání tvorbě produktu. • C) Akompetitivní – vazba substrátu na enzym předchází vazbě enzymu. Teprve vazbou substrátu na na enzym se vytvoří vazebné místo pro inhibitor a vzniklý ternární komplex je inaktivní.
Kompetitivní inhibice Klasická kompetitivní inhibice S
I Enzym
S Enzym
I
Enzym
Neklasická kompetitivní inhibice S
S Enzym
I Enzym
I
Enzym
Buďto vstoupí substrát do aktivního místa enzymu a zamezí vstupu inhibitoru nebo naopak.
Příklad klasické kompetitivní inhibice sukcinátdehydrogenasy (enzym citrátového cyklu) malonátem: -
COO
HC
CH2 -
Sukcinátdehydrogenasa OOC
CH2
-
COO
CH
+
2 H
-
COO
Sukcinát
Fumarát
-
COO CH2
-
COO
Malonát
Kompetitivní inhibitor
E + I
EI
Ki = [E] [I] / [EI]
Kompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka: 30
Stejné množství substrátu a inhibitoru: E + S + I
ES
Kompetitivní inhibice
E + P
1 /vi =
EI Nadbytek substrátu: S S S E + S ES S + S I S
Vlim [S]
1+
[I]
Ki
)
E + P
Mění se sklon
Bez inhibice 1 /vO =
Vlim se nemění
EI
Ki = [E] [I] / [EI]
Vlim
10
Km se mění
E + I
+
1
1 / [vO]
20
(
Km
0
100
200
300
1 / [S], M-1
Km Vlim [S]
+
400
1
Vlim
500
Potlačení intoxikace ethylenglykolem – ethanolem:
Tvorba oxalové kyseliny z ethylenglykolu je inhibována ethanolem: H2C
OH
Alkoholdehydrogenasa
H2C
OH
Inhibováno ethanolem
Ethylenglykol HO
+
CH2 CH3
Ethanol
O
H C H2C
COOH OH
Aldehyd
COOH
Ethandiová kyselina, oxaláty
Schéma nekompetitivní inhibice: Nekompetitivní inhibice S
S Enzym
I Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Schéma a grafické vynesení nekompetitivní inhibice dle rovnice Michaelise a Mentenové: 100
S E + I
K
ES S
i
EI
EIS
E + P
Relativní rychlost
Bez inhibitoru 80
60
[I] = K
i
40
20
[I] = 5 K
i
[I] = 10 K
i
Koncentrace substrátu [S]
Nekompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka: 30
Stejné množství substrátu a inhibitoru: E + S + I
ES + I
Nekompetitivní inhibice
E + P
1 /vi = 20
EIS Nadbytek substrátu:
S S S E + S S + S I S
ES
Vlim [S]
ESI
ES + I
Ki = [ES] [I] / [ESI]
+
Vlim
1+
[I]
Ki
)
Bez inhibice Km se nemění Vlim se mění 0
ESI
)(
10
EI
Ki = [E] [I] / [EI]
Ki
1
Mění se sklon
Nadbytek substrátu neovlivní reakci.
E + I
1+
[I]
1 / [vO]
EI + S
(
Km
100
200
1 /vO =
300
1 / [S], M-1
Km Vlim [S]
+
400
1
Vlim
500
Akompetitivní inhibice. Podmínkou vazby inhibitoru je vazba substrátu. Ternární komplex.
Akompetitivní inhibice S
S Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Akompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka: 30
Stejné množství substrátu a inhibitoru: E + S
ES + I
Akompetitivní inhibice
E + P
1 /vi =
Km Vlim [S]
EIS Nadbytek substrátu: S S S E + S S + S I S
ES
ESI
Ki
)
Nemění se sklon
1 /vO =
10
Km Vlim [S]
+
1
Vlim
Km se mění Vlim se mění
ESI
Ki = [ES] [I] / [ESI]
1+
[I]
Bez inhibice
Nadbytek substrátu neovlivní reakci.
ES + I
(
Vlim
1 / [vO]
20
+
1
0
100
200
300
1 / [S], M-1
400
500
Tabulka typů inhibice a příslušných konstant: Inhibice
Konstanty
Kompetitivní I se váže jen na E
Roste Km, Vlim se nemění.
Nekompetitivní I se váže jak na E tak na ES
Klesá Vlim, Km se nemění
Akompetitivní I se váže jen na ES
Klesá Vlim a Km Poměr Vlim / Km se nemění
PENICILIN jako INHIBITOR vzniklý enzymovou reakcí – sebevražedný substrát. • Penicilin ireversibilně inhibuje růst bakterií – narušuje syntézu bakteriální stěny. • Penicilin inhibuje enzym glykopeptidtranspeptidasu tím, že napodobuje přirozený substrát enzymu a tím je D-Ala-DAla (dipeptid). Penicilin se kovalentně naváže na Ser aktivního místa glykopeptidtranspeptidasy. • Inhibice penicilinem zasahuje do stavby buněčné stěny. Penicilin zabraňuje zesíťování peptidoglykanových vláken buněčné stěny.
Struktura penicilinu. Dipeptid (Val a Cys).
Thiazolidinový kruh, reaktivní peptidová vazba β-laktamového kruhu a R je zaměnitelná skupina. Variabilní skupina
O
R
HN
Thialozidinový kruh
H S
CH3 -
N O
CH3 -
COO
Reaktivní peptidová vazba v β-laktamovém kruhu
Model benzylpenicilinu – penicilin G. Na místě skupiny R je benzyl. Benzylová skupina
Thialozidinový kruh
Velmi reaktivní peptidová vazba
Porovnání konformací penicilinu a dipeptidu D-Ala-D-Ala, který penicilin napodobuje:
Penicilin
R-D-Ala-D-Ala peptid
Schématické znázornění peptidoglykanu bakterie
Streptococus aureus.
Žlutý je sacharid, červený tetrapeptid a pentaglycinový můstek je modrý.
Tvorba sítě peptidoglykanu (S. aureus).
Koncová aminoskupina pentaglycinového můstku v buněčné stěně napadá peptidovou vazbu mezi dvěma D-alaniny a tím dochází k zesíťování. O
O R1
C
+
C H2
NH3
+
Koncový glycin pentaglycinového můstku
O
C
H N
C H
H
CH3
C
N H
CH3 O
R2
Koncová D-Ala-D-Ala skupina O R1
C
C H2
H N
H C O
O
CH3 N H
R2
Gly-D-Ala křížová vazba
+
O
C
NH2
C H
CH3
D-Ala
Interakce penicilinu s transpeptidasou vedoucí k velmi stabilnímu inaktivnímu komplexu. R
R
NH
O
H
S
H
+ OH
Ser
Penicilin CH3
N O
O
CH3 COO
-
Glykopeptidtranspeptidasa
NH H
H
O O
S
CH3
HN
CH3 COO
-
Komplex peniciloyl-enzym
Struktura transpeptidasy s vázaným penicilinem.
Suicide substrates, mechanism based inhibitors – sebevražedný substrát. Příklad: ornithindekarboxylasa a difluormethylornithin (DFMO).
KOENZYMY
• A) Oxidoreduktas • B) Transferas • C) Isomeras, ligas, lyas
Přehledná tabulka běžných koenzymů: Koenzym
Enzymová reakce Vitaminový zdroj Onemocnění z nedostatku
Biocytin
Karboxylace
Biotin
Není známo
Koenzym A
Přenos acylů
Pantothenát (B5)
Není známo
Kobalaminové koenzymy
Alkylace
Kobalamin (B12)
Perniciosní anemie
Flavinové koenzymy
Oxidace-redukce
Riboflavin (B2)
Není známo
Lipoová kyselina
Přenos acylů
Nikotinamidové koenzymy
Oxidace-redukce
-
Není známo
Pyridoxalfosfát
Nikotinová Pelagra kyselina (niacin,B3) Přenos aminoskupin Pyridoxin (B6) Není známo
Tetrahydrofolát
Přenos C1 skupin
Listová kyselina
Megaloblastická anemie
Thiaminpyrofosfát
Přenos aldehydů
Thiamin (B1)
Beriberi
Koenzymy oxidoreduktas:
• A) Nikotinamidové • B) Flavinové
O
O NH2
N
Nikotinamid (niacinamid)
OH N
Nikotinová kyselina (niacin)
Oxidovaná forma O
Redukovaná forma H
H
+ NH2 + H
NH2 + 2 [H ]
Nikotinamid + N
O
CH2 H
D-Ribosa
N
O
R
H
H
OH OH
OH
NH2 O
P
OH
O
P O
N
N
O OH
N
N CH2
Adenosin
O H
H OH
H OH
OX
X = H
Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+)
X = PO32-
Nikotinamidadenindinukleotidfofát (NADP+)
O
Dvouelektronový přenos (hydridový aniont) při oxidačně-redukční reakci NAD+ na NADH.
H
O
H NH2
+
H
-
H:
NH2
+ N
N
R
R
NAD+
O
NADH
Alkoholdehydrogenasová reakce za účasti nikotinamidového koenzymu:
OH H3C
+
C H
H
Ethanol
+
NAD
O
ADH H3C
C
H
+
Acetaldehyd
NADH
+
H+
Struktura flavinadenindinukleotidu (FAD) s vyznačením reaktivních míst. H
O
H3C
N
H3C
N H
O
N
H
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H2C
Reaktivní místa
NH
NH2 N O
O
P O
-
O
O
P O
N
H
-
O
N CH2
O H
H
H
H OH
OH
N
H
H H3C
8a
8 7a 7
H3C
9 6
R N
N
9a 5a
10
5
10a
1
4a 4
N
H
O 2 3
N
H
O
Flavinadenindinukleotid (FAD) (oxidovaná nebo chinonová forma) H H
R
H3C
N
H3C
N H
N
O N
H
H
O
FADH (radikálová nebo semichinonová forma) H H
R
H
H3C
N
N
H3C
N H
H
O N
H
O
FADH2 (redukovaná nebo hydrochinonová forma)
Oxidovaná a plně redukovaná forma flavinového koenzymu (FAD). Mechanismus shodný s flavinmononukleotidem (FMN).
H
O N
H3C
H3C
N H
H N
N
R
Oxidovaná forma (FAD)
H
+ O
+ 2 H
+
H
O
H3C
N
H3C
N
N
R
H
N
2 e-
H
Redukovaná forma (FADH2)
H
O
Oxidace (dehydrogenace) vazby mezi dvěma uhlíky za účasti FAD:
H R1
H C
R2
C H
H
+
R2
R1 FAD
C H
+
C H
FADH2
Koenzymy transferas: • A) Koenzym A • B) Lipoová kyselina • C) Thiaminpyrofosfát (TPP)
Koenzym A, CoA, CoASH.
Vyznačena struktura složeného nukleotidu s reaktivní SH skupinou na konci. Pantothenát – vitamin B5.
NH2
Reaktivní skupina
N H
HS
NH
O
OH
NH O
O O
H3C
CH3
P O
-
O O
P O
N O
O H
Pantothenát
H
H
H OH
β-Merkaptoethylamin
N
H
-
OH
N
H
Thioesterová vazba s vysokým obsahem energie. Acetyl CoA + H2O = acetát + CoA + H+ ∆ Go´ = - 31, 4 kJ/mol
O
O R
C
S
Acyl CoA
CoA
H3C
C
S
Acetyl CoA
CoA
Lipoová kyselina
S S
OH H
O
Lipoová kyselina
Lipoamid – isopeptidová vazba lipoové kyseliny na vedlejší řetězec apoenzymu (Lys) s vyznačením reaktivní disulfidové vazby: O
H N
H Postranní řetězec lysinu
HN O
H S
S
Reaktivní disulfidová vazba
Lipoamid
Přenos acetylu z acetyldihydrolipoamidu na CoA:
O
HS CoA
SH
Koenzym A
+
H3C
S
H O Acetyllipoamid
CoA
S
R
HS CH3
+
HS H
Acetyl CoA
R
Dihydrolipoamid
Struktura thiaminpyrofosfátu:
H
NH2 +
N
N H2N
N
H3C
S
CH2
CH2
O
O P O
Thiaminpyrofosfát (TPP)
-
O
O P O
-
O
-
Uhlíkový atom mezi atomy dusíku a síry thiazolového kruhu je silně kyselý (pKa = 10). Dochází k ionizaci za tvorba karbaniontu, který se váže na oxoskupiny (např. pyruvátu v pyruvátdehydrogenase).
H3C
R2
H3C
+
N
R2 +
N
H R1
S
TPP
R1
-
S
Karbaniont TPP
+
+
H
Interakce karbaniontu TPP s pyruvátem (součást pyruvátdehydrogenasy). Hydroxyethyl-TPP se také označuje jako „aktivní acetaldehyd“.
H3C
R2
O
-
+
O
N
H
C
-
R1
C
S
+
O
+
C
N
S
R1
Adiční sloučenina
R2 OH
N
S
CO 2
-
CH3
H3C
R2 +
OH
N
C R1
O OH
C
Pyruvát
CO 2 H3C
H3C
O
H3C
Karbaniont TPP
R2
C CH3
R1
S
Rezonanční formy hydroxyethyl-TPP
+
H
H3C
R2 +
N
-
CH3
H
OH C
R1
S
CH3
Hydroxyethyl-TPP
Adenosintrifosfát – ATP, univerzálně významný koenzym a enzymový regulátor. • ATP urychluje řadu metabolických reakcí při kterých dochází k jeho hydrolýze. • Chemická energie ATP se uplatňuje při aktivním transportu, může se převést na mechanickou práci (svaly), na světlo (bioluminiscence), elektrickou energii a teplo. • ATP se účastní řady biosyntetických reakcí přenosem fosfátu, difosfátu, adenosylu a adenylu na druhé metabolity.
Fosfoesterová NH2 vazba Fosfoanhydridové vazby
O O
-
P O
-
γ
O O
P
-
β
O
N
N
O O
P
-
N
N O
α
CH2
O H
O
H
H
OH OH
OH
Adenosin AMP ADP ATP
Proč je ATP tak energeticky bohatá molekula? • Aktivní forma ATP je obvykle komplex ATP s Mg2+ nebo Mn2+. • ATP je energeticky bohatá molekula, protože její trifosfátová část obsahuje dvě fosfoanhydridové vazby. Důvodem je resonanční stabilizace, elektrostatické odpuzování a stabilita produktů. • Produkty hydrolýzy, jako je fosfát: AMP (adenosinmonofosfát) nebo ADP (adenosindifosfát), vykazují větší stabilitu a menší elektrostatickou repulzi než ATP.
Tabulka změny standardní Gibbsovy energie hydrolýzy fosfátů některých biologicky významných sloučenin: • Sloučenina • • • • • • • • • • •
Fosfoenolpyruvát 1,3-bisfosfoglycerát ATP (→ AMP + PPi→ 2Pi) Acetylfosfát Fosfokreatin ATP (→ ADP + Pi) Glukosa-1-fosfát PPi Fruktosa-6-fosfát Glukosa-6-fosfát Glycerol-3-fosfát
∆ Go' (kJ.mol-1) - 61, 9 - 49, 4 - 45,6 - 43, 1 - 43, 1 - 30,5 - 20, 9 - 19, 2 - 13, 8 - 13, 8 - 9, 2
Výpočet změny volné energie hydrolýzy ATP na ADP a Pi v buňce. • Vnitrobuněčná koncentrace ATP se udržuje v rozmezí: 2 – 10 mM. Koncentrace ADP a Pi jsou variabilní. • Při typické buněčné koncentraci [ATP] = 3, 0 mM, konc. [ADP] = 0, 8 mM konc.[ Pi] = 4, 0 mM je volná energie hydrolýzy ATP na ADP a Pi při 37oC: - 48, 1 kJ.mol-1 Podle vzorce: ∆G = ∆ G o´ + RT. ln [ADP].[ Pi ]/ [ATP]. ∆ G o´ = - 35, 6 kJ.mol-1
Hydrolýza fosfoanhydridové vazby:
O O
nebo
P O
O -
nebo
O P O
O -
H2O
O O
O
P O
O -
H
+
H
O
P O
O -
Spojení endergonní reakce s exergonní (hydrolýza ATP):
G´ (kJ.mol-1) Endergonní poloreakce 1
Pi + glukosa
glukosa-6-P
+ 13.8
Exergonní poloreakce 2
ATP + H2O
ADP + Pi
- 30.5
Celková spojená reakce
ATP + glukosa
ADP + glukosa-6-P
- 16.7
Fosfoenolpyruvát
-60
O -1 ∆G ´ hydrolýzy (kJ.mol )
-50
1,3-Bisfosfoglycerát
~P ~P
Fosfokreatin
~P -40
-30
Vysokoenergetické sloučeniny ATP
-20
P P
-10
Nízkoenergetické sloučeniny
Glukosa-6-fosfát Glycerol-3-fosfát
0
Fosfoanhydridová vazba bývá často značena ~ a používán název „makroergická vazba“.
O H3C
C
OH O
~
OPO32-
Acetylfosfát
2-
O3POCH2
C
C
~
OPO32-
1,3-Bisfosfoglycerát
Fosfoenolpyruvát ∆ Go' (kJ.mol-1) = 61, 9 P v kroužku značí fosfát, zde esterově vázaný.
COO
COO O
C-O- P CH2
CH3 Pyruvát
O -
O P O O
=
P
CH2O PO32H C OH HO C H
C H
O H H
C
C
OH
OH
α-D-Glukosa-6-fosfát
CH2OH HO
C
H
CH2OPO32-
L-Glycerol-3-fosfát
Zásobní fosfageny (guanidinové fosfáty) obratlovců: +
H2N
nebo nebo
N H X
C N
O P O
O
-
-
R R = CH2
CO 2
X = CH3
Fosfokreatin
X = H
Fosfoarginin
+
NH3 R = CH2
CH2
CH2
CH
CO 2
Doplněk:
Strukturní vzorce vitaminů rozpustných ve vodě a uplatňujících se jako prekurzory koenzymů a vitaminu C (L-askorbová kyselina): O H
O
H3C
N
H3C
+
NH N
N H
O
H
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2OH
Vitamin B2 (Riboflavin)
-
N H
O
H2 C
-
O
Vitamin B3 (Niacin)
O
OH
+
N H
Vitamin B6 (Pyridoxin)
OH
H3C
O
H2 C CH3
Vitamin B5 (Pantothenát)
CH2OH HOH2C
C H2
H
H N
CH3
H
HO O
C
C
HO
H
CH2OH
OH
Vitamin C (Askorbová kyselina)
OH
H
O
H3C
N
H3C
N H
NH N
H
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2OH
Vitamin B2 (Riboflavin)
O
O O +
N H
Vitamin B3 (Niacin)
-
O
H2 C
-
O
C H2
H
H N O
OH
H3C
Vitamin B5 (Pantothenát)
H2 C CH3
OH
CH2OH HOH2C
OH
+
N H
Vitamin B6 (Pyridoxin)
CH3
H
HO O
C
C
HO
H
CH2OH
OH
Vitamin C (Askorbová kyselina)
Askorbová kyselina, askorbát (aniont) a oxidovaná forma dehydroaskorbová kyselina. H
HO O
C
C
HO
O
CH2OH
H
H
HO C
HO
OH
C H O
Askorbát
Askorbová kyselina
H
HO O
C
C
O
H
CH2OH
O
Dehydroaskorbová kyselina
-
CH2OH
Účast askorbátu (vitaminu C) na hydroxylaci prolinu na trans -4-hydroxyL-prolin v peptidovém řetězci - klíčová role při syntéze kolagenu. Dalším kofaktorem je Fe3+. Nedostatek vit. C - skorbut.
-
O N
+
O2
+
N
O
-
Prolin-součást peptidového řetězce
+
O O
H
α-Oxoglutarát
O
O
Prolylhydrolasa + ascorbát
C H
O
C H
CO 2
-
+ O
OH
Hydroxylovaný prolin v řetězci
-
O
O
Sukcinát
O
Strukturní vzorce vitaminů rozpustných v tucích: CH3 H3C
CH3
CH3 H3C
CH3
CH3
CH3
CH3 CH2OH
CH3
CH2
H3C
Vitamin A
Vitamin D2 (Kalciferol)
(Retinol) O
CH3 HO
CH3
CH3
H3C
O CH3
(
CH3
Vitamin E (α-Tokoferol)
) CH3
3
(
H
O
CH3
Vitamin K1
) CH3
3
H
H3C
CH3
CH3
CH3 CH2OH
CH3
Vitamin A (Retinol)
CH3 H3C
CH3
CH3 CH3 CH2
H3C
Vitamin D2
(Kalciferol)
CH3 CH3
HO
H3C
O CH3
(
CH3
Vitamin E (α-Tokoferol)
) CH3
3
H
O CH3
( O
CH3
Vitamin K1
) CH3
3
H
