Základy biochemie KBC / BCH
ENZYMY – enzymová katalýza Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Charakterizace enzymů a enzymové katalýzy • Enzymy jsou katalyzátory biologických systémů umožňující chemické přeměny. Umožňují také transformaci jednoho druhu energie na druhý. • Pro enzymy je charakteristická katalytická síla a specificita. • Katalytická síla enzymu je definována jako poměr rychlosti reakce katalyzované enzymem a rychlosti reakce nekatalyzované. • Katalýza se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném AKTIVNÍ MÍSTO. • Látka jejíž přeměnu enzym katalyzuje se nazývá SUBSTRÁT. • Téměř všechny známé enzymy jsou proteiny pravděpodobně nejranější katalyzátory - ribozymy).
(RNA
jsou
UREASA z fazolu • Ureasa EC 3.5.1.5; systematický (močovina): amidohydrolasa;
název:
urea
• Enzym obsahuje Ni2+; katalyzuje hydrolýzu močoviny na oxid uhličitý a amonné ionty. • Při teplotě 20oC je rychlostní konstanta ureasou katalyzované reakce 3 x 104.sec-1. • Nekatalyzovaná reakce má rychlostní konstantu 3 x 10-10. sec-1. • Poměr rychlostních konstant: 1014. • Katalytická síla ureasy je 1014.
Působení enzymů • Enzymy urychlují ustanovení rovnováhy chemické reakce. Neovlivňují rovnovážnou konstantu. • Např. karbonátanhydrasa může katalyzovat hydrataci milionu molekul CO2 za sekundu. • Enzymy jsou specifické ve smyslu katalyzované reakce (specifita účinku) a ve smyslu výběru substrátu (substrátová specifita). • Enzymy snižují aktivační energii reakce. Tvoří komplex se substrátem.
Apoenzym, holoenzym, kofaktor, koenzym a prosthetická skupina • Součástí enzymů jsou malé molekuly – kofaktory. • Proteinová část enzymu – apoenzym. • Katalyticky aktivní enzym – holoenzym. • Apoenzym + kofaktor = holoenzym. • Kofaktory rozumíme neproteinové částice, obvykle nízké molekulové hmotnosti, které jsou nezbytné pro aktivitu enzymů. Kofaktory kovové ionty se nazývají aktivátory. Organické molekuly, které se dají od apoenzymu oddělit (např. hydrolýzou) se nazývají koenzymy. • Kofaktory kovalentně vázané na apoenzym se označují jako prosthetická skupina.
Enzymové kofaktory: •
Kofaktory
• •
Koenzymy Thiaminpyrofosfát (TPP) Pyruvátdehydrogenasa Flavinadenindinukleotid (FAD) Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) Pyridoxalfosfát Koenzym A (CoA) Biotin Paruvátkarboxylasa 5'- Deoxyadenosylkobalamin Tetrahydrofolát
• • • • • • • • • • • • • • •
Kovy Zn2+ Zn2+ Mg2+ Ni2+ Mo Se Mn2+ Superoxiddismutasa
Enzymy
Monoaminoxidasa Laktátdehydrogenasa Glykogenfosforylasa Acetyl CoAkarboxylasa Methylmalonylmutasa Thymidylátsynthasa Karbonátanhydrasa Karboxypeptidasa Hexokinasa Ureasa Nitrátreduktasa Glutathionperoxidasa
Proteolytické enzymy (proteasy, proteinasy):
• Enzymy druhově nespecifické – specifické na štěpenou vazbu. • Mnohé katalyzující také reakce štěpení esterů což se využívá ke sledování jejich aktivity. • Trypsin štěpí peptidovou vazbu v místě, kde je na straně karboxylu Lys nebo Arg. • Thrombin, enzym podílející se na procesu srážení krve štěpí pouze vazbu Arg-Gly.
Vazebné místo peptidu štěpené trypsinem: M� sto hydrolytick� ho � t� pen�
Lysin nebo Arginin
R
H
C N H
C O
O
H N
C C H
R2
Vazebné místo peptidu štěpené thrombinem: M� sto hydrolytick� ho � t� pen� Arginin
R
H
C N H
C O
O
H N
C C H
H Glycin
Třídy enzymů. • •
Třídy enzymů Třída
•
1. Oxidoreduktasy Alkoholdehydrogenasa 2. Transferasy 3. Hydrolasy 4. Lyasy
• • • • • • • • • • • • • •
Katalyzovaná reakce
5. Isomerasy Podřídy: 5. 5. 5. 5. 5. 5. 6. Ligasy
1 2 3 4 5 6
Příklad
Oxidačně-redukční Přenos skupin Proteinkinasy Štěpení vazeb za účasti vody Trypsin Adice na dvojnou vazbu nebo odštěpení skupin za tvorby dvojné vazby Fumarasa Izomerace (geometrické a strukturní změny uvnitř molekuly) Glukosafosfátmutasa racemasy nebo epimerasy cis-trans-isomerasy intramolekulaární oxidoreduktasy intramolekulární transferasy (mutasy) intramolekulární lyasy ostatní isomerasy Spojení dvou substrátů Karbamoylfosfátza spotřeby ATP synthetasy
Názvosloví enzymů • Triviální názvy – např. ureasa, trypsin, pepsin. • Systematické – popis chemické reakce, enzym katalyzuje, koncovka –asa. • Např. alkoholdehydrogenasa katalyzuje (oxidaci alkoholu na aldehyd):
kterou reakci
•
Ethanol + akceptor elektronů = ethanal + redukovaný akceptor
•
V tomto případě je akceptorem NAD+, který se redukuje na NADH + H+ (proton se uvolňuje do prostředí).
•
NAD+ je nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma)
Systematická klasifikace enzymů dle enzymové komise (EC): • EC x. y. z. p. čtyřciferný kód • Příklad: Alkoholdehydrogenasa, EC 1.1.1.1 • Systematický název: Alkohol:NAD+ oxidoreduktasa • • • •
1. 1. 1. 1.
oxidoreduktasy (oxidačně-redukční reakce) 1 Působí na CH-OH skupinu donoru 1. 1 Akceptor NAD+ nebo NADP+ 1. 1. 1(pořadí enzymu v podpodtřídě)
Energetika enzymových reakcí • Změna volné (Gibbsovy) energie je termodynamická funkce vedoucí k pochopení katalytického účinku enzymů. • 1. Reakce probíhá samovolně, když má ∆ negativní znaménko.
G
• 2. Systém je v rovnováze, když je ∆ G = 0. • 3. Reakce neprobíhá samovolně, když je ∆ G pozitivní. Musí být dodána volná energie. • Negativní ∆ G neznamená, že reakce proběhne dostatečně rychle. Rychlost reakce závisí na volné aktivační energii ∆ G*.
Standardní volná energie a její vztah k rovnovážné konstantě reakce. • A + B ↔ C + D ∆
G = ∆ Go + RT ln [C] [D] / [A] [B]
∆
Go = změna standardní volné energie
• Standardní podmínky: všechny reaktanty jsou přítomny v koncentracích 1,0 M. • V biochemii: standardní stav pH = 7. Aktivita H+ a vody je rovna 1. • Označení: ∆ Go´.
Rovnovážná konstanta za standardních podmínek: • Keq´ = [C] [D] / [A] [B] ∆
Go´ = - 2, 303 RT log10 Keq´
• Keq´ = 10- ∆ Go´
/ (2, 303 RT)
• Při 25oC • Po zjednodušení: Keq´ = 10- ∆ Go´
/ 1, 36
Enzymy snižují aktivační energii – volnou energii aktivace P� echodov�stav, S
Voln�energie
) G (nekatalyzovan�
) G (katalyzovan�
Substr� t G reakce
Produkt Sm�r reakce
Závislost reakční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu. Reakce dosahuje limitní rychlosti, dříve označované jako maximální (Vlim).
Reak�n�rychlost [vO]
Limitn�rychlost (Vlim)
Koncentrace substr� tu [S]
Modely interakce enzymu se substrátem Model zámek a klíč (lock and key)
Substr� t
+
a
Aktivn� m� sto
a
b
Enzym
c
b
Komplex ES
c
Model indukovaného přizpůsobení (induced fit)
Substr� t
+
a
Aktivn� m� sto
Komplex ES
a b
Enzym
b
c
c
Enzymová kinetika. Rovnice Michaelise a Mentenové • Kinetický popis aktivity enzymu. • Reakční rychlost vo se obvykle vyjadřuje jako počet molů produktu vytvořených za sekundu. • Podmínky pro odvození kinetické rovnice Michaelise a Mentenové: • Tvorba komplexu enzym-substrát [ES] • Měříme počáteční rychlost vo , kdy se nenahromadilo takové množství produktu, že by ovlivňovalo zpětnou reakci. • Ustálený stav – koncentrace [ES] se nemění i když koncentrace substrátu a produktu se mění. Rychlost tvorby [ES] je shodná s rychlostí rozpadu [ES].
k1
E +S
k2
ES
kcat
E +P
Ust� len�stav Tvorba [ES] = Rozpad [ES]
[ET] = [E] + [ES]
k1 [E][S] = k2 [ES] + kcat [ES]
[E] = [ET] - [ES]
k1 ([ET] - [ES]) [E] = k2 [ES] + kcat [ES] k1 [ET] [S] - k1 [ES] [S] = k2 [ES] + kcat [ES] k1 [ET] [S] = k2 [ES] + kcat [ES] + k1 [ES] [S] k1 [ET] [S] = [ES] (k2 + kcat + k1 [S]) k1 [ET] [S] [ET] [S] [ET] [S] = [ES] = = (k2 + kcat + k1 [S]) (k + k + k [S]) (k2 + kcat) / k1 + [S] 2 cat 1 [ES] =
k1
[ET] [S]
k1 Km = (k2 + kcat) / k1
Km + [S] dP/ dt = vO = kcat [ES] dP/ dt = vO =
vO =
Vlim [S] Km + [S]
kcat [ET] [S] Km + [S]
Vlim = kcat [ET]
Rovnice Michaelise a Mentenov￩
vO = 1
vO
=
=
Km +[S] Km +[S]
Km
[S] +
Vlim [S]
1
vO
Rovnice Michaelise a Mentenov￩
Vlim [S]
1
vO
Vlim [S]
=
Km Vlim [S]
Vlim [S] 1
Sklon = Km / Vlim
Vlim
Pr� se� � k = 1/ Vlim
+
Dvojn� sobn�reciprok�rovnice Lineweavera a Burka
Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu (hyperbola):
Vlim
Po�� te�n�reak�n�rychlost [vO]
Vlim
Vlim/ 2
Km Koncentrace substr� tu [S]
Dvojnásobně reciproké vynesení 1 / vo proti 1 / [S] dle Lineweaver a Burka 1 / vo = Km / Vlim . 1 / [S] + 1 / Vlim 1 / [v ] O
Sklon =Km/ Vlim
Pr� se�� k =-1/ Km Pr� se�� k =-1/ Vlim 0
1 / [S]
Význam hodnot Km a Vlim (max) • Michaelisova konstanta: • Závisí na typu substrátu a podmínkách, jako jsou pH, teplota (doporučuje se 30oC) a iontová síla roztoku. • Dva základní významy Km : • a) Koncentrace substrátu při které je substrátem obsazena polovina aktivních míst enzymu. Odpovídá koncentraci substrátu in vivo. • b) Km = (k-1 + kcat ) / k1 je vztah mezi Km a rychlostními konstantami enzymové reakce ve smyslu rovnice Michaelise a Mentenové.
• V případě, že k-1 je mnohem větší než kcat to znamená, že ES komplex disociuje na E a S mnohem rychleji, než se tvoří produkt. • Vztah se zjednoduší na Km = k-1 / k1. Disociační konstanta komplexu ES je: KES = [E] [S] / [ES] = k-1 / k1 • Jinými slovy: Km je v tomto případě rovno disociační konstantě komplexu ES. ukazují na nízkou afinitu • Vysoké hodnoty Km substrátu k enzymu, a naopak nízké hodnoty na vysokou afinitu.
Hodnoty Km některých vybraných enzymů a substrátů: Substrát Km ( µ M.L-1) • Enzym • • Trypsin N-Benzoyl-Arg ethyester 000 • Pyruvátkarboxylasa Pyruvát 400 HCO31 000 • • ATP 60 • • β • •
Penicillinasa Karbonátanhydrasa -Galaktosidasa Hexokinasa
• Glukokinasa •
Benzylpenicilin CO2 Laktosa D-Glukosa ATP D-glukosa ATP
50 8 000 4 000 32 1 200 340 250
3
Číslo přeměny enzymu
• Maximální nebo nověji nazvaná limitní rychlost enzymové reakce je číslo přeměny enzymu. • Definujeme jako počet molekul substrátu převedených na produkt enzymovou molekulou za časovou jednotku při plné saturaci enzymu substrátem. Nazývá se také katalytická konstanta kcat.
Čísla přeměny (turnover numbers) některých enzymů:
• Enzym (sec) • • • • • •
Karbonátanhydrasa Acetylcholinesterasa Penicilinasa Laktátdehydrogenasa Chymotrypsin Tryptofansynthetasa
Číslo přeměny 600 000 25 000 2 000 1 000 100 2
Kinetická dokonalost enzymové katalýzy. Kriterium kcat / Km. • V případě, že koncentrace substrátu je mnohem vyšší než Km je rychlost enzymové reakce rovna kcat což je číslo přeměny. • Za fyziologických podmínek enzym nebývá substrátem nasycen. Poměr [S] / Km je mezi 0, 01 až 1, 0. • Za situace, kdy je [S] < < Km je rychlost enyzmové reakce mnohem menší než kcat, protože je mnoho aktivních míst neobsazeno.
• Existuje nějaké číselné měřítko, které by charakterizovalo enzym za podmínek v buňce ? • • Za podmínek, kdy je [S] < < Km závisí rychlost enzymové reakce na kcat /Km a na celkovém množství enzymu [ E ]T. • • Pomocí tohoto kriteria můžeme porovnávat preferenci enzymu pro různé substráty. • Horním limitem je rychlost difůze substrátu do aktivního místa enzymu.
Estery aminokyselin jako substráty chymotrypsinu dle rostoucí hodnoty kcat / Km : Ester aminokyseliny (s-1M-1) Glycin 10-1 Valin Norvalin 102 Norleucin 103 Fenylalanin 105
Vedlejší řetězec kcat /Km -H
1, 3 x
isopropyl n-propyl
2, 0 3, 6 x
n-butyl
3, 0 x
benzyl
1, 0 x
Nejdokonalejším substrátem je fenylalanin.
Enzymy pro které je hodnota kcat / Km blízko difůzí kontrolované rychlosti vstupu substrátu do aktivního místa. Enzym Acetylcholinesterasa Karbonátanhydratasa Katalasa Fumarasa Triosafosfátisomerasa β -Laktamasa Superoxiddismutasa
kcat / Km (s-1M-1) 1,6 x 108 8,3 x 107 4,0 x 107 1, 6 x 108 2,4 x 108 1,0 x 108 7,0 x 109
Jednotky enzymové aktivity
• 1 katal (1 kat) je aktivita enzymu, který katalyzuje přeměnu jednoho molu substrátu za jednu sekundu. • Používají se µ kat (10-6 kat) a nkat (10-9 kat). • Aktivita se měří za optimálních podmínek – teplota, pH a iontová síla roztoku. • Specifická aktivita: Aktivita enzymu vztažená na množství proteinu v jednotce objemu (např. nkat/mg – vše v jednom mL).
Dvousubstrátové reakce • Sekvenční: • A) Náhodný mechanismus (bi – bi) • B) Uspořádaný mechanismus (bi – bi) • Pingpongový mechanismus
Náhodný mechanismus
• Je takový mechanismus enzymové reakce, kdy nezáleží na tom, který z obou substrátů se váže jako první na enzym. Příklad: kreatinkinasa
Náhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa):
O
-
C O
H2 C
+
NH2 N
+ C
CH3
Kreatin
NH2
+ ATP
O
-
C O
H2 C
-
NH2
O
C
P
N CH3
N H
Fosfokreatin
-
O O
+ ADP
Clelandovo schéma - náhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa):
ATP Kreatin
Fosfokreatin ADP
Enzyme
Enzyme E (kreatin) (ATP) Kreatin ATP
E (fosfokreatin) (ADP) ADP Fosfokreatin
Uspořádaný mechanismus
• Vyznačuje se tím, že substráty se váží do aktivního místa v určitém pořadí. • Příklad: alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa (nejdříve se váže koenzym NAD+ a poté druhý substrát)
Uspořádaný sekvenční mechanismus (laktátdehydrogenasa):
O
O
C C
O
O + NADH CH3
Pyruv� t
+ + H
HO
C
O
C
H
CH3 Lakt� t
+ + NAD
Clelandovo schéma uspořádaného sekvenčního mechanismu (laktátdehydrogenasa):
NADH Pyruv� t
Lakt� t NAD+
Enzyme
Enzyme E (NADH) (pyruv� t)
E (lakt� t) (NAD+)
Pingpongový mechanismus • Vyznačuje se tím, že enzym přechází mezi dvěma stálými formami. • Po vazbě prvního substrátu se tvoří substituovaný enzymový meziprodukt, modifikovaný enzym. • První produkt se uvolní a poté se váže na modifikovaný enzym druhý substrát a odštěpí se druhý produkt. • Příklad: aspartátaminotransferasa.
Pingpongový mechanismus (aspartátaminotransferasa):
-
OOC
-
OOC
-
COO
-
COO
H +
H3N
+ -
COO
Aspart� t
COO
H
-
O
t - Oxoglutar�
+
H3N
+ -
COO
Glutam� t
COO
-
O
Oxaloacet� t
Clelandovo schéma pingpongového mechanismu (aspartátaminotransferasa):
Aspart� t
Enzyme E (aspart� t)
Oxaloacet� t
(E- NH3+) (oxaloacet� t)
t - Oxoglutar�
(E- NH3+) (oxaloacet� t)
(E- NH+ ) 3 (- oxoglutar� t)
Glutam� t
Enzyme E (glutam� t)
Allosterické enzymy • Allosterické enzymy se neřídí kinetikou Michaelise a Mentenové. • Skládají se z podjednotek (kvarterní struktury). Mají více aktivních míst a míst do kterých se váže inhibitor nebo aktivátor. • Závislost rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu má sigmoidní charakter.
Reak�n�rychlost [vO]
Závislost reakční rychlosti allosterického enzymu na koncentraci substrátu (sigmoida)
Koncentrace substr� tu [S]
Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa). • ATCasa katalyzuje první krok biosyntézy pyrimidinových nukleotidů. • ATCasa je inhibována produktem – cytidintrifosfátem (CTP). • Tento typ inhibice se nazývá – zpětnovazebná inhibice nebo inhibice konečným produktem. Vždy je inhibován první reakční krok. • CTP je strukturně odlišný od substrátu a váže se proto na jiné místo enzymu než substrát. Taková místa se nazývají allosterická (z řečtiny allos jiná a steros struktura). • ATCasa je složena ze dvou katalytických podjednotek (každá obsahuje tři řetězce) a tří regulačních podjednotek (každá obsahuje dva řetězce). • ATP je allosterický aktivátor, CTP je allosterický
Rychlost tvorby N- karbamoylaspart� tu
Aspartáttranskarbamoylasa jako příklad allosterického enzymu. Přidavek allosterického inhibitoru – CTP.
+ 0.4 mM CTP
10
20
[Aspart� t], mM
Rychlost tvorby N- karbamoylaspart� tu
Aspartáttranskarbamoylasa. Přídavek allosterického aktivátoru ATP.
+ 2 mM ATP
10
20
[Aspart� t], mM
Rychlost enzymové reakce závisí na pH, teplotě a iontové síle prostředí. • Většina enzymů je aktivní pouze v úzkém rozmezí pH. Spočívá to ve vlivu pH na kombinaci faktorů: • A) Vazba substrátu na enzym • B) Stav ionizace substrátu • C) Ionizační stavy vedlejších řetězců aminokyselin v aktivním místě • Většina enzymových reakcí vytváří zvonovou křivku závislosti reakční rychlosti na pH. Např. fumarasa. • Hodnotu pH, při které dochází k nejvyšší rychlosti enzymové reakce nazýváme pH optimum.
Rychlost
Fumarasa (enzym cyklu trikarboxylových kyselin) - pH optimum
0
5
6
7
pH
8
9
Vliv teploty na stabilitu a aktivitu enzymů. • Teplotní stabilita enzymů závisí na řadě faktorů jako je pH, iontová síla prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost ligandů. Substráty obecně chrání enzymy před tepelnou denaturací. Nízkomolekulární enzymy s jednoduchým polypeptidovým řetězcem obsahující disulfidové vazby, jsou obvykle teplotně stabilnější než vysokomolekulární oligomerní enzymy. • Obecně, se zvyšující se teplotou roste aktivita enzymů. Enzymy jsou proteiny u kterých se terciární a kvarterní struktura udržuje slabými interakcemi jako jsou vodíkové vazby, iontové interakce atd. Závislost rychlosti na teplotě obvykle vykazuje vrchol, který označujeme jak teplotní optimum. Při dalším zvyšování teploty obvykle dochází k denaturaci proteinu. Závislost mezi rychlostní konstantou reakce a aktivační energií se vyjadřuje exponenciální Arrheniovou rovnicí. • Vliv teploty na rychlost reakce se také vyjadřuje termínem teplotní koeficient Q10. Q10 je faktor kterým vzroste rychlost enzymové reakce při růstu teploty o 10oC. • Pro teplotní oblast mezi 25 až 35o C je tímto faktorem pro enzymy číslo 2. • Pro práci s enzymy je doporučována IUB (mezinárodní biochemická
Inhibice enzymové aktivity Ireversibilní
Reversibilní a. Kompetitivní b. Nekompetitivní c. Akompetitivní
Ireversibilní inhibice
• Ireversibilní inhibitory blokují nevratně enzymovou aktivitu tím, že vytváří s enzymem velmi pevný kovalentní komplex enzym – inhibitor. • Příklad: Inhibice cholinesterasy a proteinas diisopropylfluorfosfátem, který se kovalentně váže na Ser v aktivním místě nebo reakce enzymů s ionty těžkých kovů.
Ireversibilní inhibice acetylcholinesterasy (enzym přenosu nervového vzruchu) diisopropylfosfofluoridem
CH3 H CH3 OH
Ser
+
F O H
CH3 H CH3
O O
P
O
O CH3 CH3
DI PF
Acetylcholinesterasa ACE
H
O
+ F- +
P O
CH3 CH3
I naktivovan�ACE kovalentn�vazba
+
H
Inaktivace cysteinového enzymu jodacetamidem
O
O SH
+
I
S
C C H2
Cys
NH2
C C H2
NH2
J odacetamid
Enzym - SH v aktivn� m m� st�
I naktivovan�enzym
+
I
-
+
+
H
Reverzibilní inhibice • Kompetitivní inhibice
Kompetitivn�inhibice Klasick�kompetitivn�inhibice S
I Enzym
S Enzym
I
Enzym
Neklasick�kompetitivn�inhibice S
S Enzym
I Enzym
I
Enzym
Bu�to vstoup�substr� t do aktivn� ho m� sta enzymu a zamez� vstupu inhibitoru nebo naopak.
Příklad klasické kompetitivní inhibice sukcinátdehydrogenasy (enzym citrátového cyklu) malonátem: -
COO HC
CH2 -
Sukcin� tdehydrogenasa OOC
CH2
-
COO
CH
+
-
COO
Sukcin� t
Fumar� t
-
COO CH2 -
COO
Malon� t
Kompetitivn� inhibitor
E +I
EI
K = [E] [I ] / [EI ] i
2H
Kompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka: 30
Stejn�mno� stv� substr� tu a inhibitoru: E +S + I
ES
Kompetitivn�inhibice E +P
1/ vi =
(
Km
Vlim [S]
1+
[I ]
Ki
)
+
1
Vlim
20
1 / [vO]
EI Nadbytek substr� tu: S S S E +S ES S +S I S
M� n�se sklon
E +P
10
Bez inhibice
Km se m� n�
Km 1/ vO = Vlim [S]
+
1
Vlim
Vlim se nem� n� 0
100
200
300
1 / [S], M- 1
400
500
Potlačení intoxikace ethylenglykolem – ethanolem:
Tvorba oxalov�kyseliny z ethylenglykolu je inhibov�na ethanolem: H
O H2C
OH
Alkoholdehydrogenasa
C
H2C
OH
I nhibov�no ethanolem
H2C
Ethylenglykol
+ HO
CH2 CH3
Ethanol
COOH OH
Aldehyd
COOH
Oxalov� kyselina
• Nekompetitivní inhibice
Schéma nekompetitivní inhibice: Nekompetitivn�inhibice S
S Enzym
I Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Schéma a grafické vynesení nekompetitivní inhibice dle rovnice Michaelise a Mentenové 100
S E +I
K
ES S
i
EI
EI S
E +P
Relativn�rychlost
Bez inhibitoru 80
60 [I ] =K
i
40
20
[I ] =5 K
i
[I ] =10 K
i
Koncentrace substr� tu [S]
Nekompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka 30
Stejn�mno� stv� substr� tu a inhibitoru: E +S + I
ES + I
Nekompetitivn�inhibice
E +P
1/ vi =
(
Km
Vlim [S]
1+
[I ]
Ki
)( +
1
Vlim
1+
20 EI S Nadbytek substr� tu: S S S E +S S +S I S
ES
Ki
)
M� n�se sklon
1 / [vO]
EI + S
[I ]
ESI
10
Bez inhibice Km
Nadbytek substr� tu neovlivn�reakci.
Km se nem� n� Vlim se m� n�
0
100
200
1/ vO = Vlim [S]
300
1 / [S], M- 1
+
400
1
Vlim
500
• Akompetitivní inhibice
Akompetitivní inhibice. Podmínkou vazby inhibitoru je vazba substrátu. Ternární komplex.
Akompetitivn�inhibice S
S Enzym
I
Enzym
I
S
Enzym
Akompetitivní inhibice dvojitě reciproké vynesení dle Lineweavera a Burka 30
Stejn�mno� stv� substr� tu a inhibitoru: E +S
ES + I
Akompetitivn�inhibice
E +P
1/ vi =
Km Vlim [S]
+
( 1
Vlim
1+
[I ]
Ki
) Nem� n�se sklon
1 / [vO]
20 EI S Nadbytek substr� tu: S S S E +S S +S I S
ES
ESI
Bez inhibice Km 1/ vO = Vlim [S]
10
Nadbytek substr� tu neovlivn�reakci.
+
1
Vlim
Km se m� n�
Vlim se m� n� 0
100
200
300
1 / [S], M- 1
400
500
Tabulka typů inhibice a příslušných konstant: Inhibice
Konstanty
Kompetitivní I se váže jen na E
Roste Km, Vlim se nemění.
Nekompetitivní I se váže jak na E tak na ES
Klesá Vlim, Km se nemění
Akompetitivní I se váže jen na ES
Klesá Vlim a Km Poměr Vlim / Km se nemění
PENICILIN jako INHIBITOR vzniklý enzymovou reakcí – sebevražedný substrát. • Penicilin ireversibilně inhibuje růst bakterií – narušuje syntézu bakteriální stěny. • Penicilin inhibuje enzym glykopeptidtranspeptidasu tím, že napodobuje přirozený substrát enzymu a tím je D-Ala-D-Ala (dipeptid). Penicilin se kovalentně naváže na Ser aktivního místa glykopeptidtranspeptidasy. • Inhibice penicilinem zasahuje do stavby buněčné stěny. Penicilin zabraňuje zesíťování peptidoglykanových vláken buněčné stěny.
Struktura penicilinu. Dipeptid (Val a Cys).
Thiazolidinový kruh, reaktivní peptidová vazba β -laktamového kruhu a R je zaměnitelná skupina. Variabiln�skupina
O
R
HN
Thialozidinov�kruh
H S
CH3 -
N O
CH3 -
COO
Reaktivn�peptidov� vazba v - laktamov� m kruhu
Model benzylpenicilinu – penicilin G. Na místě skupiny R je benzyl. Benzylov�skupina
Thialozidinov�kruh
Velmi reaktivn� laktamov�kruh
Porovnání konformací penicilinu a dipeptidu D-Ala-D-Ala, který penicilin napodobuje:
Penicilin
R- D- Ala- D- Ala peptid
Schématické znázornění peptidoglykanu bakterie Streptokokus aureus. Žlutý je sacharid, červený tetrapeptid a pentaglycinový můstek je modrý.
Tvorba sítě peptidoglykanu (S. aureus). Koncová aminoskupina pentaglycinového můstku v buněčné stěně napadá peptidovou vazbu mezi dvěma D-alaniny a tím dochází k zesíťování. O R1
C
O +
C H2
NH3
+
Koncov�glycin pentaglycinov� ho m� stku
O
C
H N
C
H
H
CH3
C
N H
CH3 O
R2
Koncov�D- Ala- D- Ala skupina
O R1
C
C H2
H N
H C O
O
CH3 N H
R2
Gly-D-Ala k��ov� vazba
+
O
C H
NH2
C
CH3
D- Ala
Interakce penicilinu s transpeptidasou vedoucí k velmi stabilnímu inaktivnímu komplexu. R
R
O
NH
H
S
H
+ OH
Ser
N O
Penicilin
O NH H
CH3 CH3 -
COO
Glykopeptidtranspeptidasa
H
S
O
HN O
CH3 CH3 -
COO
Komplex peniciloyl- enzym
KOENZYMY
• A) Oxidoreduktas • B) Transferas
Přehledná tabulka běžných koenzymů: Koenzym zdroj
Onemocnění z nedostatku
Enzymová reakce
Vitaminový
Biocytin
Karboxylace
Biotin
Koenzym A
Přenos acylů
Pantothenát (B5) Není známo
Kobalaminové koenzymy Alkylace anemie
Kobalamin (B12)
Není známo
Perniciosní
Flavinové koenzymy
Oxidace-redukce Riboflavin (B2)
Není známo
Lipoová kyselina
Přenos acylů
Není známo
-
Nikotinamidové koenzymy Oxidace-redukce Nikotinová Pelagra kyselina (niacin,B3) Pyridoxalfosfát Přenos aminoskupin Pyridoxin (B6) Není známo Tetrahydrofolát
Přenos C1 skupin Listová kyselina
Megaloblastická anemie
Koenzymy oxidoreduktas:
• A) Nikotinamidové • B) Flavinové
Struktura nikotinové kyseliny a jejího amidu.
O
O
NH2 N
Nikotinamid (niacinamid)
OH
N
Nikotinov�kyselina (niacin)
Mechanismus oxidačně-redukční reakce NAD+ a NADP+ Oxidovan�f orma O
Redukovan�f orma H
H
+ NH2 + H
NH2 + 2 [H ]
Nikotinamid + N
O
CH2
D- Ribosa
N
O H
R
H
H
OH OH
OH
NH2 O
P
OH
O
P O
N
N
O OH
N
N CH2
Adenosin
O H
H
H
OH OH
OX
X =H
Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+)
X = PO32-
Nikotinamidadenindinukleotidfof� t (NADP+)
O
Dvouelektronový přenos (hydridový anion) při oxidačně-redukční reakci NAD+ na NADH.
H
O
H NH2
+
H
-
H:
O
NH2
+ N
N
R
R
NAD+
NADH
Alkoholdehydrogenasová reakce za účasti nikotinamidového koenzymu:
OH H3C
+
C H
H
Ethanol
+
NAD
O
ADH H3C
+
C H
Acetaldehyd
NADH
+
H+
Struktura flavinadenindinukleotidu (FAD) s vyznačením reaktivních míst. H
O
H3C
N
H3C
N
Reaktivn�m� sta
NH
H
O
N
H
C
H
H
C
OH
H
C
OH
NH2 N
H
C H2C
OH
H -
-
O O
O O
N
O
P O
N
P
CH2
O H
O
H
H
H OH
OH
N
H
H H3C 8a
8 7a 7
9
6
H3C
R N
9a 5a
10
N 10a
1
4a 5
4
N H
O 2 3
N H
O
Flavinadenindinukleotid (FAD) (oxidovan�nebo chinonov�forma) H H
R
H3C
N
H3C
N
N
O
N
H
H
H
O
FADH (radik� lov�nebo semichinonov�forma) H H
R
H
H3C
N
N
H3C
N
O
N
H
H
H O
FADH2 (redukovan�nebo hydrochinonov�forma)
Oxidovaná a plně redukovaná forma flavinového koenzymu (FAD). Mechanismus shodný s flavinmononukleotidem (FMN).
H H3C
O
H
N
H N
H3C
N H
N
R
Oxidovan�forma (FAD)
+ O
+ 2H
+
H
O
H3C
N
H
H3C
N
N
R
H
N
2 e-
H
Redukovan�forma (FADH2)
O
Oxidace (dehydrogenace) vazby mezi dvěma uhlíky za účasti FAD:
H
H
R1
C R1
R2
C H
H
+
FAD
R2 C
H
+
C H
FADH2
Koenzymy transferas: • A) Koenzym A • B) Lipoová kyselina • C) Thiaminpyrofosfát (TPP)
Koenzym A, CoA, CoASH. Vyznačena struktura složeného nukleotidu s reaktivní SH skupinou na konci. Pantothenát – vitamin B5.
NH2
Reaktivn�skupina N H NH
-
OH
NH
HS
O
P
P
O O
O
H3C
CH3
O O
H
-
O
N O
O
O
H
Pantothen� t
H
H
H OH
- Merkaptoethylamin
N
OH
N
H
Thioesterová vazba s vysokým obsahem energie. Acetyl CoA + H2O = acetát + CoA + H+ ∆ Go´ = - 31, 4 kJ/mol
O
O C R
CoA S
Acyl CoA
C H3C
CoA S
Acetyl CoA
Lipoová kyselina
S S
OH H O
Lipoov�kyselina
Lipoamid – isopeptidová vazba lipoové kyseliny na vedlejší řetězec apoenzymu (Lys) s vyznačením reaktivní disulfidové vazby: H N
O C H
Postrann�� et� zec lysinu
HN O
H S
S
Reaktivn�disulfidov�vazba
Lipoamid
Přenos acetylu z acetyldihydrolipoamidu na CoA
O
HS CoA
SH
+ H3C
S
CoA
S
R
Koenzym A
H O Acetyldihydrolipoamid
HS CH3
+
HS H
Acetyl CoA
R
Dihydrolipoamid
Struktura thiaminpyrofosfátu:
H
NH2 + N
N
S -
O H2N
-
O N
H3C
CH2
CH2
Thiaminpyrofosf� t (TPP), nov� thiamindifosf� t
O O
-
O
P
P
O
O
Uhlíkový atom mezi atomy dusíku a síry thiazolového kruhu je silně kyselý (pKa = 10). Dochází k ionizaci za tvorby karbaniontu, který se váže na oxoskupiny (např. pyruvátu v pyruvátdehydrogenase).
R2 H3C
R2 H3C
+
N
+
N
-
H R1
S
TPP
R1
S
Karbaniont TPP
+ H+
Interakce karbaniontu TPP s pyruvátem (součást pyruvátdehydrogenasy). Hydroxyethyl-TPP se také označuje jako „aktivní acetaldehyd“. H3C
O
-
R2 +
O
N
-
R1
+
H
C C
S
H3C
+
S
R1
Adi� n�slou� enina
R2 OH
N
H3C
+
OH
N
C S
OH
CH3
R2
R1
CO2
O
C C
Pyruv� t
CO2 H3C
O
N
O
H3C
Karbaniont TPP
R2
C CH3
R1
S
Rezonan� n�formy hydroxyethyl- TPP
+
H
R2 H3C
+
N
-
H
OH C
CH3
R1
S
CH3
Hydroxyethyl- TPP
Adenosintrifosfát – ATP, univerzálně významný koenzym (energie) a enzymový regulátor. • ATP urychluje řadu metabolických kterých dochází k jeho hydrolýze.
reakcí
při
• Chemická energie ATP se uplatňuje při aktivním transportu, může se převést na mechanickou práci (svaly), na světlo (bioluminiscence), elektrickou energii a teplo. • ATP se účastní řady biosyntetických reakcí přenosem fosfátu, difosfátu, adenosylu a adenylu na druhé metabolity.
Fosfoesterov�NH2 Fosfoanhydridov� vazba vazby -
-
O -
O
P O
-
O O
P O
N
N O O
N
N
P
O
CH2
O H
O
H
H
OH OH
OH
Adenosin AMP ADP ATP
Proč je ATP tak energeticky bohatá molekula? • Aktivní forma ATP je obvykle komplex ATP s Mg2+ nebo Mn2+. • ATP je energeticky bohatá molekula, protože její trifosfátová část obsahuje dvě fosfoanhydridové vazby. Důvodem je resonanční stabilizace, elektrostatické odpuzování a stabilita produktů. • Produkty hydrolýzy, jako je fosfát, AMP (adenosinmonofosfát) nebo ADP (adenosindifosfát), vykazují větší stabilitu a menší elektrostatickou repulzi než ATP.
Tabulka změny standardní Gibbsovy energie hydrolýzy fosfátů některých biologicky významných sloučenin: ∆ Go' (kJ.mol-1)
• Sloučenina • • • • • • • • • • •
Fosfoenolpyruvát 1,3-bisfosfoglycerát ATP (→ AMP + PPi→ 2Pi) Acetylfosfát Fosfokreatin ATP (→ ADP + Pi) Glukosa-1-fosfát PPi Fruktosa-6-fosfát Glukosa-6-fosfát Glycerol-3-fosfát
- 61, 9 - 49, 4 - 45,6 - 43, 1 - 43, 1 - 30,5 -
20, 19, 13, 13, 9,
9 2 8 8 2
Výpočet změny volné energie hydrolýzy ATP na ADP a Pi v buňce. • Vnitrobuněčná koncentrace ATP se rozmezí: 2 – 10 mM. Koncentrace ADP a Pi jsou variabilní.
udržuje
v
• Při typické buněčné koncentraci [ATP] = 3, 0 mM, konc. [ADP] = 0, 8 mM konc.[ Pi] = 4, 0 mM je volná energie hydrolýzy ATP na ADP a Pi při 37oC: - 48, 1 kJ.mol-1 Podle vzorce: DG = D G o´ + RT. ln [ADP].[ Pi ]/ [ATP]. D G o´ = - 35, 6 kJ.mol-1
Hydrolýza fosfoanhydridové vazby:
O O
P -
O
nebo
O nebo
O P
O
-
O
H2O
O O
P -
O
O O
H
+
H
O
P -
O
O
Spřažené reakce. Spojení endergonní reakce s exergonní (hydrolýza ATP):
G￩ (kJ .mol- 1) Endergonn�poloreakce 1
Pi + glukosa
glukosa- 6- P
+ 13.8
Exergonn�poloreakce 2
ATP + H2O
ADP + Pi
- 30.5
Celkov�spojen�reakce
ATP + glukosa
ADP + glukosa- 6- P
- 16.7
Vysokoenergetické a nízkoenergetické sloučeniny
Fosfoanhydridová vazba bývá často značena ~ a používán název „makroergická vazba“.
O H3C
C
OH O
~OPO
23
Acetylfosf� t
2-
O3POCH2
C
C
~OPO
1,3- Bisfosfoglycer� t
23
23
CH2OPO C H C OH
O H
H
HO C H
H
C
C
OH
OH
t - D- Glukosa- 6- fosf�
CH2OH HO
C
H
CH2OPO32-
L- Glycerol- 3- fosf� t
Zásobní fosfageny (guanidinové fosfáty) obratlovců: + nebo nebo
H2N
C
N H X
N
O P
-
O
-
O
R R = CH2
-
CO2
X = CH3
Fosfokreatin
X=H
Fosfoarginin
+
NH3 R = CH2
CH2
CH2
CH
CO2
Doplněk: Strukturní vzorce vitaminů rozpustných ve vodě a uplatňujících se jako prekursory koenzymů a vitaminu C (Laskorbová kyselina): O H
O
H3C
-
H2 C
-
O
O
C H2
N +
NH
H3C
N H
N
H
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2OH
Vitamin B2 (Riboflavin)
N H
O
Vitamin B3 (Niacin)
O
+
Vitamin B6 (Pyridoxin)
H2 C OH
H3C
O
CH3
H
HO OH
N H
OH
Vitamin B5 (Pantothen� t)
CH2OH HOH2C
H
H N
CH3
C
O
C
HO
H
CH2OH
OH
Vitamin C (L- askorbov� kyselina)
H
O
H3C
N
H3C
N
NH
H
N
H
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2OH
Vitamin B2 (Riboflavin)
O
O -
O +
N H
Vitamin B3 (Niacin)
H2 C
-
O
O
H
H N C H2
OH
H2 C OH
O
H3C
Vitamin B5 (Pantothen� t)
CH3
CH2OH HOH2C
OH
+
N H
Vitamin B6 (Pyridoxin)
CH3
H
HO C
O
C
HO
H
CH2OH
OH
Vitamin C (L- askorbov� kyselina)
Askorbová kyselina, askorbát (aniont) a oxidovaná forma dehydroaskorbová kyselina. H
HO C
O
C
HO
C
O
CH2OH
H
H
HO
OH
C
-
HO
Askorbov�kyselina
O
Askorb� t
H
HO C
O
C
O
H
H
CH2OH
O
Dehydroaskorbov�kyselina
CH2OH
Účast askorbátu (vitaminu C) na hydroxylaci Pro v peptidovém řetězci.
-
O
N
+
O2
+
N
-
Prolin- sou� � st peptidov� ho � et� zce
O
t - Oxoglutar�
C H
-
+ CO2 +
O O
H
O
O
Prolylhydrolasa + askorb� t
C H
O
O OH
Hydroxylovan�prolin v� et� zci
-
O
O
Sukcin� t
O
Strukturní vzorce vitaminů rozpustných v tucích CH3 H3C
CH3
CH3 H3C
CH3
CH3
CH3
CH3 CH2OH
CH3
CH2
H3C
Vitamin A
Vitamin D2 (Kalciferol)
(Retinol) O
CH3 HO
CH3
CH3
H3C
O
(
CH3
CH3
Vitamin E (- Tokoferol)
) 3
CH3
(
H O
CH3
Vitamin K1
) 3
CH3
H
H3C
CH3
CH3
CH3 CH2OH
CH3
Vitamin A (Retinol)
CH3 H3C
CH3
CH3 CH3 CH2
H3C
Vitamin D2 (Kalciferol)
CH3 HO
CH3
H3C
O
(
CH3
CH3
Vitamin E (- Tokoferol)
) 3
CH3
H
O CH3
( O
CH3
Vitamin K1
) 3
CH3
H
OSNOVA • Základní charakteristika enzymů Třídy enzymů Energetika enzymových reakcí Kinetika enzymových reakcí Vliv teploty, pH a iontové síly roztoku na enzymovou reakci Inhibice a aktivace enzymových reakcí Koenzymy oxidoreduktas, transferas a isomeras, ligas a lyas. Úloha adenosintrifosfátu (ATP) jako koenzymu a univerzální skladovatelné energie. Ostatní sloučeniny s vysokým obsahem energie. Doplněk: Strukturní vzorce vitaminů rozpustných ve vodě a uplatňujících se jako prekursory koenzymů a vitaminu C (Laskorbová kyselina)
