Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
Nyomnyi mennyiségű komponensek on-line mintaelőkészítése, dúsítása a folyadékkromatográfiás mérésekben SPE-LC Hallgatói összefoglaló
Készítette: Szilágy Miklós Mihály
Vas Nóra
Titkay Dóra
Wágner Dorottya Sarolta
Tóth Anna Szilvia
Wekler Mihály István
Vallus Gábor
Zemplényi Zalán
Varga Kinga Forrás: Selective sample handling and detection is high performance liquid chromatography, part A, R.W. Frei & K Zech, ELSEVIER, 1988
2011. május 23. 1
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
Tartalomjegyzék Bevezetés.................................................................................................................................... 3 Mintaelőkészítés......................................................................................................................... 3 A szilárd fázisú extrakció lépései:.............................................................................................. 5 A megfelelő szorbens kiválasztása............................................................................................. 6 A szilárd fázisú extrakció paraméterei ....................................................................................... 6 Áttörési térfogat és retenció ....................................................................................................... 7 Zónaszélesedés az SPE kolonnánál............................................................................................ 7 SPE adszorbensek ...................................................................................................................... 8 A mintaelőkészítés off-line, illetve on-line kialakításai............................................................. 8 Kation-cserélő oszlopok ............................................................................................................. 9 Anion-cserélő oszlopok............................................................................................................ 10 Fémes töltetű SPE oszlopok ..................................................................................................... 10 Az oszlopok méretcsökkentése ................................................................................................ 11
2
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
Bevezetés Először is definiáljuk, hogy mit értünk nyomnyi mennyiségen. Hiába várnánk azonban pontos mennyiséget, a szakirodalomban nincsen pontos értékhatár rendelve a nyomnyi mennyiséghez. Általában ppm - ppt tartományt értünk rajta. Számos anyag azonban már ilyen kis mennyiségben is toxikus lehet, illetve az élőlényekben akkumulálódva, a táplálékláncban a mennyiségük megsokszorozódhat, így emberekre is potenciális veszélyt jelentenek. Ilyenek például a PAH vegyületek vagy az alkil-fenolok. Az elektronika és a számítástechnika rohamos fejlődésével az analitikai műszeres eljárások, a detektálási módszerek érzékenysége és szelektivitása jelentősen megnőtt. Analitikus berkekben azonban közismert, hogy az analitikai eljárások szűk keresztmetszete a mintavétel és a mintaelőkészítés. Ezek során sokkal nagyobb hibát követünk el, mint a mérés során. (legnagyobb hibát a mintavétel eredményezhet) Ebből kifolyólag a mintaelőkészítési módszereknek követniük kellett a technika fejlődését és szükségessé vált a szelektívebb, kifinomultabb és környezetbarátabb mintaelőkészítési módszerek kidolgozása.
Mintaelőkészítés A mintaelőkészítésnek feladata, hogy a mérendő komponenst mérhető formába és detektálható koncentrációba juttassa, azaz dúsítsa, koncentrálja (jel nő), illetve, hogy csökkentse a mátrix mennyiségét (zaj csökkentése), végső soron javítsa a jel/zaj viszonyt, azaz az érzékenységet. Emellett biztosítania kell a minta teljes információtartalmának torzítatlan megőrzését. A mai napig elterjedten használják a laborokban a folyadék-folyadék extrakciót. A módszer ismertetésétől ezúttal eltekintünk. A folyadék-folyadék extrakció több szempontból is idejétmúltnak és helyettesítendőnek tekinthető. A mintaelőkészítési módszer, amelyet e dolgozatban részletesen be kívánunk mutatni, a szilárd fázisú extrakció. A szilárd fázisú extrakció számos előnnyel bír a folyadék-folyadék extrakcióval szemben. Kiemelendő, hogy a folyadék-folyadék extrakció egy nagy vegyszerigényű, minimálisan automatizálható, kis szelektivitású, környezetterhelő mintaelőkészítési módszer, addig a szilárd fázisú extrakció kevés oldószert igényel, tehát zöld kémiai módszer, és jól automatizálható, szelektív megoldást kínál.
3
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
A két módszer összehasonlítását a következő táblázat segítségével szemléltetjük. Oldószer felhasználás Időigény Automatizálhatóság Szelektivitás Fellépő problémák
Gazdaságosság Dúsítás lehetősége
LLE Nagy (30-300ml) Nagy Nem Kicsi Sok probléma: emulzióképződés, habképződés, stb…
Gyenge Gyenge
SPE Kicsi (1-20ml) Kicsi Igen Nagy Kevés probléma: Ha a zavaró komponensek egy része gyengébben, más része erősebben kötődik az állófázishoz, mint a meghatározandó komponens Jó Jó
A szilárd fázisú extrakciót, mint on-line mintaelőkészítési módszert a folyadékkromatográfiában, a következőképpen valósítjuk meg. Az analitikai kolonna elé bekötünk egy ún. elő-kolonnát (pre-coloumn), amelyben az állófázis az adott analitikai feladatnak megfelelő. (Az alkalmazott állófázisok ismertetését ld. később.) Ennek a kolonnának a feladata a dúsítás (koncentrálás). Jellemzője, hogy az analitikai kolonnával szemben, a dúsító kolonna nagy kapacitású és kis felbontású. A SPE-LC technika egy leegyszerűsített vázlatát mutatja be az 1. ábra. 1. ábra mátrix + minta
elő - kolonna dúsítás
Szorpció: gyors, reprodukálható, reverzíbilis Szorbens: kémiaileg inert, a mátrix jól nedvesítse
analitikai kolonna
detektor
4
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
A szilárd fázisú extrakció lépései: Aktiválás Az oszlop aktiválása. Általában a kolonna közepes polaritású szerves oldószerrel való mosását, nedvesítését jelenti. Cél a szorbens szemcséi közötti térből a levegő eltávolítása, az aktív ligandumok szolvatációja és aktiválása. Kondicionálás Az aktiválás után egy egyensúlyt beállító lépés következik, amit általában egy olyan oldószer(elegy) biztosít, amely szerves oldószer tartalmát, pH-ját és ionerősségét tekintve hasonlít a mintamátrixra. Az egyensúly beállta után, mielőtt a mintát az oszlopra felvinnénk, a töltet kiszáradását el kell kerülni. Mintafelvitel A meghatározandó anyag(ok) kvantitatív visszatartása az oszlopon, miközben a szennyezők megkötődése a lehető legminimálisabb. Vagy pont a meghatározandó anyagok áteresztése az oszlopon, közben a lehető legtöbb zavaró komponens megkötésével. A mintafelvitel során figyelni kell a minta megfelelően lassú áramlására, hogy a megfelelő kölcsönhatások kialakulásához megfelelő idő álljon rendelkezésre. Mosás Az oszlopon gyengébben kötődő szennyezők és a mintamátrix nem kötődő komponenseinek eltávolítása. A mosó oldószer szükségképpen a mintafelvitelinél erősebb, de az elúciós oldószernél gyengébb eluenserősségű, valamint lehetőleg azokkal elegyedő, hogy a kolonna teljes kiszárítását el lehessen kerülni, ami az elválasztás szempontjából kedvezőtlen. Elúció A vizsgálandó komponensek szelektív leoldása az oszlopról. Törekedni kell arra, hogy az elúciót a lehető legkevesebb oldószerrel végezzük, hogy elkerüljük a minta hígulását.
A fejezet elkészítéséhez használt további források: 1. http://www.sci.u-szeged.hu/inorg/mintaelokeszites_szerveskomponensek_2010.pdf 2. http://www.ekol.chem.elte.hu/documents/spe2.pdf 5
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
A megfelelő szorbens kiválasztása A szorbens kiválasztásakor a szilárd fázisú extrakcióhoz (SPE), számításba kell vennünk néhány fizikai és kémiai szempontot. Ezek az alábbiak: A vizsgált vegyület természete. A funkciós csoportok polaritása és savassága meghatározza az anyag oldódását az adott szorbensben. A szolvatált, kötött fázis sajátosságai, mint például a polaritása, illetve a folyadék fázissal való ioncserélő képessége. A vizsgált vegyület és a kötött fázis közötti kölcsönhatások erőssége. A kovalens kötés a legerősebb, ezután sorban csökkenő erősség szerint következik az ionos, a hidrogén, a dipólus, majd a diszperziós kölcsönhatás. Másodrendű kölcsönhatások a vizsgált vegyület, és a kötött fázis között. Kölcsönhatások a minta mátrix komponensei és a kötött fázis között. Sajnos a szilárd fázisú extrakció szelektivitása nem mindig felel meg a kívánt elvárásoknak, mivel a vizsgált vegyületen kívül sok más alkotó is kiextrahálódhat. A vizsgált vegyület és a minta mátrix közötti kölcsonhatások. A különböző szennyezőanyagok adszorpciója befolyásolhatja az SPE hatékonyságát.
A szilárd fázisú extrakció paraméterei A fizikai és kémiai sajátosságok figyelembe vétele után, optimalizálni kell a szilárd fázisú extrakció paramétereit. Hidrofób szorbensek – Általában kötött szilikagél, vagy sztirén-divinilbenzol polimereket, például XAD-2-t, vagy PRP-t használnak. Ion cserélők – A szilika polimerekhez kötött szulfonát, illetve karboxil csoportokat erős illetve gyenge kationos extrakciónál használják. Ionpár mechanizmusok – Az ioncserélő extrakciós kolonnáknál jó alternatíva az ionpár reagensek használata. Normál fázis – A poláris komponensek, apoláris oldatokból való extrakciója szilikagéllel, vagy pl. florisil szorbensekkel történhet, ugyanakkor a retenciót erősen befolyásolja a minta víztartalma. Ligandum csere Méret szerinti elkülönítés – A Sephadex R kolonnák a molekulatömegükben különböző komponensek elkülönítésére használhatók. Egyéb – A Wide-poreR szilárd fázisú etrakciós kolonnákat fehérjék, illetve más nagy molekulatömegű komponensek extrakciójára használhatjuk.
6
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
Áttörési térfogat és retenció A gyakorlatban fontos, hogy a lehető legnagyobb mennyiségű mintát juttassuk át az SPE kolonnán, anélkül, hogy elérnénk az áttörési pontot. Az áttörési térfogat megállapítása azért fontos, mert ez egyfajta biztonsági határt jelenthet a minta adagolásánál. Az áttörési pont meghatározásához tudni kell a szorbens kapacitását, valamint a retenciót. A szorbens kapacitása legfőképp a töltet típusától és a töltet térfogatától függ. Az áttörési térfogat megállapításához jó módszer az áttörési hurok alkalmazása. Az első lépésben a mintát rögtön a detektorba juttatjuk, amíg folytonos jelet nem mérünk. Ezután váltunk át az SPE kolonnára, ilyenkor a detektorjel eltűnik, és a jelet abban a pillanatban kapjuk újra, amikor elértük az áttörési pontot. A detektor jelet az adagolt mennyiség függvényében ábrázolva könnyen le lehet olvasni az áttörési térfogatot valamint a retenciós térfogatot.
Zónaszélesedés az SPE kolonnánál Az on-line technikánál számítani kell a zónaszélesedésre, amikor a koncentrált mintát az SPE kolonnáról a következő kolonnára juttatjuk. A zónaszélesedésben szerepet játszik az SPE kolonna méretezése. Az optimális méret függ az analitikai kolonna térfogatától, elméleti tányérszámtól valamint a dúsítatlan minta kapacitási faktorától a következő egyenlet szerint:
Zónaszélesedést okozhat még a kolonnák részecskeméret különbsége. A harmadik lényeges pont, hogy jól kell megválasztani a különböző szorbensek kombinációját. Nem lehet például alkalmazni SPE kolonnán sztirol-divinilbenzol kopolimert és mellette az analitikai kolonnán C18 módosított szilika állófázist, mivel a polimer sokkal jobban megköti az apoláris összetevőket. Sok esetben még az is problémát jelenthet, ha két azonos típusú C18 állófázisú kolonnának különbözőek a gyártói.
7
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
SPE adszorbensek Az alkalmazható állófázisok nagyon széles skálája áll rendelkezésre a pórusméret, a részecskeméret, a fajlagos felület és a töltet típus szerint. E típusok közül csak a legfontosabbakról teszünk említést. XAD gyanták: Apoláris jellegű adszorbensek. Alkalmazásuk régóta elterjedt, elsősorban a klórozott vegyületek extrakciója esetén. A XAD-1, XAD-2, XAD-3 gyanták polisztiroldivinil-benzol alapú kopolimerek, melyek erősen hidrofób komponensek megkötésére alkalmasak. A XAD-7 és XAD-8 akril észter gyanta, melyek affinitása nagyobb a poláris anyagokhoz. A XAD gyanták nagy előnye, hogy kromatográfiás szempontból a teljes pH tartományban alkalmazhatók, jó a szemcseátmérő eloszlásuk, és hosszú az élettartamuk. Hátrányuk a kisebb hatékonyság, rossz nedvesíthetőség, lassú egyensúly beállás, és nem minden oldószerrel kompatibilisek. Módosított szilikagél: Legelterjedtebb töltetek a különböző kémiailag módosított szilikagélek, melyek eltérő tulajdonságú, polaritású csoportokat tartalmaznak, ezek lehetnek pl. fenil, aminopropil, benzolszulfonsav, alkil, stb. Kiemelt szerep jut a C8 és C18 alkillánccal módosított szilikagéleknek, melyeket a különböző klórozott vegyületek, peszticidek meghatározása esetén gyakran alkalmaznak. Ioncserélő gyanták: Erősen poláris, könnyen ionizálható vegyületek dúsítására alkalmasak. Savas jellegű vegyületek és anionok esetén anion cserélő, bázikus vegyületek és kationok esetén kation cserélő gyantákat alkalmazunk Egyéb adszorbensek: zeolit, grafitizált szén, florisil, alumínium-oxid, politertrafluoretilén (teflon), polipropilén, stb.
A mintaelőkészítés off-line, illetve on-line kialakításai Off-line kialakítás Az off-line technikák lényege, hogy a mintaelőkészítés térben-időben elkülönül a meghatározástól. Ez a módszer rendszerint egyszerűbb technikai megoldásokat igényel, de általában időigényesebb és nagyobb a hibalehetőség. Az off-line szilárd fázis extrakcióhoz elsősorban egy speciális kolonnára (SPE kolonna v. cartridge) van szükségünk. Számos különböző előre gyártott típusa kapható, de akár magunk is készíthetünk. Az SPE kolonna vázlatos felépítése az X. ábrán látható. A kolonnák legfontosabb része a töltet, amely különböző féle lehet, amelyek különböző anyagok elválasztására alkalmasak. Aktiválás és kondicionálás után a mintánkat keresztülhajtjuk 2. ábra: Az SPE kolonna a kolonnán. A hajtóerő lehet a gravitáció, de alkalmazhatunk felépítése felülről nyomást vagy alulról vákuumot is. Mosás után a megfelelő oldószerrel leoldjuk a meghatározandó komponenst. A kolonnáról lejövő extraktumot ezután manuálisan visszük át az analitikai kolonnára. 8
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
A módszer előnye, hogy akár több cartridge-al is dolgozhatunk egyszerre, illetve egy cartridge-ról akár több frakciót is kinyerhetünk. On-line kialakítás Az on-line technikák lényege, hogy a mintaelőkészítés és a mérés térben-időben együtt történik. A módszer nagy előnye az automatizálhatóság, kevesebb élőmunka igény, kisebb hibalehetőség és általában gyorsabb. Hátránya viszont, hogy legtöbbször bonyolultabb műszereket igényel. Az on-line szilárd fázis extrakcióhoz az SPE kolonnán kívül szükség van még egy vagy több nagy nyomású váltó szelepre, oldószerválasztó szelepre, kiegészítő szivattyúra. Az extrakció első négy lépése, az aktiválás, a kondicionálás, a mintafelvitel és a mosás során a kolonnáról lejövő oldószerekre, ill. a mintamátrixra nincs szükségünk, ezért ezek „mennek a kukába”. A leoldási lépés előtt a szelep átvált és a leoldott mérendő komponens így egyből az analitikai kolonnára jut. Nagyon fontos, hogy on-line kialakítás esetén a lehető legkisebb oldószer mennyiséggel dolgozzunk, hogy elkerüljük a zónaszélesedést! Ezen kívül fontos még, hogy a cartridge-ok könnyen cserélhetők legyenek.
Kation-cserélő oszlopok Erősen poláris és ionos komponensekhez a legcélszerűbb ion-cserélő anyagokat használni, az elválasztásra. Erre egy példa a poláris anilinek előkoncentrálása kation cserélőn az LC analízis előtt. A módszer alkalmazható szennyezett felszíni víz minták nyomnyi komponens meghatározására. Egy másik példa egy ipari szennyvízből kiválasztott 29 szennyezőanyag online elválasztása és nyomnyi dúsítása. A módszerhez kisméretű oszlopokat kötnek sorba, amelyekben a töltetek sorban: C18(szilikagél), PRP1(divinil-benzol-sztirol-kopolimer) és kation cserélő. A nem-poláris összetevők a C18-as oszlopon maradnak, a közepesen-poláris összetevők a PRP1 oszlopon kötődnek meg és a maradék 11 komponens az ion-cserélőn. Minden oszlopot külön-külön acetát pufferrel oldanak le és C18-as oszlopon választják el. A kromatogramon először az ioncserélőről lejött komponensek jelennek meg, a következő a PRP1-es oszlopon megkötöttek, végül pedig a C18-as oszlop komponensei. A módszer előnye, hogy az oszlopok használatával nő a szelektivitás. De problémák is vannak a módszerrel amiket meg kell oldani. Ilyen probléma, hogy a polimer alapú ioncserélő gyanták a hidrofób tulajdonságaik miatt az apoláris komponenseket is megkötik a felszínen, így csökkentve a kapacitást. Egy másik probléma lehet a zavaró kationok jelenléte, amik megkötik a szabad helyeket, így szintén csökkentve a kapacitást.
9
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
Anion-cserélő oszlopok A szelektív on-line anion cserélő nyomnyi dúsításra alkalmazhatóságát a fenol nyomnyi meghatározásán mutatták be. Nagyon nehéz megoldani a fenol koncentrálását kis méretű C 18as vagy PRP1-es töltetű oszlopokkal. A poláris tulajdonságai miatt hosszú oszlopot kell használnunk, a szelektivitás pedig gyakran kicsi. A fenol magas pH-n anionként viselkedik, így kisebb oszlopon is meg lehet kötni erősen bázikus anioncserélő gyantán. A fenolt először egy hosszú PRP1 oszlopon kötik meg. Ekkor a nem megkötött erősen poláris anionokat leválasztják és eltávolítják. Ezután az oszlopról szelektíven leoldják magas pH-n a fenolt és egy rövid anion cserélő oszlopon kötik meg. Erről acetát pufferrel oldják le és C18-as oszlopon választják szét. A detektálást fluoreszcenciával végezik. Előnye, hogy a mérés rendkívül szelektív, nagy az érzékenysége (század ppb-s tartományig tart a kimutatási határ). Az anionos zavaró hatások megjelennek itt is, hiszen a többi anionnal verseny alakul ki a szabad helyekért. Alkalmazható például folyóvíz mintákra vagy csapvíz mintákra.
Fémes töltetű SPE oszlopok A minta előkészítés, illetve előkoncentrálás során növelhető a szelektivitás, amennyiben az elő-kolonna töltetét fémekkel egészítik ki. Ebben az esetben a töltetek fémtartalmának igen szelektív komplexképzési hajlamát használják ki. Több fém alkalmazható elő-kolonnákban, ezekre adunk néhány példát: higany – elsősorban tiolok előkoncentrálására alkalmazták sikerrel platina – alkalmazásával a mátrix zavaró fenil-amin komponensei sikeresen megköthetőek az oszlopon ezüst A platina tartalmú töltet sikeres alkalmazását fenil-karbamid növényvédőszerek folyóvízből való kimutatásánál mutatták be. A fenil-amin mátrixkomponensek általában erősen rontják az elválasztás érzékenyéségét. Az SPE-oszlopon platinával való komplexképzéssel megköthetőek voltak a zavaró komponensek, míg az áthaladó minta egy C 18-as elő-kolonnán koncentrálódot. A mérés érzékenysége így drasztikusan növekedett. Hátrányok: A szelektivitás növekedésében megjelenő előnyök ellenére a fémes töltetek alkalmazását korlátozza néhány tulajdonságuk. Egyrészt a fémes töltetű oszlopok on-line regenerálására nem állnak rendelkezésre olyan technikák, melyek bevezethetőek a gyakorlatba. Továbbá körültekintően kell eljárni alkalmazásuk során, ugyanis a mátrix azon összetevői, melyek magasabb komplexképződési együtthatóval rendelkeznek az analátnál, erősen befolyásolhatják a mérési eredményeket. Az utóbbi probléma dupla SPE oszlopos rendszerekkel hidalható át, melyekben először egy nagyobb, nem szelektív oszlopon kiválasztják az interferenciát okozó anyagok többségét. Ezután engedik rá a szelektív, fémtartalmú SPE oszlopra a mintát, ahol megtörténik a mérendő komponens előkoncentrálódása. 10
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
Az oszlopok méretcsökkentése Szűk keresztmetszetű kolonnák (0,3-1 mm) alkalmazásával a folyadékkromatográfiában drasztikusan csökkenthető az oldószerszükséglet, ami mind gazdaságossági, mind környezeti szempontból előnyös. Ilyen esetben a kolonnára juttatott kis mintamennyiségből (0,05-1 µl) és csökkenő úthosszból kifolyólag azonban csökken az érzékenység. A nyomnyi mennyiségek vizsgálata szűk keresztmetszetű kolonnákban ezért nehéz feladat. A probléma megoldását a minta előkoncentrálása jelentheti, ehhez azonban olyan miniatürizált SPE oszlopokra van szükség, amelyek kompatibilisek a kis átmérőjű kolonnákkal. Ilyen megoldások eleinte csak off-line mintaelőkészítéssel voltak elérhetőek. Itt a mintát – átáramoltatva az oszlopon – adszorbeáltatták, majd rákötötték a kis belső átmérőjű kolonna bemenetére és „belemosták” megfelelő eluenssel. A miniatürizált on-line mintaelőkészítésre a „T-kialakítás” jelentett megoldást:
3. ábra: Az on-line „T kialakítás” sematikus vázlata
11
Környezetvédelmi analitika II
SPE - LC
4. ábra: Az on-line mintaelőkészítés lépései a A minta-hurkot kiöblítik vízzel, majd beleviszik a mintán b A mintát átáramoltatják az oszlopon, az analát adszorbeálódik c Lezárják a „V” szelepet, így a minta a mozgó fázissal az analitikai kolonnára jut
Az ilyen módszerrel történő on-line mintaelőkészítés nem növeli a kolonnán kívüli zónaszélesedést, a minta visszanyerés 90% fölötti. Folyamatos anyagáram hiányában azonban a kolonna elméleti tányérszáma a felére csökken
12
