Növényélettani Gyakorlatok A légzés vizsgálata /Bevezető/
Fotoszintézis Fény-szakasz: Sötétszakasz:
C5 C6
O2, NADPH, ATP
C6
2 C3 (-COOH)
C5 CO2
Cellulóz
Pentóz-P út Aminosav/fehérje anyagcsere
Pi C6
Glikolízis 2 piruvát C3+C3 C6 ATP
Tejsavas erjedés
Etanolos erjedés
NADPH
2 C3 (-CHO)
keményítő
Szaharóz
Nukleotid/nukleinsav anyagcsere
2 CO2
2 NADH
Anaerob anyagcsere
2 AcKoA C6
2 CO2 2 NADH
2 ATP 2 NADH
A redukált koenzimek oxidációja
Zsírsav szintézis /bontás
Citrát-ciklus
C4 Mitokondriális
28 ATP
Cianid-rezisztens, vagy alternatív végoxidáz
O2
Direkt végoxidázok -Glikolsavoxidáz -Polifenol-oxidáz -Aszkorbinsav-oxidáz
2 ATP 6 NADH 2 FADH2
v lutársa 2-oxog
Citokróm típusú végoxidáz: Cit-aa3 komplex
Extramitokondriális 4 CO2
Aminosav/fehérje anyagcsere
Légzésintenzitás mérése O2-elektróddal (27. gyakorlat) 1. O2-elektród kalibrálása 2. Búzagyökerek inkubálása 15 percig 50 ml-ben: - CaSO4 oldat - légzésgátlók (fluoroecetsav, monojódecetsav, Na-azid) - e--transzportlánc-szétkapcsoló (2,4-dinitrofenol:DNP) 3. Mérőküvettába helyezés: 1/2-1 percenként leolvassuk az O2-tartalom változását 4. Légzésintenzitás ábrázolása: mg (O2) / g (friss tömeg)×óra [mg/g×h]
Légzésintenzitás mérése Winkler-módszerrel (28. gyakorlat) Winkler-módszerrel az oldat O2-tartalma határozható meg: az eredeti és az inkubált oldat O2-tartalmának különbsége. 1. Búzagyökerek inkubálása (1-3 g) 1 óráig Winkler-csövekben: - CaSO4 oldat - légzésgátlók (fluoroecetsav, monojódecetsav, Na-azid) - e--transzportlánc-szétkapcsoló (2,4-dinitrofenol:DNP) - különböző hőmérsékleten Csövek buborékmentes lezárása! 2. Ismert térfogatú folyadéküveg megtöltése az oldattal. 3. Jodometriás reakciók elvégzése. Elveszett térfogatokkal korrigálni! 4. Titrálás: Na2S2O3-tal keményítő-indikátor mellett. 5. Légzésintenzitás megadása: μg (O2) / g (friss tömeg)*óra [μg/g×h]
- O2 diffúzió - Levegőbuborék - Gyökerek eredete, felülete - …..?
Légzésgátlók Monojódecetsav: citoplazma -- glikolízis SH-csoport tartalmú enzimei (pl. glicerinaldehid-3P-dehidrogenáz) Fluoroecetsav: mitokondrium -- citrát-ciklus akonitáz enzime (citrát-izocitrát átmenet, fluorocitráttá alakulás) Na-azid, CO és cianid: mitokondrium – terminális oxidáció citokróm típusú végoxidáza (Cit aa3) - Gátlás erősségének sorrendje? - Mekkora a légzési szubsztrátok bejutásának lehetősége a légzési láncba a gátlás utáni szakaszon?
Fotoszintézis Fény-szakasz: Sötétszakasz:
C5 C6
O2, NADPH, ATP
C6
2 C3 (-COOH)
C5 CO2
Cellulóz
Pentóz-P út Aminosav/fehérje anyagcsere
Pi C6
Glikolízis 2 piruvát C3+C3 C6 ATP
Tejsavas erjedés
Etanolos erjedés
NADPH
2 C3 (-CHO)
keményítő
Szaharóz
Nukleotid/nukleinsav anyagcsere
2 CO2
2 NADH
Anaerob anyagcsere
2 AcKoA C6
2 CO2 2 NADH
2 ATP 2 NADH
A redukált koenzimek oxidációja
Zsírsav Szintézis /bontás
Citrát-ciklus
C4 Mitokondriális
28 ATP
Cianid-rezisztens vagy alternatív végoxidáz
O2
Direkt végoxidázok -Glikolsavoxidáz -Polifenol-oxidáz -Aszkorbinsav-oxidáz
2 ATP 6 NADH 2 FADH2
v lutársa 2-oxog
Citokróm típusú végoxidáz: Cit-aa3 komplex
Extramitokondriális 4 CO2
Aminosav/fehérje anyagcsere
Szétkapcsoló 2,4-dinitrofenol (DNP): mitokondrium -- a terminális oxidáció e--transzportláncát és az oxidatív foszforilációt kapcsolja szét (a membrán proton-áteresztő képessége megnő) - DNP nagy koncentrációban már gátolhat (membrándezintegráció). - Hogyan változik az elektrontranszportra kifejtett akceptorkontroll?
Glikolsavoxidáz aktivitás mérése (29. gyakorlat) Calvin - ciklus
Fotorespiráció (Glikolát- ciklus)
ribulóz-1,5-P2
CO2
glicerinsav-3-P2
glikolsav
O2
CH2-OH
O2
COOH
H2O2
Glikolsav-oxidáz
glioxálsav
COH COOH
A glikolsavoxidáz: - Flavin (FMN) koenzim - H2O2 képzés - Peroxiszóma, glioxiszóma - Szintézise fényindukált (fitokróm indukció) - Öregedéskor, fertőzéskor csökkenő aktivitás - Glioxálsav glikolsav (glioxálsav-reduktáz, NADH vagy NADPH) Glikolsav NADP NAD
O2 Glikolsav oxidáz
Glioxálsav reduktáz
H2O2
NADPH NADH Glioxálsav
Gyakorlat: 1. 2. 3. 4.
Enzimkivonás foszfát pufferben. Reakcióelegyek (kezelések) összemérése. Reakció leállítása 10-15 perc múlva triklórecetsavval. Színreakció elvégzése: a glioxálsav mennyisége arányos a színes termék mennyiségével. 5. Glioxálsav mennyisége: standard kalibrációs görbe alapján, enzimaktivitás: nmol glioxálsav / g (friss tömeg)* 10 perc. Kezelések: - Fényen / sötétben nevelt (etiolált) levelek - Hozzáadott FMN-t tartalmazó / nem tartalmazó reakcióelegy Hol várható az aktivitás emelkedése?
Direkt végoxidázok indukált szintézisének vizsgálata öregített raktározó szövetben (30. gyakorlat) Károsodást követő sebzési légzés oka: egyes direkt végoxidázok indukált szintézise és aktivitásának emelkedése.
Gyakorlat: polifenol-oxidáz vizsgálata. 1. Enzimkivonás különböző növények raktározószöveteiből foszfát pufferben. 2. L-DOPA adása. 3. Extinkció-változás követése spektrofotométerrel percenként.
Barna polimer. (Barnulási reakció)
- Növényi rezisztencia. - Lokális léziók, hiperszenzitív reakció. - Redukált koenzimek visszaoxidálása: NAD(P)H-kinon-oxidoreduktáz enzim.
Enzimreakció kinetikájának jellemzése E (480 nm)
m1
Minta1
m2
ΔE = lεΔC ΔE/t ≈ ΔC/t = V0 (kezdeti reakció sebesség) Minta1
Idő (perc)
