NOVÁ METODA qpcr GENOTYPIZACE Z PERIFERNÍ LIDSKÉ KRVE U HEREDITÁRNÍ TROMBOFILIE

Vyšší odborná škola,    střední odborná škola a základní škola MILLS, s.r.o.  Čelákovice       

NOVÁ METODA qPCR GENOTYPIZACE  Z PERIFERNÍ LIDSKÉ KRVE U HEREDITÁRNÍ  TROMBOFILIE    Diplomovaný zdravotnický záchranář         

Vedoucí práce:                                                              Vypracoval:   MUDr. et. RNDr. Petr Wagner                                    Lukáš Kocanda                       

Čelákovice 2012     

                                             

   

                           

Čestné prohlášení  Prohlašuji,  že  jsem  absolventskou  práci  vypracoval  samostatně  a  všechny  použité  písemné  i  jiné  informační  zdroje  jsem  řádně  citoval.  Jsem  si  vědom,  že  doslovné  kopírování  cizích  textů  v rozsahu  větším  než  je  krátká  doslovná  citace  je  hrubým  porušením  autorských  práv  ve  smyslu  zákona  121/2000  Sb.,  je  v přímém  rozporu s interním předpisem školy a je důvodem pro nepřipuštění absolventské práce  k obhajobě.    01. 04. 2012  Praha  Lukáš Kocanda                                                         

 

 

 

 

 

 

   

 

 

…………………………………….. 

                                 

 

Poděkování  Děkuji  vedoucímu  práce  MUDr.  et  RNDr.  Petru  Wagnerovi  a  konzultantům  RNDr.  Petru  Dráberovi,  DrSc.  a  RNDr.  Petru  Matouškovi,  PhD.    za  odborné  vedení  a  vřelý  přístup  k  absolventské  práci.  Dále bych  chtěl poděkovat  Hematologicko‐transfúznímu  oddělení Oblastní nemocnice Kladno za poskytnutí kazuistik pacientů. Mé poděkování  patří i všem blízkým z laboratoře Signální transdukce Ústavu molekulární genetiky AV  ČR, v.v.i za podporu a trpělivost během vypracování mé práce.        

OBSAH  1 

ÚVOD ....................................................................................................................... 10 

2 

CÍLE PRÁCE ............................................................................................................... 11  2.1  

HLAVNÍ CÍLE .......................................................................................................... 11 

2.2 

 DÍLČÍ CÍLE ............................................................................................................ 11 

TEORETICKÁ ČÁST ........................................................................................................... 12  3 

HISTORIE PCR ........................................................................................................... 12 

4 

KVANTITATIVNÍ PCR (QPCR) .................................................................................... 13 

5 

6 

4.1 

DETEKČNÍ SYSTÉMY ................................................................................................ 14 

4.2 

ANALÝZA KŘIVKY TÁNÍ ............................................................................................. 15 

PRINCIPY A CYKLOVÁNÍ QPCR ................................................................................. 15  5.1 

KOMPONENTY PCR ................................................................................................. 16 

5.2 

PCR INHIBITORY ..................................................................................................... 17 

KREV ......................................................................................................................... 17  6.1 

KREVNÍ PLAZMA ..................................................................................................... 17 

6.2 

ČERVENÉ KRVINKY .................................................................................................. 18 

6.2.1  Hemoglobin .................................................................................................. 18  6.3  BÍLÉ KRVINKY – LEUKOCYTY ...................................................................................... 18  6.4 

KREVNÍ DESTIČKY – TROMBOCYTY .............................................................................. 19 

6.5 

KREVNÍ SKUPINY .................................................................................................... 19 

6.6 

FYZIOLOGIE HEMOSTÁZY .......................................................................................... 20 

7   HEREDITÁRNÍ TROMBOFILIE .................................................................................... 21 

8 

7.1 

MUTACE FAKTORU V LEIDENU A FAKTORU II PROTROMBINU ............................................ 21 

7.2 

MUTACE MTHFR A VZTAH K HOMOCYSTEINU ................................................................ 22 

GENOTYPIZACE ........................................................................................................ 23  8.1 

IZOLACE DNA ........................................................................................................ 23 

8.1.2  Příklad ‐ Izolace DNA komerčními kity ......................................................... 24  8.1.3  Příklad ‐ Izolace DNA fenol‐chloroformovou metodou ................................ 24  PRAKTICKÁ ČÁST ............................................................................................................. 26  9 

CHARAKTER NOVÉ METODY QPCR .......................................................................... 26   

 

9.1 

ODBĚR KRVE A NÁSLEDNÁ KOMPATIBILITA REAKČNÍCH SMĚSÍ PRO QPCR ............................. 27 

9.2 

NOVÁ METODA QPCR PRO LABORATORNÍ ÚČELY ........................................................... 28 

9.2.1  Srovnání antikoagulancií v metodách qPCR a PCR ....................................... 28  9.2.2   Použitelnost periferní krve pro genotypizaci laboratorních myší ................ 30  10  POUŽITELNOST NOVÉ METODY QPCR U ANALÝZ DĚDIČNÝCH MUTACÍCH ‐  HEREDITÁRNÍ TROMBOFILIE ........................................................................................... 31  10.1 

DETEKCE PRIMERŮ, GENOTYPIZACE, POUŽITELNOST X % KRVE VE VZORKU .......................... 31 

10.2 

DETEKCE  A  GENOTYPIZACE  JEDNOBODOVÉ  MUTACE 

1691G>A 

LIDSKÉHO  GENU  PRO  FV  

LEIDENSKÁ MUTACE ........................................................................................................... 32 

10.3 

DETEKCE  A  GENOTYPIZACE  JEDNOBODOVÉ  MUTACE 

20210G>A 

LIDSKÉHO  GENU  PRO  FII 

PROTROMBIN ................................................................................................................... 34 

11  TROMBOFILNÍ STAVY V ŽILNÍ TROMBOEMBOLICKÉ NEMOCI (TEN) ....................... 35  11.1 

INDIKACE VYŠETŘENÍ TROMBOFILIÍ ............................................................................. 37 

12  KAZUISTIKA PACIENTŮ S TROMBOEMBOLICKÝM ONEMOCNĚNÍM ZPŮSOBENÉ  RIZIKOVÝMI FAKTORY HT ................................................................................................ 39  12.1 

KAZUISTIKA Č. 1 – PACIENT 34 LET, FV LEIDEN A F II PROTROMBIN MUTACE ....................... 39 

12.2 

KAZUISTIKA Č. 2 – PACIENTKA 35 LET, FV LEIDEN MUTACE .............................................. 40 

12.3 

KAZUISTIKA Č. 3 – PACIENTKA 20 LET, FV LEIDEN MUTACE .............................................. 40 

12.4 

KAZUISTIKA Č. 4 – PACIENT 37 LET, FV LEIDEN MUTACE ................................................. 41 

12.5 

KAZUISTIKA Č. 5 – PACIENT 53 LET, FV LEIDEN MUTACE ................................................. 42 

12.6 

KAZUISTIKA Č. 6 – PACIENTKA 39 LET, F II PROTROMBIN MUTACE .................................... 43 

12.7 

KAZUISTIKA Č. 7 – PACIENT 21 LET, FV LEIDEN MUTACE ................................................. 44 

12.8 

KAZUISTIKA Č. 8 – PACIENTKA 38 LET, FV LEIDEN MUTACE .............................................. 44 

12.1.2 Hodnocení kazuistik ...................................................................................... 45  13   DISKUZE ................................................................................................................... 46  14   ZÁVĚR....................................................................................................................... 47  15  SUMMARY ............................................................................................................... 48  SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ....................................................................................... 49    Příloha 1a – 1b  Příloha 2     

Seznam zkratek   

ALT – Alanin transamináza  AST – Aspartáttransamináza  ATP – Adenosintrifosfát  BAS – Bazofily  BILC – Bilirubin total  cDNA – Komplementární deoyribonukleová kyselina  CT – Práh cyklu  dATP – Deoxyadenosintrifosfát  dCTP – Deoxycytidintrifosfát  dGTP – Deoxyguanosintrifosfát  DNA – Deoxyribonukleová kyselina  dNTP – Deoxyribonukleotid trifosfát  dTTP – Deoxythymidintrifosfát  ECT – Extracelurární tekutina  EDTA K – Draselná sůl kyseliny etylendiamintetraoctové  F IX – Serinová proteáza  FR – Fyziologický roztok  F VIII – Plazmatický glykoprotein  F X – Trombokináza  F XI – Plazmatický předchůdce tromboplastinu  F XIII – Fibrin stabilizující faktor  FII20210G – Primer na detekci F II Protrombinu, alela guanin   FII20210A – Primer na detekci F II Protrombinu, alela adenin  FV506Q(A) – Primer na detekci FVL, alela adenin  FV506R(G) – Primer na detekci FVL, alela guanin  FVL – Faktor V Leiden  G/A – Guanin / Adenin  G/C – Guanin / Cytosin  Glu – Glukóza     

GMT – Glutamatdehydrogenéza  HAK – Hormonální antikoncepce  Hb – Hemoglobin  Ht – Hematokrit  HT – Hereditární trombofilie  HRM – Higth‐Resolution melting   Hz – Heterozygot  CHOL ‐ Cholesterol  ICT – Intracelurární tekutina  KCl – Chlorid draselný  kDa – Kilodalton   Lym – Lymfocyty  M – Marker   MCV – Střední objem erytrocytů  MgCl2 – Chlorid hořečnatý  MgSO4‐ Siřičitan hořečnatý  MCH – Střední hmotnost erytrocytů  MCHC – Střední koncentrace Hb v erytrocytech  Mo ‐ Monocyty  MPV – Střední objem destičky  mRNA – Messenger RNA (jednovláknová nukleotidová kyselina)  Neu ‐ Neutrofily  NH4(2SO4) – Síran amonný  PCR – Polymerázová řetězová reakce  PDW – Distribuční křivka destičky  PLT – Trombocyty  qPCR – Kvantitativní PCR  RBC – Erytrocyty  RDW – Distribuční křivka erytrocytů  RNA – Ribonukleová kyselina  RT‐PCR – Reverzně‐Transkripční PCR  SDS – Dodecylsulfát sodný     

T F – Tkáňový faktor  T04P2 – 0,4 M trehalóza, 2 M propandiol   TEN – Tromboembolické onemocnění  TM – Teplota tání  UMG AV ČR, v.v.i. – Ústav molekulární genetiky Akademie Věd České republiky  UREA ‐ Močovina  WBC – Leukocyty  WT – Wild‐type                                                    

 

1 

Úvod  Polymerázová  řetězcová  reakce  (PCR),  z anglického  slova;  Polymeraze  chain 

reaction,  je  široce  využívaný  způsob  klonace  fragmentů  DNA.  Na  rozdíl  od  klasického  způsobu, spočívajícího ve vpravení (ligaci) studovaného úseku DNA do plasmidu, v jeho  následném vpravení do bakterií a množení bakterií, a tedy i plasmidu, v podmínkách in  vivo, PCR představuje zásadně novou kvalitu klonace úseků DNA v podmínkách in vitro.  Velikost  a  nukleotidové  složení  fragmentu  DNA,  amplifikovaného  pomocí  PCR,  jsou  určeny matricí (například úsek DNA, který se nachází v tak komplexním prostředí jakým  je  celá  genomová  DNA)  a  dvěma  oligonukleotidovými  očky  (primery),  které  se  specificky vážou na matrici a vymezují oblast amplifikace.  Metodou  PCR  se  často  používá  izolovaná  DNA  z lidské  krve  pomocí  genotypitaze,  jechž  je  metoda  určení  genetické  výbavy,  respektivě  genetických  (DNA)  informací,  týkající  se  zkoumaného  znaku  či  znaků.  Tato  metoda  se  využívá  v celé  řadě  diagnostických  stanovení  jako  například  určování  přítomnosti  mutantních  genů  (především v onkologii), detekce virových a bakteriálních infekcí a určování otcovství.  Kromě určování přítomnosti genu (kvalitativní testy) je možné stanovit také počet kopií  studovaného genu metodou kvantitativní RT‐PCR, z anglického slova; Real time.             Kvantitativní  polymerázová  řetězová  reakce  (označována  také  qPCR,  z anglického  slova;  quantitative)  je  metoda  založena  na  principu  klasické  PCR,  umožňující  však  kvantifikaci  sledovaného  úseku  DNA.  Na  rozdíl  od  běžné  PCR,  kde  se  analyzuje  až  výsledný  produkt  (amplifikovaná  DNA)  pomocí  elektroforézy  v agarovém  gelu,  je  při  qPCR  zaznamenáván  každý  cyklus  PCR  ve  skutečném  čase.  Záznam  amplifikace  je  založen na principu fluorescence, kdy se používají sondy (fluorescenční látky), které se  váží specificky nebo nespecificky na amplifikované DNA.  Problémem  při  řadě  těchto  stanovení  je  nutnost  izolace  DNA  z krve,  která  představuje časovou i finanční zátěž. Amplifikace DNA přímo z krve s využitím běžných  metod  PCR  není  možná,  neboť  krev  obsahuje  řadu  komponent,  které  inhibují  PCR/qPCR.  Jedná  se  především  o  imunoglobuliny  a  hemoglobin,  které  inhibují  amplifikační reakci i v malých množstvích.  10   

 

2 

Cíle práce 

2.1   Hlavní cíle    

Charakteristika nové metody qPCR pro genotypizaci z periferní lidské krve  Ověření  použitelnosti  qPCR  z celé  krve  u  detekce  a  genotypizace               jednobodových mutací Faktoru V Leidenu a Faktoru II Protrombinu       Trombofilní  stavy  v žilní  tromboembolické  nemoci  a  příkladné  kazuistiky               pacientů s rizikovými faktory způsobující TEN 

2.2 

 Dílčí cíle 

 

Kompatibilita reakčních směsí s qPCR  Nová metoda qPCR pro laboratorní účely                           11   

 

TEORETICKÁ ČÁST   3 

Historie PCR  Amplifikace  fragmentů  DNA  pomocí  PCR  je  laboratorní  metodou  využívající 

molekulárně‐genetické přístupy, jak na úrovni základního výzkumu, tak i diagnostické  praxe.  Tuto  metodu  objevil  roku  1983  Dr.  Kary  Banks  Mullis,  který  pracoval  pro  společnost Cetus Corporation, v souvislosti s analýzy mutací DNA. Myšlenkou Dr. Kary  B. Mullise bylo amplifikovat jednotlivé úseky DNA pomocí přepisu a zmnožení DNA za  krátkou  dobu.  Později  se  k  Dr.  Mullisovi  připojili  i  zaměstnanci  společnosti  Cetus  Co.  Část  týmu  tvořili  vědci,  kteří  se  zabývali  diagnostikou  DNA  a  identifikací  mutací  lidského  genomu.  První  článek  popisující  tuto  metodu  byl  publikován  v  roce  1985  v  časopise  Science.  Pracovní  postup  byl  následující:  malé  množství  DNA  obsahující  požadovaný  gen,  skupina  volných  oligonukleotidů  a  primery  se  vložily  do  zkumavky,  která se zahřála na teplotu 100 °C a poté zchladila. Ke směsi se následně přidala DNA  polymerasa  a  tím  došlo  k  syntéze  DNA.  Proces  zahřátí  a  zchlazení  se  několikrát  opakoval.  Vzhledem  k  tepelné  denaturaci  DNA  polymerasy  ji  bylo  nutné  přidat  k  reakční směsi před každým cyklem.   Tento  proces  zajišťoval  mnohonásobnou  amplifikaci  úseku  DNA  a  jeho  snadnější  detekci.  Avšak  tento  postup  byl  velmi  neefektivní,  jelikož  vyžadoval  neustálou  pozornost  a  byl  časově  náročný.  Dalším  problémem  byla  spotřeba  DNA  polymerásy,  která  se  vždy  vkládala  do  zkumavky  před  jednotlivým  procesem  amplifikace,  a  tím  se  zvyšoval  koeficient  kontaminace  vzorku.  Proto  bylo  vynaloženo  velké úsilí na konstrukci termocykléru a DNA polymerásy, která by byla termostabilní.  Konstrukce termocykléru vznikla za spolupráce se společností PerkinElmer. Podařilo se  také  získat  termostabilní  DNA  polymerasu,  izolovánou  z  bakterie  Thermus  aquaticus  žijící  v  termálních  pramenech  v  Yellowstonenském  národním  parku.  Spojení  termocyklerů  a  termostabilní  DNA  polymerasy  učinilo  tuto  metodu  plně  automatizovatelnou a nyní vyžaduje obsluhu při přípravě reakční směsi, zapnutí a poté  vypnutí přístroje.  

12   

 

Díky těmto vylepšením se metoda stala také citlivější a přesnější. Technika PCR  byla patentována firmou Cetus 28. července 1987 a jako hlavní vynálezce byl uveden  Dr. Mullis.   

4 

Kvantitativní PCR (qPCR)  qPCR  je  moderní  technika  umožňující  rychlou,  spolehlivou  a  citlivou  detekci  a 

kvantifikaci specifického úseku DNA nebo RNA.   Real‐time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce  přímo během reakce „v reálném čase" pomocí fluorescenčních sond nebo barviv, které  detekují  množství  PCR  produktu  během  reakce  zvýšením  své  fluorescenční  aktivity.  Real‐time  PCR  se  provádí  pomocí  přístrojů  zvaných  cyklery,  které  umožňují  jak  provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu.  Fluorescence  je  měřena  během  každého  cyklu  PCR  a  její  intenzita  je  úměrná  množstvím  amplifikátu  přítomného  v  reakční  směsi.  Kvantifikace  se  provádí  prostřednictvím  matematické  analýzy  amplifikačních  křivek  vzniklých  vynesením  naměřené fluorescence oproti pořadovému číslu příslušného cyklu.  Amplifikační křivka má esovitě zakřivený tvar a lze ji rozdělit na 3 části:   1) pozadí „background“ fázi: amplifikátu je málo a jeho fluorescence ještě nedosahuje  měřitelných hodnot   2) exponenciální fáze: množství produktu exponenciálně roste (trvá asi 4‐8 cyklů)   3) fáze plató: dochází k saturaci systému, množství amplifikovaného produktu se dále  nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní.   

 

 

 

Používané  matematické  modely  pracují  s  hodnotou  zvanou  CT  („threshold  cycle"),  která  se  rovná  cyklu,  kdy  amplifikační  křivka  překročí  zmíněný  fluorescenční  práh na počátku exponenciální fáze reakce. 

13   

 

Absolutní kvantifikace se používá např. u detekce specifických mikroorganismů.  Je založena na zjištění existujících lineárních vztahů mezi logaritmem startovního počtu  templátových kopií a CT příslušné amplifikační křivky. Pokud tedy amplifikujeme vzorek  o  neznámé  koncentraci  společně  se  sérií  standardů  o  známé  koncentraci,  získáme  kalibační  přímku  („standard  curve"),  ze  které  lze  odečíst  výchozí  koncentraci  neznámého vzorku.  Relativní kvantifikace se používá ke stanovení míry genové exprese. Porovnává  se  tzv.  relativní  změna  genové  exprese  neboli  relativní  expresní  poměr  v  testovaném  vzorku  oproti  kontrolnímu  vzorku.  CT  amplifikační  křivky  daného  genu  se  vždy  normalizuje  oproti  CT  „housekeeping“  genu    [Základní  principy  kvantitativní  real‐time  PCR, 13]   

4.1 

Detekční systémy 

Prvními látkami používanými pro detekci akumulace produktu během real‐time  PCR  reakce  byla  interkalační  barviva  (ethidium  bromid,  SYBR  Green  I),  jejichž  fluorescenční aktivita vzrůstá po vazbě na dvouřetězcovou DNA. Vzhledem k tomu, že  během PCR vzniká dvouřetězcový produkt, jehož množství zpravidla výrazně převyšuje  počáteční  množství  dsDNA  (z  anglického  slova;  „double  standart“),  lze  pomocí  interkalačních barviv sledovat průběh amplifikace.  Velkou  nevýhodou  interkalačních  barviv  je  skutečnost,  že  detekují  veškerou  dsDNA  přítomnou  v  reakční  směsi  včetně  nespecifických  produktů  amplifikace  (jako  jsou  např.  tzv.  primer‐dimer  artefakty),  které  i  při  velmi  pečlivé  optimalizaci  metody  velmi  často  vznikají.  Specifita  detekce  je  navíc  dána  pouze  sekvencemi  primerů.  Elegantní  řešení  co  se  týče  detekce  nespecifických  produktů  nabízejí  často  využívané  oligonukleotidové  sondy.  Jedná  se  o  fluorescenčně  značené  oligonukleotidy,  které  hybridizují s určitou cílovou sekvencí uvnitř amplifikovaného regionu a výrazně přitom  zvyšují  svou  fluorescenční  aktivitu.  Jejich  výhodou  je  vysoká  specifita,  jelikož  detekce  cílové  sekvence  probíhá  ve  2  stupních  ‐  na  úrovni  vazby  primerů  a  rovněž  na  úrovni  vazby sondy  [Základní principy kvantitativní real‐time PCR, 13]   

14   

 

 

4.2 

Analýza křivky tání 

Analýza  křivky  tání  je  metoda,  která  se  používá  po  ukončení  qPCR  ke  zjištění  povahy  produktů  PCR.  Ve  spojení  s  oligonukleotidovými  sondami  lze  s  její  pomocí  provádět  detekci  polymorfismů  a  mutační  analýzu  vůbec,  při  použití  interkalačních  barviv se metoda používá k odlišení specifických a nespecifických produktů PCR reakce.  Jako tání DNA označujeme proces separace komplementárních řetězců dsDNA  indukovaný zvyšováním teploty. Platí, že DNA taje nejrychleji v určitém rozsahu teplot  blížících se tzv. teplotě tání (TM).  Tání  DNA  můžeme  po  skončení  qPCR  reakce  sledovat  tak,  že  roztok  s  DNA  ochladíme  na  teplotu  nižší  než  je  očekávaná  TM  produktů,  postupně  ohříváme  na  teplotu vyšší než je očekávaná TM a měříme přitom fluorescenci. Platí, že fluorescenční  aktivita  oligonukleotidové  sondy  nebo  interkalačního  barviva  je  přímo  úměrná  množství  dsDNA  přítomné  v  reakční  směsi.  Pokud  vyneseme  naměřenou  intenzitu  fluorescence  proti  příslušené  teplotě,  dostaneme  tzv.  křivku  tání,  která  náhle  strmě  klesá v okolí TM. Teplota v inflexním bodě křivky se rovná teplotě tání a lze ji snadno  zjistit po derivovaci křivky tání, kde se v grafu objeví jako vrchol „peak".  Detekce  polymorfismů  pomocí  oligonukleotidových  sond  je  založena  na  skutečnosti, že i jediná nekomplementární báze velmi změní TM sondy, přičemž sonda  méně komplementárně taje při nižšní TM než sonda plně komplementární.  Detekce  nespecifických  produktů  při  použití  interkalačních  barviv  využívá  předpokladu,  že  nespecifické  produkty  mají  odlišnou  (obvykle  nižší)  TM  než  produkty  specifické  [Základní principy kvantitativní real‐time PCR, 13]   

5 

Principy a cyklování qPCR  První krokem je denaturace templátové DNA, obvykle při teplotě 95 °C po dobu 

2 – 5 min., avšak u vzorků bohatých na G/C oblasti je dentaruce prodloužena po dobu  15   

 

10 min. Při kterém dojde k uvolnění vodíkových vazeb mezi bazemi komplementárních  nukleotidů a vzniku volných polynukleotidových řetezců.  Následující cyklus po ukončení počáteční denaturace, se skládá ze tří kroků:  Denaturační  fáze  –  Zahřátí  na  teplotu  94  –  95°C  po  dobu  2  –  10  min.  v závislosti  na  templátu,  reakčním  objemu  a  tloušt´ce  stěn  zkumavky,  aby  došlo  k oddělení  všech  dsDNA na ssDNA (z anglického slova „single stanadrt“).  Připojení primerů – snížení teploty na 50 – 60°C po dobu 30 sek. až 2 min., kdy dochází  k připojení primerů na komplementární úseky templátu.   Polymerizace,  extenze  –  probíhá  obvykle  při  teplotě  72°C  a  tím  je  cyklus  ukončen.  Produkty z denaturační fáze se stávají substrátem druhého cyklu. Tyto cykly se opakují  řádově 30x – 40x podle specifikace templátu. V každém cyklu dojde ke dvounásobení  počtu kopií amplifikovaného úseku DNA.    

5.1 

Komponenty PCR  

Templátová DNA – templát, který slouží jako vzor pro syntézu nových řetězců DNA.  Primery – oligonukleotidová očka jsou složena obvykle z 18 – 30 nukleotidů, která svou  sekvencí odpovídají DNA templátu a vymezují úsek, který bude amplifikován.  DNA polymeráza – syntetizuje novou DNA ve směru 5´‐ 3´podle sekvence nukleotidů  v templátu od místa primeru navázaného na templát až po jeho konec.  Pufr – zajišt´uje optimální podmínky pro aktivitu DNA polymerázy.  Deoxynukleotidtrifosfát – dNTP jsou stavebními kámeny pro syntézu nové DNA v PCR  MgCl2  –  důležitá  komponenta  nezbytná  pro  aktivitu  Taq  DNA  polymerázy.  Obvyklá  koncentrace 1 – 3 mM.  PCR voda – ultra čistá voda (bez Dnáz), obecně se používá redestilovaná voda   

16   

 

5.2 

PCR inhibitory 

PCR  inhibitory  jsou  chemické  látky,  které  bývají  přítomné  ve  vyšetřovaných  biologických vzorcích, nebo do nich vnikající při manipulaci. Jsou schopné zcela zastavit  aktivitu  DNA‐polymerazy  a  znemožnit  amplifikaci  nukleové  kyseliny  pomocí  PCR.  Nejčastěji uváděnými příklady PCR inhibitorů jsou prostředky používané na vysypávání  gumových  ochranných  rukavic  –  talek  a  škrobový  pudr,  nebílkovinná  část  molekuly  hemoglobinu  (Hem)  a  heparin.  Existují  však  řada  jiných  inhibitorů,  které  mají  za  následek inaktivaci amplifikace DNA metodou PCR/qPCR.  Seznam nejběžnějších PCR inhibitorů v laboratorní a diagnostické praxi:   Etanol,  NaCl,  KCl,  Sakrosyl,  SDS,  Isopropanol,  Fenol,  Hemoglobin,  Heparin,…   

6 

Krev  Hlavní  součástí  vnitřního  prostředí  organismu  je  krev.  Krev  tvoří  ≥  7%  tělesné 

hmoty (4,5 – 5 litrů). Muži mají více objemu krve oproti ženám, jelikož ženy mají větší  podíl tukové tkáně  [Mourek 2005, 2.]   

 

6.1 

Krevní plazma 

Nažloutlá kapalina, která obsahuje anorganické a organické látky. Hodnota pH  plazmy  je  7,4  a  je  velmi  stabilní.  U  dospělého  člověka  je  objem  plazmy  je  2,8  až  3,5  litrů.  Hlavními  kationty  anorganických  látek  v  krevní  plazmě  jsou:  sodík  (Na+),  draslík  (K+),  vápník  (Ca++),  horčík  (Mg++  ),  anionty  chloru  (Cl‐)  a  bikarbonátu  (HCO3‐).  Ze  stopových prvků je důležité železo, jód viz příloha č. 1a.  Plazmatické bílkoviny (60 – 80  g/l), glukóza (3,3 – 6,1 mmol/l, laktát (0,5 – 2,2  mmol/l) a další látky glycidového metabolismu tvoří organické zastoupení látek. Krevní  plazma obsahuje celou řadu dusíkatých látek (př. močovina, kyselina močová, kreatin,  kreatinin,  amoniak),  které  představují  katabolity  bílkovinného  metabolizmu  (nebílkovinný dusík)  [Mourek 2005, 2.]   

 

 

 

17   

 

6.2 

Červené krvinky 

Červená  krvinka  (erytrocyt)  je  buňka,  která  během  svého  vývoje  ztratila  buněčné jádro. Úloha erytrocytů je transport dýchacích plynů (tj. O2 + CO2). Erytrocyt  má tvar připomínající cukrářský piškot na podélném řezu tzv. bikonkávní tvar. V krvi se  objevuje  jev,  který  se  nazývá  fyziologická  anisocytóza.  Jsou  to  malé  i  větší  makrocyty  spolu s menšími mikrocyty erytrocytů.  Počet červených krvinek se liší u můžu a u žen. Muži mají 4,3 – 5,3 . 1012/l krve a  ženy  3,8  –  4,8  .  1012l/krve.  Tento  rozdíl  vzniká  v pubertě  a  je  podmíněn  účinkem  pohlavních hormonů. Červená krvinka stárne a zaniká rozpadem (hemolýzou) po 90 ‐  120 dnech života  [Mourek 2005, 2.]    

6.2.1  Hemoglobin  Molekula hemoglobinu (Hb) se skládá ze čtyř podjednotek, každá podjednotka  je  tvořena  ze  dvou  složek.  Barevného  hemu,  který  obsahuje  železo  a  globin,  což  je  proteinový  řetězec.  Množství  Hb  je  u  mužů  135  –  17  g/l,  u  žen  120  –  158  g/l  krve.  Denně se rozpadá asi 7 – 8 g hemoglobinu a také stejné množství vzniká. Hb na sebe  váže kyslík ‐ reverzibilně (1 gram Hb váže přibližně 1,39 ml O2). V praxi to znamená, že  arteriální  krev,  která  je  nasycena  kyslíkem,  může  přenášet  okolo  200  ml  O2  v 1  litru  krve. Hb vážící kyslík (oxyhemoglobin), předává na periferii kyslík tkáním a také přenáší  i  CO2  ve  vazbě  na  aminoskupinu  proteinového  řetězce.  Tento  derivát  se  nazývá  karboxihemoglobin  [Mourek 2005, 2.]  

 

  

6.3 

Bílé krvinky – leukocyty 

Představují  mobilní  obranyschopnou  jednotku  organizmu.  Mají  schopnost  tzv.  fagocytózy  (pohlcují  a  ničí  bakterie  a  viry).  Leukocyty  se  rozdělují  na  granulocyty  a  agranulocyty.  Granulocyty  se  dělí  podle  barvitelnosti  a  velikosti  granul  na  neutrofní,  eozinofilní a bazofilní, oproti agranulocytům, kteří nemají granuly. Agranulocyty dělíme  na monocyty a lymfocyty. Počet leukocytů v krvi je 4 – 9 . 109/l. viz příloha č. 1b.   

18   

 

Neutrofilní granulocyty jsou nejpočetnějším druhem leukocytů u dospělého člověka.  Eozinofilní  granulocyty  mají  velmi  slabou  fagocytární  kapacitu.  Fagocytují  komplex    alergen – protilátka.  Bazofilní granulocyty jsou málo pohyblivé a jejich granula obsahuje histamin a heparin.    Významně se uplatňují při alergických reakcí.  Monocyty žijí velmi dlouho, řádově několik let. V krvi cirkulují jako ještě nezralé buňky,   které pak vycestují do tkání a tam dozrávají v makrofágy.  Lymfocyty se dělí podle významu a funkce v imunitních reakcích na lymfocyty typu T, B    a  NK.  T‐lymfocyty  jsou  odvozeny  od  thymu  (brzlík),  B‐lymfocyty  od  burzy  Fabricií  (lymfoidní  útvar  u  ptáků).  NK‐lymfocyty  jsou  tzv.  nulové  buňky,   které nemají znaky antiT ani B‐lymfocytů [Mourek 2005, 2.]   

 

 

 

 

 

 

6.4 

Krevní destičky – trombocyty 

 

 

 

Jsou to nejmenší formované elementy krve. Trombocyty nemají jádro, ale mají  tvar okrouhlých hladkých disků o průměru 2‐4 µm. Počet trombocytů 150 – 400 . 109/l  krve  je  celý  život  stejný  avšak  jejich  životnost  je  velmi  krátká  (9  –  12  dní)  a  proto  se  musí  neustále  vyvijí.  Destičky  obsahují  četné  granule,  jedním  z granul  je  Alfa‐granula,  která obsahuje faktory nutné pro hemokoagulaci a je významným růstovým faktorem,  který  podporuje  hojení  poraněné  stěny  cévní  (vytvoření  tzv.  destičkového  trombu  –  vazokonstrikce). Postupem času dochází k fibrinolýze (trombus je odstraněn rozpadem  trombocytů  a  fibrinů)  a  reparačně‐regeneračnímu  procesu  zhojení  rány    [Mourek 2005, 2.]   

6.5 

Krevní skupiny 

Z historického hlediska byl první, kdo objevil krevní skupiny vídeňský lékař Karl  Landsteiner  roku  1900,  který  však  identifikoval  pouze  tři  krevní  skupiny.  Za  tento  významný  objev  počátku  20.  století  obdržel  roku  1930  Nobelovu  cenu  za  medicínu  a  fyziologii.  S  objevem  krevních  skupin  je  pevně  spjat  český  lékař‐neurolog  a  psychiatr  19   

 

Jan  Jánský,  který  roku  1906  jako  první  identifikoval  všechny  čtyři  krevní  skupiny  na  základě tzv. křížových experimentů s krevními séry viz tab. 1  Tab. 1 – krevní skupiny 

Skupina 

Antigen 

Protilátky 

A 

A 

Anti B 

B 

B 

Anti A 

AB 

A i B 

Žádné 

O 

H 

Anti A i anti B 

 

Systém ABO je zastoupen aglutinogeny A a B (glykopoteiny) vázanými na povrch  erytrocytů a všech buněk v těle.   Aglutininy  anti‐A  a  anti‐B  jsou  přirozené  protilátky,  které  se  vytváření  až  po  narození, a to vždy opačně, než je antigen jedince (u skupiny A anti B, u skupiny B anti  A)  [Genetika – Krevní skupiny a jejich dědičnost, 12.]   

6.6 

 Fyziologie hemostázy 

Při porušení stěny cévní vzniká během několika minut tzv. primární destičková  zátka.  Primární  destičková  zátka  je  velmi  křehká  a  rozpustí  se,  pokud  není  zpevněna,  nebo  připevněna  fibrinovou  sítí.  Tvorba  destičkové  zátky  je  závislá  na  dostatečném  množství  a  funkci  krevních  destiček.  Fibrinové  sítě  tvoří  koagulační  systém,  který  stabilizuje  destičkovou  zátku  a  přemění  ji  na  dostatečně  pevné  koagulum.  Při  poškození  stěny  cévní  přichází  krev  do  kontaktu  s  tkáňovým  faktorem  (TF)  a  dochází  k vazbě  Faktoru  VII  (FVII),  která  se  tím  aktivuje.  Po  aktivaci  FVII  s FT  vzniká  cesta  tzv.  zevního  koagulačního  systému  (aktivace  F  IX  a  F  X).  Pro  hemostázu  in  vivo  je  vnitřní  koagulační  systém  méně  důležitý.  FIX  a  FX  přemění  FII  (protrombin)  na  jeho  aktivní  formu  trombin.  Trombin  aktivuje  zpětně  FXI  a  současně  FV  a  FVIII,  ty  jsou  pak  akcelerátory  FIX  a  FX.  K  aktivaci  faktorů  II,  VII,  IX  a  X  dochází  na  povrchu  destiček  za  přítomnosti Ca2+ iontů a tím je koagulační proces situován právě do místa poranění.     Trombin  je  hemostatický  protein,  který  přeměňuje  fibrinogen  na  fibrin  a  aktivuje  koagulační  faktory.  Tento  proces  se  významně  se  podílí  na  aktivaci  destiček.  20   

 

Na  povrchu  endotelu  se  trombin  váže  na  trombomodulin,  čímž  se  účastní  aktivace  koagulačního  inhibitoru  –  proteinu  C.  Současně  s  aktivací  koagulačního  systému  se  aktivuje  inhibiční  systém.  Antitrombin  je  nejdůležitější  koagulační  inhibitor,  jeho  aktivita je zaměřena proti aktivovaným faktorům X, trombinu a také F XII, XI a IX. Tato  reakce je urychlována především za přítomnosti heparinu, ale i dalšími inhibitory jako  jsou protein C a protein S. [Raušová 2005, 7]   

7  

 

 

Hereditární trombofilie  Hereditární trombofile jsou dědičné rizikové faktory, které mají značný podíl na 

vzniku  trombózy  ve  venózním  nízkotlakém  řečišti  s následnou  trombembolickou  chorobou.  Některé  však  mají  souvislost  se  vznikem  trombotických  komplikací  v arteriálním systému se se vznikem těhotenských komplikací př. opakované spontánní  potraty  ve  2.  trimestu  gravidity,  porody  mrtvých  plodů,  těžké  intrauterinní  růstové  retardace plodu, preeklampsie a abrupce placenty.  Trombotické  komplikace  jsou  multifaktoriální  povahy  a  na  jejich  vzniku  se  podílejí jak dědičné, tak získané rizikové faktory. Nyní jsou již známy mnohé genetické  abnormality,  které  se  podílejí  na  zvýšeném  riziku  trombofilie.  Jejich  kombinace  –  přítomnost  více  než  jednoho  rizikového  faktoru  –  zvyšují  riziko  ještě  významněji.  Proces  hemostázy  vyžaduje  rovnováhu  mezi  prokoagulačními  a  antikoagulačními  faktory.  Prvními  popsanými  genetickými  protrombotickými  rizikovými  faktory  byly  deficity přirozeně se vyskytujících antikoagulačních proteinů, antitrombinu III, proteinu  C a proteinu S, které však patří mezi vzácnější rizikové faktory, s výraznou genetickou  heterogenitou. V současné době se pozornost obrací k relativně často se vyskytujícím  polymorfismům, jako jsou faktor V‐Leiden a protrombinová mutace FIIG20210A, které  ovlivňují riziko trombózy  [Raušová 2005, 7]   

7.1 

Mutace Faktoru V Leidenu a Faktoru II Protrombinu 

Rezistence na aktivovaný protein C (APC resistence) představuje nedostatečnou  nebo  vůbec  žádnou  odpověď  na  aktivovaný  protein  C.  Jedná  se  tedy  o  odolnost  21   

 

koagulačního systému vůči inhibičnímu vlivu proteinu C na koagulačně aktivní faktory  Va  a  VIII.  Vrozená  APC  rezistence  je  v  95%  případy  vyvolána  jednobodovou  mutací  v  genu pro koagulační faktor V. V evropské populaci jsou nejčastější mutace 1691G>A ‐  tzv.  Leidenská  mutace  způsobující  záměnu  argininu  za  glutamin  v  pozici  506  FV  a  1091G>A  ‐  tzv.  Cambridge  mutace  způsobující  záměnu  argininu  za  threonin  v  pozici  306 FV. Velmi vzácná v naší populaci je pak mutace 1090A>G ‐ tzv. Hong Kong (záměna  argininu v pozici 306 za glycin). Faktor V Leiden má normální prokoagulační aktivitu, ale  nedá  se  proteolyticky  štěpit  aktivovaným  proteinem  C.  Faktor  tak  zůstává  ve  své  aktivované podobě a nedochází k jeho inaktivaci. Tím se rozvijí hyperkoagulační stav a  zvyšuje  se  roziko  trombózy.  Leidenská  mutace  s 5,7‐8,3%  výskytem  v evropské  populaci je nejčastejším vrozeným rizikovým faktorem trombóz.   Polymorfismus  genu  pro  tvorbu  protrombinu  v  5.  exonu,  spojený  s  vysokou  hladinou protrombinu, je další z vrozených příčin trombotických stavů. Podobně jako u  APC rezistence je i tento defekt vyvolán jednobodovou mutací. Jedná se o záměnu G za  A v pozici 20210 protrombinového genu (20210G>A). Ačkoli se jedná o mutaci v oblasti  3´  netranslatované  oblasti  genu,  dochází  k  jejímu  projevu  díky  větší  stabilitě  mRNA.  Heterozygoti  s  touto  mutací  mají  zvýšenou  hladinu  protrombinu  zhruba  o  30%.  Frekvence této mutace v evropské populaci se pohybuje kolem 2%.    

7.2 

Mutace MTHFR a vztah k homocysteinu 

Enzym  nazvaný  methylentetrahydrofolátreduktáza  (MTHFR)  má  velký  význam  v metabolismu  homocysteinu.  Homocystein  je  neesenciální  aminokyselina,  která  vzniká  v organismu  jako  sekundární  produkt  metabolismu  esenciální  kyseliny  methioninu.  Při  normálně  fungujícím  metabolismu  v buňce  se  vznikající  homocystein  rychle přeměňuje v dále zužitkovatelné a neškodné látky. Bodovými mutacemi v genu  pro  MTHFR  vzniká  enzym  se  zvýšenou  termolabilitou  a  se  sníženou  aktivitou  a  významně  souvisí  s vyšší  hladinou  homocysteinu  v plazmě.  Homocystein  působí  cytotoxicky na endoteliální buňky, inhibuje buněčnou proliferaci a stimuluje proliferaci  buněk  hladkého  svalstva  v cévách.  Homocystein  má  velký  podíl  a  podporu  protrombotické  aktivity  v cévním  řečišti,  což  má  za  následek  vznik  aterosklerózy  a  22   

 

trombózy.  Polymorfismus  spočívá  v záměně  adeninu  za  cytosin  v 1298  nukleotidu.  Nejčastější mutací tohoto genu je bodová mutace (substituce) C (cytozin) za T (tymin)  v pozici  677  (C677T),  což  má  za  následek  substituci  aminokyseliny  alaninu  (Ala=A)  za  valin  (Val)  na  místě  223  v peptidickém  řetězci    [Krajská  nemocnice  Liberec,  odd.  Klinické biochemie, 9]   

8 

Genotypizace  Genotypizace  je  detekce  zkoumaného  genu.  V řadě  diagnostických, 

výzkumných  a  vývojových  laboratoří  se  genotypizace  často  provádí  za  účelem  identifikace  geneticky  modifikovaných  organismů  (laboratorní  zvířata)  a  diagnostika  onemocnění.   

8.1 

Izolace DNA 

Pro  izolaci  DNA  se  používá  řada  postupů.  Část  tkáně,  nebo  např.  leukocyty  izolované z periferní krve, se zpravidla nejprve lyzuje pomocí kitů a pak se DNA očistí  od bílkovin a dalších kontaminujících látek. Může se tak dít chemicky (např. hydrolýzou  bílkovin  pomocí  proteolytických  enzymů,  jejich  denaturací  apod.)  i  fyzikálně  (na  základě  různé  afinity  DNA  a  kontaminantů  k  různým  látkám).  V  současnosti  se  nejčastěji používají tři metody:  Izolace  DNA  vazbou  na silikátovou kolonku:    Využívá  se  vysoké  afinity DNA  k  silikagelové  náplni  v  chromatografické  kolonce.  DNA  se  v  přítomnosti  vysoké  koncentrace solí naváže na silikát, zatímco kontaminující látky kolonkou protečou. DNA  se pak vymyje např. destilovanou vodou nebo zředěným pufrem.  Izolace DNA fenol‐chloroformovou metodou: Jde o „zlatý standard“, který se i  přes  jistou  pracnost  a  nepohodlnost  (práce  s  toxickými  a  zapáchajícími  látkami)  stále  používá, neboť je spolehlivý, levný a poskytuje velmi čistou DNA.  Izolace  DNA  komerčními  kity:  tato  metoda  izolace  pomocí  kitů  je  z hlediska  nenáročnosti času velmi využívaná, však bývá dražší.   23   

 

  8.1.2 

Příklad ­ Izolace DNA komerčními kity 

Komerční  kit  DNA  Lego  kit  od  společnosti  Top‐Bio,  s.r.o  ‐  Izolace  DNA  z  neseparované krve.  1. Odebrat krev do antikoaglulancia (EDTA, Citrát sodný)  2. Do 1,5 ml zkumavky Eppendorf (Epp.) vpravit 1 ml DNA vazebného pufru, 50 µl  DNA bind partikulí (po extensivním protřepání a míchání).  3. Směs inkubovat 10 min; intenzivně protřepat (vortex) každé 2 min.  4. Zkumavky stočit na mikrofuze 30 sec.  5. Peletu DNA bind a nukleových kyselin postupně opláchnout:   1 x 1 ml DNA vazebný pufr   2 x 1 ml promývací pufr   1 x 1 ml acetonu  Každý oplachovací krok spočívá v přidání odpovídajícího roztoku, vortexování 5  sec, centrifugaci 30 sec a odsání supernatantu. Po opláchnutí v acetonu vysušit peletu  10  min  při  56oC.  K  vysušené  peletě  přidat  100  µl  elučního  pufru,  vortexovat  a  inkubovat 10 min. při 56oC; dojde k uvolnění DNA z DNA bind. Vzorek  centrifugovat  1   min  na  mikrofuze a supernatant s DNA (přibližně 1 µg) přenést do nové zkumavky. Pro  PCR lze použít 1 ‐ 10 µl takto izolované DNA.  Celková doba přípravy je odhadnuta na cca 20 – 30 min.    8.1.3 

Příklad ­ Izolace DNA fenol­chloroformovou metodou 

Izolace DNA z části ocásku pro určení genotypu laboratorních myší  1. Odstřihnout část ocásku (0,3 ‐ 0,5 cm) laboratorní myši a vložit je do 1,5 ml Epp.  zkumavky  2. Předem si připravit vodní lázeň na 55 °C, Lyzační pufr a Proteinázu K  3. Do zkumavky s ocáskem napipetovat 0,5 ml Lyzačního pufru a 35 µl ProteinázyK   4. Vortex a vložit do vodní lázně při teplotě 65 °C   5. Inkubace ve vodní lázni minimálně 12 hod.  24   

 

6. Po 12 hod. inkubaci napipetovat do zkumavky 0,5 ml fenolu pH 8  7. Vortex a následná chlazená centrifugace při 12 – 13 000 rpm po dobu 5 min.  8. Odebrat supernatant a přenést jej do nové 1,5 ml Epp. zkumavky   9. K supernatantu nepipetovat 0,2 ml Chloroformu a 0,2 ml fenolu pH 8  10. Vortex a 5 min. chlazená centrifugace při 12 – 13 000 rpm   11. Opět odebrat supernatant a přenést do nové 1,5 ml Epp. zkumavky  12. Napipetovat 0,5 ml etanolu a 50 µl 4 M acetátu sodného pH 6  13. Inkubace v ‐20 °C po dobu 1 hod.  Po  hodinové  inkubaci  zkumavku  centrifugovat  (5  min.)  při  12  –  13 000  rpm  a  odsát  supernatant a zbylý centrifugovaný pelet z DNA ponechat.   14. Napipetovat 0,8 – 1 ml 70% etanolu a centrifugovat (5 min.) při 13 000 rpm  15. Znovu odsát supernatant a ponechat centrifugovaný pelet s DNA  16. Vložit do točícího vakua a inkubovat po dobu 15 min.  17. Po  inkubaci  v točivém  vakuu,  přidat  do  zkumavky  100  –  200  µl  dienizované  vody (dH2O)  18. Konečná 15 minutová inkubace v termostatu při 65°C  Z měření koncentrace DNA pomocí spektrofotometru  Odhadovaný čas: 14 hodin  Tato  izolace  DNA  z myšího  ocásku  je  „osvědčená“  metoda  používaná  ve  výzkumných  laboratořích.  Jde  sice  o  pracnou  a  časovou  záležitost,  ale  výsledkem  je  čistá DNA s výtěžností 30‐110 ng/µl v objemu 100 – 200 µl.     

25   

 

PRAKTICKÁ ČÁST   9 

Charakter nové metody qPCR   Pro stanovení DNA metodou PCR se často používá izolovaná DNA z lidské krve. 

Tato  metoda  se  využívá  v celé  řadě  diagnostických  stanovení  jako  například  určování  přítomnosti mutantních genů (především v onkologii), detekce virových a bakteriálních  infekcí  a  určování  otcovství.  Kromě  určování  přítomnosti  genu  (kvalitativní  testy)  je  možné stanovit také počet kopií studovaného genu metodou kvantitativní PCR.  Problémem  při  řadě  těchto  stanovení  je  nutnost  izolace  DNA  z krve,  která  představuje časovou i finanční zátěž. Amplifikace DNA přímo z krve s využitím běžných  metod  PCR  není  možná,  neboť  krev  obsahuje  řadu  komponent,  které  inhibují  PCR.  Jedná se především o imunoglobuliny a hemoglobin, které inhibují amplifikační reakci i  v malých množstvích.  Hlavním  cílem  této  práce  bylo  navržení  nové  metody  qPCR  genotypizace  z periferní  lidské  krve.    V práci  byl  využit  nový  poznatek,  že  krevní  inhibitory  PCR  je  možné blokovat, pokud se do reakční směsi přidají aditiva typu trehalózy [Horáková et  al.,  2011,  3.].  V práci  bylo  optimalizováno  složení  reakční  směsi  pro  PCR  (přidání  různých koncentrací trehalózy a dalších aditiv, tetraalkylammonium chlorid [Kovářova  and  Dráber,  2000;  Shaik  et  al.,  2008,  4.].  Navíc  bylo  zjištěno,  jaké  množství  celé  krve  PCR  toleruje  a  jaké  jsou  optimální  antikoagulační  látky  (heparin,  EDTA,  citrát  sodný).  Součástí  práce  bylo  i  zjištování  kompatibility  reakčních  směsí  s qPCR  kde  narůstá  problém  s působením  inhibitorů  (především  hemoglobinu)  nejen  na  vlastní  amplifikační reakci, ale také na detekci fluorescenčních DNA barviv typu SYBR green I.  Konečná  práce  byla  zaměřena  na  ověření  použitelnosti  této  metody  při  detekci  a  genotypizaci  jednobodových  mutací  pro  Faktor  V Leiden  a  Faktor  II  Protrombin  (Hereditární trombofilie) způsobující tromboembolické onemocnění.  1. Kompatibilita reakčních směsí pro qPCR  2. Použitelnost metody pro laboratorní účely 

26   

 

3. Použitelnost  metody  při  detekci  a  genotypizaci  mutací  Faktoru  V Leidenu  a  Faktoru II Protrombinu u Hereditární trombofilie z celé krve  4. Příkladné kazuistiky pacientů s tromboembolickým onemocněním   

9.1 

Odběr krve a následná kompatibilita reakčních směsí  qPCR  

Odběr krve byl proveden u třech dobrovolných dárců v ordinaci MUDr. Steppanové  v areálu  Akademie  Věd  ČR  v  Praze.  Odběr  jsem  provedl  ze  střední  kubitální  žíly  (v.  mediana  cubiti)  za  účasti  zdravotní  sestry,  krev  byla  dělena  do  tří  odběrových  zkumavek typu SARSTEDT Monovette EDTA K (2,7 ml), Coagulation s Citrátem sodným  (3 ml), zkumavky s přídavkem Heparinu 10 µl/1 ml krve (5 mj) v celkovém objemu 3 ml  krve/15  mj.  Heparinu  a  zkumavky  Serum‐Gel  (7,5  ml)  pro  sérum  z krve.  Následně  proveden vortex a rozplnění do předem připravených PCR zkumavek po 200 µl v každé  znich. Od každého typu PCR zkumavek bylo umístěno do + 4°C k přímému testování a  zbylé pcr zkumavky byly umístěny do ‐70°C pro další možné testování.    U  kompatibility  jsem  srovnával  reakční  pufr  PP  Plain,  který  řada  z klinických  laboratoří využívá díky svým aditivům umožňující přímou elektoforézu a nově navržený  T04P2  SG  (Sybr  green)  pufr.  Také  jsem  použil  odlišné  primery  bohaté  na  oblasti  GC  lidského genu.   PP Plain SG (Sybr green) byl ve složení 2 x koncentrovaný:  150 mM Tris‐HCl, pH 8,8  (25oC), 40 mM (NH4)2SO4, 0,02% Tween 20, 5 mM MgCl2, 400 µM dATP, 400 µM dCTP,  400  µM  dGTP,  400  µM  dTTP,  100  U/ml  Taq  DNA  polymerázy,  stabilizátory  a  aditiva.  Nově navržený pufr T04P2 – 2 x koncentrovaný: 20 mM Tris‐HCl, pH 8,8 (21°C), 10 mM  KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X‐100, 200 µl dNTPs, 25 U/ml Taq  DNA polymerázy, 22 nM anti‐Taq mAb.   První  set  primerů  s označením  RET  GC  f:CCCGCACTGAGCTCCTACAC  94°C  (5  min.),  RET  GC  primer  r:  GGACGTCGCCTTCGCCATCG  94°C  (30  sek.),  60°C  (30  sek.),  72°C  (45  sek.)  x 40 cycles 72°C (5 min.) [Horáková et al., 2011, 3.]. Druhý set primerů GC 71,5%:  f  –  GGTCGCCGACATCCACTC/r‐TGCTCCGGGAACAGAACCT.  Periferní  lidskou  krev  jsem  použil od dárců v antikoagulacii Heparin.      27   

 

Vyhodnocení:  Experimenty dokládají, že bez přidání PCR enhanceru betain spolu s trehalosou  a  propandiolem  je  výsledná  reakce  negativní,  pouze  při  vyšší  koncentraci  betainu  (1,5M) je signál na elektroforézním gelu a vícekrát ředěná krev min. 2 x – 5 x ředění.  Avšak u zobrazení CT křivek v jednotlivých cyklech qPCR byly signály negativní.  Naopak u T04P2 SG pufru, PCR produkty aktivní již v nižších koncentracích krve  (7,5, 5, 2,5%) bez přidání betainu. Po přidání různě ředěného betainu (0,5, 1, 1,5M) se  zvýšila finální koncentrace krve. U zobrazení CT křivek na qPCR byla zobrazena stupnice  stability krve. Jako výsledek kompatibility PCR mixů mohu doporučit pouze T04P2 pufr  s PCR enhancery 0,5M betain, 0,4M trehalosou, 0,2M propandiolem s použitím 5, 2 a  1% krve tj. ředění 2 x, 4x, 10x – obr. 1    Obr. 1 (vlastní) ‐ elektroforézní gely  

A 

B

       5%                        2,5% 

   10% F.            7,5%               5%             2,5% 

    

 

     0    0,5   1   1,5       0   0,5   1    1,5     M            0   0,5  1  1,5    0   0,5  1  1,5    0   0,5  1  1,5    0   0,5  1  1,5  M   Betain       PP Plain pufr                                                            T04P2 pufr  Obr. 1 – 2 % eletroforézní gely v 1 x TBE. A. Elektroforézní gel zobrazuje využití komerčního master mixu PP Plain s přidáním různě  ředěného betainu 0 – 1,5 M (molární) a s koncentrací 5 – 2,5 %periferní lidské krve. B. Elektroforézní gel zobrazuje využití T04P2  master mixu s různě ředěným betainem 0 – 1,5 M a stupnici ředění periferní lidské krve od 2,5 do 10 %.  M = marker, který určuje  molekulová hmotnost fragmentů (490 kDa ‐ kilodaltonů).     

9.2 

Nová metoda qPCR pro laboratorní účely   

9.2.1   Srovnání antikoagulancií v metodách qPCR a PCR  EDTA K – draselná sůl kyseliny etylendiamintetraoctové je antikoagulační činidlo, které  váže vápenaté ionty a tím blokuje kaogulační kaskádu.   Ve  zkumavkách  typu  EDTA  K2  jsou  erytrocyty,  leukocyty  a  trombocyty  stabilní  po  dobu  24  hodin  od  odběru.  Tyto  zkumavky  se  používají  pro  molekulárně biologické testy z plné krve.   28   

 

Citrát  sodný    ‐  obvykle  označuje  sůl  kyseliny  citronové  se  třemi  sodíkovými  atomy  v molekule (citronan (tri)sodný, C6H5Na3O7). Používá se pro zabránění hemokoagulace  v podmínkách in vitro.  Heparin  –  je  antikoagulační  činidlo,  které  aktivuje  antitrombiny  (AT),  čímž  blokuje  koagulační kaskádu, takže nevznikne krevní sraženina a sérum, ale plná nesrážlivá krev.  Existují tři základní druhy heparinu tj. lithný, amonný a sodný.  AT – antitrombiny – látky, které na různých úrovních (inaktivace trombinu)  tlumí krevní sražení koagulaci.  Testy  provedeny  na  termocykléru  zn.  Real  plex  Eppendorf  a  vyhodnoceny  pomocí výpočtu CT, křivky tání a elektorforézního gelu pod UV světlem.   Stanoven reakční objem 25 µl. T04P2 SG (Sybr Green) 12,5 µl, 0,8 µl RET GC_gcr  primer, 1,7 µl PCR voda, 7,5 µl, (ne)přidání 5M Betainu (různě ředěného) a 2,5µl krve  s antikoagulanciem  Heparin  (22,5  mj.),  EDTA  K,  Citrát  sodný  ve  finální  a  ředěné  koncentraci  10,  5,  2,5%  krve.  Nastavení  teplot  v cykléru:  95°C  denaturační  fáze  po  dobu  10  min.,  94°C  –  15  sek.,  56°C  –  15  sek.  a  72°C  –  2  min.  v počtu  40  cyklů  (kvantifikační fáze), konečná fáze křivka tání.   Vyhodnocení:  Stabilita u antikoagulancií Heparinu, EDTA K a Citrátu sodného pro účely qPCR  bylo zjištěno, že lze využít EDTU K a Citrát sodný pouze při max. 2% finální koncentraci  krve, nejlépe však u 1 – 0,5% koncetraci. Hodnoty fluorescence (CT) byly srovnatelné u  obouch studovaných antikoagulancií s pozitivními fragmenty na elektroforézním gelu.  Při  použití  heparinu  byly  však  pozitivní  fragmenty  pouze  u  2,5%  ředěné  krve.  Avšak  přidáním PCR enhanceru betain s koncentrací 0,5 – 1 M  PCR reakci zlepšilo (pozitivní  PCR produkt u 10% konc. krve), ale snížilo kvantitativní PCR reakci důsledkem vyššího  objemu hemoglobinu v krvi.  Závěrem lze říct, že u stability testovaných antikoagulancií pomocí izolace DNA  je  možno  využít  všechny  dosavadní  testované  antikoagulancia  s periferní  lidskou  krví  ředěnou 5 až 10 x.  

29   

 

  9.2.2   Použitelnost periferní krve pro genotypizaci laboratorních myší  Laboratorní  myši  4.1  KO  x  Bl.6,  PAG  x  Bl.6  a  NTAL  x  Bl.6  s typem  genu  „wild‐ type“  WT  ‐  divoká  alela,  která  se  běžně  vyskytuje  v populaci  a  podmiňuje  normální  fenotypový znak v diploidní buňce (obr. 2).  Krev odebrána z v. facialis pomocí metody  odběru  krve  Goldenrod  Animal  Lacent.  U  těchto  testů  jsem  užil  antikoagulancium  Heparin  při  odběru  2,5  U  /  250  µl  krve.  Krev  byla  dále  zpracována  a  ředěna  ve  fyziologickém  roztoku  (FR)  v poměru  1:3,  1:7  a  1:15.  Reakční  objem  master  mixu  stanoven na 24 µl pro dané primery WT. T04P2 SG. 12,5 µl, 0,25 µl Exon 4R/4F, 2 µl  PAG 1, 1 µl PAG Zeo, 0,25 µl 344/345 a 11/8,5 µl pcr H2O.  Nastavení teplot v cykléru DYAD: 95°C denaturační fáze po dobu 10 min., 94°C –  15 sek., 56°C – 30 sek. a 72°C – 1 min. v počtu 40 cyklů (kvantifikační fáze).    Obr. 2 (vlastní) – genotypizace laboratorních myší  

A 

B 

C

        4x      8x     16x    D       M       4x     8x    16x     D       M       4x    8x      16x    D      M               4.1 KO x Bl.6                        PAG KO x Bl.6                        NTAL KO x Bl.6  Obr. 2 – 1 % elektroforézní gel v 1 x TBE. A. Použití primerů pro kmen myší 4.1 KO x Bl.6 s ředěním periferní myší krve 4 – 16 x +  kontrolní vzorek DNA (D) vy‐izolované z myšího ocásku kmene myši. B. Použití primerů pro kmen PAG KO x Bl.6 s ředěním periferní  myší krve 4 – 16 x + kontrolní vzorek DNA (D) vy‐izolované z myšího ocásku kmene myši. C. Použití primerů pro kmen myší NTAL  KO x Bl.6 s ředěním periferní myší krve 4 – 16 x + kontrolní vzorek DNA (D) vy‐izolované z myšího ocásku kmene myši.                      

Vyhodnocení:  Výsledky  dokládají,  že  nová  metoda  qPCR  z periferní  krve  je  použitelná  pro  laboratorní  účely  v oblasti  genotypizace  laboratorních  myší.  Srovnatelná  s metodou  izolace  DNA  z  ocásků  a  tkání.  Ovšem  za  přispění  master  mixu  T04P2  a  zvýšení  doby  denaturačního  cyklu  s teplotou  95  °C.  Přispění  této  metody  se  zkrátí  čas  pro  vyhodnocení  zkoumaného  genotypu  (odbourání  přípravy  DNA)  a  zamezí  se  stresový  faktor u laboratorních myší. 

30   

 

10  Použitelnost  nové  metody  qPCR  u  analýz  dědičných            mutacích ‐ Hereditární trombofilie   

10.1  Detekce primerů, genotypizace, použitelnost X % krve ve vzorku   Pro  tento  test  jsem  použil  vybrané  zástupce  pacientů  s mutacemi  i  bez  rizikových  faktorů  V Leiden  a  II  Protrombin.  Krev  odebraná  z v.  m.  cubity  separovaná  do 2,7 ml SARSTEDT Monovette EDTA K zkumavky. Krev byla zamražena v ‐70 °C, pro  protokol  experimentu  byla  krev  ředěna  1:7  (jeden  díl  krve  a  sedm  dílů  vody).  Byly  zakoupeny šestice primerů podle článku [Endler G. 2001, č. 5] k detekci a genotypizaci  genů  pro  mutaci  Faktoru  V Leidenu  a  Faktoru  II  Protrombin  od  firmy  Generi  Biotech,  naředěny na požadovanou koncentraci 100pmol/µl (0,1µM/µl) viz Tab. 4., zamraženy v  ‐20°C.   Sestava protokolu:  Reakční objem 5 x 25µl – 5 x PCR reakce pro každý genotyp zvlášt´. T04P2 SG/  PlainPP  SG  12,5µl,  0,1µl  FV506R  (1pmol/25µl),  0,1µl  FV506Q  (1pmol/25µl),  0,125µl  FVcommon  (1,25pmol/25µl),  0,05µl  FII20210G  (5pmol/25µl),  0,2µl  FII20210A  (20pmol/25µl),  0,2µl  FIIcommon  (20pmol/25µl),  10,725/11,25/11,05µl  pcr  voda  a 1µl  krve  s antikoagulanciem  EDTA  K.  Z předešlých  PCR  testů  (viz  kapitola  9.2.1  Srovnání  antikoagulancií  v metodách  qPCR  a  PCR)  bylo  zjištěno,  že  krev  s EDTA  K se  musí  minimálně 5 až 10 x ředit ve finální koncentraci. Pro tento test byla finální koncentrace  krve  1:7.  Nastavení  teplot  v cykléru  Roto‐Gene  Q:  95°C  denaturační  fáze  po  dobu  10  min., 94°C – 20 sek., 54°C – 30 sek. a 72°C – 1 min. v počtu 35 cyklů (kvantifikační fáze),  konečná  fáze  křivka  tání  94°C  –  72°C  –  10  sek.  Cílem experimentu  bylo  ověření  nově  zakoupených primerů a srovnání tří zástupců pacientů s mutací a bez mutace faktoru  V Leiden a dvou zástupců faktoru II protrombinu. Obr. 3   Tab. 4 Sekvence primerů, PCR produkt a koncentrace primerů pro detekci mutací FVL a Protrombinu  

Mutace/alela 

Sekvence primerů

PCR produkt

Koncentrace 

FV506R / 1691G 

5´AACAAGGACAAAATACCTGTATTCATC 3´ 

233 kDa 

1 pmol/25µl / 2 pmol/50µl 

FV506Q / 1691A 

5´GTCTGTCTGTCTCTTTCAAGGACAAAATACC 3´ 

246 kDa 

1pmol/25µl / 2 pmol/50µl 

FVcommon 

5´CGCAGGAACAACACCATGAT 3´ 

 

1,25pmol/25µl / 2,5 pmol/50µl 

FII20210G / 20210G 

5´CACTGGGAGCATTGAGGCGC 3´ 

180 kDa 

5pmol/25µl / 10 pmol/50µl  

31   

  FII20210A / 20210A 

5´ATGAATAGTAATGGGAGCATTGAGGATT 3´ 

209 kDa  

20pmol/25µl / 40 pmol/50µl 

FIIcommon 

5´ATGTGTTCCGCCTGAAGAAGTGGA 3´ 

 

20pmol/25µl / 40 pmol/50µl 

   

Vyhodnocení:  Výsledky dokládají, že sestava zakoupených primerů od firmy Generi Biotech je  vhodná  pro  detekci  a  genotypizaci  mutací  faktorů  V Leiden  a  II  Protrombinu  při  spuštění  klasické  PCR  metody  a  vyhodnocení  eletroforézním  gelem.  Tato  kombinace  navržených  primerů  podle  článku  [Endler  G.  et  al.  2001,  č.  5]  může  být  použita  i  k vědeckému  výzkumu  v monitoringu  2D  elektroforézních  agarových  gelů,  avšak  pro  svoji časovou délku není vhodná pro lékařské nebo laboratorní vyšetření. V lékařském  a laboratorním vyšetření se usvědčila metoda qPCR – viz kapitola 10.2 a 10.3.    Obr. 3 (vlastní) ‐ Detekce mutací FVL a FII Protrombinu  

 

A 

 

B 

 

C

D

 

E 

246 kDa

233 kDa

209 kDa

180 kDa 

 

 

    N      Mt 

     N      Mt 

      N       Mt 

FV 1691G 

FV 1691A 

FV 1691G>A 

     N      Mt  PT 20210G 

     N        Mt  PT 20210G>A 

   Obr. 3. Elektroforézní gel 2% v 0,5 x TBE.  A. Přirozený homozygot FV 1691G (N: wild‐type alela 233 kDa). B. Homozygot‐mutant FV  1691A (Mt: mutanční alela 246 kDa). C. Heterozygot‐mutant 1691G>A (N: wild‐type alela 233 kDa, Mt: mutanční alela 246 kDa). D.  Přirozený homozygot PT G20210G (N: wild‐type alela 180 kDa). E. Heterozygot‐mutant PT G20210G>A (N: wild‐type alela 180 kDa,  Mt: mutanční alela 209 kDa). Amplifikační křivky – viz. Obr. 9 A, B, C, obr. 10 A, B.   

10.2  Detekce a genotypizace jednobodové mutace 1691G>A lidského  genu pro FV Leidenská mutace  Krev  odebrána  od  40  pacientů  z KNL,  a.  s.,  odd.  Klinické  biochemie.  Odběr  proveden z cubitální žíly (v. m. cubita) do EDTA K3 zkumavek o objemu 3 ml v období  mezi  březnem  až  červnem  2011.  Odd.  Klinické  biochemie  provedlo  analýzu  pomocí  kapilárních  setů  pro  určení  mutace  Faktoru  V Leidenu.  Z 67%  se  amplifikační  kapiláry  32   

 

hojně využívají v klinických laboratořích za pomocí reakčních kitů (př. Factor V Leiden  kit). Analýza se provádí podle křivek tání. Metoda však využívá izolaci DNA z periferní  krve, čož má za následek finanční a časovou náročnost.   Předáno  celkem  31  vzorků  kreve  pro  WT  mutaci  (1691G),  8  vzorků  pro  Hz.  mutaci (1691G>A) a 1 vzorek pro MUT  mutaci (1691A). Krev uchována na suchém ledu  a  převezena  do  laboratoře  odd.  Signální  transdukce,  ÚMG  AV  ČR,  v.v.i.  v  Praze,  kde  jsem provedl srovnávací testy.   Sestava protokolu:  Reakční objem 2 x 25µl – 2 x PCR reakce pro každý genotyp zvlášt´. T04P2 SG  12,5µl,  0,1µl  FV506R  (1pmol/25µl),  0,1µl  FV506Q  (1pmol/25µl),  0,15µl  FVcommon  (1,5pmol/25µl),  11,25  µl  pcr  voda  a  1µl  krve.  Krev  ředěna  8  x  tj.  finální  koncentrace  0,5%. Nastavení teplot v cykléru ROCHE Ligthcycler 480: 95°C denaturační fáze po dobu  10  minut,  94°C  –  20  sek.,  54°C  –  30  sek.  a  72°C  –  1  minuta  v počtu  35  cyklů  (kvantifikační  fáze),  konečná  fáze  křivka  tání  94°C  –  10  sek.,  40°C  –  10  sek.  a  85°C  měření intenzity fluorescence. Cíl tohoto protokolu stanoven na srovnání této metody  s metodou kapilárních setů.  Vyhodnocení:   Test  vyhodnocen  podle  amplifikačních  křivek  (CP)  oproti  křivkám  tání  (TM)  v  cykléru ROCHE LigthCycler 480**, jelikož tato metoda neumožňuje vyhodnocení křivek  tání  v důsledku  fluorescenčně  specifických  hybridizačních  sond,  které  hybridizují  s mutovanou  sekvencí  (mutovaná  a  wild‐tipe  alela  se  od  sebe  liší  různou  teplotou  křivky tání a intenzitou fluorescence), **ale využívám sekvenčně nespecifické detekce  na  odlišné  mobilitě  molekul  DNA  (odlišení  heterozygotů  od  homozygotů)  lišící  se  odlišnou intenzitou fluorescence viz obr. 4 A, B, C. V příkladu lze říct, že krev, která má  obě specifické alely Faktoru V Leidenu se naváží na primery FV ‐ FV506R G a FV506Q A,  tím  vznikne  dvojí  nárůst  fluorescence  alel  1691G>A,  obr.  4  C,  pokud  krev  obsahuje  pouze  alelu  1691G  je  nárůst  fluorescence  pouze  u  této  alely  a  u  alely  značící  mutaci  1691A  je  nárůst  negativní  obr.  4  A.  V opačném  případě  při  mutaci  genu  je  nárůst  fluorescence  u  alely  značící  mutaci  1691A,  obr.  4  B,  wild‐tipe  alela  je  negativní.  33   

 

V příloze  2  jsou  zobrazeny  amplifikační  křivky  testovaných  pacientů  (31  přirozených  homozygotů  (WT),  8  heterozygotů  (Hz.)  a  jeden  mutantní  homozygot  (MUT)  =  40  vzorků).  Srovnání 

těchto  výsledků  s metodou  pomocí  amplifikačních  kapilár  používaných  v KNL,  a.  s.  na  odd. Klinické biochemie je odlišná díky časové nenáročnosti, přípravě vzorků k detekci  bez izolace DNA z periferní krve, která je finančně zatěžující.    Obr. 4 (vlastní) ‐ Amplifikační křivky  mutace Faktoru V Leidenu  

A 

B 

1691G 

1691A 

 

C 

1691A

1691G>A 

1691G

  

  

 

Obr.  5  A  zobrazuje  wild‐tipe  alelu  (přirozený  homozygot)  1691G  s fluorescenčním  nárůstem  26,48  °C  ≥  1,79.  B  ‐  mutantní  alelu  1691A s fluorescenčním nárůstem 26,23. C specifická alela 1691G>A značící heterozygota 28,14 °C ≥ 29,66 °C.    

10.3  Detekce a genotypizace jednobodové mutace 20210G>A lidského  genu pro FII Protrombin        Krev použita ze stejných vzorků pacientů z KNL, a. s., odd.  Klinické biochemie,  jako při analýze Faktoru V Leidenu viz kapitola 10.2  Analýza z KNL, a. s. byla provedena s výsledky 37 vzorků kreve pro WT mutaci  (20210G) a 3 vzorky pro Hz. mutaci (20210G>A).    Sestava protokolu:  Reakční objem 2 x 25µl – 2 x PCR reakce pro každý genotyp zvlášt´. T04P2 SG  12,5µl,  0,05µl  FII20210G  (5pmol/25µl),  0,2µl  FII20210A  (20pmol/25µl),  0,2µl  FIIcommon  (20pmol/25µl),  11,25  µl  pcr  voda  a  1µl  krve.  Krev  ředěna  8  x  tj.  finální  koncentrace 0,5%. Nastavení teplot v cykléru ROCHE Ligthcycler 480: 95°C denaturační  fáze  po  dobu  10  minut,  94°C  –  20  sek.,  54°C  –  30  sek.  a  72°C  –  1  minuta  v počtu  35  cyklů (kvantifikační fáze), konečná fáze křivka tání 94°C – 10 sek., 40°C – 10 sek. a 85°C  měření  intenzity  fluorescence.  Cíl  tohoto  protokolu  byl  stanoven  na  srovnání  této  metody s metodou kapilárních setů.    34   

 

Vyhodnocení:   Opět se potvrdilo, že krev, která má obě specifické alely Faktoru II Protrombinu  se naváží na primery FII – FII20210G a FII20210A, tím vznikne dvojí nárůst fluorescence  alel  20210G>A,  obr.  5  A,  pokud  krev  obsahuje  pouze  alelu  20210G  je  nárůst  fluorescence pouze u této alely a u alely značící mutaci 20210A je nárůst negativní obr.  5  B  –  wild‐type  alela  (přirozený  homozygot).  V příloze  2  jsou  zobrazeny  amplifikační  křivky testovaných pacientů (37 přirozených homozygotů (WT), 3 heterozygoti (Hz.) = 40 vzorků).  Obr. 5 (vlastní) ‐ Amplifikační křivky   

A   

B 

20210G   

20210G   

  20210A 

      

  20210A 

                  

 

Obr.  5  A  zobrazuje  3  pozitivní  vzorky  pro  Hz.  alelu  20210G>A  s fluorescenčním  nárůstem  27,71°C  ±  2,6°C.  8  B  zobrazuje  37  pozitivních vzorků pro wild‐type alelu 20210G s fluorescenčním nárůstem 27,61°C ± 0,8°C.   

11  Trombofilní stavy v žilní tromboembolické nemoci (TEN)  Trombofilní  stavy  jsou  vrozené  nebo  získané  poruchy  hemostázy,  patofyziologicky asociované se zvýšeným rizikem trombózy.   Jejich  nejvýznamnější  klinickou  manifestací  je  žilní  tromboembolismus,  př.  varixy  na  dolních  končetinách  ‐  viz  obr.  6.  U  více  než  50%  osob  s  neprovokovanou  trombózou  nacházíme  některou  ze  známých  trombofilií.  Osoby  s  vrozenými  trombofiliemi  mají  proti  osobám  bez  trombofilie  především  zvýšené  riziko  první  tromboembolické  nemoci  (TEN),  zatímco  vliv  geneticky  podmíněných  trombofilních  stavů na rekurenci není tak zřejmý a proto se provádějí studie možných polymorfizmů,  viz kapitola 9.2 Hereditární trombofilie.      35   

  Obr. 6  (vlastní) – Sekundární varixy po hluboké žilní trombózy 

 

  

Sekundární  žilní  varixy  (dilatace  a  vinutí)  dolní  končetiny  v povodí  anatomicky  definované  oblasti  a  malé  safeny.  

   U  pacientů  s  idiopatickou  trombózou  je  riziko  recidivy  7‐10%  za  rok  i  při  absenci  známých  trombofilií.  Riziko  rekurentní  příhody  je  ovlivněno  řadou  dalších  faktorů (přetrvávající nebo nezjištěný vyvolávající faktor, proximální trombóza a plicní  embolie, neúplná rekanalizace trombotizované cévy, přítomnost některých trombofilií,  vysoká  hladina  D‐dimerů  po  vysazení  antikoagulační  léčby).  Jejich  identifikace  a  následná monitorace má rozhodující význam pro optimální volbu léčby a délku jejího  podávání  v  sekundární  prevenci  žilního  tromboembolismu.  V  primární  prevenci  žilní  trombózy je důležitá znalost obecných provokujících faktorů a konkrétních rizik daného  pacienta, což znamená i včasné vyšetření trombofilních stavů u pacientů, kteří z jejich  identifikace  mají  prospěch,  pokud  mají  aspoň  středně  vysokou  pravděpodobnost  záchytu. Paušální dlouhodobá profylaxe u dosud asymptomatických nosičů vrozených  trombofilií  není  indikována  vzhledem  k  možným  komplikacím  antikoagulační  léčby.  Ženy  s  trombofilními  poruchami  mají  zvýšené  riziko  tromboembolické  příhody  při  užívání hormonální antikoncepce, během gravidity a je u nich vyšší výskyt komplikací  těhotenství souvisejících s poruchami průtoku krve v placentárním řečišti.  Vrozené trombofilie  1.

Mutace faktoru V Leidenu (FVL) 

2.

Mutace faktoru II Protrombinu 20210A 

3.

Homozygotní homocystinurie 

4.

Dysfibrinogenémie 

5.

Deficit antikoagulačních faktorů – protein C, S, AT  36 

 

 

Získané trombofilní stavy  1.

Malignita 

2.

Respirační onemocnění 

3.

Gravidita a šestinedělí 

4.

Negrotický sy 

5.

Věk nad 60 let 

6.

Chronické střevní záněty 

7.

Obezita, kouření 

8.

Varixy dolních končetin, paréza končetin 

9.

Autoimunitní choroby 

10.

Stav po prodělané trombóze 

 

11.1  Indikace vyšetření trombofilií   Zde  si  můžeme  položit  otázky,  které  mám,  zjednoduší  význam  o  vyšetření  na  TEN.  Součastné  znalosti  o  výskytu  a  následků  žilního  tromboembilismu  je  zahaleno  několika  otázek,  avšak  mají  zásadní  význam  pro  indikací  optimálního  vyšetřovacího  postupu u pacienta a možnou volbu terapie s délkou trvání léčby.   Otázka první: U koho je indikováno vyšetření?   Před  každým  vyšetřením  je  nutné  zvážit  pravděpodobnost  záchytu  a  významu  pro  vyšetřovanou  osobu.  Nejčastěji  se  uvádí  pacienti  s vysokou  pravděpodobností  zachycení trombofilie  před 45. rokem života, opakované trombotické ataky, atypická  lokalizace  trombózy,  tepenná  trombóza  před  35.  rokem  života,  pozitivní  rodinná  anamnéza  na  mutace  genů,  ženy  s opakovanými  komplikacemi  v těhotenství  anebo  pacienti s přímými příbuznými se známou trombofilií.   Pro klinickou praxi byl vytvořen tzv. skórovací systém, podle kterého se indikuje  vyšetření na možnou trombofilii.  Pravděpodobnost záchytu: vysoká 2 body, střední 1 bod, malá 0 bodů, praktický  dopad:  významný  pro  vyšetřovanou  osobu  2  body,  významný  pro  dosud  nevyšetřeného přímého příbuzného 1 bod, malý 0 bodů.  37   

 

Otázka druhá: U koho je indikována primární prevence TEN?   Cílem primární prevence je snížení rizika trombózy. V praxi to znamená podání  a  délku  farmakoterapie  u  všech  pacientů  se  silnými  provokujícími  faktory  žilního  tromboemboliusmu.  Mezi  pacienty  se  silnými  provokujícími  faktory  řadíme  př.:  A.  operace,  B.  úrazy,  C.  imobilizace  s dalšími  faktory,  D.  chemoterapeutické  režimy  u  nádorů.    Ostatní  provokující  faktory  mohou  být  př.  sádrová  fixace  dolních  končetin,  imobilizace na 72 hodin, dlouhodobě zavedený centrální katétr, gravidita a šestinedělí,  hormonální  antikoncepce,  terapie  možnými  antiestrogeny,  kortikoidy,  nebo  také  tzv.  „long distance travel“ – dlouhodobý let.    Otázka třetí: Jaký je optimální způsob a délka trvání sekundární prevence TEN?   Sekundární prevence rekurence (opětovný výskyt) tromboembolických nemocí  může  být  například  protrhovaná  léčba  kumarinovanými  preparáty,  nebo  ukončení  a  následná trombofylaxe v rizikových situacích.  Rozhodnutí u každého pacienta musí být  zváženo  riziko  rekurence,  což  je  přítomnost  nebo  nepřítomnost  trombofilie.   K protrhované antikoagulační léčbě jsou indikovány pacienti s přetrvávajícími příčinami  TEN  (systémové  onemocnění,  malignita,  mechanická  překážka,  apod.),  neúplná  rekanalizace cévního řečiště, deficit antitrombinu, idiopatická trombóza.   Otázka čtvrtá: Jaký je význam trombofilií u profylaxe s komplikacemi v graviditě?   Vyšetření  trombofilií  a  antifosfolipidových  protilátek  je  indikováno  u  všech  pacientek po opakovaných časných potratech, po ztrátě plodu v 2. trimestru, po těžké  či  opakované  preeklampsii  a  po  porodu  mrtvého  plodu.  Není  doporučen  rutinní  screening mutací faktoru V Leiden a protrombinu G20210A u těhotných  [Trombofilní  stavy významné v patogenezi žilní tromboembolické nemoci, 14.]  Při vyšetření musí být vždy předložen fakt, zda se o přítomnost trombofilních  stavů nebo defektů, viz kapitola 11.1 Indikace vyšetření trombofilií, které ovlivní léčbu  a profylaxi u nositelů mutací. Nemělo by se však provádět vyšetření, kde není značná  mutace či polymorfizmus a není jasné, proč se vyšetření indikuje.  

38   

 

Vždy poskytneme řádnou edukaci pacienta o možném typu mutací, rizicích a  příkladné prevenci či profylaxi. U zdravých jedinců bychom měli vysvětlit možné rizika  mutací, defektů a neměli bychom jej bezpředmětně vystrašit!       

12  Kazuistika 

pacientů 

s 

tromboembolickým 

          onemocněním způsobené rizikovými faktory HT             Při  své  praxi  jsem  se  seznámil  s několika  kazuistik  pacientů  z  Hematologicko‐ transfuzního  oddělení  Oblastní  nemocnice  Kladno.  Bylo  mne  umožněno  výběru  pacientů  s rizikovými  TEN,  způsobené  mutacemi  faktorů  V Leidenu  a  II  Protrombinu,  které bych rád zde uvedl. Celkový sběr z období r. 2011 byl 34, z toho jsem zde umístil  8  kazuistik  s odlišnými  diagnózami,  kdy  po  provedení  PCR  screeningu  byla  potvrzena  mutace genů (dg: gravidita, CMP, Palpitace, Cholecystolithiaza,…).   

12.1  Kazuistika č. 1 – Pacient 34 let, FV Leiden a F II Protrombin mutace  Pohlaví: Muž          Věk: 34 let  Osobní anamnéza (OS): Operace oka, jinak 0, úrazy nebyly, nekuřák.   Rodinná anamnéza RA): Trombózy v rodině nejsou, CMP ani IM v mladším věku nebyly  Farmakologická anamnéza (FA): Negativní    Alergická anamnéza (AA): Pobodání hmyzem  Zdroj informací: Pacient    Nynější onemocnění (NO) – zjištěna mutace FV Leiden v heterozygotní formě, odeslán  k vyšetření a dispenzarizaci.    Objektivní nález:  Laboratoř:  Provedena PCR – FVL heterozygot, FII 20210 heterozygot, MTHFR C677T bez mutace,     Hemocystein 9,1    AT 107%, APCR index 1,56 – svědčí pro APC rezistenci, PC 120%, PS 116%, FVIII 132%,  FIX 100%, LA scr. 50,1 sec, R 1,49, LA konfirm. 41,1 sec, R 1,22 – LA slabě pozitivní    Závěr: FV Leiden heterozygot, FII 20210 heterozygot    39   

 

Diagnoza: D689 Vada koagulace NS     

12.2  Kazuistika č. 2 – Pacientka 35 let, FV Leiden mutace   Pohlaví:  Žena         Věk:  35 let  OS:  Trombózu neprodělala, úrazy nebyly  RA:  Matka prodělala v graviditě trombózu, dědeček z matčiny strany 2x trombóza  Z otcovy strany též dědeček prodělal trombózu. Bratr v dětství imunitní problémy, nyní   pouze polyvalentní alergie.                                                                  FA:  Clexan   AA:  Negativní   Gynekologická anamnéza (GA): V první graviditě užívala Anavenol a nosila kompresní   punčochy. HAK užívala 15 let, bez komplikací (indikováno pro nepravidelnost cyklu).        Zdroj informací:  Pacient    NO – gravidita 27. týden, začala opět nosit kompresivní punčochy – měla pocit pnutí  v DK,  křeče  v tříslech  –  potíže  na  čas  vymizely.  Clexan  toleruje  lépe  po  změně  desinfekce. Pouze občas zarudnutí v místě vpichu.    Laboratoř: 14. 2. 2012  KO: Ery 3,98, Hb 111, Ht 0,33, MCV 83, Leu 8, Neu 0,69, Mon 0,07, Eos 0,02, Bas 0,01,  Lym 0,22, Neu abs poč. 5,5, Trom 233  Koag: Quick 10,8, INR 0,94, APTT 35,3, index 1,06, D‐dimery 660, Antitrom 104, Fibrin  4,16, Anti Xa/LMWH aktiv 0,345    Závěr: FV Leiden heterozygot, nyní gravidita 27. Týden.    Doporučení: Clexane 0,6 ml 1 x denně s.c.     Diagnoza: D689 Vada koagulace NS      

12.3  Kazuistika č. 3 – Pacientka 20 let, FV Leiden mutace   Pohlaví:  Žena         Věk:  20 let  OS: Operace 0, úrazy 0, nekouří, rekreační sport ‐ aerobic  RA:  Babička zemřela ve 43 letech na leukemii, jinak v rodině nebyly trombózy, náhlá   smrt ani IM či CMP v mladším věku nebyly.                                                                        FA:  Negativní  AA: Negativní  Zdroj informací: Praktické lékař    40   

 

NO – Odeslána k vyšetření pro susp. prodělanou trombózu při cca 9 měsíci s trvajícím  užívání HAK.  Nyní bez potíží, odeslána k doplnění vyšetření trombofilních markerů    Laboratoř:   Provedena PCR – FV Ledien heterozygotní forma mutace   3. 11. 2011  KO: Ery 4,5, Hb 132, Ht 0,4, MCV 88, Leu 6,3, Neu 0,53, Mon 0,09, Eos 0,01, Bas 0,01,  Lym 0,36, Neu abs poč. 3,3, Trom 216  Koag: Quick 11,7, INR 1,02, APTT 35,7, index 1,07, APTT FS 26,7, index 0,97, D‐dimery  88, Antitrom 92, APC rez V 1,51, P C 84, P S 107, F VIII 70, F IX 94, F VII 85, LA screen  sec 32,6. Nález svědčí pro přítomnost APC rez. Z přítomnosti FV Leiden. Index odpovídá  heterozygotní  formě  mutace,  LA  negativní,  G20210A  –  Protrombin  –  zdravý  homozygot.  Elisa: AB/Kardiolip IgG, A, M – negat., AB/Beta‐2‐GPI IgG, A,M – negat.     Závěr: FVL heterozygot, susp. St. p. prodělané trombóze – klinické potíže s negativním  DUS – s odstupem cca 14 dní po odeznění potíží.    Doporučení:  Užívání  HAK  neschvalujeme,  poučena.  Dále  nutné  preventivní  podání  LMWH  v období  imobilizace  končetin,  před  delšími  lety  letadlem  a  cestami  autem  či  autobusem – poučena.    Diagnoza: D689 Vada koagulace NS     

12.4  Kazuistika č. 4 – Pacient 37 let, FV Leiden mutace  Pohlaví: Muž          Věk: 37 let  OS: Operace kolene 5/2010 v epid. anestesii, poté postpunkční sy, spontánně upravený   během cca 7 dnů. Od operace kolene otok PDK, bolesti. Diagnostikována trombóza   v obl. lýtka. Kontrolní duplex 25. 1. 2011 oboustranná průchodnost hlubokého žilního   systému od třísel do podkolení, ve v. poplitea nástěnné změny, susp. uzávěr jedné   z mediálních větví lýtkových žil. Proti 8/2010 zlepšeno. Kontrolní duplex 11. 8. 11 – PDK   st. p. popliteocrurální trombóze dx., přetrvávající lehké nástěnné změny ve v. poplitea,   susp. Přechod do crurálních žil. Nález se proti minulosti nemění.  LDK – hluboký žil. Systém od třísel do podkolenní průchodný, nejsou zn. Insuficience.  Hypertenze – definitivně potvrzeno a nyní na terapii Prenesa 4 mg 1x1  RA: Oba rodiče zemřeli náhlou smrtí v 55 a 63 letech, sestra zdravá       FA: Prenesa 4 m 1x1, Warfarin            AA: Negativní  Zdroj informací: Chir. odd.    NO:  Od  1.  9.  2011  vysazen  Warfarin,  kontrola  DDi  během  prvního  týdne  po  vysazení  s norm. hodnotou. DK nebolí, otoky pouze při větší zátěži, nadále bez problémů. 4. 10.  41   

 

2011  vyšetřen  na  pohotovosti  pro  biliární  koliku.  SONO  –  cholecystolithiaza,  susp.  Cholecystitida. Od té doby recidivující potíže, plánována CHCE začátkem března 2012.    Laboratoř:   Sérum: Na 138, K 4,2, Cl 98, Urea 3,6, Kre 79, bili 12, ALT 0,56, GMT 0,32, AL“P 1,09,  AST 0,37, glu 4,8  KO: Ery 5,12, Hb 148, Ht 0,44, MCV 86, Leu 8, Trom 252  Koag: Quick 12,4, INR 1,07, APTT 34,8, index 1,04  Moč: hust 1023, pH 6,5, Bil, Glu, Ac, Urobil, Bil 0, Nit, Ery perox, Leu ester neg.  M+Š: Leu, Epi kul 0, Hlen 1  PCR: FV Leiden – heterozygotní forma mutace, MTHFR A1298C – heterozygotní forma  mutace s norm. hladinou homocysteinu.    Závěr:  FV  Leiden  heterozygot,  MTHFR  A1298C  homozygotní  mutace  s normální  hladinou  homocysteinu.  St.p.  HŽT  po  operaci  kolene  5/2010,  diagnostikována  a  zaléčena až v 8/2010, dle kontrolního DUS není plná rekanalizace trombotizované žíly.  Antikoagulační  terapie  ukončena  9/2011  s následnou  kontrolou  d  Dimeru  –  bez  zn.  Recidivy.  Cholecystolithiasis – plánována operace    Doporučení: Vzhledem k trombofilnímu riziku při FVL v heterozygotní formě mutace a  prodělané  trombóze  s ne  zcela  plnou  rekanalizací  doporučujeme  pokrytí  operace  nízkomolekulárním  heparinem  v dávce  minimálně  0,6  ml  v preventivním  režimu  (1  x  denně).     Diagnoza: D689 Vada koagulace NS            

12.5  Kazuistika č. 5 – Pacient 53 let, FV Leiden mutace  Pohlaví: Muž         Věk:  53  NO: 15.  6.  2011 pro pocit celkové slabosti  vyšetřen internistou, zjištěny zvýšené DDi.  Vyšetřen  na  kardiologii,  nasazen  Zibor.  Po  cca  3  dnech  z plného  zdraví  palpitace,  objevily  se  ve  spánku,  bolesti  na  hrudi  ani  dušnost  necítil.  Vyšetřen  kardiologem  –  ECHO, duplex SONO s norm. nálezem. Po týdnu se Zibor vysadil, kontrolní Ddi z 28. 6.  2011 již negativní.  Pro  recidivu  palpitací  znovu  odebrán  DDi  –  opět  vzestup  na  725  (OKBH  Kladno)  a  provedena  scinti  plic  s negativním  nálezem.  Palpitace  zaléčeny  sedací  a  Trimepranolem. Trvale od té doby užívá Citalopram.  Od 19. 8. 2011 aplikuje Zibor, bez komplikací. Cítí se dobře, palpitace nebyly. Vyšetřen  endokrinologem  k vyš.  Podílu  thyreopatie  na  arytmiích  –  vše  normě,  hlad.  Hormonů  v mezích,  SONO  št.  zl.  –  lehce  nehomogenní,  hraniční  velikost,  bez  jednoznačných  ložiskových změn. Uzavřeno jako normální nález.  42   

 

      Laboratoř:  Koag: Quick 11,5, INR 0,98, APTT 32,2, index 1,02, D‐dimery 0, Antitrom 90, Fib 2,08,  APC  rez  V 1,56,  PCR:  PC  rezistence  z přítomnosti  FV  Leiden.  Index  odpovídá  heterozygotní formě mutace  FV Leiden – heterozygotní mutanta  C677T MTHFR – heterozygotní mutanta  G20210A Protrombin – zdravý homozygot  A1298C MTHRF – zdravý homozygot    Závěr: Po zahájení Ziboru normalizace DDi. Z této skutečnosti soudíme, že se skutečně  jednalo  o  trombózu,  lokalizace  nejspíše  v pánevních  plexech.  Otázka  drobné  plicní  embolizace je nejasná vzhledem k negativitě scintigrafie.    Doporučení: Zibor 10000 J 1 x denně po dobu 3 měsíců.     Diagnoza: D689 Vada koagulace NS       

12.6  Kazuistika č. 6 – Pacientka 39 let, F II Protrombin mutace  Pohlaví:  Žena         Věk:  39 let  OS: Trombózu neprodělala, operace – APE, sactio caesarea, grav. Extrauterina, opka.  drobné výkony – gynekologie. Sádrová fixace LHK pro frakturu v zápěstí.   RA: Matka 0, otec pozitivní FII C20210A protrombin – heterozygot, bratr po   embolizační CMP s nálezem FII C20210A Protrombin.   FA:  0  AA: 0  Zdroj informací: Praktické lékař  NO: Během uplynulého roku výraznější únava v posledních týdnech, silné menstruační  krvácení. Otoky DK neměla. Snadnější tvorba hematomů.  Laboratoř:  Homocystein  6,3,  APC  rez  V 1,49,  PC  98,  PS  100,  PCR  nález  pro  přítomnost  APC  rezistence z přítomnosti FII C20210A Protrombin – heterozygotní forma mutace.    Závěr:  FII  C20210A  Protrombin  heterozygotní  mutanta,  st.p.  opak.  operacích  a  graviditách  bez  tromboembolických  komplikací.  St.p.  porodu  sekcí  23.  8.  2010  bez  komplikací.  Doporučení:  Pokrýt  aplikací  LMWH celkem  3  týdny  po  porodu  –  vydáno  10  inj.  Zibor  2500 J.   43   

 

Diagnoza: D689 Vada koagulace NS     

12.7  Kazuistika č. 7 – Pacient 21 let, FV Leiden mutace  Pohlaví:  Muž          Věk:  21 let  OS: Úrazy 0, operace kýly v 15 letech, zdráv  RA: Otec náhodně zjištěn trombofilní stav – konkrétně neuvedeno o co přesně se   jedná. Matka trombózu neprodělala.  FA:  0  AA: 0  Zdroj informací: Praktické lékař  NO: Odeslán k vyšetření vzhledem k rodinné zátěži.  Laboratoř:  Homocystein  6,3,  APC  rez  V 1.52,  PC  99,  PS  100.  Nález  svědčí  o  přítomnosti  APC  rezistence z přítomnosti FV Leiden – heterozygotní forma mutace. Provedena PCR.  PCR: FV Leiden – heterozygotní forma mutace, MTHFR C677T – heterozygotní forma  mutace  pro  C677T,  MTHFR  A1298C  –  heterozygotní  forma  mutace  pro    A1298C,  FII  C20210A Protrombin – zdravý homozygot.    Závěr: FVL heterozygot, MTHFR heterozygot pro oba typy mutací, bez vlivu na hladinu  homocysteinu.    Doporučení:  Důsledná  prevence  trombózy  aplikací  LMWH  v rizikových  situacích  –  poučen,  vydán  průkaz.  Vzhledem  k norm.  hladinám  homocysteinu  není  nutná  substituce  vitamínů,  přesto  doporučujeme  nestravovat  se  vegetariánsky  (nutný  dostatečný přísun B12).    Diagnoza: D689 Vada koagulace NS     

12.8  Kazuistika č. 8 – Pacientka 38 let, FV Leiden mutace   Pohlaví:  Žena           Věk: 38 let   Zdroj informací: Neurologické odd.     NO:  V minulosti  u  nás  vyšetřena  po  mozkové  ischemii  (výpadek  zorného  pole,  opak.  dvakrát).  Dále  komplikace  v graviditě  2x  problémy  s donošením  plodu,  v té  době  nebyla ještě stran trombóz rizik vyšetřena. 1x spontánní abortus (při první graviditě).  12/2006 zjištěna hladina F VIII a FV Leiden v heterozygotní formě mutace.     44   

 

Medikace – Euthyrox, vitamíny pro gravidní  Placenta praevia, opakovaně hospitalizována pro předčasnou porodní činnost, nakonec  předčasně  po  odtoku  plodové  vody  porod  s.c.  4.  12.  2010.  Clexan  aplikace  do  konce  šestinedělí  (polovina  ledna  2011),  poté  nasadila  Anopyrin  100  mg/den.  Cítí  se  dobře,  vizus bez výpadků.     Laboratoř:   CRP 10, KO: Er 4,79, Hb 0,41, MCV 85, Leu 7, Neu 0,57, Mono 0,09, Eos 0,04, Bas 0,0+,  Neu abs 4, Tromb 261  Koag: Quick 11,1, INR 0,97, index 0,97, APTT 30,7, index 0,92, D‐dimery 70, Antitromb.  86, F VIII 148, LA screening sec 33,5, Anti Xa LWMH aktiv. 0,00  Šz: T4 15,1, TSH 2,273    Závěr:  FV  Leiden  –  heterozygotní  forma  mutace,  vyšší  F  VIII  v úvodu.  St.p.  susp.  Mozkových ischemiích transitorního char. – projevilo se opak. výpadky zorného pole –  sledována na neurolog. ambulanci.    Doporučení: Anopyrin 100 mg    Diagnoza: D689 Vada koagulace NS        12.1.2  Hodnocení kazuistik:   

Z vybraných  kazuistik  je  patrné,  že  laboratorní  vyšetření  na  tromboembolické  onemocnění  způsobené  rizikovými  faktory  (hereditární  trombofilie)  jsou  jedním  z nosných  pilířů  oborů  hematologicko‐transfúzního  a  klinicko  biochemického  velmi  rozsáhlé a důležité k dopomoci správného stanovení diagnóz. Rád zde bych uvedl, že  tromboembolické  onemocnění  nemusí  postihovat  jen  starší  ročníky,  ale  i  ročníky  mladšího  věku  viz  kazuistika  č.  3  –  pacientka  20  let:  s prodělanou  trombózou  a  kazuistika  č.  7  –  pacient  21  let:    FVL  heterozygot  a  MTHFR  heterozygot  pro  oba  typy  mutací.         

45   

 

13   Diskuze  Vzhledem  k tomu,  že  pracuji  na  odd.  Signální  transdukce  Akademie  Věd  ČR,  v.v.i.,  Praha  4  Krč,  kde  zastávám  funkci  technicko‐vědeckého  pracovníka  a  deteguji  a  genotypizuji laboratorní zvířata (lab. myši) metodou PCR, jsem si zvolil téma své práce  Nová metoda qPCR genotypizace z periferní lidské krve u hereditární trombofilie.    

Ve  své  praktické  části  jsem  se  specializoval  na  určení  jednobodových  mutací 

Faktoru  V Leidenu  a  Faktoru  II  Protrombinu,  které  se  v  67%  používají  v klinických  laboratořích. Při této metodě  je povinna izolace DNA z periferní lidské krve, která má  za  následek  finanční  a  časovou  přítrž.  Existuje  mnoho  firem,  již  nabízející  spousty  nových  a  bezkonkurenčních  izolačních  setů  pro  přípravu  DNA  z periferní  lidské  krve,  avšak  za  vysokou  finanční  částku  (v  průměru  2500  –  16.000,‐  Kč  za  izolační  sety  pro  analýzu  32  ‐  300  vzorků  krve).  Dále  jsem  chtěl  zde  uvést  možné  kazuistiky  pacientů  s rizikovými  faktory  HT,  které  mají  značný  podíl  na  vzniku  tromboembolických  onemocnění.  Jsem  přesvědčen,  že  díky  této  nové  metodě  se  finanční  problém  zjednoduší  a  časový hendikep zkrátí. Je zde prokázán nový rozvoj při určení analýzy jednobodových  mutací, nejen pro FVL a FII Protrombinu, ale i pro ostatní analýzu onemocnění.    Při  zpracování  této  absolventské  práce  jsem  se  seznámil  s mnoho  metod,  laboratorních  postupů  a  příkladných  tromboembolických  onemocnění  zapříčiněnými  rizikovými faktory HT, které mne usvědčili, že přínos této nové metody je první krok do  „laboratorních vyšetření a diagnostik bez nutnosti izolace DNA z periferní lidské krve.  Práce  však  může  být  zdokonalena,  zkvalitněna  o  standarty  analýz  měření,  při  diplomové nebo dizertační práce.           

46   

 

14   Závěr   Hlavním cílem mé absolventské práce bylo charakterizovat novou metodu qPCR  genotypizace  z periferní  lidské  krve  u  Hereditární  trombofilie  (HT).  Tento  úkol  jsem  splnil a snažil jsem zde popsat jednotlivé kroky, které pomohou k dalšímu zkvalitnění  této  metody.  Druhý  krok  hlavního  cíle  bylo  ověření  použitelnosti  nové  metody  qPCR  z celé  krve  u  stanovení  analýz  jednobodových  mutací  Faktoru  V Leidenu  a  Faktoru  II  Protrombinu u HT. Použitelnost nové metody zde byla srovnána s metodou z klinické  laboratoře  u  stanovení  40  pacientů  trpící  možnou  dědičnou  mutací.  Nová  metoda  je  srovnatelná a použitelná k analýze dědičných mj. mutací Faktoru V Leidenu a Faktoru II  Protrombinu.   Dílčím  cílem  bylo  zjištění  kompatibility  reakčních  směsí  s qPCR,  kde  narůstá  problém s působením inhibitorů, především hemoglobinu a leukocytů. Zde jsem popsal  srovnání  různých  reakčních  směsí,  které  se  používají  v klinických  laboratořích  a  také  jsem  stanovil  reakční  směs  odbourávající  inhibitor  –  hemoglobin  a  stabilizující  leukocyty.   Závěrem celé práce byl výběr jednotlivých kazuistik pacientů, které měli příčinu  jednobodových mutací Faktoru V Leidenu a Faktoru II protrombinu (HT) za příčiněné ke  vzniku tromboembolických onemocněních.     Stanovené cíle jsem splnil a doufám, že moje absolventská práce bude k přínosu  vedoucím  klinických  laboratoří,  hematologických  a  transfuzních  oddělení,  studentům  zdravotnických, přírodovědeckých a technických oborů, tak i odborné veřejnosti.                  

47   

 

15  Summary   

A new method of qPCR genotyping from peripheral of human blood from  patients with hereditary thrombophilia  Determination  of  DNA  by  PCR  is  often  used  DNA  isolated  from  human  blood  using  genotypitaze  a  method  of  determining  genetic,  or  genetic  (DNA)  information  concerning the character or characters examined. This method is used in a wide range  of diagnostic setting, such as determining the presence of mutant genes (especially in  oncology),  detection  of  viral  and  bacterial  infections  and  determining  paternity.  In  addition to determining the presence of the gene (qualitative test) can determine the  number of copies of the gene studied by quantitative RT‐PCR.  The  problem  with  many  of  these  determinations  is  the  necessity  of  DNA  isolation from blood, which represents the time and financial burden. Amplification of  DNA directly from blood using conventional methods of PCR is not possible, because  the  blood  contains  many  components  that  inhibit  PCR/qPCR.  These  are  mainly  immunoglobulins  and  hemoglobin,  which  inhibit  the  amplification  reaction,  even  in  small quantities.   The practical part of my work proposes a new method for qPCR genotyping of  composite human blood and simultaneously to determine compatibility with the qPCR  reaction  mixtures  where  the  increasing  problem  with  the  effects  of  inhibitors,  especially hemoglobin. Finally, the whole work will focus on verifying the applicability  of qPCR from whole blood in the various diseases diagnosed by using qPCR hereditary  thrombophilia.    Key words:   Polymerase  chain  reaction,  quantitative  polymerase  chain  reaction,  genotypization, PCR inhibitors, melting curve analysis, hereditary thrombophilia 

48   

 

  Seznam použité literatury   

Knižní publikace  1. Martínková Jiřina a kolektiv., Farmakologie pro studenty zdravotnických oborů.  Grada 2007, ISBN: 978‐80‐247‐1356‐4.  2. Mourek, Fyziologie: učebnice pro studenty zdravotnických oborů. Grada 2005,  ISBN 80‐247‐1190‐7  Vědecké publikační články  3. Horáková  et  al.,  1,2‐propanediol‐trehalose  mixture  and  a  potent  quantitative  real‐time PCR enhancer. BMC Biotechnology 2011, č. 11.  4. Shaik  GM  et  al.,  Tetraalkyammonium  derivatives  as  real‐time  PCR  enhancers  and stabilizers of the qPCR mixture containing SYBR Green I., Nucleic Acids Res.  2008, č. 15, 2‐10.  5. Endler  et  al.,  Multiplexed  Mutagenically  Separated  PCR:  Simultaneous  Single‐ Tube  Detection  of  the  Factor  V R506Q  (G1691A),  the  Prothrombin  G20210A,  and  Methylenetetrahydrofolate  Reductase  A223C  (C677T)  Variants.  Clinical  Chemistry 2001, č. 2, 333‐335.  6. Morteza Bagheri and Isa Abdi Rad, A Multiplex Allel Specific Polymerase Chain  Reaction  (MAS‐PCR)  for  the  Detection  of  Factor  V Leiden  and  Prothrombin  G20210A. Medica – a Journal of Clinical Medicine 2011, č. 1.  7. Raušová  E.,  Hadačová  I.,  Macek  M.,  Hereditární  trombofilie  –  jeden  z modelů  molekulární medicíny. Klinická biochemie a metabolismus 2005, č. 2, p.68‐76.  8. Tajed Pajič, Factor V Leiden and FII 20210 testing in thromboembolic disorders.  Clin.Chem.Lab Med 2010, č. 48, S79‐S87.  Internetové stránky  9. Krajská  nemocnice  Liberec,  a.s.,  Oddělení  Klinické  biochemie,  Hereditární  trombofilie  49   

 

[on‐line]. 2011. Dostupný z WWW:    10. Petr  Schneiderka  a  kolektiv,  Vybrané  kapitoly  z klinické  biochemie,  [on‐line].  2000 [cit. 2000‐10‐05]. Dostupný z WWW:     11. Margaret  Hunt,  Microbiology  and  Immunology  –  Real  time  PCR,  [on‐line].  2009. Dostupný z WWW:    12.  Genetika – Krevní skupiny a jejich dědičnost. Dostupný z WWW:    13. Základní principy kvantitativní real‐time PCR. Dostupný z WWW:     14. Trombofilní  stavy  významné  v patogenezi  žilní  tromboembolické  nemoci.  Doporučení pro klinickou praxi. Dostupný z WWW:    15. Indikace k vyšetření rizikových faktorů žilní trombózy. Dostupný z WWW:                          50   

 

         

51