Nieuwe anti-tumor therapie ontwikkelingen in de moleculaire pathologie therapie op maat
Ed Schuuring Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie Hoofd Laboratorium Moleculaire Pathologie Hoogleraar Moleculaire Oncologische Pathologie Afdeling Pathologie UMCG
De klassieke diagnostiek van kanker
Classificatie op basis van histologie
2014
Aangevuld met immunohistochemische kleuringen (e.g. HER2, ER, PR)
Klassieke pathologie: behandelkeuze op basis van histologie
Longkankerpatiënten
diagnose
Selectie voor behandeling
therapie
Histopathologische diagnose
Adenocarcinoom
Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie
plaveiselcel carcinoom
Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie
grootcellig carcinoom
Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie
kleincellig carcinoom
Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie
Moleculaire Pathologie
2001: De DNA volgorde van het hele humane genoom is ontrafeld
Niet de veranderingen in het DNA, maar ook verschillen in RNA/eiwit expressie zijn klinische/biologische relevant
DNA: 6.000.000.000 nucleotiden/cel RNA/eiwit: ~30.000 genen
Functioneel eiwit
Welke genetische veranderingen ? Chromosomale deleties DNA amplificaties Puntmutaties Chromosomale translocaties Numerieke chromosoom afwijkingen
Expressie-verschillen Polymorfismen Exogene agentia (bv virussen)
Anno 2015 beschikken we over veel moleculaire
methoden om genetische afwijkingen te detecteren
De moleculaire pathologie van borstkanker
Voorbeelden van genprofielen die prognostisch zijn in borstkanker
• • • •
Mammaprint (70 genen) Oncotype DX (21 genen) 76 gene profile (Rotterdam) PAM50 (50 genen)
Microarray (gen-expressie) analyse voor de vaststellen van de prognose van patiënten met een mammacarcinoom
Cut-off
van 't Veer, Nature 415, 530-536; 2002
Microarray (gen-expressie) analyse voor de vaststellen van de prognose van patiënten met een mammacarcinoom
Significant verschillend expressie profiel (70 genen)
MAAR predictie is niet perfect !
Vals-positieve uitslag
Vals-negatieve uitslag
van 't Veer, Nature 415, 530-536; 2002
Gen-gerichte therapie in borstkanker therapie op maat als één van de klassieke voorbeelden in de oncologie • ER-positief mammacarcinoom: tamoxifen • HER2-positief mammacarcinoom: herceptin
• BRCA1/2-positief mammacarcinoom: olaparib
the ErbB Family of Cell Surface Receptors
Extracellular Domain Transmembrane Domain Intracellular TK Domain
ErbB3 (HER3) ErbB1 (EGFR) Amgen slide
ErbB2 (HER2/neu)
ErbB4 (HER4)
ligand/groeifactor
erbB/ receptoren
2 = erbB2 = HER2/neu
ligand/groeifactor
erbB/ receptoren
Gecontroleerde groei migratie Regulatie celdood
Her2/neu expressie en gen amplificatie
‘0’ (negatief)
‘1+’ (negatief)
‘2+’ (twijfelachtig) (23-43%)
‘3+’ (positief) (~15%)
Plaatjes courtesy of Wesseling, Nederlof, Bart Wolff, ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 and 2013 (Guideline recommendations)
ligand/groeifactor
erbB/ receptoren
Groei Metastasering Remming apoptose
ligand/groeifactor
erbB/ receptoren
Remming celdeling Voorkomt metastasering Induceert apoptose
+ Herceptin
Her2/neu expressie en gen amplificatie
Geen Herceptin-behandeling
‘0’ (negatief)
Herceptin-behandeling ???
‘2+’ (twijfelachtig) (23-43%)
Geen Herceptin-behandeling
‘1+’ (negatief)
Herceptin-behandeling
‘3+’ (positief)
Plaatjes courtesy of Wesseling, Nederlof, Bart Wolff, ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 and 2013 (Guideline recommendations)
HER2/neu amplificatie in borstkanker Mbv FISH (moleculaire test) FISH
Amplificatie her2
FISH
normaal
Moleculaire Pathologie UMCG
Her2/neu test-algoritme (inter)nationale richtlijn mammacarcinoom
ISH
IHC 0
1+
2+
3+ Herceptin® Therapie
ISH -
+ Herceptin® Therapie
Wolff, ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 and 2013 (Guideline recommendations)
-
+ Herceptin® Therapie
Mutaties om patiënten te selecteren voor beschikbare gen-gerichte therapie
Dancey Cell 2012
De moleculaire pathologie van longkanker
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie (2015)
In 2007: gestart met EGFR-mutatie screening
In 2013: Landelijke richtlijn “Niet-kleincellig longcarcinoom” (23-05-2011) De enige moleculair-diagnostische test in de huidige richtlijn !!!
In 2013: ALK-ELM4 translocatie (crizotinib geregistreerd vanaf 2012)
“Lazarus Response” to Gefitinib: Chemoresistant EGFR mutant adenocarcinoma
January 2002
October 2004 Johnson 2004
Activating Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Underlying Responsiveness of Non–Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib
NEJM (2004) 350:2129-2139
Thomas J. Lynch, M.D., Daphne W. Bell, Ph.D., Raffaella Sordella, Ph.D., Sarada Gurubhagavatula, M.D., Ross A. Okimoto, B.S., Brian W. Brannigan, B.A., Patricia L. Harris, M.S., Sara M. Haserlat, B.A., Jeffrey G. Supko, Ph.D., Frank G. Haluska, M.D., Ph.D., David N. Louis, M.D., David C. Christiani, M.D.,Jeff Settleman, Ph.D., and Daniel A. Haber, M.D., Ph.D.
Science (2004) 304:1497-1500
PNAS (2004) 101:13306-13311
Response to gefitinib in a patient with refractory non-small-cell lung cancer to chemotherapy with EGFR exon 21 mutation
Improvement in 6 weeks
De ziekte-vrije-overleving van NSCLC patiënten met/zonder EGFR-mutatie behandeld met gefitinib
Mok T et al, NEJM 2009
Belangrijkste resultaten van de behandeling van NSCLC met TKI (erlotinib/gefinitib) 1) Verbeterde ziekte-vrije overleving voor patiënten met EGFR-mutatie 2) Verbeterde overleving voor patiënten met EGFR-mutatie (m.n. primair NSCLC) 3) Veel geringere mate van bijwerkingen i.t.t. chemotherapie 4) Verbeterde kwaliteit-van-leven
Bepalen van de EGFR-mutatie-status is belangrijk onderdeel van de nieuwe landelijke richtlijn “Niet-kleincellig longcarcinoom” (dd 23 mei 2011)).
Detectie van mutaties in EGFR Waar zitten de mutaties ? hotspots 18
G719 (~5%)
19
LREA deletions (45-50%)
P- loop
Extracellular domain
C- helix Transmembrane
region ATP binding cleft
duplications/ insertions (~5%)
20 N-lobe
TK C-lobe
T790M (3-5%)
domain
Regulatory
A- loop
domain EGFR-EIWIT-MOLECULE
Sequist JCO 2007, 25; 587
L858R (35-45%) 21
L861 (~2%)
EGFR-GEN en EXONEN
De ziekte-vrije-overleving van NSCLC patiënten met/zonder EGFR-mutatie behandeld met gefitinib
Mok T et al, NEJM 2009
Alle longkankerpatiënten behandeld met EGFR-TKI worden uiteindelijk therapie-resistent
Resistant EGFR mutations
Sequist et al, Sci Transl Med 2011 3:75ra26
Detectie van mutaties in EGFR TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties
tegen EGFR-targeted therapie
G719 (~5%)
19
LREA deletions (45-50%)
D761Y L747S
duplications/ insertions 20 T790M
T854A
L858R (35-45%) 21
L861 (~2%)
< 5% TKI-resistente EGFR mutaties
EGFR-mutaties die gevoelig zijn
18
voor EGFR-targeted therapie
EGFR-mutaties met resistentie
hotspots
~90% TKI- sensitieve EGFREGFR-GEN en EXONEN
mutaties: del19 en L858R
Presence of T790M mutations in tumor-biopsy and decreased progression-free survival
Maheswaran S et al. N Engl J Med 2008;10.1056
Tumor regression by T790M mutation status with afatinib + cetuximab
PS: alleen in trial-verband verkrijgbaar (2015)
Horn L, Groen HJM et al WCLC 2011
PS: alleen in trial-verband verkrijgbaar (2015)
Nieuwe drugs gericht tegen specifieke EGFR-mutaties voorbeeld
PS: alleen in trial-verband verkrijgbaar (2015)
Ohashi JCO 2013
Progression-free survival in EGFR exon 19 deletion and L858R point mutation with EGFR-TKI
Detectie van mutaties in EGFR TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties hotspots
254 EGFR-mutations associated with TKI-response Only 9D761Y with frequency => 1% L747S
Linardou NatRevCancer 2009
LREA deletions (45-50%)
19
duplications/ insertions 20 T790M
T854A
L858R (35-45%) 21
L861 (~2%)
< 5% TKI-resistente EGFR mutaties
EGFR-mutaties die gevoelig zijn
tegen EGFR-targeted therapie
G719 (~5%)
voor EGFR-targeted therapie
EGFR-mutaties met resistentie
3305 different EGFR-mutations 18
~90% TKI- sensitieve EGFREGFR-GEN en EXONEN
mutaties: del19 en L858R
EGFR mutaties in longkanker EGFR-mutaties: 32.9% (wereldbreed) EGFR-mutaties: 15% (blanken) EGFR-mutaties: 10% (Nederland) EGFR-mutaties: 30% (aziaten) EGFR-mutaties: 60% (non-smoking aziaten)
Dahabreh, meta-analyse Clin Cancer Res 2010
Sasaki Eur J Cancer 2010
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie (2015)
In 2007: gestart met EGFR-mutatie screening
In 2013: Landelijke richtlijn “Niet-kleincellig longcarcinoom” (23-05-2011) De enige moleculair-diagnostische test in de huidige richtlijn !!!
In 2013: ALK-ELM4 translocatie (crizotinib geregistreerd vanaf 2012)
FDA approved Xalkori treatment only in combination with FDA approved ALK-test Abbott/Vysis ALK Break Apart FISH test
Complex patterns detected with ALK-split signal assay Single red (3’) pattern (positive)
Due to deletion of 5’ allele
representing 30% of ALK-positive cases
ALK-breuk in <3.5% NSCLC
FISH-ALK-positive NSCLC
Tumor response on crizotinib in FISH positive EML4-ALK translocation
Before start crizotinib
After 6 weeks of crizotinib
ALK-D5F3-CTS IHC (manueel)
FISH-ALK-positief
FISH-ALK-negatief
ALK-D5F3-CTS IHC (Ventana/Ultrabench)
FISH-ALK-positief
FISH-ALK-positief
Tumor response on crizotinib in FISH ALK positive and IHC ALK positive NSCLC: complete response 26-07-2011
27-09-2011
10-11-2011
FISH-ALKpositief
IHC-ALKpositief By courtesy of prof Harry Groen, UMCG
Anno 2015: “therapie op maat” op basis van 2 gen-mutaties
Longkankerpatiënten
diagnose
Selectie voor behandeling
therapie
Mutattie profiling
Geen mutatie (87%%)
EGFR-mutatie (9%)
Medicijn op maat
ALK-mutatie (3%)
Medicijn op maat
Driver Mutation Incidence In Lung Cancers
Mark Kris JAMA 2014
ROS1-rearrangements in NSCLC target for crizotinib detection of ROS1 breaks using Vysis/Abbott FISH (> Sept 2013)
ROS1-rearrangements in NSCLC: * 9/556 NSCLC (1.6%) • sensitive to crizotinib • detected by FISH (2012: Kreatech/CytoCell) Voor behandeling
na 4 weken
na 8 weken
• >7 partners
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv gen-mutatie-gerichte therapie Vanaf 2015 e.v. (verwachtte toepassingen): • • • • •
“resistente” EGFR mutaties $ FGFR1-amplificatie $ BRAF-mutatie $ KRAS-mutatie $ MET-amplificatie &
(100% AC) (~20% SCC) (< 2% AC) (~40% AC) (4-20% AC)
• • • • • •
ROS1-translocatie & RET/KIF5B-translocatie & HER2-mutatie & EGFR-amplificatie $ PIK3CA-mutatie & DDR1-mutatie
(1.7% AC) (<2% AC) (2% AC) (10% AC) (<5% AC) (~4% SCC)
> next-generation-TKI > BIBF1120 > PLX4732 > sorafenib, … > Metmab, Crizotinib, AMG102, XL880 (GSK1363089) > crizotinib > vandetanib > herceptin > cetuximab, erlotinib, … > mTOR inhibitor, aspirine > dasatinib
Alle testen in kader van klinische trials UMCG is longkanker-expertcentrum en participeert in vele internationale trials
Anno 2015-16: “therapie op maat” op basis van >6 gen-mutaties Longkankerpatiënten
diagnose
Selectie voor behandeling
therapie
Geen mutatie (60%%)
Mutattie profiling
EGFR-mutatie (9%)
Medicijn op maat
FGFR1-mutatie (20%)
Medicijn op maat
MET-mutatie (3%)
Medicijn op maat
ALK-mutatie (3%)
Medicijn op maat
ROS-mutatie (1%)
Medicijn op maat
BRAF-mutatie (3%)
Medicijn op maat
Het in kaart brengen van de mutaties in alle genen in verschillende Longkankerpatiënten m.b.v. genoom-brede sequentie analyse next-generation-sequencing
Resultaat: * in elke tumor zijn >2 genmutaties aanwezig * mogelijkheid voor specifieke genmutatie-gerichte therapie voor elke individuele patiënt
Een arsenaal aan nieuwe farmaceutica gericht tegen kankercellen die aangrijpen op een gemuteerd eiwit gen-gerichte therapie (gene-targeted therapy)
Anno 2015: Moleculaire Pathologie > tumor mutatie profiel > individuele therapie op maat Medicijn op maat
Medicijn op maat Medicijn op maat
Medicijn op maat
Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat
Medicijn op maat Medicijn op maat
Medicijn op maat Medicijn op maat
Medicijn op maat
Medicijn op maat
Medicijn op maat
Medicijn op maat
Medicijn op maat
Medicijn op maat
Medicijn op maat Medicijn op maat
Elke kleur = andere mutatie en ander medicijn op maat
Ellke pijl = moleculaire test
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie anno 2015 binnen lab Moleculaire Pathologie UMCG
• longkanker-mutatie-analyse (EGFR, KRAS, BRAF) • ALK-/ROS1-translocatie en ALK-immunohistochemie
• Sporadisch/op verzoek: PIK3CA, RET, FGFR1
Mutation detection to selected patients that benefit from gene-target-therapy in cancer in general based on registered drugs and guidelines In 2015 (MD-aanvraagformulier-UMCG*): Melanoma mutation testing:
BRAF, NRAS, cKIT
Thyroid carcinoma mutation testing:
BRAF
Lung cancer mutation testing:
EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA, ROS, ALK, RET, HER2, MET
CRC mutation testing:
KRAS, NRAS, BRAF
GIST mutation testing
cKIT, PDGFRA
Breast cancer mutation testing:
HER2
* In 2015 voor targeted therapie: mutatie-profiling mbv next-gen-sequencing met panel 11 genen en FISH voor 5 genen * www.MolOncoPath.nl
Targeted next-generation sequencing (Ion-Torrent)
UMCG-PGM-oncopanel (11-genes; 29 amplicons) ALK codon 1174
GNA11 codon 209
KRAS codon 61
ALKcodon 1275
GNAQ codon 209
NRAS codon 117/146
BRAF exon 15
KIT exon 11
NRAS codon 12/13
EGFR exon 18
KIT exon 13
NRAS codon 61
EGFR exon 19
KIT exon 14
PDGFRA exon 12
EGFR exon 20
KIT exon 17
PDGFRA exon 14
EGFR exon 21
KIT exon 8
PDGFRA exon 18
ERBB2 exon 19
KIT exon 9
PIK3CA exon 20
ERBB2 exon 20
KRAS codon 117/146
PIK3CA exon 9
ERBB2 exon 21
KRAS codon 12/13
Standaard mutatie-test vanaf 01-09-2014 Klinisch gevalideerd volgens ISO15189 Doorlooptijd 5-7 werkdagen (2x/week NGS) Pathologie-verslag: uitgebreid vanaf 1 mei 2015 conform ISO en europese richtlijnen Behandeladvies (lastige cases besproken in wekelijkse Moleculaire Tumor Board)
www.MolOncoPath.nl
Nieuwe ontwikkelingen • Targeted next-generation-sequencing (vanaf 1 september 2014) • Standarisatie, archivering en analyse van de FISH • Moleculaire bloedtest
D
A small biopsy B core-needle biopsy C surgical specimen D cytology E biopsy with very few tumor cells Invasieve methoden zijn nodig om de tumor te biopteren om diagnose te kunnen stellen Biopteren niet altijd mogelijk (erg belastend en risicovol neveneffecten) Biopteren vaak niet toegestaan
Risico op iatrogene metastasering Geen representatief weefsel (kleine tumoren, non-vitaal weefsel, image-negatief
E
Liquid biopsies: the detection of cell-free circulating tumor DNA in plasma (ctDNA)
Crowly E. et al Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013)
Can peripheral blood be used to determine the presence of the tumor ? Plasma: * DNA and circulating tumor DNA (ctDNA) * RNA and circulating tumor RNA (ctRNA) * Proteomic/immunological tumor markers * Pharmacokinetics ([drug]) Leukocytes and circulating tumor cells (CTC) Platelets and tumor RNA
Digital droplet PCR technologie ddPCR
ddPCR-assay: primer-set with HEX-probe for mutation and FAM-probe for wt
Rare Mutation Detection: Example (KRAS G12V) mutant only mut
1% mutant
0.1% mutant
0.001% mutant
0% mutant
mut + wt
wt
0.01% mutant
wt
Biorad
Work-flow of monitoring response to targeted therapy in plasma ctDNA
Tumor volume
Resistant mutations
Druggable mutation
Druggable mutation
Tumor volume
Detection of mutation before treatment (high tumor load): diagnosis/prognosis Monitoring of treatment respons Early detection of therapy-resistent mutation levels (prior to clinical manifestation)
Dank voor uw aandacht
[email protected] www.MolOncoPath.nl
Recente literatuur te lezen in oratie van prof dr Ed Schuuring: http://www.rug.nl/news-and-events/promotioninauguration/2013/06_oratie-schuuring.pdf
Doelgerichte behandelingen bij het gevorderd longkanker 1. 2. 3. 4. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Chemotherapy: “one size fits all” EGFR inhibitors BRAF inhibitors ALK inhibitors ROS1, RET inhibitors FGFR1 inhibitors MET inhibitors KRAS inhibitors HER2 inhibitors PIK3CA inhibitors
H.Groen
Doelgerichte behandelingen bij het gevorderd longkanker 1. 2. 3. 4. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Chemotherapy: “one size fits all” EGFR inhibitors BRAF inhibitors ALK inhibitors ROS1, RET inhibitors FGFR1 inhibitors MET inhibitors KRAS inhibitors HER2 inhibitors PIK3CA inhibitors
Validation of ALK IHC and FISH in relation to response to crizotinib preliminary (Van der Wekken, Groen, Schuuring)
• 21 NSCLC • 21 positive for ALK breaks by FISH (15%) or/and IHC (internat guidelines) • Median % nuclei with ALK breaks: 47% (6-76%) > Tumour response: 12 pts with median of 51% (6-76) and 9 non-responders with median of 27% (15-64) breaks >> 8/11 responders were ALK-IHC positive (73%) >> 2/9 non-responders were ALK-IHC positive (22%) >>> median PFS for ALK-IHC-positive: 8 mo >>> median PFS for ALK-IHC-negative: 2 mo (n=17, p=0.01) >> PFS for > 47% ALK breaks: 7 mo >> PFS for < 47% ALK breaks: 1 mo (n=21, p=0.03) >> PFS is more prolonged in those tumors with more ALK breaks
Doelgerichte behandelingen bij het gevorderd longkanker 1. 2. 3. 4. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Chemotherapy: “one size fits all” EGFR inhibitors BRAF inhibitors ALK inhibitors >>> trial: registratie en bloedtest ROS1, RET inhibitors >>> 4 ROS1-pos cases FGFR1 inhibitors >>> trial: FISH test amp-FGFR1 in scc MET inhibitors KRAS inhibitors HER2 inhibitors PIK3CA inhibitors
Nieuwe ontwikkelingen • Targeted next-generation-sequencing (vanaf 1 september 2014) • Standarisatie, archivering en analyse van de FISH • Moleculaire bloedtest
Detectie van mutaties in EGFR (UMCG tot 1 september 2014) (1) Voor-screening mbv High-Melting-Resolution-Analysis: is er een mutatie of niet ?
80% 60% 40% 20% 10% 5% tonsil
Sensitivity for HMRA of EGFR exon 19 del (Inge Platteel)
(2) Indien ja, bevestiging met directe (bidirectionele) sequentie analyse
Wild type del746 -750
EGFR Exon 19 Analytische gevoeligheid is 40% tumor cellen
Targeted next-generation sequencing (Ion-Torrent)
Diepte (coverage 500x) Oncopanel 22 genes/ 109 amplicons Ion Torrent: coverage 500x => gevoeligheid ~1-5% Exome/WGS: coverage 30x => gevoeligheid >10-20%
314: 1-2 samples/run 316: 1-8 samples/run
UMCG-PGM-oncopanel (11-genes; 29 amplicons) start-panel voor validatie van workflow, kosten, gevoeligheid, reproduceerbaarheid, werkbelasting, specificiteit ALK codon 1174
GNA11 codon 209
KRAS codon 61
ALKcodon 1275
GNAQ codon 209
NRAS codon 117/146
BRAF exon 15
KIT exon 11
NRAS codon 12/13
EGFR exon 18
KIT exon 13
NRAS codon 61
EGFR exon 19
KIT exon 14
PDGFRA exon 12
EGFR exon 20
KIT exon 17
PDGFRA exon 14
EGFR exon 21
KIT exon 8
PDGFRA exon 18
ERBB2 exon 19
KIT exon 9
PIK3CA exon 20
ERBB2 exon 20
KRAS codon 117/146
PIK3CA exon 9
ERBB2 exon 21
KRAS codon 12/13
Klinische validatie is afgerond (~1 jaar) Standaard mutatie-test vanaf 1 sept 2014 Doorlooptijd hetzelfde (2x/week NGS) 5x/week DNA isolatie Verslag: alleen genen volgens richtlijnen Voobereid op nabije toekomst/trials Procedure aanvragen veranderd
UMCG-PGM-oncopanel versie 2 ALK codon 1174
GNA11 codon 209
KRAS codon 61
ALKcodon 1275
GNAQ codon 209
NRAS codon 117/146
BRAF exon 15
KIT exon 11
NRAS codon 12/13
EGFR exon 18
KIT exon 13
NRAS codon 61
EGFR exon 19
KIT exon 14
PDGFRA exon 12
EGFR exon 20
KIT exon 17
PDGFRA exon 14
EGFR exon 21
KIT exon 8
PDGFRA exon 18
ERBB2 exon 19
KIT exon 9
PIK3CA exon 20
ERBB2 exon 20
KRAS codon 117/146
PIK3CA exon 9
ERBB2 exon 21
KRAS codon 12/13
Uitbreiding: mutaties in
Oncopanel
•MET
>
long
Colonpanel
•HRAS
>
???
Longpanel
•JAK2
>
hemato
GIST-panel
•P53
>
???
TKI-resistentie panel
•Notch
>
HN
……
•AKT
>
??? Advies van klinici
Voorwaarden: •
Diep sequencen (hoge gevoeligheid)
•
Kosten/baten (2x amplicons = 2x zo duur)
•
Ethische (te veel informatie)
50 genen = 739 amplicons = 2790 bekende mutaties
Commerciële en custome-made panels met frequent gemuteerde genen in verschillende kankers let op: de meeste zijn niet klinisch-gevalideerd volgens ISO15189 voor FFPE materiaal
miSeq (Illumuna): Cancer-panel: 48 genes/212 amplicons
ABI/PGM-Ion Torrent: UMCN-oncopanel: 22 genes Oncogene-panel: 400 genes
Custom-panel (11-genes UMCG) Cancerpanel: 50 genes/739 amplicons
Nieuwe ontwikkelingen
• Targeted next-generation-sequencing (vanaf 1 september 2014) • Standarisatie, archivering en analyse van de FISH • Moleculaire bloedtest
the ErbB Family of Cell Surface Receptors
Extracellular Domain Transmembrane Domain Intracellular TK Domain
ErbB3 (HER3) ErbB1 (EGFR) Amgen slide
ErbB2 (HER2/neu)
ErbB4 (HER4)
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) De activatie in normale cellen
PTEN
Evasion of apoptosis
STAT signaling
Proliferation Pathway
Gazdar 2007
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) De activatie in tumorcellen
1. Verhoogde expressie van de groeifactor (ligand) 2. Verhoogde expressie van EGFR PTEN
als gevolg van DNA amplificatie
STAT signaling
3. Mutaties in tyrosine kinase domein van EGFR Evasion of apoptosis
Proliferation Pathway
Gazdar 2007
4. Mutaties in KRAS/NRAS
Receptor-protein tyrosine kinases as target for therapy
Cetuximab
Panitumumab
Erlotinib Gefitinib
Dual-target EGFR drugs in the pipeline • Agent
Target
Sponsor
Status
•
Lapatinib
EFGR,HER2
GlaxoSmithKline
Phase III breast, kidney cancer
•
ZD6474
EGFR, HER2, VEGFR
AstraZeneca
Phase III, NSCLC; phase II, medullary thyroid carcinoma
•
HKI-272
EGFR, HER2
Wyeth
Phase II, breast, NSCLC
•
BIBW-2992
EGFR, HER2
Boehringer-Ingelheim
• •
AEE788 EGFR, HER2, VEGFR BMS-599626 EGFR, HER2
Planning for phase II in breast, prostate, and ovarian cancer
Novartis Phase I solid tumor Bristol-Myers Squibb Phase I for solid
tumors
• •
CI-1033 XL-647
EGFR, HER2, HER4 Pfizer EGFR, HER2, VEGFR2, EphB4
Phase II breast, NSCLC
Exelixis
Phase I completed; phase II planned fo rNSCLC
Groen 2010
Steeds meer specifieke drugs gericht tegen specifieke EGFR-mutaties
> Het dus essentieel om exact te bepalen welke mutatie aanwezig is
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie anno 2015 binnen lab Moleculaire Pathologie UMCG
• longkanker-mutatie-analyse (EGFR, KRAS, BRAF) • ALK-/ROS1-translocatie en ALK-immunohistochemie
• Sporadisch/op verzoek: PIK3CA, RET, FGFR1
Veelvoorkomende mutaties (%) in verschillende kankers Gen
EGFR
HNSCC NSCLC colonca thyroidca breast ca
3
26
0
6
0
10
3
8
5
25
KRAS
4
17
35
3
4
BRAF
2
2
15
39
3
CDKN2A
18
15
5
14
5
P53
70
64
56
STR11
2
10
14
APC
6
1
27
MET
15
2
FGFR3
21
1
HRAS
9
0
PIK3CA
47
4
3 Cosmic database 09/2009
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv gen-mutatie-gerichte therapie Vanaf 2014 e.v. (verwachtte toepassingen): • • • • •
“resistente” EGFR mutaties $ FGFR1-amplificatie $ BRAF-mutatie $ KRAS-mutatie $ MET-amplificatie &
(100% AC) (~20% SCC) (< 2% AC) (~40% AC) (4-20% AC)
• • • • • • • •
ROS1-translocatie & RET/KIF5B-translocatie & HER2-mutatie & EGFR-amplificatie $ PIK3CA-mutatie & DDR1-mutatie ALK-translocatie/IHC ……
(1.7% AC) (<2% AC) (2% AC) (10% AC) (<5% AC) (~4% SCC) (~4% AC)
> next-generation-TKI > BIBF1120, … > PLX4732, … > sorafenib, … > Metmab, Crizotinib, AMG102, XL880 (GSK1363089) > crizotinib, … > vandetanib > herceptin > cetuximab, erlotinib, … > mTOR inhibitor > dasatinib, … > crizotinib, …
Alle testen in kader van klinische trials
Veelvoorkomende mutaties (%) in verschillende kankers Gen
EGFR
HNSCC NSCLC colonca thyroidca breast ca
3
26
0
6
0
10
3
8
5
25
KRAS
4
17
35
3
4
BRAF
2
2
15
39
3
CDKN2A
18
15
5
14
5
P53
70
64
56
STR11
2
10
14
APC
6
1
27
MET
15
2
FGFR3
21
1
HRAS
9
0
PIK3CA
47
4
3 Cosmic database 09/2009
Veelvoorkomende mutaties (%) in borstkanker Gen
EGFR
HNSCC NSCLC colonca thyroidca breast ca
3
26
0
6
0
10
3
8
5
25
KRAS
4
17
35
3
4
BRAF
2
2
15
39
3
CDKN2A
18
15
5
14
5
P53
70
64
56
STR11
2
10
14
APC
6
1
27
MET
15
2
FGFR3
21
1
HRAS
9
0
PIK3CA
47
4
3 Cosmic database 09/2009
Landscape of driver mutations in breast carcinoma using whole-genome-sequencing
TGCA, Nature 2012
Mutation detection to selected patients that benefit from gene-target-therapy in cancer in general (UMCG-list) In 2015: Melanoma mutation testing:
BRAF, NRAS, cKIT
Thyroid carcinoma mutation testing:
BRAF
Lung cancer mutation testing:
EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA, DRD2, ALK, ROS, FGFR1
CRC mutation testing:
NRAS, KRAS, BRAF
GIST mutation testing
cKIT, PDGFRA
Breast cancer mutation testing:
HER2
After 2015: mutation-profiling for all/most malignancies !!!
de classificatie van longkanker in de tijd 2013
Pao W., Hutchinson K.E. Nature Medicine, 18, 349–351, 2012
Moleculaire Pathologie:
Pao, Lancet Oncol 2011
•
Veranderde expertise (moleculair bioloog, informaticus)
•
Geavanceerde, kostbare apparatuur
•
Hoge kwaliteitsborging
•
Relatief dure diagnostiek
Vereist: centralisatie in zeer beperkt aantal expertcentra
discussie • Moleculaire testen in elk zks uitvoeren ? • Neen, centraliseren maar multidisciplinair overleg belangrijk
• Geen EGFR-mutaties, dan nooit meer testen ? • Neen, want aantal target/nieuwe middelen groeit enorm
• Breed testen ipv beperkt aantal testen ? • Neen, ethisch verantwoord om informatie te verkrijgen waar je niets mee kunt (diagnostiek vs klinische trials)
PS dit is de visie van prof dr Ed Schuuring anno 2014
discussie • Pathologen overbodig straks ? • Neen, moleculaire interpretatie is niet los te zien van de gehele diagnose (wel optimale samenwerking met KMBP)
• Patiënt dient te weten in welk zks getest wordt ? • Zou niet nodig moeten zijn ! In NL is accreditatie voor deze testen niet verplicht én niet elk lab voldoet aan kwaliteitsnormen. Dus ja. Belangrijk is vooral naar zks te gaan die de expertise heeft voor bepaalde ziekte
• Snelheid bepaalt de kwaliteit van de test ? • Ja, kwaliteit kost tijd
PS dit is de visie van prof dr Ed Schuuring anno 2014
Genes
Complexiteit van chromosomale afwijkingen LOC401700 LOC220070 LOC399921 SHANK2 CTTN PPFIA1 FADD TMEM16A LOC399920 FGF3 FGF4 FGF19 ORAOV1 FLJ42258 CCND1 LOC399919 LOC390218 MYEOV TPCN2 MRGPRF MRGPRD IGHMBP2 MRPL21 CPT1A 68,2
68,4
68,6
68,8
69,0
69,2
69,4
69,6
69,8
70,0
70,2
70,4
Chromosome 11 position (Mbp, NCBI B35)
Het 11q13 amplicon bevat >13 genen waarvan er >8 geactiveerd zijn Welke zijn biologisch/klinisch relevant ?
Gibcus Clin Cancer Res 2007 Gibcus Hum Genet 2007 Gibcus Brit J Cancer 2008
Wat is de biologische betekenis van expressie van het FADD gen gelegen in het 11q13 amplicon ?
Survival %
100
10
EV unstimulated EV + 5 uM PonA FADD SA unstimulated FADD SA + 5 uM PonA FADD SE unstimulated FADD SE + 5uM PonA
1
0.1 0
2
4
6
Radiation (Gy)
Clinical samples show that high
In vitro radiation experiments show that
pFADD associates with radiosensitivity
pFADD increases radiosensitivity
In early-stage-laryngeal carcinomas
Schrijvers IJROBP 2011
Pattje unpublished
Microarray (gen-expressie) analyse voor de vaststellen van de prognose van patiënten met een mammacarcinoom De mammaprint
Significant verschillend expressie profiel (70 genen)
MAAR predictie is niet perfect ! van 't Veer, Nature 415, 530-536, 2002
Whole genome CGH arrays Red = chromosomal loss = ratio < 0.8 Green = chromosomal gain = ratio >1.3 Yellow = normal = ratio 1
Voorbeeld van een tumor
Gain 1q
Amplification 11q13
Normalized ratio
8.0 7.8 7.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
3
0
500
11
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Clones sorted by chromosome
Loss 3p
Normal copy
Gibcus Clin Cancer Res 2007 Gibcus Hum Genet 2007 Gibcus Brit J Cancer 2008
Detectie van chromosoom 11q13 amplificatie in ~15% van mammacarcinomen
FISH
FISH 11q13 Amplificatie
Schuuring, Cancer Res 1992
11q13 amplificatie voorspeller voor overleving in borstkanker mortaliteit
Significant verschillend MAAR predictie is niet perfect !
Niet alle patienten met 11q13-amp hebben korte overleving
en niet alle patienten zonder 11q13 amp worden genezen
Schuuring, Cancer Res 1992
De mogelijke biologische betekenis van geactiveerde genen in het 11q13 amplificon
FISH
FISH 11q13 Amplificatie
• cyclin D1 involved in cycle regulation (Schuuring, Oncogene 1991) • cortactin/EMS1 involved in migration (Schuuring, Oncogene 1992) • EMSY involved in BRCA2-dependent DNA repair (Cell 2003) • myeov a putative transforming gene (Blood 2000) • FADD involved in radioresponse (Pattje, unpub and schrijvers IJRBP 2011) • ORAOV involved in migration • PPFIA1 involved in migration • FGF3/4/19 are ligands for receptor kinases •…
Welk gen is verantwoordelijk voor het biologische of klinische effect • Is het één gen ?
• Is het een combinatie van genen ?
Whole genome Array CGH comparative genomic hybridization voor het in kaart brengen van chromosomale afwijkingen in borstkanker
Genomic clones: Van elke clone is de exacte sequentie bekend (chromosomale locatie welke genen)
Array CGH hoe worden afwijkingen gedetecteerd ? Clones
carcinoma
reference
Red = chromosomal loss Green = chromosomal gain Yellow = normal
Labelling
Printing
Hybridize Computer analysis Excitation
Emission
Sex-mismatch hybridisatie Red = chromosomal loss = ratio < 0.8 Green = chromosomal gain = ratio >1.3 Yellow = normal = ratio 1
Normalized ratio
Normalized ratio
4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
Female to male ratio: X=2:1 Y=0:1 0
500
1000
1500
2000
2500
Clones sorted by chromosome
3000
3500
4000
Whole genome CGH arrays voorbeeld van genetische afwijkingen in 2 tumoren
Normalized ratio
8,0 7,8 7,6
A
3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
5
0
500
1000
18
1500
2000
2500
3000
3500
Clones sorted by chromosome
Normalized ratio
7,0 6,8 6,6
7
B
3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0
11 8
500
1000
1500
17
2000
Clones sorted by chromosome
2500
3000
Gibcus Clin Cancer Res 2007 Gibcus Hum Genet 2007 Gibcus Brit J Cancer 2008
CGH classifier profiel om onderscheid te maken tussen low-risk/high-risk borstkankertypen
Significant verschillend CGH profiel MAAR predictie is niet perfect !
Niet alle patienten met HR-profiel hebben korte overleving en niet alle patienten met LR-profiel worden genezen
Gravier Genes Chrom Cancer 2010
Niet de veranderingen in het DNA, maar ook verschillen in RNA/eiwit expressie zijn klinische/biologische relevant
DNA: 6.000.000.000 nucleotiden/cel RNA/eiwit: ~30.000 genen
Functioneel eiwit
Expressie microarray analyse identificatie van RNA-expressieprofielen cDNA clones
carcinoma
reference
Red = chromosomal loss Green = chromosomal gain Yellow = normal
Labelling
Printing
Hybridize Computer analysis Excitation
Emission
