Neuropeptiden als behandeling tegen epilepsie

Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen

2de jaar Master Biomedische Wetenschappen

Neuropeptiden als behandeling tegen epilepsie

Camille ROELENS

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. MEURS Vakgroep Inwendige Ziekten, Neurologie

Academiejaar 2013-2014  

Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen

2de jaar Master Biomedische Wetenschappen

Neuropeptiden als behandeling tegen epilepsie

Camille ROELENS

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. MEURS Vakgroep Inwendige Ziekten, Neurologie

Academiejaar 2013-2014

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

14 mei 2014

Camille Roelens

Prof. Dr. Alfred Meurs

Voorwoord In dit voorwoord zou ik van de gelegenheid gebruik willen maken om mijn dank uit te spreken aan enkele belangrijke personen rondom me, die al dan niet bewust deze masterproef mee gerealiseerd hebben. Mijn oprechte dank gaat uit naar mijn promotor Professor A. Meurs. Zijn deskundigheid en uitgebreide ervaring in het vakgebied hebben vorm gegeven aan de uitwerking van mijn masterproef, gaande van de initiële ideeën in mijn eerste masterjaar tot de realisaties in het tweede masterjaar. Daarnaast wil ik 2 personen in het bijzonder bedanken. Dankzij hun steun, begrip en begeleiding, heb ik het doorzettingsvermogen gevonden deze masterproef tot een goed einde te brengen. Bedankt Jeanelle Portelli en Ine Buffel om me steeds zo begripvol bij te staan in de tegenslagen die zijn opgetreden in het verloop van mijn masterproef. De energie en moeite die jullie voor mijn thesis hebben opgebracht, hebben me vele keren met een groot gevoel van dankbaarheid achtergelaten. Ik wil jullie meegeven dat ik dit zeker niet als vanzelfsprekend neem. Bedankt… Een grote dank gaat uit naar mijn ouders die me de kans hebben gegeven te studeren en me zelfs nog meer kansen bieden door me volgend jaar een Europese masteropleiding te laten starten. Bedankt voor jullie vertrouwen in mijn studies en de opportuniteiten die ik krijg dankzij jullie. Tenslotte wens ik mijn schoonbroer Piet een speciale plaats in dit voorwoord te schenken. Zijn plotse overlijden gedurende de laatste maanden van mijn masterproef was een zware klap voor ons allen. Piet heeft me echter geleerd nooit op te geven in het leven en steeds alles in te zetten. Hij was de meest gemotiveerde en enthousiaste persoon die ik heb mogen ontmoeten en ik zal zijn boodschap steeds met me meedragen.

Inhoudstafel SAMENVATTING ................................................................................................................... 1 SUMMARY............................................................................................................................... 2 DEEL 1: INLEIDING .............................................................................................................. 3 1 EPILEPSIE .............................................................................................................................. 3 1.1 Definitie van epilepsie ............................................................................................... 3 1.2 Classificatie van epilepsie.......................................................................................... 3 1.2.1 Focale of partiële epilepsie ............................................................................... 3 1.2.1.1 Enkelvoudige partiële epilepsie .............................................................. 4 1.2.1.2 Complex partiële epilepsie ..................................................................... 4 1.2.1.3 Secundair gegeneraliseerde epilepsie .................................................... 4 1.2.2 Primair gegeneraliseerde of veralgemeende epilepsie ...................................... 4 1.2.2.1 Absences ................................................................................................. 4 1.2.2.2 Gegeneraliseerde tonisch-clonische epilepsie ........................................ 5 1.2.2.3 Myoclonische epilepsie ........................................................................... 5 1.3 Temporale kwab epilepsie ......................................................................................... 6 1.4 Behandelingen ........................................................................................................... 6 1.4.1 De Farmacologische behandeling ..................................................................... 6 1.4.2 Chirurgische resectie ........................................................................................ 7 1.4.3 Neurostimulatie................................................................................................. 8 1.4.3.1 Nervus vagus stimulatie (VNS) ............................................................... 8 1.4.3.2 Diepe hersenstimulatie (Eng.: Deep brain stimulation, DBS) ............... 8 1.4.4 Ketogeen dieet .................................................................................................. 9 1.4.5 Toekomstperspectieven .................................................................................... 9 2 DIERMODELLEN .................................................................................................................... 9 2.1 Diermodellen voor post-laesionele epilepsie ............................................................. 9 2.2 Modellen voor temporele kwab epilepsie .................................................................. 9 2.2.1 Pilocarpine of kaïnaat model ............................................................................ 9 2.2.2 Kindling model ............................................................................................... 10 2.3 Genetische modellen voor absence epilepsie .......................................................... 11 3 NEUROPEPTIDEN ................................................................................................................. 11 3.1 Definitie ................................................................................................................... 11 3.2 Orexine / Hypocretine.............................................................................................. 13 3.3 Orexine antagonisten ............................................................................................... 15 4 DOELSTELLING VAN DE MASTERPROEF................................................................................ 15 DEEL 2: MATERIALEN EN METHODEN ....................................................................... 17 1 PROEFDIEREN ...................................................................................................................... 17 2 ELEKTRODEN ...................................................................................................................... 17 2.1 Scalp elektrode......................................................................................................... 17 2.2 Tripolaire elektrode ................................................................................................. 18 3 OPERATIE ............................................................................................................................ 18 4 EXPERIMENTELE SET-UP ...................................................................................................... 22

5 6 7

KINDLING ACQUISITIE ......................................................................................................... 22 HISTOLOGISCHE CONTROLE ................................................................................................. 23 STATISTIEK ......................................................................................................................... 24

DEEL 3: RESULTATEN....................................................................................................... 25 1 AFTERDISCHARGE TRESHOLD (ADT) .................................................................................. 25 2 GEMIDDELDE AANVALSSTAGE ............................................................................................ 26 2.1 Controle groep ......................................................................................................... 26 2.2 SB-334867 ............................................................................................................... 27 2.3 TCS-OX2-29............................................................................................................ 28 2.4 Overzichtsgrafiek ..................................................................................................... 29 2.5 Area under the curve (AUC).................................................................................... 30 3 AANTAL STIMULATIES TOT HET BEREIKEN VAN STAGE 4 EN 5 ............................................. 31 4 DUUR VAN DE AFTERDISCHARGES (ADD) ........................................................................... 32 4.1 ADD in functie van de stimulatie sessie voor de controlegroep ............................. 32 4.2 ADD in functie van de stimulatie sessie voor de SB-334867 groep ....................... 33 4.3 ADD in functie van de stimulatie sessie voor de TCS-OX2-29 groep .................... 34 4.4 Overzichtsgrafiek ..................................................................................................... 35 4.5 Cumulatieve primaire ADD in vergelijking met de cumulatieve totale ADD ........ 36 5 HISTOLOGIE ........................................................................................................................ 37 DEEL 4: BESPREKING ....................................................................................................... 38 1 AFTERDISCHARGE TRESHOLD (ADT) .................................................................................. 38 2 GEMIDDELDE AANVALSSTAGE ............................................................................................ 39 3 AANTAL STIMULATIES TOT HET BEREIKEN VAN EEN STAGE 4 EN 5 ...................................... 40 4 DUUR VAN DE AFTERDISCHARGE (ADD)............................................................................. 41 4.1 ADD in functie van de stimulatie sessie .................................................................. 41 4.2 Cumulatieve primaire ADD in vergelijking met de cumulatieve totale ADD ........ 42 5 HISTOLOGIE ........................................................................................................................ 42 5.1 Gemiddelde stage per stimulatie sessie en de AUC ................................................ 42 5.2 Aantal stimulaties tot stage 4 of stage 5 .................................................................. 44 5.3 Duur van de afterdischarges .................................................................................... 45 5.4 Cumulatieve primaire ADD en cumulatieve totale ADD ........................................ 45 DEEL 5: ALGEMEEN BESLUIT ........................................................................................ 47 REFERENTIES ...................................................................................................................... 49 BIJLAGEN ............................................................................................................................... I BIJLAGE 1: LIJST MET GEBRUIKTE ACRONIEMEN ........................................................................ II BIJLAGE 2: LIJST MET FIGUREN ................................................................................................. III BIJLAGE 3: LIJST MET TABELLEN ............................................................................................... IV BIJLAGE 4: LIJST MET GRAFIEKEN .............................................................................................. V

Samenvatting Epilepsie is een neurologische aandoening die in België 1 op 150 mensen treft. Epilepsie kan globaal worden ingedeeld in focale en gegeneraliseerde epilepsie, afhankelijk van de omvang van de epileptische focus. De meest voorkomende vorm van focale epilepsie is temporale kwab epilepsie (Eng.: temporal lobe epilepsy, TLE). De standaardbehandeling bestaat uit anti-epileptische drugs. Daarnaast behoren speciale dieetvormen en neurochirurgie tot de mogelijkheden. Helaas blijft nog steeds één derde van de patiënten refractair na het doorlopen van de verschillende behandelingsopties. Voor deze patiënten is onderzoek naar alternatieven essentieel. In deze masterproef wordt het effect nagegaan van twee selectieve orexine antagonisten (SB334867 en TCS-OX2-29) in vergelijking met een controlegroep in het rapid kindling model voor TLE. In dit model bezorgen we ratten een epileptisch profiel aan de hand van elektrische stimulaties in de amygdala. Op deze manier ontvangt elk dier 10 stimulaties per dag met een tijdsinterval van 30 minuten gedurende 2 opeenvolgende dagen. De infusie met de toegediende compound wordt intracerebroventriculair (i.c.v.) aangebracht 30 minuten voor de eerste stimulatie. De parameters die we kunnen bepalen bij kindling zijn: de drempelwaarde van stimulatie-intensiteit om een gedragsverandering uit te lokken, de gedragsverandering per stimulatie gescoord via de schaal van Racine en de duur van de ontladingen (afterdischarges) zichtbaar op het elektro-encefalogram. Gedurende het kindling protocol verwachten we bij de controlegroep dat de aanvallen toenemen in ernst en de afterdischarges steeds langer duren. Daarnaast verwachten we een vertraging van de kindling acquisitie in de twee groepen die orexine antagonisten ontvangen. In deze dierexperimentele studie is er evidentie dat de orexine receptor type 2 antagonist, TCS-OX2-29, een vertragend effect uitoefent op de rapid kindling acquisitie. Hierbij vertoont deze groep lagere aanvalsstages dan de controlegroep en hebben ze meer stimulaties nodig om een stage 4 of 5 te bereiken. Na afloop van de experimenten is een histologische controle uitgevoerd van de locaties van elektroden en canule. Na het isoleren van de correct geïmplanteerde dieren vertonen hun resultaten dezelfde trend. Bijkomend onderzoek met een grotere steekproefgrootte kan in de toekomst meer duidelijkheid scheppen. 1

Summary Background Epilepsy is a neurological disorder, affecting 1-2% of the population. The subdivisions in epilepsy are partial and generalized epilepsy. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent form of partial epilepsy. Despite the broad range of treatment options, a third of the patients remain epileptic. The search for alternative treatments is necessary. In this research we will evaluate the effects of the orexin antagonists SB-334867 and TCS-OX2-29 in the rapid kindling model for TLE. Methods A tripolar electrode was implanted in the right amygdala and a cannula in the left ventricle of 26 male Wistar rats. The animals were randomly divided into 3 groups (n=8); 2 compound groups and one control group in which a rapid amygdala kindling protocol was performed. The kindling parameters afterdischarge threshold (ADT), afterdischarge duration (ADD) and behavioural stage were registered. Results Each group showed the expected kindling profile of higher stages and longer AD’s towards the end of the stimulation sessions. In the antagonist groups, more stimulations were required to reach a stage 4 or 5 in comparison to the control group. A significant difference in the seizure severity progression was observed between the control group and the TCS-OX229 group. Conclusions In this study we observed a beneficial effect on seizure progression in the orexin receptor 2 subtype TCS-OX2-29. Being a pilot study, a larger group as well as possible optimization in this new kindling protocol within our laboratory is necessary.

2

Deel 1: Inleiding 1 Epilepsie 1.1

Definitie van epilepsie

Epilepsie is een aandoening die 1–2 % van de wereldbevolking treft. Voor België is dit 1 op 150 personen. Epilepsie staat in de volksmond bekend onder de term ‘de vallende ziekte’, maar dit is echter een zeer stereotype beschrijving aangezien de klinische manifestaties van een epileptische aanval enorm kunnen variëren. We kunnen eenvoudig stellen dat bij epilepsie het evenwicht tussen excitatie en inhibitie in de hersenstructuur verstoord is. Doordat het zenuwstelsel deze balans op verschillende wijzen controleert, is het aantal oorzaken voor epilepsie zeer uitgebreid [1]. De termen epileptisch insult of epileptische aanval en epilepsie worden vaak als eenzelfde begrip beschouwd, maar er dient een duidelijk onderscheid gemaakt te worden. De algemene definitie voor een epileptische aanval stelt dat dit een periode omvat van abnormale, synchrone excitatie van de neuronale cellen. Deze ontladingen nemen typisch seconden tot minuten in beslag. Hierop vormt de status epilepticus een uitzondering, waarbij de ontladingen sterk verlengd en continu zijn. Daarnaast kan epilepsie gedefinieerd worden als het herhalend voorkomen van dergelijke spontane aanvallen. Als echter één geïsoleerde aanval voorkomt in een individu, wil dit nog niet zeggen dat deze persoon epilepsie heeft, aangezien 50% na één aanval aanvalsvrij blijft. Hierdoor stellen we de diagnose van epilepsie pas na het tweede epileptische insult. Tenslotte wijst het begrip ‘epileptogenese’ op de reeks van processen die een normale hersenstructuur omvormen naar een hyperexciteerbare structuur [1]. 1.2

Classificatie van epilepsie

Epilepsie kan worden geclassificeerd op verschillende manieren. Een eerste wijze van indeling is op basis van de grootte van de epileptische focus. Deze indeling wordt het meest toegepast. Globaal maakt men een onderscheid tussen focale of partiële epilepsie enerzijds en gegeneraliseerde of veralgemeende epilepsie anderzijds [2]. 1.2.1 Focale of partiële epilepsie Bij focale of partiële epilepsie is de initiële corticale activatie gelimiteerd tot één deel van de hersenen of één van beide hemisferen [3]. 3

De focale aanvallen zijn het meest frequente epileptisch aanvalstype bij volwassenen met een voorkomen bij 2/3 van alle epilepsie patiënten. We kunnen een onderscheid maken in 3 verschillende groepen van focale epilepsie. 1.2.1.1 Enkelvoudige partiële epilepsie Bij dit type insult is er geen verlies van het bewustzijn, dit komt doordat de epileptische activiteit slechts een klein gedeelte van de hersenstructuur omvat. De klinische manifestaties variëren naargelang de oorsprong van de epileptische ontladingen en ze kunnen motorische, sensorische, autonome en psychische symptomen includeren. Voorbeelden hiervan zijn het waarnemen van een onaangename geur of een trekking van arm of been. 1.2.1.2 Complex partiële epilepsie Deze vorm van epilepsie gaat gepaard met een verandering in het bewustzijn, waarbij de patiënt vaak bewegingsautomatismen vertoont. Als voorbeelden hiervan hebben we het maken van smakkende bewegingen met de lippen, het friemelen van de handen, kauwen, … 1.2.1.3 Secundair gegeneraliseerde epilepsie Wanneer de elektrische activiteit van een enkelvoudige of complex partiële aanval zich verspreidt over beide hemisferen, spreken we van een secundair gegeneraliseerde aanval. 1.2.2 Primair gegeneraliseerde of veralgemeende epilepsie Gegeneraliseerde epilepsie wijst erop dat de ontladingen zich bilateraal in de cortex situeren. Dit type epilepsie treft één derde van alle epilepsie patiënten. Zoals bij focale epilepsie kent de gegeneraliseerde vorm ook verschillende subtypes [3]. 1.2.2.1 Absences Een verlaten benaming voor dit subtype is ‘petit mal’. Kenmerkend is de eerder korte duur van de aanval met een daling van het bewustzijn, waardoor men vaak gaat staren. Absences kan bij kinderen een leerachterstand veroorzaken, doordat ze gedurende de lessen vaak dergelijke afwezige momenten ervaren. Het wordt niet meteen door de omgeving opgemerkt en eerder bestempeld als verstrooidheid van het kind.

4

1.2.2.2 Gegeneraliseerde tonisch-clonische epilepsie De oude benaming voor dit tonisch-clonische subtype is ‘grand mal’. Sommige patiënten ervaren een aura of prodroom voor het krijgen van deze aanval. Zo een aura is heel persoonlijk en kan zich uiten als een vreemde smaak in de mond, onbehaaglijk gevoel in buik of ledematen, … Wanneer de aanval zich voordoet is er een bewustzijnsverlies en een volledige verkramping van het lichaam, ook de tonische fase genaamd. Hierop volgt de clonische fase met heel duidelijk zichtbare spierschokken. Tijdens de aanval kunnen onder andere incontinentie en tongbeet optreden. Tot ongeveer 15 minuten na het einde van de aanval kan het bewustzijn nog steeds sterk gedaald zijn. Wanneer deze aanvallen elkaar voortdurend opvolgen, spreken we van een status epilepticus. Dit kan ernstige hersenschade veroorzaken door eventueel zuurstoftekort. 1.2.2.3 Myoclonische epilepsie Myoclonische epilepsie kent geen tonische fase, maar wel repetitieve musculaire contracties van armen en/of benen. Er is een daling van bewustzijn, maar doordat dergelijk insult van korte duur is, valt het vaak niet op. Een tweede manier van classificatie, die minder in gebruik is, is gebaseerd op de causale etiologie of de onderliggende oorzaken van de epilepsie. Hierbij hebben we als eerste indeling de idiopathische epilepsie, waarbij de meeste vormen leeftijdsafhankelijk en goedaardig zijn. Men heeft een vermoeden dat een genetische predispositie belangrijk is in het ontstaan van de epileptische insulten en men is er reeds in geslaagd verschillende kandidaatgenen te isoleren. Deze genen blijken voornamelijk verantwoordelijk voor ionkanalen. Deze vervullen immers een essentiële rol in de communicatie tussen neuronen en een genetisch defect kan het evenwicht tussen excitatie en inhibitie verstoren. De idiopathische vorm van epilepsie komt vaak voor bij gegeneraliseerde epilepsie. Vervolgens hebben we de symptomatische epilepsie. Hierbij is er een duidelijke oorzaak voor de epilepsie, zoals een geboortedefect, hersentumor, infectie, … Deze symptomatische vorm geeft meestal aanleiding tot focale epilepsie. Tenslotte gebruikt men de term cryptogene epilepsie als er geen duidelijke onderliggende oorzaak geïdentificeerd kan worden [2, 3].

5

1.3

Temporale kwab epilepsie

Temporale kwab complex partiële epilepsie of eenvoudig gesteld temporale kwab epilepsie (Eng.: temporal lobe epilepsy, TLE) is de meest frequente vorm van adulte, focale epilepsie. Hierbij is de epileptische focus gelegen in de mesiale temporale structuren, zoals de amygdala, hippocampus of beiden. Deze structuren zijn heel kwetsbare structuren voor epileptogenese. Hierdoor treedt mesiale TLE frequent op en wordt het in dit onderdeel afzonderlijk behandeld. Er is reeds extensief onderzoek gevoerd naar de pathologie en de pathofysiologie van de hippocampus in epilepsie. In 90% van de chirurgisch geresecteerde hippocampi is hippocampale sclerosis zichtbaar. Dit omvat vooreerst extensieve gliosis, wat duidt op de verdichting van het gliaweefsel. Daarnaast is er ook een selectief verlies van neuronen in de hippocampus en de dentate gyrus. Het neuronale verlies bestaat uit glutamaterge neuronen en inhibitorische neuronen in de dentate hilus en CA1 regio (cornu ammonis regio) van de hippocampus. Dit celverlies en de gliosis kunnen zich verder verspreiden naar andere mesotemporale regio’s, zoals de amygdala. De verhoogde exciteerbaarheid van de hippocampus wordt voornamelijk veroorzaakt door het verlies van de inhibitorische interneuronen. Tenslotte treedt bij de hippocampale sclerosis mossy fiber sprouting op. Dit is de groei van aberrante collateralen van korrelcel axonen in de binnenste moleculaire laag van de dentate gyrus. In deze locus maken ze synaps met de dendrieten van andere korrelcellen en zo vormen ze excitatorische feedback loops. De sprouting ontstaat door het verlies van de normale postsynaptische targets. De graad van axonal sprouting is evenredig met de omvang van sclerosis en neuronaal celverlies [4]. Het onderzoek naar de betrokkenheid van de amygdala is echter minder uitgebreid, ondanks de evidentie dat deze structuur minstens even belangrijk is als de hippocampus in TLE. De wijziging in exciteerbaarheid ligt vermoedelijk in de verandering van de excitatie en inhibitie pathways, namelijk de glutamaterge en gamma-aminoboterzuur (GABA) systemen [5]. 1.4

Behandelingen

1.4.1 De Farmacologische behandeling Anti-epileptische drugs (AED) zijn de basis in de huidige behandeling tegen epilepsie. Op heden zijn reeds meer dan 20 verschillende anti-epileptica beschikbaar. Na het voorkomen 6

van minstens 2 epileptische aanvallen kiest men ervoor een farmacologische behandeling op te starten. Er zijn echter ook patiënten die na slechts één epileptisch insult starten met een behandeling, doordat hun risico op herhaling erg hoog is. Dit risico kan men inschatten op basis van elektro-encefalogram (EEG) ontladingen, neurologisch onderzoek of ander bewijs van eventuele structurele abnormaliteit in het centrale zenuwstelsel. De therapie met AED wordt meestal gedurende verschillende jaren of soms levenslang onderhouden, voornamelijk bij volwassenen. De keuze om met deze behandeling te starten heeft dus verstrekkende gevolgen en dient gebaseerd te zijn op een zorgvuldige risicovoordeel analyse. Hierbij weegt men de voordelen van de behandeling af t.o.v. de mogelijke bijwerkingen. Uiteraard is het ultieme doel van de farmacologische behandeling de patiënt te verlossen van de epileptische aanvallen zonder of met zo weinig mogelijk bijwerkingen. Ongeveer 50% van de adulte populatie is volledig aanvalsvrij door de voorgeschreven medicatie, dit indiceert echter dat de overige 50% niet volledig geholpen wordt. Wanneer de initiële monotherapie faalt, kan men overgaan op een alternatieve AED of kan men kiezen voor een combinatie van verschillende anti-epileptica. Wanneer patiënten na minstens 2 geschikte AED’s, in monotherapie of combinatietherapie toegediend, nog niet aanvalsvrij zijn, stelt men dat deze patiënten refractair zijn. Helaas is ongeveer 20 à 40 % van de patiënten refractair. Voor deze personen zijn alternatieve therapieën nodig, zoals epileptische chirurgie, neurostimulatie, ketogeen dieet, … [6] 1.4.2 Chirurgische resectie Indien de farmacologische therapie blijkt te falen, kan men als tweede hoofdtherapie een chirurgische interventie overwegen. Bij deze aanpak verwijdert men de epileptische focus of verbreekt men de verbindingen van het epileptisch weefsel. De resectie kan gaan van een klein gedeelte van de cerebrale cortex tot het verwijderen van één of meer hersenkwabben en in extreme gevallen een volledige hemisfeer. Aan de hand van verscheidene onderzoeken tracht men de exacte locatie en grootte van de epileptische zone te bepalen, alsook de functies die deze zone vervult. Op deze manier kan men achterhalen welke vaardigheden eventueel verloren gaan na resectie. Video-EEG monitoring, een NMR-scan, PET-scan, neuropsychologisch onderzoek, … zijn voorbeelden van onderzoeken gebruikt voor deze preheelkundige evaluatie. Bij patiënten met focale epilepsie kan men op deze manier, na grondige identificatie van de epileptische

focus,

deze

zone

verwijderen.

Zo

voert

men

geregeld

een

amygdalohippocampectomie uit bij patiënten met TLE. Dit blijkt zijn effect niet te missen, 7

aangezien 80% van deze patiënten nadien aanvalsvrij blijkt te zijn. Extratemporale resecties worden minder frequent uitgevoerd en hebben ook een minder gunstig resultaat met 50% van de patiënten die nadien aanvalsvrij blijft. De chirurgische resectie is een zeer goed alternatief, maar helaas komt slechts een klein aandeel van de patiënten in aanmerking. Vaak kan men geen operatieve ingreep uitvoeren doordat de focus niet goed definieerbaar is, er een verlies van essentiële functies optreedt of doordat er meer dan één focus is [7]. Wanneer de klassieke AED’s blijken te falen en de patiënt ook niet geschikt blijkt voor een operatieve ingreep, zal men alternatieve behandelingen aanraden. Hierbij is de eerste optie neurostimulatie en de tweede een specifiek dieet. 1.4.3 Neurostimulatie In de praktijk worden 2 types van neurostimulatie gehanteerd, hierbij hebben we enerzijds intracraniële stimulatie en anderzijds extracraniële stimulatie. Bij deze behandeling zal men op elektrische of magnetische wijze het zenuwstelsel stimuleren. De stimulaties zorgen voor een desynchronisatie van de abnormale epileptogene activiteit, waardoor ze de aanvallen onderdrukken. 1.4.3.1 Nervus vagus stimulatie (VNS) VNS is een gevestigde behandeling voor voornamelijk partiële refractaire aanvallen en behoort tot het type van extracraniële stimulatie. Bij VNS stimuleert men op een automatische en chronische wijze de linker nervus vagus d.m.v. een pulsgenerator. Daarnaast kan de patiënt zelf ook de generator activeren door een externe magneet. Ongeveer 30 à 40 % van de patiënten die deze behandeling krijgen, ziet een verbetering in zijn epileptische aanvalsprofiel, gedefinieerd als een reductie van minimaal 50% in de aanvalsfrequentie [8]. 1.4.3.2 Diepe hersenstimulatie (Eng.: Deep brain stimulation, DBS) Tot het tweede type van neurostimulatie, nl. de intracraniële stimulatie, behoort DBS. Hierbij worden diepte-elektroden aangebracht in de hersenen en verbonden met een pulsgenerator. De structuren die worden gestimuleerd zijn vaak de thalamus en subthalame kernen, aangezien deze vaak een belangrijke rol spelen in het epileptische netwerk. DBS wordt reeds toegepast voor de behandeling van Parkinson, maar in het domein van epilepsie is de behandeling nog in volle ontwikkeling [8].

8

1.4.4 Ketogeen dieet De samenstelling van het klassieke ketogene dieet wordt gekenmerkt door een restrictie in koolhydraat-, eiwit- en calorie-inname. Het nuttigen van dit dieet wordt voorgesteld om de aanvalsfrequentie te reduceren. Hierbij is het exacte werkingsmechanisme tot op heden onduidelijk. Helaas blijkt het ook niet eenvoudig het dieet te onderhouden, wegens onder andere gastro-intestinale bijwerkingen. Sinds kort is er ook een groeiende interesse in minder restrictieve voedingspatronen, zoals o.a. het Atkins dieet [9]. 1.4.5 Toekomstperspectieven Op heden is er uitgebreid onderzoek naar mogelijke alternatieve strategieën om refractaire patiënten te helpen. Een belangrijk voorbeeld hiervan is het onderzoek naar celtherapie. Op deze manier zou men nieuwe cellen kunnen introduceren en zou men eventueel beschadigde neuronale epileptische circuits kunnen reconstrueren of bepaalde neurotransmitter functies terug balanceren. Deze therapie staat nog in zijn kinderschoenen, maar de onderzoeken op proefdieren zien er veelbelovend uit [4].

2 Diermodellen 2.1

Diermodellen voor post-laesionele epilepsie

Bij deze diermodellen trachten we epilepsie na te bootsen die ontstaat na een laesie. De modellen zijn snel en betrouwbaar, maar vaak ook ernstiger dan de humane situatie, waardoor ze minder representatief zijn [10]. Voorbeelden zijn: traumatic brain injury (TBI), metaalimplantatie en toediening van endotheline-1 [11]. 2.2

Modellen voor temporele kwab epilepsie

TLE is klinisch zeer relevant en daardoor is er een ruime keuze aan mogelijke diermodellen. Voor deze bespreking wordt enkel gefocust op het pilocarpine of kaïnaat model en het kindling model. 2.2.1 Pilocarpine of kaïnaat model Het pilocarpine of kaïnaat model is een post-status model. Hiermee bedoelt men dat de stoffen een status epilepticus (SE) uitlokken bij het proefdier. De daarop volgende weken zal epileptogenese plaatsvinden, waardoor het dier nadien spontane aanvallen vertoont. Het nadeel aan dit model is dat de aanvalsfrequentie erg variabel is [12].

9

2.2.2 Kindling model Het kindling model is het proefdiermodel bij uitstek voor het bestuderen van TLE en AED. Het model vertoont sterke gelijkenissen met humane TLE. Zo vindt enerzijds de initiële aanvalsactiviteit in dezelfde hersenregio plaats, nl. de hippocampus en amygdala. Anderzijds hebben we een overeenkomst in de aanvalsactiviteit zichtbaar op het EEG, deze start met vroege hoog frequente activiteit en verandert naar tonische bursts. Het model biedt als voordelen dat de aanvallen gecontroleerd worden uitgelokt en dat het proces van de epileptogenese goed bestudeerd kan worden. De nadelen verbonden aan het klassieke model zijn de hoge graad van arbeidsintensiteit en de moeilijkheidsgraad om spontane aanvallen te creëren. We kunnen klassieke kindling en rapid kindling onderscheiden. In de klassieke procedure wordt het proefdier dagelijks gestimuleerd gedurende enkele weken met een elektrische stimulus ter hoogte van de amygdala of hippocampus. Voor aanvang van het protocol dient de afterdischarge threshold (ADT) bepaald te worden. Dit is de intensiteit van de elektrische stimulus waarbij een ontlading of afterdischarge (AD) van minimaal 5 seconden wordt gegenereerd op het EEG. Na deze bepaling wordt een intensiteit gekozen voor de stimuli die in het experiment gehanteerd zullen worden. Deze moet hoger zijn dan de ADT, zodat elke stimulus aanleiding geeft tot een AD op het EEG. Daarnaast gaat een AD gepaard met een zichtbare gedragsverandering van het dier, die we kunnen classificeren volgens het model van Racine. Bij deze classificatie wordt het gedrag gescoord met een cijfer gaande van 0 tot 5, waarbij 0 geen gedragsverandering betekent en 5 staat voor een gegeneraliseerde Tabel 1: Classificatie volgens Racine

Stage Gedragsverandering

tonisch-clonische aanval. In tabel 1 vind je de stages van Racine terug

1 Mond en faciale clonus

met

de

daarbij

horende

2 ‘Head nodding’

gedragsverandering.

3 Unilaterale voorpoot clonus

Gedurende het kindling protocol zal

4 Bilaterale voorpoot clonus en steigeren

de AD steeds langer duren en de

5 Steigeren en neervallen

stage van de aanval zal oplopen van 0 tot 5. M.a.w. de AD duur en ernst

van de aanvallen zijn progressief van aard. Bij het lang aanhouden van de herhaaldelijke stimuli zou in dit model eveneens spontane aanvalsactiviteit kunnen ontstaan. Wanneer het dier vijf opeenvolgende dagen reageert met een stage 5 reactie spreken we van een ‘fully kindled’ rat. 10

De parameters die bij het kindling model bepaald kunnen worden, zijn: de ADT, de AD duur, de ernst van de gedragsverandering en de latentietijd van de AD [3]. Daarnaast kan ook de rapid kindling procedure worden uitgevoerd, die een snelle screening voor mogelijk werkzame stoffen toelaat. Bij deze snelle kindling wordt op slechts 2 dagen tijd een fully kindled dier bekomen. Elke dag ontvangt het dier een stimulus om de 30 minuten, waarbij de ADT bepaling als eerste stimulatie geldt. Het dier ontvangt zo 10 stimulaties per dag gedurende 2 dagen. Zowel de evolutie van de gedragsveranderingen als de duur van de AD zijn beduidend progressiever dan de klassieke kindling procedure [13]. 2.3

Genetische modellen voor absence epilepsie

Er zijn reeds verschillende ratten en muizen lijnen ontwikkeld waarbij de dieren enkele dagen na de geboorte spontaan absences vertonen. Voorbeelden van dergelijke rassen zijn: GAERS, Wag/Rij, stargazer, … [14]

3 Neuropeptiden 3.1

Definitie

De laatste 30 jaar is de rol van neuropeptiden als signaalmoleculen in het zenuwstelsel intensief bestudeerd geweest. Neuropeptiden zijn 3 tot 100 aminozuren lang en hiermee ongeveer 50 keer groter dan klassieke neurotransmitters. Ze onderscheiden zich eveneens van deze klassieke neurotransmitters door hun kleinere eiwitstructuur en een minder complexe 3D-structuur. Daarnaast bezitten ze verschillende extra herkenningsplaatsen voor receptoren en dit leidt tot een 1000 keer grotere affiniteit in de binding met ook een beduidend grotere selectiviteit. De neuropeptiden en hun G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR) zijn verspreid over het lichaam en komen vaak voor samen met de klassieke neurotransmitters. Naast de verschillen in structuur zijn er ook meerdere afwijkingen tussen neuropeptiden en andere boodschappersmoleculen op vlak van synthese, opslag en signaalfunctie. Een voorbeeld hiervan is dat de vrijstelling van neuropeptiden hoog frequente ontladingen vereist. Eenmaal losgelaten kunnen ze ver gelegen receptoren bereiken. Dit principe heet volume transmissie [15]. De receptoren van neuropeptiden en de klassieke transmitters zijn van het type GPCR. Deze zijn reeds talrijke jaren een target voor drugtherapie. In het humane genoom zijn er ongeveer 11

550 GPCR genen, waarbij neuropeptiden ligand zijn voor ongeveer 20% van deze receptoren. De GPCR’s zijn verspreid geëxpresseerd in het zenuwstelsel, alsook in vele andere weefsels [15]. De

functies

van

de

neuropeptiden

zijn

divers.

Zo

reiken

hun

functies

van

boodschappersmoleculen tot groeifactoren. Ze zijn aanwezig in gliacellen, komen voor als hormonen in het endocriene systeem en als boodschappers in het immuunsysteem. Daarnaast zijn ze betrokken in verschillende ziektebeelden zoals depressie, verslaving, narcolepsie, … Er is ook significant bewijs dat neuropeptiden een belangrijke rol vervullen in het zenuwstelsel. Deze bevinding en de grote hoeveelheid aan zowel neuropeptiden en hun receptoren, bieden een nieuw drug target voor de behandeling van bepaalde aandoeningen in het zenuwstelsel. Het grote obstakel in deze drugontwikkeling is de administratiemethode. Peptiden kunnen namelijk niet oraal worden toegediend omdat ze worden afgebroken tijdens de vertering. Daarnaast bestaat er een bijkomende uitdaging voor neuropeptiden in het centrale zenuwstelsel, aangezien zij de bloed-hersenbarrière (BHB) moeten doorkruisen. Men is er reeds in geslaagd verschillende liganden te creëren door non-peptide liganden chemisch aan te passen qua selectiviteit en farmacokinetische eigenschappen [15]. Meerdere studies hebben reeds bewijs geleverd dat verschillende neuropeptiden een rol spelen in epilepsie. De evidentie was er reeds doordat ze worden vrijgesteld bij hoog frequente ontladingen, wat typerend is voor epileptische activiteit. Hierbij is de grootste vooruitgang geboekt met het neuropeptide Y (NPY). NPY en zijn receptoren worden verspreid teruggevonden in het zenuwstelsel en er is bewijs dat dit neuropeptide een rol speelt in de aanvalscontrole bij epilepsie. Zo wordt spontane aanvalsactiviteit gezien bij NPY deficiënte muizen en zijn deze eveneens veel gevoeliger voor chemisch geïnduceerde insulten. Daarnaast vertonen transgene ratten met een NPY overexpressie een lagere gevoeligheid voor epileptische aanvallen. Het is eveneens opvallend dat een stijging in de NPY concentratie wordt gezien in de interneuronen bij epileptische aanvallen. Deze bevindingen hebben aanleiding gegeven tot het idee dat NPY een mogelijke invalshoek is voor een nieuwe antiepileptische therapie [16]. Ook voor andere neuropeptiden, als galanine en somatostatine is bewijs geleverd dat ze een anti-convulsieve eigenschap bezitten [17].

12

3.2

Orexine / Hypocretine

Orexine is een neuropeptide ontdekt in 1998 door twee onafhankelijke onderzoeksgroepen. De ene groep gaf het peptide de naam orexine, afgeleid van het Griekse orexis wat honger betekent en duidt op één van de functies van het neuropeptide. De tweede groep koos voor de naam hypocretine, een samenvoeging van hypothalamus en secretine, doordat men het peptide talrijk terug vond in vesikels van de hypothalamische neuronen. Beide namen worden op heden aanvaard. Orexinerge neuronale cellichamen zijn enkel terug te vinden in de laterale hypothalamische regio en de aangelegen gebieden. Ze vormen een gemengde populatie met andere neuronen en men schat de omvang van de totale populatie op minder dan 80.000 cellen. De orexine neuronen

worden

gereguleerd

door

tal

van

transmitter

systemen,

alsook

door

bloedcomponenten zoals glucose. De neuronen projecteren specifiek naar verschillende hersenregio’s, zoals de prefrontale cortex, amygdala, hypothalamus, nucleus accumbens, hersenstam en ruggenmerg [18]. Orexine kent 2 isovormen: orexine A en B of ook hypocretine 1 en 2. Het zijn excitatorische neuropeptiden met 50% gelijkenis in hun sequentie. Beide peptiden worden gevormd uit het pre-pro-orexine (PPO of preprohypocretine). Het PPO gen codeert voor één kopij van elke isovorm. De synthese vindt plaats in een beperkt aantal neuronen in het laterale deel van de hypothalamus. Orexine A is 33 aminozuren lang en heeft 2 disulfidebindingen. Orexine B daarentegen is lineair en bezit 28 aminozuren. Studies veronderstellen dat orexine A biologisch belangrijker zou zijn doordat het stabieler en lipofieler is dan orexine B [18]. Er zijn 2 types receptoren voor orexine, beiden GPCR’s: orexine receptor 1 en 2 (OX1 en OX2), of ook de hypocretine receptor 1 en 2. Beide orexines worden beschouwd als evenwaardige liganden voor OX2, maar orexine B bindt ongeveer 5 tot 100 keer zwakker dan orexine A met OX1. Wanneer de orexines hun receptoren binden, kan een wijd repertoire aan cellulaire responsen geactiveerd worden. Dit repertoire verschilt niet enkel tussen verschillende celtypes, maar zelfs binnen één celtype kunnen verschillende responsen voorkomen. Daarnaast is het moeilijk om de exacte G-eiwit koppeling van de GPCR te bepalen, aangezien vaak specifieke moleculaire technieken ontbreken, directe metingen soms niet mogelijk zijn of men het cellulaire milieu moet verstoren. Hierdoor is ook bij de orexine

13

receptoren de exacte G-eiwit koppeling ver van duidelijk, maar is er bewijs dat beide receptoren de Gi/o, Gs en Gq familie van G-eiwitten binden [18]. Verschillende functies zijn geïdentificeerd voor orexine. In de eerste studies vond men dat intracerebroventriculaire (i.c.v.) injectie op korte termijn de voedselopname doet stijgen en dat centrale injectie de metabolische graad opdrijft. Vandaag veronderstelt men dat de voornaamste functie van orexine de regulatie van het metabolisme is, eerder dan de voedselopname. De orexinerge neuronen worden beïnvloed door het glucose niveau in het bloed. Voedsel deprivatie of acute hypoglycemie induceert de expressie van PPO mRNA en dit activeert de orexinerge neuronen [18]. Daarnaast is een belangrijke rol weggelegd voor orexine in de regulatie van slaap en waak. Men vond dat een knock-out (KO) diermodel voor PPO een narcoleptisch fenotype geeft. Knock-out modellen voor de orexine receptoren geven in verschillende dieren een ander resultaat. Bij mensen is de rol van de receptor subtypes nog niet geïdentificeerd, maar is het onderwerp zeer relevant voor eventuele ontwikkeling van receptor antagonisten tegen insomnia [18]. Men veronderstelt dat orexine histaminerge, noradrenerge, serotonerge en cholinerge neuronen activeert en op deze wijze de toestand van waak bevordert. De GABAerge neuronen die actief zijn tijdens de slaap zenden een inhibitorische output naar de orexinerge neuronen. Op heden veronderstelt men dat bij sommige patiënten met narcolepsie de orexinerge neuronen afsterven en zo hun orexine niveaus dalen. Overige functies van de orexines zijn terug te vinden in analgesie, verslaving en angst [18]. Het effect dat orexine kent op epilepsie is echter nog controversieel en het aantal studies is beperkt. Men zag in een onderzoek dat het orexine A gehalte in de cerebrospinale vloeistof gedaald was na gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen [19]. Dit kan een potentiële verklaring zijn voor de typische post-ictale somnolentie. Daarnaast werd in een in vitro model met hippocampale slices aangetoond dat orexine A een anti-epileptische werking vertoont op bicuculline-geïnduceerde epileptische activiteit [20]. Tenslotte is er nog een derde onderzoeksgroep die stelt dat een daling in de orexine B innervatie een rol zou spelen in epileptogenese en dat i.c.v. toediening van orexine B antiepileptisch zou werken [21]. In 2 andere studies werd dan weer aangetoond dat orexines eerder epileptische activiteit veroorzaken. Dit werd enerzijds aangetoond door intracorticale aanbreng van orexine A en orexine B in niet-epileptische proefdieren en anderzijds door intracorticale injectie in 14

proefdieren met penicilline-G geïnduceerde epileptische activiteit [22, 23]. In beide studies is het onderliggende mechanisme van de epileptische activiteit niet gekend. Door deze tegenstrijdigheden is het niet duidelijk of orexine een epileptische of anti-epileptische werking heeft. 3.3

Orexine antagonisten

Op heden zijn verschillende antagonisten op de markt die voornamelijk worden ontwikkeld voor de behandeling van insomnia. De niet-selectieve antagonisten zijn SB-649868, ACT078573 en Merck’s MK-4305. Daarnaast zijn ook selectieve antagonisten ontwikkeld die u terug kan vinden in onderstaande tabel (tabel 2). Er is ook gelabeld orexine A en B beschikbaar: 3H-SB-674042, 3H-almorexant en 3H-EMPA [18]. Er is preliminair onderzoek gebeurd rond het effect van de antagonisten SB-334867 of TCSOX2-29 op slaap gedepriveerde ratten, behandeld met het pro-convulsieve pentylenetetrazol. Hierbij bleken beide antagonisten de schade, veroorzaakt door de epileptische insulten, te beperken ter hoogte van de hippocampus. Daarnaast inhiberen beide antagonisten ook de cellulaire proliferatie in de dentate gyrus. Deze data veronderstellen in de grote lijnen een anti-convulsief effect van beide compounds [24]. Tabel 2: Overzicht van de orexine antagonisten

SB-334867

Selectieve OX1 antagonist

SB-408124

Selectieve OX1 antagonist

SB-410220

Selectieve OX1 antagonist

SB-674042

Selectieve OX1 antagonist

TCS-OX2-29

Selectieve OX2 antagonist

EMPA

Selectieve OX2 antagonist

4 Doelstelling van de masterproef Het objectief van deze masterproef is het evalueren van het effect van de orexine antagonisten SB-334867 (selectieve OX1 antagonist) en TCS-OX2-29 (selectieve OX2 antagonist) in de kindling acquisitie. Hierbij kiezen we voor rapid kindling met de amygdala als stimulatiefocus. De amygdala wordt gekozen, aangezien deze in het labo ook gebruikt wordt als focus voor het klassieke kindling protocol. Het rapid kindling model lijkt veelbelovend voor de snelle screening van compounds, aangezien het protocol slechts enkele dagen in beslag neemt in vergelijking met de duur van meerdere weken voor klassieke kindling. 15

Dit experiment is eveneens een pilootstudie voor het rapid kindling model, aangezien het nog niet eerder werd toegepast in het laboratorium voor klinische en experimentele neurofysiologie (LKEN). De proefdieren worden verdeeld over 3 groepen, namelijk een controlegroep (n=8) en 2 compoundgroepen (n=8). De oplossingen worden steeds i.c.v. toegediend 30 minuten voor de eerste stimulatie tot het einde van de stimulatie sessies. Deze toedieningswijze omzeilt de nadelen van orale of intraveneuze administratie. In deze gevallen moeten de antagonisten namelijk resistent zijn voor de vertering (orale toediening) en ze moeten de BHB kunnen doorkruisen. Daarnaast zou lokale toediening ter hoogte van de amygdala of hippocampus ernstige schade aan de structuren berokkenen en een sterke invloed uitoefenen op het epileptisch aanvalsprofiel van de dieren. Zowel de aanbreng van de canule als de druk van de toegediende vloeistof veroorzaken deze ernstige schade aan het hersenweefsel. Onze beste keuze bestaat dus bijgevolg uit i.c.v. toediening, waarbij de impact op de amygdala, de plaats waar de insulten ontstaan, zo klein mogelijk is. In het onderzoek zullen we aan de hand van de kindling parameters (ADT, ADD en stage) het effect nagaan van de antagonisten in vergelijking met de controlegroep. Hierbij verwachten we dat de antagonisten het kindling proces zullen remmen met lagere stages en kortere ADD’s met toenemende stimulatie sessies in vergelijking met de controlegroep, die enkel saline ontvangt.

16

Deel 2: Materialen en methoden 1 Proefdieren In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van mannelijke Wistar ratten met een gewicht tussen 250 en 350 gram (ISO-2009, Janvier, Frankrijk). Deze worden behandeld volgens richtlijnen goedgekeurd door het Europees Ethisch Comité (86/609/EEC). Het studie protocol werd goedgekeurd door het Dierexperimenteel Ethisch Comité van de Universiteit Gent (ECP 12/12). In totaal zijn 26 dieren geopereerd en vervolgens ad random verdeeld in een controlegroep en 2 behandelingsgroepen. De controlegroep ontvangt saline en de 2 onderzoeksgroepen krijgen SB-334867 of TCS-OX2-29. De huisvesting is onderworpen aan gecontroleerde omgevingsfactoren met een 12 uur dag/nacht cyclus, een kamertemperatuur van 20-23° C en 50-60% relatieve vochtigheid. Voedsel en water worden ad libitum aangeboden.

2 Elektroden Twee types elektroden zijn voor aanvang van de operaties handmatig vervaardigd: scalp elektroden en tripolaire elektroden. Elk proefdier vereist 2 scalp elektroden en 1 tripolaire elektrode. 2.1

Scalp elektrode Het maken van de scalp elektrode start met het snijden van een metalen draad (RS 359-891) met een Connectiepin

lengte van ongeveer 2 cm. Beide uiteinden van de draad worden gestript met een facom stripper. Aan de ene zijde van de draad wordt een juwelierschroefje (1.57 mm diameter, Bilaney, Duitsland) gesoldeerd

Metalen draad

met behulp van soldeerdraad (RS Components, 0.50 mm, Tin/Lead/Silver), soldeervloeistof (Griffon, S39) en een soldeerbout. Aan het andere uiteinde

Schroef

wordt een gouden connectiepin bevestigd (figuur 1).

Figuur 1: Scalp elektrode

17

2.2

Tripolaire elektrode

De tripolaire elektrode telt twee draden voor stimulatie van de hersenen en één voor registratie van de hersenactiviteit. De stimulatie-elektroden worden vervaardigd uit een polyimide gecoate stainless steel draad (125 µm diameter; Bilaney, Düsseldorf, Germany) en de registratie-elektrode uit een dunnere draad (70 µm diameter; CFW, Grover Beach, USA). Door middel van een magnetische roerder worden deze 3 draden getwist in een 20-tal omwentelingen. Met

behulp

van

een

binoculaire

microscoop worden de draden op een afstand van 0.25 mm van elkaar afgesneden

met

de

dunne

registratiedraad in het midden, zoals u terug kan vinden in figuur 2. We fixeren het geheel door een touwtje te knopen tussen het getwiste en niet Figuur 2: Afstanden tussen de 3 draden van de tripolaire elektrode

getwiste gedeelte en hier secondelijm op aan te brengen (figuur 3).

Tenslotte strippen we de coating van de draden aan de tegenovergestelde zijde, namelijk daar waar de 3 draden samen komen op eenzelfde lengte en we bevestigen 3 connectiepinnen op de 3 draden (figuur 3). Deze connectiepinnen worden later bevestigd in een hoedje dat de verbinding vormt Figuur 3: Tripolaire elektrode

naar de voorversterker.

3 Operatie De operatie houdt in dat zowel de elektroden voor stimulatie als voor EEG-registratie worden aangebracht in de hersenen van het proefdier. Daarnaast wordt ook een canule aangebracht in het ventrikel voor de i.c.v. aanbreng van de oplossingen.

18

Voor aanvang van de operatie worden alle nodige materialen klaargezet en dient de operatiezone ontsmet te worden. Op deze manier kan de operatie vlotter verlopen. Het ontsmetten van de operatietafel gebeurt door middel van 70% ethanol. Het proefdier wordt vervolgens in zijn eigen kooi tot verdoving gebracht via gasanesthesie met isofluraan (5% voor de inductie, 2% tijdens de eigenlijke operatie).

Figuur 4: Overzicht operatie. A. Subcutane injectie van Temgesic. B. Scheren van de hoofdhuid. C. Bregma bepalen. D. Stereotactische aanbreng elektroden. E. Verbinden hoedje en voorversterker. F. Eindresultaat.

Eenmaal verdoofd, wordt het dier gewogen om de dosissen medicatie te bepalen en wordt het vervolgens geplaatst op een stereotactisch kader, waarbij het hoofd gefixeerd wordt d.m.v. oorstaven. Subcutaan injecteren we Temgesic (buprenorphine hydrochloride, 0.05 mg/kg, figuur

4.A).

In

de

spier

van

de

achterpoot

injecteren

we

Xylocaïne

(2%,

19

licocaïnehydrochloride). We bereiden de vacht voor op het scheren door deze vochtig te maken met ethanol en water (figuur 4.B). De ogen worden bedekt met een doekje, geweekt in saline, om uitdroging tegen te gaan. Na het scheren en ontsmetten van de hoofdhuid wordt een rechte incisie gemaakt met een scalpel. Vervolgens wordt de schedel bloot gelegd en het werkoppervlak vrij gemaakt van bloed om de zichtbaarheid te optimaliseren. Bloedingen worden gestelpt door ‘bone wax’ aan te brengen op de schedel. Door het aanstippen van aceton op de schedel worden de sutura donkerder en zo is het mogelijk het snijpunt van de sutura coronalis en de sutura sagittalis te bepalen. Dit punt wordt ook ‘bregma’ genoemd (figuur 4.C). Bregma is het referentiepunt voor het stereotactisch coördinatensysteem die gehanteerd wordt voor de bepaling van de coördinaten van de canule en de stimulatie/registratie-elektroden. Een schema voor de implantatie van de verschillende onderdelen is terug te vinden in figuur 5 . De ankerschroeven worden eerst aangebracht, deze zijn essentieel voor fixatie van het geheel. Op figuur 5 zijn deze schroeven zichtbaar als

kruisjes.

Er

worden

in

totaal

4

ankerschroeven aangebracht: 2 langs beide zijden van de schedel, één ter versteviging van de canule en één naast de tripolaire elektrode, eveneens ter versteviging. De tweede stap in de operatie omvat het aanbrengen

van

de

scalpelektrode

ter

referentie, waarbij het EEG bepaald wordt tussen deze referentie-elektrode en de 3e pool van de tripolaire elektrode. Er wordt ook een scalpelektrode aangebracht ter Figuur 5: Implantatie schema

hoogte van de frontale cortex voor EEG registratie ter hoogte van de hersenschors.

We brengen de tripolaire elektrode stereotactisch aan in de rechter amygdala (AP -2.30 mm, ML +4.70 mm, DV -8.40 mm). De stimulatie gebeurt met de 2 buitenste polen van deze elektrode (figuur 4.D). De 3e (middelste) pool wordt gebruikt om het EEG te registreren in de amygdala (diepte EEG registratie).

20

We verbinden de elektroden met het hoedje zoals voorgesteld in figuur 6 en fixeren het geheel met acryl dentaal cement (Belgica Dental, België). Tenslotte

wordt

een

canule

aangebracht 1 mm boven het linker ventrikel (AP -0.26 mm, ML -1.10 mm, DV -2.50 mm) voor de i.c.v. aanbreng van saline, antagonist 1 of 2. De canule wordt niet in het ventrikel zelf

aangebracht

omdat

dit

aanleiding zou kunnen geven tot een lek van de cerebrospinale vloeistof. Daarom wordt een Figuur 6: Lokalisatie van de elektroden in het hoedje. In het rood: aangebrachte elektroden.

dummy aangebracht om de canule af te sluiten van de buitenwereld.

Bij aanvang van het eigenlijke experiment brengen we een internal aan die 1 mm dieper dan de canule zit, waardoor deze wel

in het ventrikel terecht komt.

We verbinden het geheel met de voorversterker en verstevigen met het dentaal cement (figuur 4.E). Vervolgens hechten we de huid en verwijderen we de internal, voorlopig wordt hierin een dummy geplaatst zoals eerder aangehaald (figuur 4.F). Op de wonde brengen we Xylocaïne 2% gel aan en Neobacitracine. We injecteren subcutaan het antibioticum Baytril (10 mg/kg) en de niet-steroïde anti-inflammatoire drug (NSAID) Metacam (1 mg/kg). Elke 24 uur zal het dier gedurende de eerste 2 dagen na de operatie een subcutane injectie Metacam (1 mg/kg) ontvangen. Na de operatie wordt het dier onder een infrarood lamp geplaatst en volgt er een herstelperiode van 2 weken. Gedurende deze revalidatieperiode zullen de dieren ‘gehandled’ worden om ze gewoon te maken aan menselijke aanrakingen en aanwezigheid. Dit omvat dagelijks aaien en oppakken van het dier gedurende een 5 à 10-tal minuten. In totaal worden 26 ratten geopereerd, waarbij elke onderzoeksgroep 8 dieren omvat en 2 dieren als reserve worden gehouden.

21

4 Experimentele set-up De dieren worden gedurende de looptijd van het experiment ondergebracht in het animalarium, met uitzondering van een periode van maximaal 3 dagen als ze hun kindling protocol doorlopen. Een dag voor aanvang van het experiment worden de geselecteerde dieren verhuist naar onze experimentele ruimte. Hier zijn 3 kooien voorzien waarbij 3 dieren met dezelfde set-up achtereenvolgens gestimuleerd kunnen worden. De monitorkooien hebben een afmeting van 29 x 29 x 50 cm. Voedsel en water zijn ad libitum tot hun beschikking. Na afloop van de tweede dag van het kindling protocol worden de dieren terug gebracht naar het animalarium. De dieren worden geselecteerd op basis van verschillende parameters. Zo wordt gekeken naar hun algemeen gedrag tijdens de handling periode en het verloop van hun operatie. Op deze manier kiezen we ervoor om de dieren waarbij er afwijkingen waren tijdens de operatie als reserve te houden of niet te gebruiken voor ons onderzoek. Mogelijke afwijkingen tijdens de operatie zijn: een elektrode die te diep wordt ingebracht en een technisch defect aan een geïmplanteerde elektrode. In de monitorkooien staan de dieren via hun connectiehoedje, voorversterker en een swivel in verbinding met de versterker en de National instruments data acquisition card (National Instruments, Austin, Texas, USA). Op deze manier kunnen de dieren vrij rond bewegen gedurende de monitoring en stimulaties. De elektrische stimulaties worden toegediend door middel van de DS4 stimulator. Vlak voor de stimulaties verbinden we het juiste dier met de stimulator. Een half uur voor aanvang van de eerste stimulaties wordt de dummy in het ventrikel vervangen door een internal die 1 mm dieper zit en zo uitmondt in het ventrikel. De compounds worden toegediend in het ventrikel via een tube geconnecteerd met een automatische infusiepomp aan een flowrate van 0.05 µl/min gedurende de volledige looptijd van het experiment.

5 Kindling acquisitie Een dag voor aanvang van de eerste stimulaties dient de ADT bepaald te worden. Dit is de stimulatie intensiteit waarbij een AD wordt bekomen van minimaal 5 seconden. Het is hierbij vereist eerst de impedantie te bepalen om het stimulatiecircuit te controleren. We stellen de kalibrator in op een waarde van 50 kOhm en verbinden een 10 kOhm verbindingsstuk tussen beide polen. Op deze wijze bepalen we de accuraatheid van de kalibrator, namelijk of deze ook werkelijk 10 kOhm aangeeft. Vervolgens veranderen we de instelling van de kalibrator 22

naar 500 kOhm en connecteren we de 2 polen van het stimulatiecircuit. Deze impedantie wordt steeds genoteerd en beoordeeld voor aanvang van de stimulaties de dagen nadien. Voor het bepalen van de ADT verbinden we de kabels van het dier met de DS4 stimulator. Met behulp van de softwaretool ‘Matlab’ en het programma ‘Neuron’ starten we het stimulatieprotocol op voor het bepalen van de ADT. Hierbij starten we met een stimulatie intensiteit van 60 µAmpère en verhogen we bij iedere stimulatie de intensiteit met 20 µA. Om de minuut wordt een stimulatie (bifasische square wave pulsen, 50 Hz gedurende 1 seconde) toegediend tot een AD bekomen wordt van minimaal 5 seconden. Het belang van deze bepaling is om zeker te zijn dat nadien boven deze drempelwaarde gestimuleerd wordt, anders zal het dier niet kindlen. Op dag 1 van het experiment starten we opnieuw met het bepalen van de impedantie. De infusie wordt vervolgens toegediend aan een flowrate van 0.05 µl/min gedurende de volledige experimentele periode van 5 uren. Het dier wordt voor de eerste maal gestimuleerd 30 minuten na aanvang van de infusie. Ook in deze stap wordt de ADT bepaald en deze ADT stimulatie zal beschouwd worden als de eerste stimulatie van het kindling acquisitie protocol. Op deze manier zal elke 30 minuten een elektrische stimulatie (400 µA, gedurende 10 seconden, bifasische square wave pulsen, 50 Hz) worden gegeven met een totaal van 10 stimulaties per dag gedurende 2 dagen. Na iedere gegeven stimulatie wordt het EEG voor 5 minuten geregistreerd en noteren we de duur van de AD’s (ADD), alsook de stage van de aanval volgens het model van Racine.

6 Histologische controle Na afloop van het experiment worden de dieren gesacrificeerd en voeren we een histologische controle uit op de locatie van de elektrode en canule. We brengen de rat onder verdoving d.m.v. isofluraan en dienen vervolgens een overdosis pentobarbital (180 mg/kg intraperitoneaal) toe. Voor de controle van de canule brengen we trypaan blauw (4 µl, 1/10 verdunning) aan in het ventrikel en wachten we een 10-tal minuten. Na bevestiging van een volledige verdoving maken we een rechte incisie op de borst tot aan het sternum. Vervolgens creëren we een venster waarbij het hart goed zichtbaar is. We brengen 0.1 ml heparine in de apex van het hart om bloedstolling te vermijden. Vervolgens perfuseren we transcardiaal een PBS-oplossing (phosphate-buffered saline, PH 7.4) waardoor het bloed in het arterieel systeem wordt weggespoeld. Na een 5-tal minuten brengen we een oplossing van 0.9% saline en 10% formaline oplossing aan. Deze paraformaldehyde oplossing zal ervoor zorgen dat de weefsels gefixeerd worden. 23

Na deze procedure isoleren we de hersenen en leggen we ze voor 24 uur in een paraformaldehyde oplossing. Daarna brengen we de hersenen gedurende 3 opeenvolgende dagen in stijgende concentraties glucose oplossingen, gaande van 10%, 20% naar 30% glucose. Deze stijgende concentraties zijn essentieel om het water uit de coupe te verdringen en zo kristalvorming tegen te gaan. Nadien zijn de hersenen klaar voor invriezing. Hiervoor koelen we isopentaan in vloeibaar stikstof en brengen de hersenen één voor één aan in de isopentaan om ze vervolgens in een cryovial te leggen. De cryovials worden bewaard in het stikstofvat waar ze minimaal 24 uur voor aanvang van de eerste cryosecties moeten blijven. Door middel van een vriesmicrotoom worden coupes gemaakt van 70 µm. De coupes worden in een plaat met welletjes, gevuld met PBS, bewaard om vervolgens gesorteerd te worden op dekglaasjes. Nadien wordt een Nissl-kleuring uitgevoerd op de coupes om de structuren beter te visualiseren. De locatie van de canule en elektrodes worden tenslotte gecontroleerd.

7 Statistiek Voor de statistische verwerking van de data is het mixed model gekozen. Dit wordt uitgevoerd in het programma ‘SPSS statistics V22’. Het mixed model is een statistisch model dat zowel vaste als willekeurige effecten omvat, vandaar de naam ‘mixed’. Het wordt voornamelijk gebruikt wanneer herhaalde metingen worden uitgevoerd in hetzelfde dier, waardoor deze metingen afhankelijk worden van elkaar. Je verwacht namelijk binnen eenzelfde dier dat de metingen gecorreleerd zijn aan elkaar en deze niet onafhankelijk zijn. Dit model heeft ook als voordeel dat wanneer er een waarde ontbreekt, het model er rekening mee houdt en niet meteen het dier uit de studie uitsluit. Het mixed model is analoog aan de ‘repeated measures Anova’. Voor de analyse van het onderdeel ‘aantal stimulaties tot het bereiken van stage 4 of 5’ is gekozen voor de niet-parametrische Kruskal Wallis test, aangezien er per dier slechts één uitkomstvariabele is. Deze test laat ons toe de gemiddelde scores te vergelijken van 2 of meer groepen.

24

Deel 3: Resultaten Bij aanvang van het experiment zijn 26 dieren geopereerd, waarvan er één dier overleden is gedurende de operatie. Tijdens de operaties is bij 5 dieren een probleem opgetreden, zoals een tripolaire elektrode met een los stimulatiedraadje, een elektrode die te diep is ingebracht, … Deze 5 dieren zijn niet gebruikt in ons experimenten. Het initiële protocol voor ons experiment bestond uit 40 stimulaties die om de 5 minuten werden toegediend [25]. Na het testen van dit protocol bij 2 controledieren bleek dit de dieren niet te kindlen en is er voor gekozen het protocol te herzien en te optimaliseren. Beide dieren zijn niet opnieuw gebruikt in onze definitieve studie. In het eigenlijke protocol tenslotte reageerden 3 dieren op de eerste stimulaties reeds met een heel hevige respons. De kindling acquisitie werd niet uitgevoerd op deze 3 proefdieren. Dit levert ons een steekproefgrootte op van 15 proefdieren, onderverdeeld in de controlegroep (n=6), de SB-334867 groep (n=4) en de TCS-OX2-29 groep (n=5).

1 Afterdischarge treshold (ADT) De ADT wordt gedefinieerd als een AD met een minimale duur van 5 seconden. Deze wordt bepaald op dag 0 zonder toediening van enige compound en vervolgens op dag 1 en 2, 30 minuten na infusie (flowrate van 3 µl/uur). We definiëren dag 0 als de dag voor aanvang van de kindling stimulaties. Grafiek 1 is een weergave van de gemiddelde ADT op dag 0, dag 1 na infusie en op dag 2 na infusie voor de 3 onderzoeksgroepen: controle, SB-334867 en TCSOX2-29. Bij de drie onderzoeksgroepen zien we een variatie van de ADT op dag 0, met respectievelijke waarden van 130±6.8313 µA, 95±12.583 µA en 140±16.733 µA voor de controlegroep, SB-334867 en TCS-OX2-29 groep. In de 3 groepen is zichtbaar dat met verloop van tijd de ADT daalt. Opvallend is de daling tussen dag 0 en dag 1 na infusie. Hierbij is er een significant verschil (p < 0.05) in de controlegroep tussen de waarde 130 µA±6.831 op dag 0 en 103.330±15.847 µA op dag 1. Bij de SB-334867 groep zijn dit waarden van 95±12.583 µA en 85±5.000 µA. De TCS-OX2-29 groep tenslotte vertoont een significant verschil (p < 0.05) tussen de ADT op dag 0, nl. 140±16.733 µA en de ADT op dag 1 na infusie, nl. 100±15.492 µA. Er is daarnaast ook een significant verschil (p < 0.05) in deze groep tussen de ADT op dag 0, 140±16.733 µA en deze 25

op dag 2 na infusie, 92±10.198 µA. De ADT daalt tenslotte bij iedere groep op dag 2 na infusie t.o.v. de ADT op dag 1 na infusie. De controlegroep gaat van 103.333±15.846 µA op dag 1 naar 88±9.798 µA op dag 2. Dit zijn waarden van 85± 5 µA en 80±8.165 µA voor de SB-334867 groep en 100±15.491 µA en 92±10.198 µA voor de TCS-OX2-29 groep. §    

180  

Y

*

160  

Gemiddelde ADT

140   120   100   80   60   40   20   0  

Controle ADT dag 0

SB-334867 ADT dag 1 (na infusie)

TCS-OX2-29 ADT dag 2 (na infusie)

Grafiek 1: Gemiddelde ADT (µA, ± Standard error of the mean, SEM) voor de controlegroep (n=6), SB334867 (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5) op dag 0 (zonder infusie), op dag 1 (na infusie) en op dag 2 (na infusie). (*) Significant verschil (p < 0.05) tussen ADT dag 0 en ADT dag 2 voor de controlegroep. (Y ) Significant verschil (p < 0.05) tussen ADT dag 0 en ADT dag 1 voor de TCS-OX2-29 groep. (§) Significant verschil (p < 0.05) tussen ADT dag 0 en ADT dag 2 voor de TCS-OX2-29 groep.

2 Gemiddelde aanvalsstage Het kindling protocol bestaat uit het toedienen van tien elektrische stimuli per dag, gedurende 2 dagen, met een tijdsinterval van 30 minuten tussen iedere stimulus. De stimulatie sessies worden in onderstaande grafieken doorgenummerd doorheen de 2 dagen, gaande van stimulatie 1 tot 20. De ernst van de aanvallen wordt bij elke stimulatie sessie gescoord via de schaal van Racine. 2.1

Controle groep

Bij de eerste stimulaties vertonen de meeste dieren een lage aanvalsstage van 1 of 2, maar één dier reageerde echter meteen met een stage 5. Gedurende het protocol stijgt de gemiddelde aanvalsstage voor de controlegroep. Tussen dag 1 en dag 2 (stimulatie 10 en 11) is er een 26

stijging van de stage van een gemiddelde van 2.833±0.477 naar 4.333±0.333. Gedurende het protocol is er soms een schommeling zichtbaar tussen een hoge en lage stage in opeenvolgende stimuli. Er is een significant verschil (p < 0.05) tussen de stage bereikt op stimulatie 2 en deze op stimulatie 14 en 18, met respectievelijke waarden van 1.833±0.307, 4.833±0.167 en 4.667±0.333. Op het einde van de 2 stimulatiedagen zijn 4 van de 6 controledieren fully kindled. De overige twee dieren eindigen met een stage 2 respons, hoewel ze voordien reeds een stage 4 of 5 respons vertoonden. In grafiek 2 vindt u een weergave van de gemiddelde aanvalsstage per stimulatie voor de controlegroep. 5  

*

*

4,5  

Aanvalsstage

4   3,5   3   2,5   2   1,5   1  

Dag 1

Dag 2

0,5   0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Grafiek 2: Gemiddelde aanvalsstage (± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de controlegroep (n=6). De stippellijn geeft het onderscheid aan tussen stimulatiedag 1 en 2. (*) Dit punt is significant verschillend (p < 0.05) t.o.v. stimulatie sessie 2.

2.2

SB-334867

In grafiek 3 vindt u een overzicht van de gemiddelde aanvalsstages voor elke stimulatie gegeven op dag 1 en dag 2 voor de SB-334867 groep. Bij de eerste stimulaties reageert elk dier met een stage 0 of stage 1. Gedurende de stimulatie sessies stijgt bij elk dier de aanvalsstage, waarbij op het einde van dag 1 (stimulaties 9 en 10) en bij de stimulaties van dag 2 (stimulaties 11 tot 18) een schommelend verloop kan worden waargenomen tussen de aanvalsstages van opeenvolgende stimulaties. Op dag 2 kan bij de eerste stimulatie (stimulatienummer 11) een lagere aanvalsstage worden 27

opgemerkt in vergelijking met de laatste stimulatie van dag 1 (stimulatie 10). Deze waarden zijn respectievelijk een gemiddelde stage van 3.250±0.479 en 1.250±0.479. Op het einde van dag 2 is 1 dier fully kindled en reageren 2 dieren met een stage 4 respons. Één dier reageert echter op het einde met een stage 0, wat de gemiddelde eindwaarden van stimulaties 19 en 20 doet dalen naar waarden van 3±1.225 en 3.250± 1.109. Doorheen beide stimulatiedagen is de stage op stimulatie sessie 1, m.a.w. de baseline stage, significant verschillend (p < 0.05) ten opzichte van sessies 14 (4±0.707), 16 (4.500±0.289), 17 (4.000±0.707) en 18 (4.750±0.250). 5  

*

*

4,5  

*

4  

*

Aanvalsstage

3,5   3   2,5   2   1,5   1  

Dag 1

Dag 2

0,5   0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Grafiek 3: Gemiddelde aanvalsstage (± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de SB-334867 groep (n=4). De stippellijn geeft het onderscheid weer tussen stimulatiedag 1 en 2. (*) Dit punt is significant verschillend (p < 0.05) t.o.v. stimulatie sessie 1.

2.3

TCS-OX2-29

In grafiek 4 vindt u de gemiddelde aanvalsstage terug per stimulatie voor de TCS-OX2-29 groep. Alle dieren starten bij de eerste stimulaties met een lage aanvalsstage. Gedurende de kindling acquisitie stijgt de aanvalsstage met bijkomende stimulaties. Bij de latere stimulaties op dag 1 (stimulaties 5 tot 10) zien we een oscillerend verloop in de aanvalsstages, alsook in de tweede helft van dag 2 (stimulaties 14 tot 20). De stage, bereikt op stimulatie sessie 1 (1.400±0.245), is significant verschillend (p < 0.05) 28

van de stage op stimulatie sessie 14 (4.400±0.600) en 20 (4.200±0.583). Op het einde van de beide stimulatiedagen zijn 3 van de 5 dieren uit deze groep fully kindled. Één dier reageert gedurende het volledige stimulatieproces nooit met een stage hoger dan 2. Het laatste dier uit deze groep eindigt tenslotte met een stage 4. 5  

*

4,5   4  

*

Aanvalsstage

3,5   3   2,5   2   1,5   1  

Dag 1

0,5  

Dag 2

0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Grafiek 4: Gemiddelde aanvalsstage (± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de TCS-OX2-29 groep (n=5). De stippellijn geeft het onderscheid aan tussen stimulatiedag 1 en 2. (*) Dit punt is significant verschillend (p < 0.05) t.o.v. de baseline, stimulatie sessie 1.

2.4

Overzichtsgrafiek

Grafiek 5 geeft een combinatie weer van de drie voorgaande grafieken: grafiek 2, 3 en 4. Hierbij kan men opmerken dat de controledieren bij de eerste stimulaties een hogere gemiddelde aanvalsstage vertonen dan de SB-334867 groep en de TCS-OX2-29 groep, met respectievelijke waarden van 2.5±0.671, 0.5±0.289 en 1.4± 0.245. De SB-334867 groep start met de laagste waarden van de 3 groepen. De gemiddelde aanvalsstage bij stimulatie 1 bedraagt 0.5±0.289. Bij de laatste stimulaties op dag 2 eindigt de TCS-OX2-29 groep met de hoogste gemiddelde stage, namelijk 4.2±0.583. Daarna volgt de controlegroep met een gemiddelde stage van 4±0.632 en de SB-334867 groep eindigt met de laagste stage bij stimulatie 10 op dag 2: 3.25±1.109. Er is een significant verschil (p < 0.05) tussen de controlegroep en de SB-334867 groep op sessies 1 (2.5±0.671 voor de controlegroep en 0.5±0.289 voor de SB-groep) en 11 (4.333±0.333 voor de controlegroep en 1.25±0.479 voor de SB-groep). De controlegroep en 29

de TCS-OX2-29 groep zijn significant verschillend (p < 0.05) op sessies 4 en 9 met waarden van 4.167±0.307 en 3.5±0.5 voor de controlegroep en 2.2±0.435 en 1.4±0.4 voor de TCSgroep. Tenslotte zijn de TCS-groep en SB-groep significant verschillend (p < 0.05) op de punten 7 en 9 met waarden van 1.4±0.245 en 1.4±0.4 voor de TCS-groep en 3.5±0.645 en 3.25±0.479 voor de SB-groep. Globaal is er een significant verschil (p < 0.05) in de stijging van de stages met de opeenvolgende metingen tussen de 3 onderzoeksgroepen. Hierbij kent de controlegroep de sterkste stijging. 5   4,5  

Gemiddelde aanvalsstage

4   3,5   3   2,5  

§    

2  

w

1,5  

°  

°   §    

1   0,5  

*  

*  

0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Controle  (n=6)  

SB-­‐334867  (n=4)  

TCS-­‐OX2-­‐29  (n=4)  

Grafiek 5: Combinatie van de aanvalsstage/stimulatie sessie grafieken (± SEM) van de controlegroep (n=6), SB-334867 (n=4) en TCS-OX2-29 (n=5). (*) Dit punt van de SB-groep is significant verschillend (p < 0.05) van de controle groep. (§) Dit punt van de TCS-groep is significant verschillend (p < 0.05) van de controle groep. (°) Dit punt van de TCS-groep is significant verschillend (p < 0.05) van de SB-groep.

2.5

Area under the curve (AUC)

De oppervlakte onder de curve (AUC) van grafiek 5 is voor iedere groep voorgesteld op dag 1 en dag 2 in grafiek 6. Op dag 1 heeft de controlegroep de grootste AUC, gevolgd door de SB-groep en tenslotte de TCS-groep. De waarden voor deze oppervlakten zijn respectievelijk 29.667±2.231, 25.750±2.496 en 19.600±3.776. Op dag 2 is de volgorde echter licht gewijzigd, waarbij de 30

controlegroep nog steeds de grootste AUC heeft, maar deze wordt eerst gevolgd door de TCSgroep en tenslotte door de SB-groep. Deze AUC’s zijn: 39.667±2.765 voor de controlegroep, 36.8±5.877 voor de TCS-groep en 35.750±3.568 voor de SB-groep. Voor alle groepen zijn de AUC’s op dag 2 hoger dan deze op dag 1. Zowel de controlegroep als de TCS-groep vertonen een significant verschil (p < 0.05) tussen dag 1 en dag 2. *   *  

45   40   35  

AUC

30   25   20   15   10   5   0  

Dag 1 Controle (n=6)

Dag 2 SB-334867 (n=4)

TCS-OX2-29 (n=5)

Grafiek 6: AUC (± SEM) voor de controlegroep (n=6), SB-334867 groep (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5) op dag 1 en dag 2. (*) Significant verschil (p < 0.05) tussen de AUC op dag 1 en dag 2.

3 Aantal stimulaties tot het bereiken van stage 4 en 5 Per groep is gekeken naar het gemiddeld aantal stimulaties dat de dieren nodig hebben om een stage 4 of 5 te bereiken. De resultaten zijn terug te vinden in grafiek 7. Beide behandelingsgroepen vereisen meer stimulaties t.o.v. de controlegroep voor het bereiken van zowel stage 4 als stage 5. De controlegroep vertoont na een gemiddeld aantal van 3.333±0.558 stimulaties een stage 4 en 5.333±1.563 stimulaties een stage 5. Voor het bereiken van een stage 4 zijn er meer stimulaties nodig voor de TCS-OX2-29 groep in vergelijking met de SB-334867 groep, met een gemiddeld aantal van 10.200±3.513 stimulaties voor de TCS-OX-29 groep en 6.75±0.946 voor de SB-334867 groep. Dezelfde trend is terug te vinden voor het bereiken van een stage 5. Zo is het gemiddeld aantal stimulaties voor een stage 5 10.75±0.946 voor de SB-334867 groep en 12.400±2.768 voor de 31

TCS-OX2-29 groep. In de TCS-groep is er één dier die nooit een stage 4 of 5 bereikt. Voor dit dier is het toegekende aantal stimulaties tot het bereiken van stage 4 en 5 de maximale waarde van 21. Er is een significant verschil (p < 0.05) voor het behalen van een stage 5 tussen de controlegroep en de TCS-OX2-29 groep volgens de Kruskal-Wallis test. 16  

*  

14  

Aantal stimulaties

12   10   8   6   4   2   0  

Stage 4 Controle (n=6)

Stage 5 SB-334867 (n=4)

TCS-OX2-29 (n=5)

Grafiek 7: Gemiddeld aantal stimulaties voor het bereiken van een stage 4 of 5 (±SEM) volgens de classificatie van Racine voor de controlegroep (n=6), TCS-OX2-29 (n=4) en SB-334867 groep (n=5). (*) Significant verschil (p < 0.05) tussen de controle en TCS-OX2-29 groep.

4 Duur van de afterdischarges (ADD) Na het toedienen van een elektrische stimulus wordt op het EEG een AD waargenomen. Deze wordt gemeten vanaf het ogenblik dat de stimulatie beëindigd is gedurende 5 minuten. Er wordt steeds een primaire AD waargenomen. Soms kan na de primaire AD een secundaire, tertiaire, … AD volgen. De som van de duurtijden van alle AD’s van stimulatie sessie 1 tot 20 noemen we de cumulatieve totale ADD. De som van alle primaire ADD’s van stimulatie sessie 1 tot 20 heet de cumulatieve primaire ADD. 4.1

ADD in functie van de stimulatie sessie voor de controlegroep

Grafiek 8 is een weergave van de gemiddelde ADD (seconden) in functie van de stimulatie sessie. De gemiddelde ADD van de eerste stimulatie is 42.694±17.825 seconden. Zowel op dag 1 als 32

dag 2 zien we een oscillerend verloop, met waarden die schommelen tussen een hoge ADD en een lagere ADD. De ADD’s stijgen in het verloop van het stimulatieproces. Hierbij gaan we van een ADD bij stimulatie 1 van 42.694±17.825 seconden naar een ADD van 91.427±8.891 seconden op stimulatie 20 (= stimulatie 10 op dag 2). Bij de overgang tussen de stimulaties van dag 1 en dag 2 zit er een val in de ADD. Hierbij is de ADD van de laatste stimulatie op dag één 79.851±14.925 seconden en de eerste stimulatie op dag 2 is 29.1660±16.038 seconden.

Gemiddelde ADD (seconden)

140   120   100   80   60   40  

Dag 1

20  

Dag 2

0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Grafiek 8: Gemiddelde ADD (seconden, ± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de controlegroep (n=6). De stippellijn geeft het onderscheid aan tussen dag 1 en dag 2 van de stimulaties.

4.2

ADD in functie van de stimulatie sessie voor de SB-334867 groep

De gemiddelde ADD in functie van de stimulatie sessie voor de SB-334867 groep is zichtbaar in grafiek 9. De gemiddelde ADD’s starten met een duur van 22.099±8.517 seconden en stijgen naar een uiteindelijke waarde van 65.569±22.444 seconden. Zowel op dag 1 als dag 2 is er op de laatste stimulaties een terugval zichtbaar in de ADD. Hierbij gaan we van 101.056±12.378 seconden naar 77.401±30.836 seconden voor de 9e en 10e stimulatie op dag 1 en van 83.675±6.653 seconden naar 60.569±21.475 seconden voor de 8e en 9e stimulatie van dag 2. Tussen dag 1 en dag 2 is er een terugval zichtbaar in de ADD, gaande van een waarde van 77.401±30.836 seconden bij de laatste stimulatie op dag 1 en 52.670±13.998 seconden bij de eerste stimulatie op dag 2. Tenslotte is er een significant verschil (p < 0.05) tussen de gemiddelde ADD van de baseline stimulatie sessie 1 en stimulatie sessie 9, namelijk tussen de 33

waarden 22.099±8.517 seconden en 101.056±12.378 seconden.

Gemiddelde ADD (seconden)

120  

*

100   80   60   40  

Dag 1

20  

Dag 2

0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Grafiek 9: Gemiddelde ADD (seconden, ± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de SB-334867 groep (n=4). De stippellijn geeft het onderscheid aan tussen dag 1 en dag 2 van de stimulaties. (*) Dit punt is significant verschillend (p < 0.05) t.o.v. stimulatie sessie 1 (baseline).

4.3

ADD in functie van de stimulatie sessie voor de TCS-OX2-29 groep

Grafiek 10 geeft een voorstelling van de gemiddelde ADD (seconden) per stimulatie sessie voor de TCS-OX2-29 groep. Deze groep start met een gemiddelde ADD van 45.559±21.978 seconden en kent over de algemene lijn een stijgend verloop tot de finale ADD op dag 2 van 80.150±11.853 seconden. Gedurende de stimulaties vertoont de ADD een oscillerende verloop op zowel dag 1 als dag 2. Er wordt een val in de ADD gezien bij de overgang van dag 1 naar dag 2. Hierbij is de ADD op het einde van dag één 83.468±19.117 seconden en aan het begin van dag twee 36.674±16.449 seconden.

34

120  

Gemiddelde ADD (seconden)

100  

80  

60  

40  

20  

Dag 1

Dag 2

0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Grafiek 10: Gemiddelde ADD (seconden, ± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de TCS-OX2-29 groep (n=5). De stippellijn geeft het onderscheid aan tussen dag 1 en dag 2 van de stimulaties.

4.4

Overzichtsgrafiek

Een overzicht van de grafieken 8, 9 en 10 vindt u terug in grafiek 11. Op deze grafiek is zichtbaar dat de SB-334867 groep met een lagere ADD start bij stimulatie 1 op dag 1 in vergelijking met de controlegroep en de TCS-OX2-29 groep. Deze duur bedraagt 22.099±8.517 seconden voor de SB-334867 groep, 42.694±17.825 seconden voor de controlegroep en 45.559±21.978 seconden voor de TCS-OX2-29 groep. De 3 groepen vertonen een terugval in de ADD tussen de laatste stimulaties van dag 1 en de eerste stimulaties van dag 2. Hierbij gaat de controlegroep van 79.856±14.925 seconden naar 29.166±16.038 seconden, de SB-334867 groep van 77.401±30.836 seconden naar 52.670±13.998 seconden en de TCS-OX2-29 groep tenslotte van 83.468±19.449 seconden naar 36.674±16.449 seconden. Bij de laatste stimulatie op dag 2 eindigt de controlegroep met de langste ADD en de SB334867 groep met de kortste. De duurtijden zijn 91.427±8.891 seconden voor de controlegroep en 65.569±22.444 seconden voor de SB-334867 groep. Voor elke groep afzonderlijk is er een significant effect (p < 0.05) van de meting (stimulatie sessie), waarbij de ADD steeds significant langer wordt in het verloop van de kindling acquisitie. 35

140   120  

ADD (seconden)

100   80   60   40   20   0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatienummer Controle  (n=6)    

SB-­‐334867  (n=4)  

TCS-­‐OX2-­‐29  (n=5)  

Grafiek 11: Overzicht van de gemiddelde totale ADD (seconden, ± SEM) per stimulatie sessie voor de controlegroep (n=6), SB-334867 (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5).

4.5

Cumulatieve primaire ADD in vergelijking met de cumulatieve totale ADD

Zowel de gemiddelde duur van de som van alle primaire AD’s van stimulatie sessie 1 tot 20, als van de cumulatieve totale AD’s voor de 3 groepen staat weergegeven in grafiek 12. De controlegroep kent de hoogste cumulatieve primaire ADD met een waarde van 1162.092±156.903 seconden. De duur van de cumulatieve primaire AD van de SB-334867 groep is hoger dan de TCS-OX2-29 groep met respectievelijke waarden van 1082.129±194.164 en 1021.865±92.392 seconden. Dezelfde trend kunnen we terugvinden voor de cumulatieve totale ADD met de langste duur voor de controlegroep, nl. 1442.816±194.721 seconden en de kortste duur voor de TCS-OX229 groep, nl. 1220.661±98.636 seconden. De cumulatieve totale ADD van de SB-334867 groep ligt tussen beiden met een duur van 1256.442±169.901 seconden. Binnen elke onderzoeksgroep zijn de cumulatieve primaire ADD en de cumulatieve totale ADD significant verschillend van elkaar (p < 0.05).

36

1800  

*  

*  

*  

1600  

ADD (seconden)

1400   1200   1000   800   600   400   200   0  

Controle (n=6) SB-334867 (n=4) TCS-OX2-29 (n=5) Primaire ADD Cumulatieve ADD Grafiek 12: Gemiddelde duur van de cumulatieve primaire AD (seconden, ± SEM) en de cumulatieve totale ADD (seconden, ± SEM) voor de controlegroep (n=6), SB-334867 (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5). (*) Significant verschil (p < 0.05) tussen de cumulatieve primaire ADD en de totale cumulatieve ADD.

5 Histologie Na afloop van de experimenten zijn de dieren gesacrificeerd en de hersenen geïsoleerd om de histologie na te gaan. Hierbij zijn de locaties van de canules gecontroleerd aan de hand van een blauwkleuring en de posities van de elektroden in de amygdala via de gevormde laesie van de elektrode. In de controlegroep vertonen 3 van de 6 dieren een blauwe kleuring van de ventrikels en de elektrode blijkt eveneens correct geïmplanteerd. De 3 overige dieren daarentegen vertonen geen blauwe aankleuring van de ventrikels, aangezien de canule niet reikt tot in het ventrikel. De locatie van de tripolaire elektrode blijkt echter wel steeds correct. Bij de SB-334867 groep is bij geen enkel dier het ventriculair systeem blauw gekleurd. Daarnaast lijkt hun elektrode wel steeds tot in de amygdala te gaan. De TCS-OX2-29 groep tenslotte heeft 3 dieren van de 5 waarbij zowel de elektrodes correct zitten en de ventrikels blauw zijn aangekleurd. De overige 2 dieren hebben een correcte lokalisatie van de elektrode. Bij de ene rat is het ventrikel niet aangekleurd en bij de andere rat kon geen kleuring worden uitgevoerd doordat het hoedje met canule was afgebroken op het einde van de stimulatie sessies. 37

Deel 4: Bespreking In deze masterproef wensen we het effect van de selectieve orexine 1 receptor antagonist SB334867 en de selectieve orexine 2 receptor antagonist TCS-OX2-29 op de rapid kindling acquisitie van ratten na te gaan. Meer specifiek willen we weten of één van beide antagonisten (of beide) een vertraging of verhindering veroorzaken van de kindling acquisitie. Dit effect meten we aan de hand van de kindling parameters ADT, aanvalsstage en ADD en vergelijken we met de waarden uit de controlegroep, waar de dieren een zuivere saline-oplossing ontvangen.

1 Afterdischarge treshold (ADT) Op dag 0 (zonder infusie), stimulatie dag 1 (na infusie) en stimulatie dag 2 (na infusie) wordt de ADT bepaald per dier. Deze minimale stimulatie intensiteit om een AD te bekomen 5 seconden of meer weerspiegelt de sensitiviteit van het dier om een epileptische aanval te ontwikkelen. Hoe lager deze drempel ligt, hoe gevoeliger het dier. In de normale kindling acquisitie verlaagt de ADT doorheen de opeenvolgende stimulatie dagen, aangezien de hersenstructuur vatbaarder wordt om epileptische insulten te ontwikkelen [26]. We onderzoeken of de orexine receptor antagonisten een verhoging van deze ADT veroorzaken, wat op een beschermend effect zou wijzen in het kindling protocol. We vinden geen significant verschil tussen de 3 onderzoeksgroepen onderling, wat erop duidt dat de antagonisten geen beduidend effect hebben op de ADT. Op de dag voor de eerste stimulaties (dag 0) is er variatie zichtbaar tussen de drie onderzoeksgroepen. Deze onderlinge verschillen zijn toe te kennen aan biologische variatie binnen de proefdieren. Voor en na infusie van de compound, namelijk de metingen op dag 0 en dag 1, is er een daling zichtbaar van de ADT bij alle 3 de groepen. Dit kunnen we verklaren op basis van de internal, ADT bepaling en infusie. Op dag 0 is namelijk de internal, die 1 mm dieper zit dan de dummy, nog niet aangebracht. Deze aanbreng, 30 minuten voor de ADT bepaling op dag 1, kan histologische en neurochemische veranderingen induceren. Daarnaast is er minstens een periode van 12 uren tussen beide metingen, hierdoor kunnen de elektrische stimulaties van de ADT bepaling op dag 0 reeds een kindling effect op gang zetten [27]. Tenslotte kan de infusie een mechanisch effect veroorzaken in de ventrikels. Om dit uit te sluiten zou een 38

vierde groep, die niets toegediend krijgt, onderzocht moeten worden. De 3 voorgaand vermelde redenen kunnen bijdragen aan de daling van de ADT tussen dag 0 en dag 1. Er is tenslotte in elke groep een daling zichtbaar tussen de ADT op dag 1 en dag 2. Dit volgt het verwachte patroon zoals bestudeerd door Racine in 1972. Hoe vaker de hersenen getriggerd worden door de elektrische stimuli, des te lager hun drempel zal worden om een epileptische aanval te ontwikkelen [26].

2 Gemiddelde aanvalsstage Kenmerkend voor het kindling protocol zijn de gedragsveranderingen die gepaard gaan met iedere elektrische stimulatie. Deze veranderingen scoren we gedurende iedere stimulatie met een cijfer gaande van 0 tot 5, waarbij 0 geen gedragsverandering en 5 een tonisch-clonisch insult betekent. Gedurende het verloop van het kindling protocol zijn de stages progressief van aard, waarbij we gaan van een lage stage naar een hoge stage van 4 of 5. De onderliggende verklaring is dat bij aanvang van het kindlen slechts een beperkt aantal neuronale circuits betrokken is in het epileptische netwerk. Naarmate we meer stimuleren, worden meer neuronale circuits betrokken en dit geeft weerslag op de hogere graad van gedragsmatige verandering [28]. Door de verhoogde elektrische prikkeling krijgen we een remodelering van de hersencircuits. Zo krijgen we neurobiologische veranderingen, zoals het falen van inhibitorische systemen, vereenvoudigde activatie van excitatorische circuits, veranderingen in post-synaptische configuraties, neuronaal celverlies, … [3] In deze sectie gaan we na of de selectieve orexine receptor type 1 of type 2 antagonisten een verandering teweeg brengen in de aanvalsstages in vergelijking met de controlegroep. We kunnen opmerken dat in iedere groep de aanvalsstage heviger wordt met toenemende stimulaties. Dit wordt op verschillende punten bevestigd door een significant verschil (p < 0.05) tussen de baseline stage (stimulatie sessie 1) en de stage in hogere stimulatie sessies. We bemerken een trend op stimulatie dag 1, waarbij de TCS-OX2-29 antagonist groep lagere stages vertoont in vergelijking met de controlegroep of SB-334867 groep. Deze trend wordt echter niet waargenomen op dag 2. We kunnen deze 2 bevindingen ook bevestigen door de grafiek die de AUC weergeeft. De orexine receptor type 2 antagonist TCS-OX2-29 lijkt een vertragend effect uit te oefenen in het rapid kindling model. Dit dient echter in een grotere onderzoeksgroep bevestigd te worden. In iedere groep start het merendeel van de dieren met een lage aanvalsstage van 1 of 2. Enkele dieren reageren echter iets heviger. Een mogelijke verklaring is dat deze dieren een hogere 39

predispositie hebben om epilepsie te ontwikkelen door natuurlijke variatie in de hersenstructuur. Bij aanvang van het kindlen start de controlegroep met hogere stages dan de 2 behandelingsgroepen. Gedurende de kindling acquisitie stijgt de gemiddelde aanvalsstage voor iedere groep. Dit is eveneens merkbaar in de AUC, waarbij de oppervlakte onder de curve op dag 2 significant hoger is dan op dag 1 voor de controlegroep en TCS-OX2-29 groep. De stijging van de aanvalsstage is significant verschillend tussen de verschillende groepen, waarbij de controlegroep het snelste stijgt. Dit suggereert dat de controlegroep vatbaarder schijnt voor epilepsie dan de 2 andere groepen die orexine antagonisten kregen. Voornamelijk in de controlegroep zien we een schommelend verloop tussen hoge en lage stages, dit wordt ook gezien in een vergelijkbaar rapid kindling experiment, waarbij men het effect van levetiracetam nagaat [29]. We eindigen met 4 van de 6 controle dieren die fully kindled zijn, dit zorgt ervoor dat deze groep iets minder representatief is om te vergelijken met de 2 compoundgroepen. Niet alle dieren zijn op het einde van de rit fully kindled door voornamelijk biologische variatie. Het rapid kindling protocol is daarnaast een volledig nieuwe techniek voor ons laboratorium, het LKEN. De klassieke amygdala kindling is echter goed gekend en bestudeerd in deze onderzoeksgroep. We kunnen het protocol optimaliseren door meer ervaring op te doen in dit model. Ervaring leert ons namelijk efficiënter met technische en andere problemen om te gaan.

3 Aantal stimulaties tot het bereiken van een stage 4 en 5 We gaan na of de orexine recepor antagonisten een verschil veroorzaken in het aantal stimulaties, nodig om een stage 4 of stage 5 respons uit te lokken, t.o.v. de controlegroep. Toediening van de orexine receptor 2 antagonist TCS-OX2-29 veroorzaakt hierbij een vertraging in de kindling acquisitie, waarbij we significant meer moeten stimuleren dan de controlegroep om een stage 5 te bekomen. Wanneer we echter een Bonferroni correctie invoeren blijkt dit verschil niet meer significant. Om de significantie te bevestigen is het essentieel in de toekomst een grotere onderzoeksgroep te gebruiken. Via de tool ‘SAS power and sample size’ bekomen we een steekproefgrootte van 15 dieren per groep (power = 0.80). Dit wil zeggen dat er voor de controlegroep 9 bijkomende dieren gekindled moeten worden, 11 voor de SB-334867 groep en 10 voor de TCS-OX2-29 groep.

40

4 Duur van de afterdischarge (ADD) 4.1

ADD in functie van de stimulatie sessie

Gedurende de kindling acquisitie registreren we de hersenactiviteit en brengen we deze in beeld aan de hand van het EEG. We starten met de EEG registratie bij aanvang van de stimulatie en volgen het gedurende 5 minuten op. Na iedere stimulus wordt, eigen aan het kindling protocol, een primaire ontlading of afterdischarge terug gevonden. Gedurende de daaropvolgende registratieperiode kunnen nog secundaire, tertiaire, … ontladingen optreden door de propagatie van de epileptische activiteit [30]. Naarmate men vordert in het kindling protocol, verlengen de ADD’s per stimulatie sessie [31]. Bij de eerste stimulaties wordt namelijk slechts een kleine primaire focus van de hersenen getriggerd. Dit uit zich als geen of een heel subtiele gedragsverandering en een korte ADD. Naarmate men de hersenen meer stimuleert, worden ook de nabij gelegen gebieden rond de primaire focus betrokken in het epileptische netwerk. De hersenen zullen zich herorganiseren ten gevolge van de overtollige neuronale activatie. Door de propagatie van de epileptische activiteit zullen de gedragsveranderingen toenemen in ernst en de duur van de AD’s zal stijgen. We vergelijken eerst de gemiddelde totale duur van alle AD’s (primair, secundair, tertiair,…) samen per stimulatie sessie tussen de controlegroep en de 2 orexine antagonisten. Indien de orexine receptor type 1 antagonist SB-334867 en/of de orexine receptor type 2 antagonist TCS-OX2-29 een daling van de ADD’s veroorzaken, kunnen we afleiden dat deze compound(s) een vertraging veroorzaken van de kindling acquisitie. Er is in elke onderzoeksgroep een significant verschil (p < 0.05) van de ADD’s tussen de opeenvolgende stimulatie sessies. Elke groep kent namelijk een stijging van de AD duur in de loop van het stimulatie protocol. We kunnen echter niet concluderen dat de antagonisten de duur van de ontladingen inperken. De 3 onderzoeksgroepen vertonen een daling in de ADD na het verstrijken van de nacht tussen beide stimulatiedagen. De meest plausibele verklaring ligt in het herstel van de hersenstructuren dat plaats vindt gedurende de stimulatievrije periode. Tijdens de kindling acquisitie volgen de stimulaties zich iedere 30 minuten op, waardoor herstel niet mogelijk is. Gedurende de nacht tussen beide stimulatiedagen krijgen de hersenen de nodige rust. Hierdoor kan bij aanvang van de stimulaties op dag 2 het effect verminderd lijken in vergelijking met dag 2. Eenmaal terug getriggerd kennen de ADD’s terug een stijgend 41

verloop. De terugval van de ADD op de tweede stimulatiedag werd ook terug gevonden in andere rapid kindling studies [32]. Tenslotte schommelen de ADD’s gedurende de opeenvolgende stimulatie sessies, dit verloop is in de literatuur ook reeds beschreven [29]. 4.2

Cumulatieve primaire ADD in vergelijking met de cumulatieve totale ADD

Per dier nemen we de som van alle primaire ADD’s en nemen hier vervolgens per groep het gemiddelde uit. Deze uitkomst heet de cumulatieve primaire ADD. Deze vergelijken we met de cumulatieve totale ADD, dit is het gemiddelde per groep van de som van de ADD’s van alle ontladingen in het kindling protocol. Binnen de 3 onderzoeksgroepen zien we steeds een significant verschil (p < 0.05) tussen de cumulatieve primaire ADD en de cumulatieve totale ADD. Dit duidt op het voorkomen van bijkomende ontladingen na de primaire AD. Deze bevinding voldoet aan onze verwachtingen, gebaseerd op de literatuurstudie [30]. Er is geen significant verschil tussen de onderzoeksgroepen onderling voor zowel de cumulatieve primaire ADD als cumulatieve totale ADD. Dit wijst erop dat de orexine antagonisten de bijkomende AD’s naast de primaire AD niet noemenswaardig onderdrukken.

5 Histologie Na de experimenten is een histologische controle uitgevoerd om de locatie van de canule en elektrode na te gaan. Hierbij blijkt dat slechts bij 3 van de 6 controledieren en 3 van de 5 TCS-OX2-29 dieren zowel de canule als de elektrode correct geïmplanteerd is. Bij de overige dieren zijn de ingebrachte elementen steeds één millimeter te hoog aangebracht, waardoor de canule het ventrikel niet bereikt. Door een communicatiefout zijn de coördinaten voor implantatie geïnterpreteerd vanaf de schedelbasis in plaats van het hersenoppervlak. De elektrode komt ondanks de 1 mm te hoog nog in de basolaterale amygdala terecht. De data van de 3 goede dieren uit de controlegroep en de 3 goede dieren uit de TCS-groep zijn vervolgens geïsoleerd uit de dataset. De voornaamste grafieken zijn opnieuw opgesteld om een ruw beeld te krijgen van enig effect van de selectieve orexine receptor 2 antagonist in vergelijking met de controlegroep. In onderstaande bespreking vindt u deze grafieken (A tot E) terug. 5.1

Gemiddelde stage per stimulatie sessie en de AUC

Grafiek A is een weergave van de gemiddeld bereikte stage per stimulatie sessie voor de goede controle en TCS-OX2-29 dieren. In de grafiek is een trend zichtbaar dat de dieren, die TCS-OX2-29 kregen, meestal een lagere 42

aanvalsstage vertonen in vergelijking met de controlegroep. Uit deze data kan men met voorzorg besluiten dat de TCS-OX2-29 antagonist een vertragend effect uitoefent in het rapid kindling protocol van ratten. Op basis van grafiek B, die de oppervlakte onder de curve (AUC) weergeeft van grafiek A, kunnen we hetzelfde concluderen. De TCS-OX2-29 groep heeft een kleinere AUC dan de controlegroep op beide dagen en dit reflecteert de lagere stages die deze groep behaalt. In beide groepen stijgt de AUC tussen dag 1 en dag 2, wat het normale kindling verloop volgt [31]. 5   4,5  

Gemiddelde aanvalsstage

4   3,5   3   2,5   2   1,5   1   0,5   0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Controle (n=3)

TCS-OX2-29 (n=3)

Grafiek A: Gemiddelde aanvalsstage (± SEM) per stimulatie sessie voor de controlegroep (n=3) en de TCS-OX2-29 groep (n=3).

43

50   45   40   35  

AUC

30   25   20   15   10   5   0  

Dag 1

Dag 2

Controle(n=3)

TCS-OX2-29 (n=3)

Grafiek B: AUC (± SEM) op dag 1 en dag 2 voor de controlegroep en TCS-OX2-29 groep.

5.2

Aantal stimulaties tot stage 4 of stage 5

Grafiek C geeft weer hoeveel elektrische stimulaties nodig zijn tot een stage 4 of 5 wordt bereikt. Hierbij vinden we een trend terug voor beide stages, waarbij de TCS-OX2-29 groep meer stimulaties vereist in vergelijking met de controlegroep. Dit bevestigt de hypothese uit voorgaande grafieken (grafieken A en B) dat de antagonist van de orexine receptor type 2 een beschermend effect biedt gedurende het kindlen. 18   16  

Aantal stimulaties

14   12   10   8   6   4  

Grafiek2  C: Aantal stimulaties tot het bereiken van een stage 4 of 5 (± SEM) voor de controlegroep (n=3) en de TCS-OX2-29 groep (n=3). 0  

Stage 4 Controle (n=3)

Stage 5 TCS-OX2-29 (n=3)

Grafiek C: Aantal stimulaties tot het bereiken van een stage 4 of 5 (± SEM) voor de controlegroep (n=3) en de TCS-OX2-29 groep (n=3).

44

5.3

Duur van de afterdischarges

Grafiek D toont de gemiddelde ADD in seconden per stimulatie sessie voor de controlegroep en TCS-OX2-29 groep. De antagonist groep behaalt hierbij, met uitzondering van 2 punten, steeds lagere waarden dan de controlegroep. Dit sluit aan bij de trends uit grafiek A en B. Een lagere stage van gedragsverandering hangt namelijk samen met kortere AD’s. We kunnen behoedzaam besluiten dat de TCS-OX2-29 groep de duur van de ADD’s doet inkorten in vergelijking met de controlegroep. 140  

ADD (seconden)

120   100   80   60   40   20   0   1  

2  

3  

4  

5  

6  

7  

8  

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

Stimulatie sessie Controle  (n=3)  

TCS-­‐OX2-­‐29  (n=3)  

Grafiek D: ADD (seconden, ± SEM) per stimulatie sessie voor de controlegroep (n=3) en de TCS-OX2-29 groep (n=3).

5.4

Cumulatieve primaire ADD en cumulatieve totale ADD

Grafiek E geeft de cumulatieve primaire en totale ADD’s weer voor beide onderzoeksgroepen. Hierbij is een tendens merkbaar, waarbij de TCS-OX2-29 groep een gemiddeld lagere cumulatieve primaire en totale ADD heeft in vergelijking met de controlegroep. Dit impliceert dat bij de antagonist van orexine receptor type 2 de duur van de primaire AD’s lager zijn en dat er minder secundaire, tertiaire, … AD’s optreden in vergelijking met de controlegroep. Deze bevinding bevestigt ons vermoeden van het vertragend effect dat de TCS-OX2-29 compound uitoefent op de kindling acquisitie.

45

Cumulatieve ADD (seconden)

1800   1600   1400   1200   1000   800   600   400   200   0  

Cumulatieve primaire ADD Controle (n=3)

Cumulatieve totale ADD TCS-OX2-29 (n=3)

Grafiek E: Cumulatieve primaire ADD en cumulatieve totale ADD (±SEM) voor de controlegroep (n=3) en de TCS-groep (n=3).

46

Deel 5: Algemeen besluit De klassieke kindling procedure als een eerste evaluatiemiddel voor de screening van compounds is ver van optimaal. Niet enkel vergt het veel werk van de onderzoeksgroep, daarnaast neemt het een aanzienlijke tijd in beslag doordat het weken vraagt vooraleer je fully kindled dieren bekomt. Voor de initiële screening is dus een snellere en minder arbeidsintensieve methode gewenst, zoals de rapid kindling procedure. De resultaten voor onze controlegroep in de rapid kindling procedure zijn redelijk reproduceerbaar. Niet alle controledieren raakten echter fully kindled. Dit is te wijten aan het gebrek aan ervaring binnen ons laboratorium met dit nieuwe model, de biologische variatie en fout geïmplanteerde canules. Door herhaling in de toekomst creëren we meer ervaring, waardoor problemen sneller gedetecteerd worden en we efficiënter ingrijpen. Daarnaast is het niet zeker of de resultaten bekomen in een rapid kindling model extrapoleerbaar zijn naar het klassieke kindling model of de humane situatie. Om deze reden dienen we onze resultaten met de nodige kritische houding te evalueren. In deze studie is de doelstelling het effect na te gaan van 2 selectieve orexine receptor antagonisten op de kindling parameters. De keuze van de antagonisten is gebaseerd op preliminair onderzoek. In de literatuur is beschreven dat beide compounds de hippocampale schade, veroorzaakt door pentylenetetrazol-uitgelokte insulten, beperken [24]. Daarnaast heeft doctoraatstudente Ine Buffel onderzoek uitgevoerd voor beide antagonisten in het corticaal stimulatiemodel. Hier was eveneens evidentie van een anti-convulsief effect. De resultaten zijn echter niet gepubliceerd. In ons onderzoek zijn er argumenten dat i.c.v. toediening van de orexine receptor type 2 antagonist TCS-OX2-29 zorgt voor een vertragend effect van de kindling acquisitie. Dit besluiten we op basis van 3 bevindingen. Als eerste hebben we de lagere stages die de TCSOX2-29 groep vertoont met toenemende stimulatie sessies in vergelijking met de controlegroep. Deze waarneming kunnen we ook terug vinden in onze tweede bevinding: de oppervlakte onder de curve (AUC) van de grafiek, die de aanvalsstage weergeeft in functie van de stimulatie sessie. Hierbij zien we een trend, waarbij de TCS-OX2-29 groep lager scoort op voornamelijk stimulatiedag 1. Dit leiden we af uit de kleinere AUC op dag 1 voor de TCS-OX2-29 groep in vergelijking met de controlegroep. Tenslotte is er een significant verschil (p < 0.05) tussen de controlegroep en de TCS-OX2-29 groep in het aantal stimulatie 47

sessies nodig om een stage 5 respons te bekomen. Dit bevestigt ons vermoeden dat de antagonist een vertragend effect uitoefent op de kindling acquisitie. We dienen echter de betrouwbaarheid van de data te evalueren, aangezien verschillende methodologische en technische problemen zijn opgetreden. Isolatie van de data van de correct geopereerde dieren geeft echter ook evidentie dat het vertragend effect op de kindling acquisitie daadwerkelijk aanwezig is bij de selectieve orexine receptor type 2 antagonist. We kunnen besluiten dat er een vermoeden is dat TCS-OX2-29 een vertragend effect in het rapid kindling model veroorzaakt. Enkel bijkomend onderzoek kan hierover meer duidelijkheid bieden.

48

Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

H. Scharfman (2007). The neurobiology of epilepsy. Current neurology and neuroscience reports 7 (4): 348354. J. Huff, N. Fountain (2011). Pathophysiology and definitions of seizures and status epilepticus. Emergency medicine clinics of North America (29): 1-13. K. Morimoto, M. Fahnestock, R. J. Racine (2004). Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in neurobiology 73: 1-60. R. Raedt, A. Van Dycke, K. Vonck, P. Boon (2007). Cell therapy in models for temporal lobe epilepsy. Seizure (16): 565-578. A. Vassiliki, B. Fritsch, F. Qashu, M. Braga (2008). Pathology and pathophysiology of the amygdala in epileptogenesis and epilepsy. Epilepsy research 78 (2-3): 102-116. E. Perucca, T. Tornson (2011). The pharmacological treatment of epilepsy in adults. The lancet neurology 10 (5): 446-456. S. Wiebe (2003). Brain surgery for epilepsy. The lancet 362 (1): 48-49. G. Bergey (2013). Neurostimulation in the treatment of epilepsy. Experimental neurology 244: 87-95. R.G. Levy, P. Cooper, P. Giri, J. Pulman (2012). Ketogenic diet and other dietary treatments for epilepsy. The cochrane collaboration (3): 1-23. W. Löscher (2011). Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure 20: 359-368. I.   Kharatishvili,   J.   Nissinen,   K.   McIntosh,   A.   Pitkänen   (2006).   A   model   of   posttraumatic   epilepsy   induced  by  lateral  fluid-­‐  percussion  brain  injury  in  rats.  Neuroscience  140:  685-­‐  697. W. Löscher (2002). Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and diseasemodifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post- status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy research 50: 105 – 123. U. Ebert, W. Löscher (1995). Differences in mossy fibre sprouting during conventional and rapid amygdala kindling of the rat. Neuroscience letters 190 (3): 199 – 202. A. Coenen, E. Van Luijetelaar (2003). Genetic animal models for absence epilepsy: a review of the WAG/Rij strain of rats. Behavior genetics 33 (6): 635 -655. T. Hökfelt, T. Bartfai, F. Bloom (2003). Neuropeptides: opportunities for drug discovery. The lancet neurology 2: 463- 472. M. Decressac, R. Barker (2012). Neuropeptide Y and its role in CNS disease and repair. Experimental neurology 238: 265 – 272. A. Sorensen, M. Kokaia (2013). Novel approaches to epilepsy treatment. Epilepsia 54 (1): 1-10. J.P. Kukkonen (2013). Physiology of the orexinergic/hypocretinergic system: a revisit in 2012. The american physiological society 304: C2-C32. K. Rejdak, E. Papuc, G. Pawel, Z. Stelmasiak (2009). Decreased cerebrospinal fluid hypocretin-1 (orexin A) in patients after repetitive generalized tonic-clonic seizures. Epilepsia 50(6): 1641-1644. N. Doreulee, M. Alania, G. Vashalomidze, E. Skhirtladze, T. Kapanadze (2010). Orexinergic system and pathophysiology of epilepsy. Georgian medical news 188: 74-79. A. Morales, S. Bouvard, M. Le Cavorsin, C. Bonnet, B. Georges, C. Moulin, H. Kouchil, A. Belmeguenail, P. Ryvlin, L. Bezin (2009). Antiepileptogenic effect of orexin B in the kindling model of epilepsy in rats. Epilepsia 50: 73. A. E. Haydar, E. Gülten, G. Osman, K. Selim, S. Melike, T. Günfer, T. Sebahat (2012). Orexins cause epileptic activity. Peptides 37: 161-164. K. Selim, E. Haydar, E. Gülten, G. Osman, S. Melike, T. Sebahat, T. Günfer (2012). Orexins increase penicillin-induces epileptic activity. Peptides 34: 419-422. L. Ni, M. Zhu, Y. Song, J. Tang (2014). Pentylenetetrazol-induced seizures are exacerbated by sleep deprivation through orexin receptor-mediated hippocampal cell proliferation. Neurological sciences 35 (2): 245-252. R. Benmaamar, C. Richichi, M. Gobbi, A. Daniels, A. Beck-Sickinger, A. Vezzani (2005). Neuropeptide Y Y5 receptors inhibit kindling acquisition in rats. Regulatory peptides 125: 79-83. R.  Racine  (1972).  Modification  of  seizure  activity  by  electrical  stimulation:  I.  Afterdischarge  treshold.   Electroencephalography  and  clinical  neurophysiology  32  (3):  269  –  279. M.   Mark,   P.   Hwang,   W.   Burnham   (2006).   Afterdischarge   treshold   reduction   in   the   kindling   model   of   epilepsy.  Epilepsy  research  72  (2-­‐3):  97  –  101. E.  Bertram  (2007).  The  relevance  of  kindling  for  human  epilepsy.  Epilepsia  48  (2):  65  –  74.

49

29. T.   De   Smedt,   K.   Vonck,   R.   Raedt,   S.   Dedeurwaerdere,   P.   Claeys,   B.   Legros,   T.   Wyckhuys,   W.   Wadman,   P.   Boon   (2005).   Rapid   kindling   in   preclinical   anti-­‐epileptic   drug   development:   the   effect   of   levetiracetam.  Epilepsy  research  67:  109  –  116. 30. U.  Ebert,  C.  Rundfeldt,  W.  Löscher  (2006).  Development  and  pharmacogical  suppression  of  secondary   afterdischarges  in  the  hippocampus  of  amygdala-­‐kindled  rats.  European  journal  of  neuroscience  7  (4):   732  –  741. 31. R.  Racine  (1978).  Kindling:  the  first  decade.  Neurosurgery  3  (2):  234  –  252.   32. T. De Smedt, S. De Rouck, R. Raedt, T. Wyckhuys, L. Waterschoot, V. De Herdt, A. Van Dycke, R. El Tahry, K. Vonck, P. Boon (2007). Serial day rapid kindling is an effective tool in screening the antiepileptic properties of topiramate. Seizure 16 (7): 620 – 626.

50

Bijlagen Deze bijlagen bevatten: Bijlage 1: Lijst met gebruikte acroniemen Bijlage 2: Lijst met figuren Bijlage 3: Lijst met tabellen Bijlage 4: Lijst met grafieken

I

Bijlage 1: Lijst met gebruikte acroniemen AD: ADT: AED: AUC: BHB: CA: DBS: EEG: FPBI: GABA: GPCR: ICV: KO: LKEN: mRNA: NPY: NSAID: OX: PBS: PPO: PPS: PTE: SE: SEM: TBI: TLE: VNS:

Afterdischarge Afterdischarge threshold Anti-epileptische drugs Area under the curve Bloed-hersenbarrière Cornu Ammonis Diepe hersenstimulatie Elektro-encefalogram Lateral fluid percussion brain injury Gama-aminoboterzuur G-eiwit gekoppelde receptor Intracerebrovenriculair Knock-out Laboratorium voor klinische en experimentele neurofysiologie Messenger ribo-nucleic acid Neuropeptide Y Niet-steroïde anti-inflammatoire drugs Orexine receptor Phosphate buffered saline Pre-pro-orexine Perforante pathway stimulatie Post-traumatische epilepie Status epilepticus Standard error of the mean Traumatic brain injury Temporale kwab epilepsie Nervus vagus stimulatie

II

Bijlage 2: Lijst met figuren Figuur 1: Figuur 2: Figuur 3: Figuur 4: Figuur 5: Figuur 6:

Scalp elektrode Afstanden tussen de 3 draden van de tripolaire electrode Tripolaire electrode Overzicht operatie Implantatie schema Lokalisatie van de elektroden in het hoedje

III

Bijlage 3: Lijst met tabellen Tabel 1: Tabel 2:

Classificatie volgens Racine Overzicht van de orexine antagonisten

IV

Bijlage 4: Lijst met grafieken Grafiek 1:

Gemiddelde ADT (µA, ± SEM) voor de controlegroep (n=6), SB-334867 (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5) op dag 0, dag 1 en dag 2. Grafiek 2: Gemiddelde aanvalsstage (± SEM) in fuctie van de stimulatie sessie voor de controlegroep (n=6). Grafiek 3: Gemiddelde aanvalsstage (± SEM) in fuctie van de stimulatie sessie voor de SB-334867 groep (n=4). Grafiek 4: Gemiddelde aanvalsstage (± SEM) in fuctie van de stimulatie sessie voor de TCS-OX2-29 groep (n=5). Grafiek 5: Combinatie van aanvalsstage/stimulatie sessie grafieken (± SEM) van de controlegroep (n=6), SB-334867 groep (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5). Grafiek 6: AUC (± SEM) voor de controlegroep (n=6), SB-334867 groep (n=4) en TCSOX2-29 groep (n=5) op dag 1 en dag 2. Grafiek 7: Gemiddeld aantal stimulaties voor het bereiken van een stage 4 of 5 (±SEM) volgens de classificatie van Racine voor de controlegroep (n=6), TCS-OX2-29 (n=4) en SB-334867 groep (n=5). Grafiek 8: Gemiddelde ADD (seconden, ± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de controlegroep (n=6). Grafiek 9: Gemiddelde ADD (seconden, ± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de SB-335867 groep (n=4). Grafiek 10: Gemiddelde ADD (seconden, ± SEM) in functie van de stimulatie sessie voor de TCS-OX2-29 groep (n=5). Grafiek 11: Overzicht van de gemiddelde totale ADD per stimulatie voor de controlegroep (n=6), SB-334867 (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5). Grafiek 12: Gemiddelde duur van de primaire AD (seconden, ± SEM) en de cumulatieve totale ADD (seconden, ± SEM) voor de controlegroep (n=6), SB-334867 (n=4) en TCS-OX2-29 groep (n=5). Grafiek A: Grafiek B: Grafiek C: Grafiek D: Grafiek E:

Gemiddelde stage (± SEM) per stimulatie sessie voor de controlegroep (n=3) en de TCS-OX2-29 groep (n=3). AUC (± SEM) op dag 1 en dag 2 voor de controlegroep en TCS-OX2-29 groep. Aantal stimulaties tot het bereiken van een stage 4 of 5 (± SEM) voor de controlegroep (n=3) en de TCS-OX2-29 groep (n=3). ADD (seconden, ± SEM) per stimulatie sessie voor de controlegroep (n=3) en de TCS-groep (n=3). Cumulatieve primaire ADD en cumulatieve totale ADD (±SEM) voor de controlegroep (n=3) en de TCS-groep (n=3).

V