neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody

PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody

zabarvení mezi těmito dvěma testy. Další informace naleznete v kapitole Souhrn očekávaných výsledků. Další informace o metodě PATHWAY HER2 (4B5) naleznete v části Reference, 25-31. VENTANA PATHWAY HER2 (4B5) ve spojení s detekční soupravou VENTANA iVIEW DAB Detection Kit, vyuţívá biotinylované sekundární protilátky při vyhledávání vázané primární protilátky PATHWAY HER2 (4B5) (vyrobené za pouţití syntetických peptidů odpovídajících místu na vnitřní doméně proteinu HER2). To je následováno vazbou enzymového konjugátu avidin/streptavidin na biotin. Komplex je pak vizualizován pomocí sráţecího produktu vytvořeného enzymu.

790-2991 05278368001 50

Pouţití předem naředěné VENTANA PATHWAY HER2 (4B5) a detekčních sad připravených k pouţití iVIEW DAB Detection Kit a ultraView Universal DAB Detection Kit, ve spojení s barvicím automatem VENTANA, sniţuje moţnost lidské chyby a inherentní variabilitu vyplývající z jednotlivých činidel ředění, ručního pipetování a ruční aplikace ředidla.

INDIKACE A POUŢITÍ Pouţití Tato protilátka je určena k použití při diagnostice in vitro.

Ventana Medical Systems, Inc.’s (Ventana) PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) Rabbit KLINICKÝ VÝZNAM Monoclonal Primary Antibody (PATHWAY HER2 (4B5)) je rekombinantní králičí monoklonální protilátka určená k laboratornímu pouţití pro semikvantitativní detekci Rakovina prsu je nejčastější karcinom u ţen a druhá nejběţnější příčina rakovinou antigenu HER2 na imunohistochemickém barvicím automatu VENTANA v běţných a zapříčiněné smrti. V Severní Americe je moţnost nákazy rakovinou prsu u ţen jedna ku neoplastických tkáních fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Tato protilátka je osmi.9 Časná detekce a vhodná terapeutická léčba mohou významně ovlivnit celkové indikována jako pomůcka při posouzení pacientů s rakovinou prsu, u kterých je zvaţována přeţití.10 Malé vzorky tkáně lze snadno pouţití v běţné imunohistochemii (IHC). Tato léčba látkou Herceptin. technika ve spojení s protilátkami, které rozpoznají antigeny důleţité pro interpretaci Poznámka: Všichni pacienti byly pro klinické testy látkou Herceptin vybráni na základě karcinomu, je účinným nástrojem pro patology při diagnostice a prognóze onemocnění. klinického vyhodnocení testu. Ţádný z pacientů pro tyto klinické testy nebyl vybrán na Důleţitým ukazatelem v oblasti nádoru prsu je dnes onkoprotein c-erbB-2 (HER2). základě PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5). PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5), pacienti byli 11 srovnáni s PATHWAY HER-2 (clone CB11) Primary Antibody na nezávislé sadě vzorků a HER2 je intracelulární membránový protein detekovaný v buněčné membráně. Úzce souvisí s EGFR a stejně jako EGFR má tyrosinkinázovou aktivitu.1 Rozšíření genu a bylo zjištěno, zda se výsledky dostatečně shodují. Aktuální korelace PATHWAY odpovídající nadměrná exprese c-erbB-2 byla zjištěna v různých nádorech, včetně anti-HER-2/neu (4B5) s klinickými výsledky nebyla stanovena. karcinomů prsu.11,12 VIAS Image Analysis System je přídatná volitelná obrazová analýza systému řízená Bylo prokázáno, ţe terapeutická látka Herceptin pomáhá u některých pacientů s počítačem a funkčně připojená k interaktivnímu mikroskopu. Je určena k pouţití jako karcinomem prsu zastavit růst nádoru a v některých případech při zvrácení růstu pomůcka patologům při detekci, třídění a počítání důleţitých buněk na základě ukazatele intenzity, velikosti a tvaru za pouţití vhodné kontroly k zajištění platnosti skóre VIAS. rakoviny.8 Látka je lidská monoklonální protilátka, která se váţe na protein HER2 na rakovinových buňkách. Proto by se pouze pacienti s pozitivními karcinomy prsu Souhrn a vysvětlení HER-2/neu měli léčit pomocí látky Herceptin. Diagnostiky In vitro pro determinaci stavu HER2 v karcinomech prsu jsou důleţitou pomocí klinickým lékařům při stanovení léčby PATHWAY anti-HER-2/neu je králičí monoklonální protilátka (klon 4B5) nasměrovaná látkou Herceptin. proti vnitřní oblasti onkoproteinu c-erbB-2 (HER2). Onkoprotein c-erbB-2 naklonoval a popsal Akiyama et al v roce 1986.1 Je to přibliţně transmembránový glykoprotein 185 kD, Interpretace výsledků kaţdého detekčního systému HER2 musí brát v úvahu skutečnost, který je strukturálně podobný receptoru pro epidermální růstový faktor (EGFR). Tento ţe HER2 je vyjádřen jak v rakovinových nádorech prsu, tak ve zdravé tkáni, i kdyţ na protein je spojen s tyrosinkinázy aktivitou podobnou aktivitě několika receptorů růstového různých úrovních a s různými vzory exprese.13 Histologické přípravy tkáně mají tu faktoru a aktivitě transformace proteinů rodiny src. Kódující sekvence je v souladu s výhodu, ţe intaktní morfologie tkáně pomáhá při interpretaci pozitivity vzorku na HER2. extracelulární vazební doménou a intracelulární doménou kinázy. To naznačuje, ţe HER2 Všechny histologické testy by měly být interpretovány specialisty na morfologii rakoviny 1 můţe být zapojeno do transdukce signálu a stimulace mitogenní aktivity. prsu a/nebo patologii, a výsledky by měly být doplněny morfologickými studiemi, vhodnými zkouškami a pouţity ve spojení s dalšími klinickými a laboratorními výsledky. Bylo prokázáno, ţe klon 4B5 reaguje s proteinem 185 kD z buněčných lyzátů SK-BR-3 přes Westernový přenos. SK-BR-3 je karcinom prsu buněčné linie, která má 128 krát větší Principy a postupy nadměrnou expresi HER2 mRNA.2 Velikost buněk identifikovaných pásmově koreluje PATHWAY HER2 (4B5) je králičí monoklonální protilátka, která se váţe na HER2 v oblasti dobře s metodou popsanou doktorem Akiyama et al pro protein HER2 (185 kD).1 tkáně zalité v parafínu. Specifickou protilátku lze lokalizovat buď formulací sekundární Imunohistochemie se pouţívá pro detekci specifických antigenů v buňkách a tkáních od protilátky konjugované biotinem, která rozpozná králičí imunoglobuliny, následovanou roku 1950.3 Pouţívání enzymů a peroxidázy jako markerů pro imunohistochemii popsali přidáním konjugované streptavidin křenové peroxidázy (HRP) (detekční sada iVIEW DAB 4 Nakane a Pierce v roce 1967. Zvýšená citlivost detekčního systému avidin-biotionové Detection Kit) nebo sekundární konjugované protilátky HRP (detekční sada ultraView peroxidázy na enzymem značenou protilátkovou metodu byla zdokumentována Hsu et al Universal DAB Detection Kit). Specifický komplex protilátkového enzymu je pak 5 v roce 1981. vizualizován pomocí sráţecího produktu enzymatické reakce. Kaţdý krok je inkubován po Protein HER2 je vyjádřen na úrovni zjistitelné imunohistochemicky v aţ 20 procentech výskytu adenokarcinomu z různých míst. V 15 aţ 30 procentech invazivní duktální rakoviny je protein HER2 pozitivní.6 Téměř ve všech případech jsou onemocnění prsu Paget7 pozitivní, a aţ v 90 procentech případů jsou pozitivní duktální karcinomy in situ typu komedon.6 Imunohistochemická detekce nadměrné exprese proteinu HER2 se rovněţ pouţívá jako pomocný faktor při výběru pacientů, pro které je indikována léčba látkou Herceptin.8 Zde jsou výsledky zabarvení po aplikaci PATHWAY HER2 (4B5) na normálních tkáních, neoplastických tkáních a v 322 případech karcinomu prsu, vyhodnocení společnosti Ventana. V případě normálních tkání exprese souhlasila s publikovanou literaturou, nebylo pozorováno ţádné neočekávané specifické cytoplazmatické/membránové zabarvení, kromě následujících výjimek: dva případy mandlí vykazující zabarvení epitelu buněčné membrány, jeden případ příštítných tělísek a jeden případ epitelu jícnu. V případě testování neoplastických tkáních bylo pozorováno cytoplazmické/membránové zabarvení v rakovinových buňkách prsu, tračníku a vaječníku. Tři sta dvacet dva (322) karcinomů prsu bylo vyhodnoceno metodou VENTANA PATHWAY HER2 (4B5) ve srovnávací studii s metodou PATHWAY HER-2 (CB11). Existuje významná korelace

2012-03-16

přesnou dobu a při přesné teplotě. Na konci kaţdého inkubačního kroku jsou řezy v barvicím automatu VENTANA omyty za účelem ukončení probíhající reakce a k odstranění nenavázaného materiálu, který by mohl bránit poţadované reakci v následujících krocích. Rovněţ je aplikováno Liquid Coverslip, které minimalizuje odpařování vodných činidel ze vzorku na podloţním skle.

Při hodnocení klinických případů by měly být prováděny vhodné kontroly. Společnost Ventana doporučuje začlenění pozitivní kontroly tkáně, stanovené a zpracované stejným způsobem, jako vzorek pacienta (například, slabě pozitivní karcinom prsu). Kromě barvení PATHWAY HER2 (4B5), by měl být druhý vzorek nabarven CONFIRM Negative Control Rabbit Ig. Aby byl test povaţován za platný, měla by pozitivní kontrola tkáně vykazovat zabarvení membrány rakovinových buněk. Tyto komponenty by měly být negativní při barvení CONFIRM Negative Control Rabbit Ig. Kromě toho je doporučeno, aby se prováděla negativní kontrola vzorku tkáně (například negativní karcinom prsu HER-2/neu) pro kaţdou sadu zpracovaných vzorků a pokračovat na barvicím automatu VENTANA. Tato negativní kontrola tkáně by měla být obarvena PATHWAY HER2 (4B5), aby bylo zajištěno, ţe antigenové zlepšení a další postupy předúpravy nevytvořily falešné pozitivní zabarvení.

Strana 1 / 11

14427CS Rev F

VIAS je interaktivní histologické zobrazovací zařízení, které provádí zpracování obrazu pomocí mikroskopu, digitální barevné videokamery, počítače a softwaru pro analýzu obrazu, tak je moţné získat a analyzovat uţivatelem zvolené obrázky na barvení PATHWAY HER-2/neu (4B5). Zařízení je určeno jako pomoc patologům při analyzování, poskytuje semikvantitativní vstup, který nahrazuje kvalitativní interpretaci patologů o podloţních sklech PATHWAY HER-2/neu (4B5). Patolog provádí běţnou manuální interpretaci podloţních skel HER-2/neu, aby vyhodnotil vyjádření HER-2/neu jako skóre pro podloţní sklo na stupnici (0, 1+, 2+, 3+) s pomocí mikroskopu VIAS. Poté má patolog moţnost zvolit pro semikvantitativní analýzu různé náhledy pomocí mikroskopu VIAS a počítače. Zařízení VIAS zpracuje barevné snímky zvolené uţivatelem, vyhodnotí vyjádření HER-2/neu pomocí softwarového algoritmu, a tak patologům pomůţe při kvalitativní interpretaci. Patolog provede konečné hodnocení zaloţené jak na semikvantitativních, tak kvalitativních informacích. Doporučuje se, aby uţivatel v této aplikaci VIAS dodrţoval při VENTANA PATHWAY HER-2/neu (4B5) pokyny v návodu k pouţití a v souvisejícím průvodci vyhodnocovacím skóre. Další informace naleznete v Návodu k obsluze Ventana Image Analysis System (VIAS). MATERIÁLY A METODY Dodávaná činidla Katalog #790-2991: PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) Primary Antibody obsahuje mnoţství činidla postačující na 50 testů. Jeden aţ 5 mL dávkovač PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) Primary Antibody obsahuje přibliţně 30 µg králičí monoklonální protilátky nasměrované proti lidskému antigenu c-erbB-2. Protilátka je naředěna v 0,05 M Tris pufrovaném fyziologickém roztoku, 0,01 M EDTA, 0,05 % Brij-35 s 0,3 % obsahem proteinu a 0,05 % azidu sodného, a konzervačního činidla. Obsaţeny jsou stopy fetálního telecího séra, přibliţně 0,25 %, pochází ze zásobního roztoku.

11.

Biocare Medical’s Decloaking Chamber (Kat. č. DC2002) (NexES IHC barvicí automaty) 12. NexES IHC, BenchMark Series barvicí automaty 13. Detekční soupravy iVIEW DAB Detection Kit (Kat. č. 760-091) nebo ultraView Universal DAB (Kat. č. 760-500) 14. Endogenous Biotin Blocking Kit (Kat. č. 760-050) 15. APK Wash (10X)* (Kat. č. 250-042) (NexES IHC barvicí automaty) 16. Liquid Coverslip (Low Temperature) (Kat. č. 250-009) (NexES IHC barvicí automaty) 17. EZ Prep (10X)* (Kat. č. 950-102) (BenchMark Series barvicí automaty) 18. Reaction Buffer (10X)* (Kat. č. 950-300) (BenchMark Series barvicí automaty) 19. Liquid Coverslip (High Temperature) (Kat. č. 650-010) (BenchMark Series barvicí automaty) 20. Cell Conditioning 1 (Pre-dilute) (CC1) (Kat. č. 950-124) 21. Hematoxylin II kontrastní barvivo (Kat. č. 790-2208) 22. Bluing Reagent (Kat. č. 760-2037) 23. Permanentní fixační médium (Permount, Fisher Kat. č. SP15-500 nebo ekvivalentní) 24. Krycí sklo (dostatečně velké pro překrytí tkáně, např. VWR Kat. č. 48393-60 nebo ekvivalentní) 25. Zařízení pro automatické překrytí (např. zařízení pro automatické překrytí Tissue-Tek SCA). 26. Absorpční utěrky (v případě, ţe se provádí manuální odmaskování antigenu) 27. Světelný mikroskop (20-80X) nebo Ventana Image Analysis System (VIAS).* * Podle potřeb specifických aplikací. Skladování a manipulace Uchovejte při teplotě 2 aţ 8 C. Chraňte před mrazem. Uţivatel musí ověřit všechny podmínky pro skladování, pokud se tyto podmínky liší od podmínek specifikovaných v příbalovém letáku. PATHWAY HER2 (4B5) by měl zůstat před pouţitím alespoň 30 minut při pokojové teplotě. Aby byl zajištěn správný výkon činidla a stabilita protilátky, musí se dávkovač po kaţdém pouţití uzavřít víčkem a okamţitě umístit ve vertikální poloze do ledničky.

Celková proteinová koncentrace činidla je přibliţně 16 mg/mL. Specifická koncentrace protilátky je přibliţně 6 µg/mL. PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) Primary Antibody je králičí IgG rozředěný ze supernatantů tkáňové kultury. Pro tento produkt není známa irelevantní protilátková reaktivita.

Kaţdý dávkovač s protilátkou má stanovenou dobu pouţitelnosti. Při řádném skladování je činidlo stabilní do data uvedeného na štítku. Nepouţívejte činidlo po uplynutí doby pouţitelnosti pro předepsanou metodu skladování. Tento produkt je určen pro spotřebu do 18ti měsíců po datu výroby.

Rekonstituce, smísení, ředění, titrace

Tento produkt nejeví ţádné známky indikující nestabilitu, proto by se současně s testováním neznámých vzorků měly provádět testy s pozitivní i negativní kontrolou. Pokud by byly zjištěny známky nestability činidla, je nutno se okamţitě obrátit na místního zástupce podpory.

Tato protilátka je optimalizována pro pouţití v barvicích automatech VENTANA spolu s VENTANA iVIEW DAB Detection Kit a kompatibilní s detekčními soupravami ultraView Universal DAB Detection Kit. Nevyţaduje se rekonstituce, smísení, ředění ani titrace. Další ředění můţe způsobit ztrátu zabarvení antigenu. Uţivatel musí všechny takové změny ověřit. Rozdíly v případě zpracování tkání a technických postupů mohou způsobit výrazně rozdílné výsledky a vyţadují pravidelné kontroly pouţívání (viz část Postupy kontroly kvality). Potřebné materiály a činidla, která se nedodávají Následující činidla materiály mohou být potřebné pro barvení, ale nejsou součástí dodávky: 1. CONFIRM Negative Control Rabbit Ig (Kat. č. 760-1029) (negative reagent control činidlo pro negativní kontrolu) 2. Mikroskopická podloţní skla, Superfrost Plus [VWR Kat. č. 48311-703 nebo ekvivalentní] 3. Pozitivní a negativní kontroly tkání (invazivní karcinom prsu a normální tkáň prsu) 4. Štítky s čárovým kódem (odpovídající testovanému činidlu negative reagent control a primární protilátce) 5. Nádoby nebo lázně na barvení 6. Tissue-Tek nádobí na barvení 7. Časový spínač (umoţňující intervaly 2 aţ 10 minut) 8. Xylen (histologický stupeň) 9. Ethanol nebo reagenční alkohol (histologický stupeň)  100 % roztok: neředěný ethanol nebo reagenční alkohol   10.

95 % roztok: směs 95 částí ethanolu nebo reagenčního alkoholu a 5 částí deionizované vody 80 % roztok: směs 80 částí ethanolu a reagenčního alkoholu s 20 částmi deionizované vody

Deionizovaná nebo destilovaná voda

2012-03-16

Odběr vzorků a příprava pro analýzu Pro pouţití PATHWAY HER2 (4B5) s detekčními soupravami VENTANA a na barvicích automatech VENTANA jsou vhodné tkáně fixované ve formalínu a zalité v parafínu (viz Potřebné materiály a činidla, které však nejsou součástí dodávky). Doporučené fixativum je 10 % neutrální pufrovaný formalín. Pouţívané mnoţství je 15 aţ 20 krát objem tkáně. Ţádné fixativum nepronikne během 24 h více neţ 2 aţ 3 mm do pevné tkáně nebo 5 mm do porózní tkáně. 3 mm nebo menší část tkáně by měla být fixována po dobu nejméně 4 hodin a nejvíce 8 hodin. Fixaci lze provést při pokojové teplotě (15 aţ 25 °C).14 Správně fixované a zalité tkáně exprimující antigen zůstanou stabilní po dobu nejméně 2 let, pokud jsou skladovány v chladu (15 aţ 25 °C). Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA) (Zákon o zdokonalení klinických laboratoří) z roku 1988, 42CFR493.1259(b) od profesionálních uţivatelů ve Spojených Státech vyţaduje: “Laboratoř musí uchovávat obarvená podloţní skla nejméně deset let od data vykonání testu.” Měly by se nařezat přibliţně 5 m silné řezy a ty následně vloţit na podloţení skla. Měla by se pouţít podloţní skla Superfrost Plus nebo ekvivalentní. Tkáně by se měly vysušit vzduchem a umístit na podloţní skla při teplotě prostředí přes noc.14 Studie společnosti Ventana dokazují, ţe vzduchem vysušené řezy tkání a řezy buněčných linií skladované při 2 aţ 8 °C jsou stabilní po dobu minimálně 6 měsíců. Kaţdá laboratoř musí pro vlastní postupy a podmínky prostředí skladování ověřit stabilitu tkáňových řezů. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY 1. 2. 3.

Strana 2 / 11

Tato protilátka je určena k pouţití při diagnostice in vitro. Při manipulaci s činidly dodrţujte příslušná bezpečnostní opatření. Při manipulaci s karcinogenními nebo toxickými materiály pouţívejte rukavice na jednorázové pouţití (např.: xylen nebo formaldehyd). Nepouţívejte v blízkosti otevřeného ohně. Nekuřte, nejezte a nepijte v místnosti, kde se manipuluje se vzorky nebo činidly.

14427CS Rev F

4. 5. 6. 7. 8. 9.

10. 11.

Zabraňte kontaktu činidel s očima a sliznicemi. Jestliţe se činidla dostanou do kontaktu s citlivými oblastmi, omyjte je vydatným mnoţstvím vody. Se vzorky pacienta a se všemi materiály je nutno manipulovat jako s potenciálně biologicky nebezpečnými materiály a likvidovat je v souladu s příslušnými předpisy. Nikdy nepipetujte ústy. Zamezte mikrobiologické kontaminaci činidel, protoţe by pak mohla dávat nesprávné výsledky. Nedodrţení příslušných inkubačních dob a teplot můţe vést k chybným výsledkům. Jakoukoliv změnu tohoto druhu musí uţivatel ověřit. Činidla byla optimálně rozředěná a další ředění můţe mít za následek ztrátu citlivosti barvení antigenů. Jakoukoliv změnu tohoto druhu musí uţivatel ověřit. Pokud je tento produkt pouţíván podle pokynů, není klasifikován jako nebezpečná látka. Konzervačním prostředkem v činidle je azid sodný. Příznaky nadměrné expozice azidu sodnému zahrnují podráţdění pokoţky a očí, podráţdění sliznic a horních cest dýchacích. Koncentrace azidu sodného v tomto produktu je 0,05 % a nesplňuje tudíţ kritéria OSHA pro nebezpečné látky. Usazeniny NaN3 mohou reagovat s olovem a mědí v potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným mnoţstvím vody, aby nedocházelo k usazování azidů v potrubí.15 U citlivých jedinců se mohou objevit systémové alergické reakce. Doporučené metody likvidace jsou uvedeny ve vnitrostátních a místních předpisech. Další bezpečnostní informace naleznete v Bezpečnostním listu k výrobku a R- a Světách umístěných na adrese www.ventana.com.

NÁVOD K POUŢITÍ

Tabulka 2. Doporučené barvicí protokoly pro PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) s detekční soupravou ultraView Universal DAB. Platforma nebo metoda Přístroj BenchMark XT

Přístroj BenchMark ULTRA

Inkubace

Ţádná

Ţádná

Odstraňování parafínu

Zvoleno

Zvoleno

Cell Conditioning 1, mírná

ULTRA CC1, mírná

Enzym (proteáza)

Není vyţadováno

Není vyţadováno

Protilátka (primární)

Přibliţně 16 minut, 37 C


Kontrastní barvení (hematoxylin)

Hematoxylin II, 4 minuty


Po kontrastní barvení

Bluing, 4 minuty

Bluing, 4 minuty

Typ postupu

Úprava buněk (odmaskování antigenu)

Postupy barvení na barvicích automatech VENTANA jsou uvedeny dále. Další podrobné pokyny a další vlastnosti protokolu naleznete v Návodu k obsluze.

Jednotlivé kroky postupu

Barvicí automat BenchMark Series 1. Opatřit podloţní skla štítkem s čárovým kódem odpovídajícím protilátkovému protokolu, který se má provést. 2. Zaloţit primární protilátku a dávkovače příslušné detekční soupravy a potřebná přídavná činidla do přihrádky pro činidla a umístit je do barvicího automatu. Zkontrolovat nádoby na tekutiny a odpad. 3. Vloţit podloţní skla do barvicího automatu. 4. Spustit barvicí cyklus. Tabulka 1. Doporučené barvicí protokoly pro PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) s detekční 5. Po dokončení cyklu vyjmout podloţní skla z barvicího automatu. soupravou iVIEW DAB Detection Kit. 6. K odstranění krycího roztoku promýt podloţní skla v roztoku mírného saponátu na nádobí. Platforma nebo metoda 7. Dehydratovat, vyčistit a zakrýt permanentním fixačním médiem obvyklým způsobem. Přístroj BenchMark a Přístroj BenchMark 8. Barvená podloţní skla by se měla interpretovat po dvou aţ třech dnech po barvení, Typ postupu BenchMark XT ULTRA jsou stabilní nejméně po dobu dvou let, pokud jsou správně uskladněna při Inkubace Ţádná Ţádná pokojové teplotě (15 aţ 25 C). Primární protilátky VENTANA byly vyvinuty za účelem pouţití v barvicích automatech VENTANA ve spojení s detekčními soupravami VENTANA a příslušenstvím. Doporučené barvicí protokoly pro barvicí automaty jsou uvedeny níţe v Tabulce 1 a Tabulce 2. Parametry automatických postupů lze zobrazit, vytisknout a upravovat podle postupů uvedených v Návodu k obsluze. Některé parametry obsluhy barvicího automatu sklíček jsou předem nastaveny výrobcem.

Odstraňování parafínu

Postupy kontroly kvality

Zvoleno

Zvoleno

Cell Conditioning 1, standardní

ULTRA CC1, mírná

Není vyţadováno

Není vyţadováno



Vyţadováno

Vyţadováno

Kontrolní systém buněčných linií

Úprava buněk (odmaskování antigenu) Enzym (proteáza) Protilátka (primární) A/B Blok (blokování biotinu)

Ventana má k dispozici jako samostatný produkt čtyři kontroly buněčných linií fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu, nařezané a umístěné na jediném nabitém podloţní skle (Katalog # 781-2991). PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides můţe být uţitečné při předběţné validaci metody zpracování pouţívané pro barvení podloţních skel PATHWAY HER2 (4B5). Tyto čtyři kontroly buněčných linií se vyznačují hybridizací počtu kopií genu in situ. Při správném zpracování a nabarvení by měly být buněčné linie zabarvené tak, jak je popsáno v Tabulce 4. Pokud uvedené zabarvení není v příslušném jádru evidentní, zvláště pak u kontrol 1+ a 2+, barvení tkání by se mělo opakovat. Tabulka 3. Vlastnosti PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides.

Kontrastní barvení (hematoxylin)



Po kontrastní barvení

Bluing, 4 minuty

Bluing, 4 minuty

HER2 IHC Score

Buněčná linie

Podíl HER2/Chr17*

0

MDA-MB-231

1,11

1+

T47D

1,12

2+

MDA-MB-453

2,66

3+

BT-474

5,53

* Podíl HER2/Chr17 je průměr tří šarţí PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides stanovených pouţitím fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Tkáň pro pozitivní kontrolu Tkáň pro pozitivní kontrolu fixovaná a zpracovaná stejným způsobem jako vzorky pacienta musí být zpracována pro kaţdý soubor testovacích podmínek a s kaţdým provedeným postupem barvení PATHWAY HER2. Tkáň můţe obsahovat pozitivně barvené buněčné/tkáňové komponenty a negativní komponenty buněčné tkáně a slouţí 2012-03-16

Strana 3 / 11

14427CS Rev F

jako tkáň pro pozitivní i negativní kontrolu. Kontrolní tkáně by měly být čerstvé vzorky z Pokud se u pozitivních kontrolních tkání neprojeví pozitivní zabarvení, je nutno povaţovat pitvy, biopsie nebo operace zpracované a fixované co nejdříve stejným způsobem jako výsledky testovaných vzorků za neplatné. testované řezy. Takové tkáně mohou monitorovat všechny kroky analýzy, od přípravy Tkáň pro negativní kontroly tkáně, aţ po barvení. Pouţití tkáňového řezu fixovaného nebo zpracovaného jiným způsobem neţ testovaný vzorek zajistí kontrolu pro všechna činidla a kroky metody kromě Tkáň pro negativní kontrolu je nutno testovat po tkáni pro pozitivní kontrolu, abychom fixace a přípravy tkáně. Tkáň se slabým pozitivním zabarvením je vhodnější pro optimální ověřili specificitu značení cílového antigenu primární protilátkou. Nepřítomnost specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost zkříţené kontrolu kvality a detekci niţších úrovní degradace činidla neţ silné pozitivní zabarvení. reaktivity s buňkami nebo částmi buněk. Zabarvení normální tkáně prsu je vhodnou tkání Ideálně by měla být vybrána tkáň se slabým, ale pozitivním zabarvením, aby bylo pro negativní kontrolu. Intaktní stromální a duktální prvky by neměly vykazovat intenzivní zaručeno, ţe je systém citlivý na malé mnoţství degradace činidla nebo problémy s zabarvení v membráně, coţ indikuje, ţe k zabarvení nedošlo. Pokud je tkáň kontrastně metodologií IHC. Ačkoliv obecně neoplastická tkáň, která je pozitivní na HER-2/neu, je zabarvena, je moţné pozorovat zabarvení kolem vnější části buňky, např. intersticiální silně pozitivní díky typu patologie (nadměrná exprese). Příkladem pozitivní kontroly pro prostory. Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno PATHWAY HER2 (4B5) je známý slabý pozitivní invazivní karcinom prsu HER-2/neu povaţovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. (např. duktální nebo lobulární). Součásti tkání pro pozitivní kontrolu (cytoplazmická membrána neoplastických buněk) se pouţívají k potvrzení přidání protilátky a správného Negative Reagent Controls (činidlo pro negativní kontroly) fungování přístroje. Pokud se vyskytuje nespecifické zabarvení, je většinou difúzní. Sporadické slabé Tkáň se známým slabým invazivním pozitivním karcinomem prsu HER-2/neu můţe zabarvení pojivové tkáně lze také pozorovat v řezech z tkání, které jsou nadměrně obsahovat jak pozitivně, tak negativně zbarvené buňky nebo tkáňové komponenty a můţe fixovány formalínem. K interpretaci výsledků barvení by se měly pouţívat pouze intaktní slouţit jako tkáň pro pozitivní i negativní kontrolu. buňky, neboť nekrotické nebo degenerované buňky často specificky nezabarví. Známe pozitivní kontroly tkání by měly být pouţívány pouze ke sledování správné funkce Tkáň pacienta zpracovaných tkání a testovaných činidel a ne jako pomůcka k formulaci specifické Vzorky pacienta se vyšetřují jako poslední. Intenzitu pozitivního zabarvení je nutno diagnózy vzorku pacientů. posuzovat v kontextu jakéhokoliv zabarvení pozadí negative reagent control (činidla pro Tkáň pro negativní kontrolu negativní kontrolu). Jako u kaţdého imunohistochemického testu, negativní výsledek znamená, ţe antigen nebyl detekován, nikoliv, ţe antigen není v testovaných buňkách Stejné podloţní sklo pouţité s tkání pro pozitivní kontrolu (duktální nebo lobulární nebo tkáni přítomen. Ke správné interpretaci kaţdého imunohistochemického výsledku by invazivní karcinom prsu) můţe být pouţito s tkání pro negativní kontrolu. Nebarvené komponenty (okolní stroma, lymfoidní buňky a krevní cévy) by měli prokázat nepřítomnost měla být testována rovněţ morfologie kaţdého vzorku tkáně s vyuţitím řezů barvených hematoxylinem a eozinem. Morfologický nález a příslušné klinické údaje pacienta musí specifického zabarvení a poskytnout indikaci specificky zabarveného pozadí u primární protilátky. Také normální prsní tkáň je vhodnou tkání pro negativní kontrolu. Pouţít známé interpretovat kvalifikovaný patolog. tkáně, které budou fixovány, zpracovány a zality identickým způsobem, jako vzorek(rky) Dříve neţ budou výsledky interpretovány, musí kvalifikovaný patolog se zkušenostmi v pacienta s kaţdým barvicím cyklem, aby byla zkontrolována specificita PATHWAY HER2 oblasti imunohistochemických postupů vyhodnotit pozitivní a negativní kontroly a kvalitu (4B5) pro prokázání HER-2/neu a poskytnutí indikace specifického barevného pozadí barevných produktů. (falešné pozitivní barvení). Konvence vyhodnocení pro interpretaci PATHWAY HER2 (4B5) Negative Reagent Control (činidlo pro negativní kontrolu) Karcinomy prsu, které jsou povaţovány za pozitivní pro nadměrnou expresi proteinu K usnadnění interpretace výsledků je třeba provést pro kaţdý vzorek cyklus s činidlem HER-2 musí splňovat kritéria pro intenzitu zabarvení (2+ nebo vyšší na stupnici od 0 do negative reagent control. Činidlo negative reagent control je pouţito místo primární 3+) a procentuálně pozitivní nádorové buňky (vyšší neţ 10 %). Zabarvení musí být rovněţ protilátky, aby se dalo vyhodnotit nespecifické zabarvení. Podloţní sklo by mělo být lokalizováno na buněčné membráně. Cytoplazmatické zabarvení můţe být stále přítomno, nabarveno CONFIRM Negative Control Rabbit Ig. Inkubační doba činidla negative reagent ale toto zabarvení není zahrnuto do stanovení pozitivity. Co se intenzity zabarvení a control by měla odpovídat inkubační době primární protilátky. stanovení kompletnosti cytoplazmatického zabarvení membrány týče, měly být zkontrolována tři pole v rámci dobře uchované a dobře zabarvené oblasti tkáně. Nevysvětlitelné rozpory Zabarvení, které zcela obklopí cytoplazmatické membrány by mělo být vyhodnoceno jako Nevysvětlitelné rozpory v kontrolách by měly být ihned ohlášeny místnímu zástupci intenzita “2+” nebo “3+”. Částečné zabarvení membrány by mělo být vyhodnoceno jako podpory. Pokud se výsledky kontrol neshodují se specifikacemi, výsledky pacienta jsou “1+”. Můţe být zapotřebí prozkoumat hraniční případy při 400 násobném nebo vyšším neplatné. Viz část Řešení problémů v tomto letáku. Identifikovat a opravit problém a zvětšení, aby bylo moţné rozlišit mezi intenzitou “1+” a “2+”. Na rozdíl od případů potom opakovat vzorky pacienta. vyhodnocených jako intenzita 3+, zabarvení vyhodnocené jako 2+ má ostřejší a zřetelněji Ověření testu vymezený prsten, zatímco případy vyhodnocené jako 3+ vykazují velmi silný obrys. Níţe Před prvním pouţitím protilátky nebo barvicího systému v diagnostické proceduře by měla je uvedena přehledná tabulka s kritérii pro zabarvení. Podrobnější popis naleznete v Průvodci vyhodnocovacím skóre společnosti VENTANA, kde jsou také uvedeny fotografie být ověřena specificita protilátky testováním na řadě dostupných tkáních se známými zabarvení pro PATHWAY HER2 (4B5). imunohistochemickými účinky, které představují známé pozitivní a negativní tkáně (prostudujte si Postupy kontroly kvality popsané dříve v této části příbalového letáku produktu a Poţadavky na kontrolu kvality akreditačního programu College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist,15 nebo schválenou směrnici CLSI16 případně oba tyto dokumenty). Tyto postupy kontroly kvality musí být provedeny vţdy, kdyţ se změní šarţe protilátky, nebo kdyţ se změní parametry testu. Tkáně rakoviny prsu se známým stavem HER2 jsou vhodné pro ověření účinnosti.

Tabulka 4. Kritéria pro intenzitu a vzor zabarvení buněčné membrány PATHWAY HER2 (4B5).

Vzor zabarvení

Vyhodnocení (zpráva pro ošetřujícího lékaře)

HER2 vyhodnocení zabarvení

Interpretace výsledků

Nepozoruje se ţádné zabarvení membrány

0

Negativní

Automatické imuno barvicí postupy společnosti VENTANA způsobují, ţe se hnědě zbarvený reakční produkt (DAB) srazí na částek antigenu lokalizovaných PATHWAY HER2 (4B5). Dříve neţ budou výsledky interpretovány, musí kvalifikovaný patolog se zkušenostmi v oblasti imunohistochemických postupů vyhodnotit kontroly a kvalitu barevných produktů.

Nepatrné, částečné zabarvení membrány v jakémkoliv poměru rakovinových buněk

1+

Negativní

Slabé celkové zabarvení membrány, vyšší neţ 10 % rakovinových buněk

2+

Slabě pozitivní

Intenzivní celkové zabarvení membrány, vyšší neţ 10 % rakovinových buněk

3+

Pozitivní

Pozitivní kontroly Nejprve je nutné provést test zabarvené tkáně pro pozitivní kontrolu a ověřit tak správnost funkce všech činidel. Přítomnost správně zabarveného reakčního produktu uvnitř membrán cílových buněk indikuje pozitivní reaktivitu. V závislosti na délce inkubační doby a potenci pouţitého hematoxylinu způsobí kontrastní barvení bleděmodré, aţ tmavomodré zabarvení buněčných jader. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení můţe ohrozit správnou interpretaci výsledků.

2012-03-16

Strana 4 / 11

14427CS Rev F

OMEZENÍ Všeobecná omezení 1.

Imunohistochemie je diagnostický proces obsahující více kroků, který vyţaduje specializovaná vyškolení ve výběru vhodných činidel, selekci tkání, fixací a zpracování, přípravě imunohistochemického podloţního skla a interpretaci výsledků zabarvení. 2. Zabarvení tkání závisí na manipulaci s tkání a na jejím zpracování před barvením. Nesprávná fixace, zmraţení, rozmraţení, umývání, sušení, zahřívání, řezání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami můţe vést ke vzniku artefaktů, zachycení protilátky nebo falešně negativním výsledkům. Následkem odchylek při fixaci a metodách zalévání či následkem stávajících nerovnoměrností ve tkáni můţe docházet k inkonzistentním výsledkům. 3. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení můţe ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace jakéhokoliv pozitivního zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být vyhodnocena v kontextu klinického projevu, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoliv zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a řádnými kontrolami a také dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná pouţité protilátky, činidla a pouţité metody. Barvení se musí provádět v certifikované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem patologa zodpovědného za hodnocení barvených podloţních skel a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. 5. Ventana dodává protilátky a činidla pro pouţití optimálně naředěné, pokud jsou dodrţeny pokyny, které jsou součástí produktu. Jakákoliv odchylka od doporučených testovacích postupů můţe způsobit neočekávané výsledky. Je nutno provést a zdokumentovat příslušné kontroly. Uţivatelé, kteří nedodrţí doporučené postupy, musejí za těchto okolností přijmout zodpovědnost za interpretaci výsledků pacienta. 6. Tento produkt není určen pro pouţití v průtokové cytometrii, jejíţ vlastnosti účinnosti nebyly stanoveny. 7. Činidla mohou vykazovat neočekávané reakce v dříve netestovaných tkáních. V důsledku biologické variability exprese antigenu v neoplazmě nebo jiných patologických tkáních nelze zcela vyloučit moţnost neočekávaných reakcí i v testovaných skupinách tkáních.17 Ze zdokumentovanými neočekávanými reakcemi se obraťte na místního zástupce podpory. 8. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B, které obsahují povrchový antigen (HBsAg) hepatitidy B, mohou s křenovou peroxidázou vykazovat nespecifické zabarvení.18 9. Falešně negativní výsledky se mohou vyskytovat v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo produktů reakce se substrátem. Mohou být také způsobeny aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty), endogenní aktivitou peroxidázy (cytochrom C) nebo endogenním biotinem (příklad: játra, mozek, prsa, ledviny) podle typu pouţitého imuno barviva.19 10. Jako u kaţdého imunohistochemického testu, negativní výsledek znamená, ţe antigen nebyl detekován, nikoliv, ţe antigen není v testovaných buňkách nebo tkáni přítomen. Specifická omezení 1. Protilátka byla zoptimalizována tak, jak je uvedeno v Tabulkách 1 a 2 pro platformy a detekční chemikálie společnosti VENTANA. Vzhledem k různým způsobům fixace a zpracování tkání můţe být potřeba zvýšit nebo sníţit inkubační dobu primární protilátky pro jednotlivé vzorky. Další informace o různých fixacích naleznete v příručce “Immunohistochemistry Principles and Advances”.20 2. Protilátka, ve spojení s detekčními soupravami VENTANA a příslušenstvím, detekuje antigen, který přeţívá běţnou formalínové fixaci, zpracování tkáně a řezání. Uţivatelé, kteří nedodrţí doporučené postupy, musejí za těchto okolností přijmout zodpovědnost za interpretaci výsledků pacienta. 3. Kostní dřeň nebyla na specificitu testována. Uţivatel by měl před zahájením interpretace informací o barvení stanovit vhodné barvení tkání.

2.

3.

4.

5.

6. 7.

8.

SOUHRN OČEKÁVANÝCH VÝSLEDKŮ Účinnost PATHWAY HER2 (4B5) Primary Antibody byla vyhodnocena na základě specificity, reprodukčnosti a metody srovnávací studie. Veškeré barvení bylo provedené za pouţití detekční protokolu iVIEW DAB Detection Kit uvedeného výše na barvicím automatu BenchMark XT, pokud není uvedeno jinak. 1. Specificita: PATHWAY HER2 (4B5) specificita byla stanovena studií, která neprokázala specifické zabarvení membrány pro většinu normálních tkání. Výsledky zabarvení byly následující: nadledvina (0/3), prsa (0/3), malý mozek (0/3), mozek (0/3), děloţního hrdlo (0/3), trakčník (0/3), jícen (1/3), srdce (0/2), ledviny (0/3), játra

2012-03-16

Strana 5 / 11

(0/3), plíce (0/3), mezoteliální buňky (0/3), vaječníky (0/3), slinivka břišní (0/3), příštítná tělíska (1/3, ohniskové membránové zabarvení), periferní nerv (1/3), hypofýza (0/2), prostata (1/3), slinná ţláza (0/3), kosterní svaly (0/3), kůţe (0/3), tenké střevo (0/3), slezina (0/3), ţaludek (0/3), varlata (0/3), brzlík (0/2), štítná ţláza (0/3), mandle (2/3, ohniskové zabarvení povrchových epitelových buněk) a děloha (0/3). PATHWAY HER2 (4B5) specificita byla rovněţ stanovena studií, která neprokázala specifické zabarvení membrány pro většinu neoplastických tkání. Výsledky zabarvení byly následující: rakovina prsu (1/4), karcinoid (0/2), rakovina trakčníku (1/3), rakovina jater (0/5), leiomyom (0/2), rakoviny plic (0/2), lymfom (0/3), melanom (0/2), rakovina vaječníků (1/2), rakovina slinivky břišní (0/3), rakovina prostaty (0/3), rakovina ledvin (0/5), sarkom (0/2), rakovina ţaludku (0/3), rakovina štítné ţlázy (0/3) a nediferencovaný karcinom (0/1). Pozitivní zabarvení na tonsilárním epitelu, epitel jícnu, prostaty, periferních nervů, příštítných tělísek, rakoviny prsu, trakčníku a rakoviny vaječníků souhlasí ohledně exprese HER-2/neu s publikovanou literaturou. Senzitivita: Senzitivita je závislá na uchování antigenu. Jakákoliv nesprávná manipulace s tkání během fixace, řezání, zalévání nebo skladování, které ovlivní antigennost oslabí detekci proteinu HER-2/neu pomocí PATHWAY HER2 (4B5) a můţe způsobit falešně negativní výsledky. Reprodukovatelnost barvení uvnitř cyklu na barvicích platformách NexES, BenchMark a BenchMark XT byla stanovena na základě barvení tří podkladových skel, kaţdé s pěti tkáněmi rakoviny prsu a skóre exprese HER-2 0, 1+, 2+, a 3+. Pro kaţdý případ, tři ze tří podkladových skel správně zabarvena během jednoho cyklu a všechny přístrojové platformy otestovány. Uţivatel musí ověřit reprodukovatelnost výsledků v rámci jednoho cyklu barvením různých sad sériových řezů s nízkou, střední a vysokou hustotou antigenu v jednom cyklu. Reprodukovatelnost barvení uvnitř cyklu a mezi platformami byla stanovena na základě barvení tří podkladových skel, kaţdé s pěti tkáněmi rakoviny prsu a skóre exprese HER-2 0, 1+, 2+, a 3+ na třech různých instrumentálních cyklech mezi přístrojovými platformami NexES, BenchMark a BenchMark XT. Pro kaţdý případ, devět z devíti podkladových skel správně zabarvena na třech instrumentálních cyklech a mezi a všechny přístrojové platformy otestovány. Uţivatelé by měli ověřit výsledky reprodukovatelnosti mezi cyklem nabarvením několika souborů sériových řezů s nízkou, střední a vysokou hustotou antigenu v různé dny. BenchMark XT mezilaboratorní barvení a skóre reprodukovatelnosti u různých odborných pracovníků: tři laboratoře v různých oddělených institucích ve Spojených Státech se zúčastnily mezilaboratorní studie reprodukovatelnosti. Řezy podloţních skel 40 neutrálních pufrovaných formalínem fixovaných invazivních případů karcinomu prsu [10 kaţdých z kaţdé kategorie vazby HER-2 (0-1+, 2+, 3+)] a šest (6) PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides byly zaslány na barvení na barvicích automatech VENTANA BenchMark XT za pouţití doporučeného barvicího protokolu. Kontroly zahrnovaly PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides a druhé podloţní sklo kaţdého případu bylo nabarveno negativní činidlem Ig. Nedošlo k neplatným cyklům na kvalifikovaných pracovištích, zaloţeno na provádění kontrol. Výsledky analyzovala společnost Ventana. Třicet čtyři ze čtyřiceti (34/40) podkladových skel vykazovala podobnou intenzitu zabarvení na všech barvicích pracovištích. Šest vzorků (6/40 nebo 15 %) se nelišilo o více neţ 1 úroveň intenzity. Tři (3/6) vzorky se lišily mezi 0 a 1+, pročeţ byly oba povaţovány za negativní. Dva vzorky (2/40 nebo 5 %) se lišilo mezi 2+ a 3+ a jeden vzorek (1/40) se lišil mezi 1+ a 2+. BenchMark XT Skóre reprodukovatelnosti u různých odborných pracovníků: ve všech 40 případech (100 %), minimálně 2 ze 3 patologů souhlasili. Reprodukovatelnost mezi šarţemi byla stanoveny na základě automatického barvení pěti rakovinových tkání expresí HER2 na skóre 0, 1+, 2+ a 3+ se třemi šarţemi PATHWAY HER2 (4B5). Barvené tkáně byly hodnoceny na stupnici skóre 0 aţ 3+ třemi odbornými pracovníky. Zde byl 100 % souhlas mezi šarţemi a odbornými pracovníky pro všechny 3 podkladová skla a 5 barvených tkání. Srovnávací studie PATHWAY HER2 (4B5) králičí monoklonální protilátky s PATHWAY HER-2 (CB11) myší monoklonální protilátkou: Souhrn uskutečněných studií. Pro zkoumání korelace PATHWAY HER2 (4B5) s PATHWAY HER-2 (CB11) a PathVysion Her-2 FISH byly provedena studie zaloţená na srovnávací metodě, jiţ dříve schválené diagnostické testy FDA. Této studie se zúčastnilo šest vědců. Dva týmy tří různých vědců vyhodnotily dvě různé skupiny (Skupina 1: n=144, Skupina 2: n=178) za pouţití známých případů rakovinu prsu barvených HER-2 CB11 a HER2 4B5. Údaje fluorescenční in situ hybridizace (FISH) byla získány z anamnézy pacienta. Bylo vytvořeno shodné skóre všemi třemi odbornými pracovníky pro kaţdou protilátku a pro kaţdý případ, aby byla sníţena variabilita interpretace různých odborných pracovníky existující při vyhodnocení skóre HER-2. 22, 23, 24 Celkem bylo vyhodnoceno 322 případů. Podkladová skla barvená PATHWAY HER-2 (CB11) byla zpracována a nabarvena podle pokynů výrobce uvedených v příbalovém letáku společnosti VENTANA CB11. Mezi barvením a 14427CS Rev F

čtením podkladových skel CB11 uběhl průběrně jeden rok. Pokud se skóre jednoho z šesti odborných pracovníků pohybovalo mimo důvěryhodný interval, jsou údaje z obou skupin prezentovány tak, jak je uvedeno dále.

Tabulka 8. Skupina 1- shodné skóre 4B5 IHC tří patologů v porovnání s FISH. Výsledky FISH

Reprodukovatelnost mezi patology ve srovnávací studii vzorků

Skóre 4B5

Tabulka 5. Skupina 1- shodné skóre IHC tří patologů.

3+

55

3

58

2+

25

8

33

6

47

53

86

58

144

Skóre CB11 Skóre 4B5

3+

2+

0, 1+

Celkem

0, 1+

3+

29

24

5

58

2+

2

13

17

32

0, 1+

0

0

53

53

31

37

75

143

Celkem

Skupina 1: Vlastnosti účinnosti pro prezentaci 3 x 3. Celková shoda je 29+13+53/143=66,4 % (95 % C.I. = 38,6 %, 59,7 %). Skupina 1: Vlastnosti účinnosti pro prezentaci 2 x 2 (HER-2 pozitivní protilátka (2+ a 3+) a negativní (0+ a 1+) skóre jsou kombinována). 

Pozitivní procentuální shoda je 29+2+24+13/31+37=100 % (95 % C.I. % = 97,5 % 100 %).



Negativní procentuální shoda je 53/75=70,7 % (95 % C.I. = 58,5 % - 80,1 %).



Celková shoda je 29+24+2+13+53/143=84,7 % (95 % C.I. = 78,2 % - 90,0 %).

Celkem

2+

Pozitivní procentuální shoda je 55+25/86=93,0 % (95 % C.I. = 87,9 % - 96,3 %).






Celkový souhlas je 55+25+47/144=88,2 % (95 % C.I. = 82,1 % - 92,2 %).

Tabulka 9. Skupina 2- shodné skóre CB11 IHC tří patologů v porovnání s FISH. Výsledky FISH Skóre CB11

Celkem

72

1

0

73

2+

1

12

5

18

0, 1+

0

7

80

87

73

20

85

178

Negativní

Celkem

3+

72

1

73

2+

13

7

20

8

77

85

93

85

178

Celkem

3+

Celkem

Pozitivní

0, 1+

0, 1+

Celkem



Skóre CB11 3+

Negativní

Skupina 1: Vlastnosti účinnosti pro 4B5 a FISH, prezentaci 2 x 2 (kde skóre 2 a 3 jsou povaţována za pozitivní).

Tabulka 6. Skupina 2 - shodné skóre IHC tří patologů. Skóre 4B5

Pozitivní

Skupina 2: Vlastnosti účinnosti pro CB11 a FISH, prezentaci 2 x 2 (kde skóre 2 a 3 jsou povaţována za pozitivní). 








Tabulka 10. Skupina 2 - shodné skóre 4B5 IHC tří patologů: v porovnání s FISH. Výsledky FISH

Skupina 2: Vlastnosti účinnosti pro prezentaci 3 x 3. Celkový souhlas je 72+12+80/178=92,1 % (95 % C.I. = 80,1 %, 93,1 %).

Skóre 4B5

Skupina 2: Vlastnosti účinnosti pro prezentaci 2 x 2 (HER-2 pozitivní protilátka (2+ a 3+) a negativní (0+ a 1+) skóre jsou kombinována).

3+

72

1

73

2+

11

7

18

0, 1+

10

77

87

Celkem

93

85

178



Pozitivní procentuální shoda je 72+12+1+1/73+20=92,5 % (95 % C.I. = 85,2 % 96,9 %).






Celkový souhlas je 72+12+1+1+80/178=93,3 % (95 % C.I. = 88,5 % - 96,4 %).

Tabulka 7. Skupina 1- shodné skóre CB11 IHC tří patologů v porovnání s FISH. Výsledky FISH Skóre CB11 3+

Pozitivní 32

Negativní

Celkem

Skupina 2: Vlastnosti účinnosti pro 4B5 a FISH, prezentaci 2 x 2 (kde skóre 2 a 3 jsou povaţována za pozitivní). Pozitivní procentuální shoda je 72+11/93=89,2 % (95 % C.I. = 82,5 % - 95,1 %).



Negativní procentuální shoda je 77/85=90,6 % (95 % C.I.=84,0 % - 96,4 %).

32




Reprodukovatelnost mezi patology ve srovnávací studii vzorků

2+

32

5

37

0, 1+

22

53

75

Celkem

86

58

144

Skupina 1: Vlastnosti účinnosti pro CB11 a FISH, prezentaci 2 x 2 (kde skóre 2 a 3 jsou povaţována za pozitivní). 








2012-03-16

Negativní

 Celkem 0

Pozitivní

Je známo, ţe různí patologové mohou provést různé interpretace imunohistochemických podloţních sklíček, pro kaţdé dvě skupiny byly přiřazeni tři patologové (celkem 6 patologů) pro interpretaci vzorků. Pro posouzení konečných výsledků bylo pouţito pravidlo dva ze tří ven. Níţe je uveden souhrn různých výsledků získaných třemi patology při srovnávací studii vzorků pro kaţdou skupinu (skupina 1: n=178, skupina 2: n=144).

Strana 6 / 11

14427CS Rev F

Tabulka 11. Skupina 1: Skóre 4B5 pro tři patology.

Tabulka 14. Skupina 2: Skóre CB11 pro tři patology.

Skóre 4B5 Skóre HER2

Vědec 1

Vědec 2

Skóre CB11 Skóre HER2

Vědec 3

3+

72

70

73

2+

22

19

18

0, 1+

80

89

87

174

178

178

Celkem

31

37

28

2+

38

32

47

0, 1+

75

75

69

144

144

144

Vzorky 1 aţ 6: jeden patolog hodnotil skóre 0+, druhý skóre 1+ a třetí skóre 2+. Vzorek 7 a 8: jeden patolog hodnotil skóre 0+, druhý skóre 2+ a třetí skóre 2+.

Vzorek 2: Jeden patolog hodnotil skóre 0+, dva patologové hodnotili skóre 2+.

Následuje uspořádání stupnic procentuálních shod mezi páry patologů do tabulky (tři páry pro kaţdou skupinu). Tabulka 15. Stupnice shody 2 x 2* pro tři patology.

Tabulka 12. Skupina 1: Skóre CB11 pro tři patology. Skóre CB11 Vědec 1

Vědec 6

Poznámka: Celkem 8 vzorků se lišilo při hodnocení třemi patology o více neţ jeden úrovňový stupeň (např. 0 - 2+).

Vzorek 1: Jeden patolog hodnotil skóre 2+, dva patologové hodnotili skóre 0+.

Skóre HER2

Vědec 5

3+

Celkem

Poznámka: Celkem se při hodnocení třemi patology lišily 3 vzorky ve více neţ jednom úrovňovém stupni (např. 0, 2+).

Vzorek 3: Jeden patolog hodnotil skóre 0+, druhý skóre 1+ a třetí skóre 2+.

Vědec 4

Vědec 2

Vědec 3

Celková procentuální shoda

Pozitivní procentuální shoda

Negativní procentuální shoda

3+

72

75

73

4B5 vs. CB11

2+

22

22

18

Skupina 1

82,6–86,9 %

97,3–100,0 %

68,0–75,4 %

0, 1+

80

81

87

Skupina 2

88,2–95,5 %

87,6–95,6 %

86,1–95,4 %

178

4B5 vs. FISH Skupina 1

86,8–88,2 %

90,7–94,2 %

79,3–81,0 %

Skupina 2

87,4–89,9 %

88,2–90,0 %

84,5–91,8 %

Skupina 1

79,9–84,0 %

73,3–80,2 %

89,7–89,7 %

Skupina 2

84,8–93,3 %

86,7–92,5 %

82,7–94,1 %

174

Celkem

178

Poznámka: Celkem se při hodnocení třemi patology lišil 1 vzorek ve více neţ jednom úrovňovém stupni (např. 1 - 3+). Vzorek 1: Jeden patolog hodnotil skóre 1+, druhý skóre 2+ a třetí skóre 3+.

CB11 vs. FISH

Tabulka 13. Skupina 2: Skóre 4B5 pro tři patology. Skóre 4B5 Skóre HER2

Vědec 4

Vědec 5

* 0, 1+ = Negativní. 2+ a 3+ = Pozitivní. Vědec 6

3

59

65

50

2

30

28

39

0, 1

52

51

55

141

144

144

Celkem

Poznámka: Celkem se při hodnocení třemi patology lišilo 6 vzorků ve více neţ jednom úrovňovém stupni (např. 0, 3+). Vzorek 1: Jeden patolog hodnotil skóre 0+, druhý skóre 0+ a třetí skóre 2+. Vzorek 2: Jeden patolog hodnotil skóre 1+, druhý skóre 1+ a třetí skóre 3+. Vzorek 3: Jeden patolog hodnotil skóre 0+, druhý skóre 2+ a třetí skóre 2+. Vzorek 4 a 5: Jeden patolog hodnotil skóre 0+, druhý skóre 2+ a třetí skóre 2+. Vzorek 6: Jeden patolog hodnotil skóre 0+, druhý skóre 3+ a třetí skóre 3+.

2012-03-16

Závěr: Údaje z těchto studií indikují, ţe primární protilátka PATHWAY HER2 (4B5) byla specifická a reproduktivní ve své schopnosti lokace příslušného zabarvení membrány pro normální a neoplastické tkáně. Srovnávací metoda údajů ukázala, ţe primární protilátka PATHWAY HER2 (4B5) je indikována jako pomůcka při posouzení pacientů s rakovinou prsu, u kterých je zvaţována léčba látkou Herceptin. Vlastnosti účinnosti na přístroji BenchMark ULTRA za použití detekce iVIEW DAB Detection Kit nebo ultraView Universal DAB Detection Kit. 9. BenchMark ULTRA Mezilaboratorní barvení a reprodukovatelnost v různé dny. Tři laboratoře v různých oddělených institucích ve Spojených Státech se zúčastnily mezilaboratorní studie reprodukovatelnosti. Řezy podloţních skel 48 FFPE případů invazivního karcinomu prsu [12 kaţdých z kaţdého kategorie vazby HER-2 (0, 1+, 2+, 3+)] a 1 pár PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides z kaţdých 12 barvicích cyklů byly distribuovány za účelem studie pracoviště s barvením na barvicích automatech VENTANA BenchMark ULTRA za pouţití doporučeného barvicího protokolu a detekce ultraView Universal DAB Detection Kit. Kontroly zahrnovaly PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides a druhé podloţní sklo kaţdého případu bylo nabarveno negativní činidlem Ig. Patologové, bez znalosti stavu případu, hodnotili podkladová sklad a poskytli klinické skóre (např. 0, 1+, 2+, 3+). Výsledky analyzovala společnost Ventana. Na základě standardní nomenklatury pro tabulky 2 x 2, byla vypočítána průměrná pozitivní shoda (APA) mezi pracovišti jako [2a/(2a+b+c)] a průměrná negativní shoda (ANA) jako j [2d/(2d+b+c)]. Mezi všemi pracovišti byla APA zaloţená na klinickém hodnocení (pozitivní, negativní) 90,0 % (108/120) a ANA 92,9 % (156/168). U párových srovnání pracovišť byla APA vypočítána jako a/(a+c) a ANA byla vypočítána jako d/(b+d). Hodnoty APA mezi pracovišti byly 93,0 % (40/43), 87,2 % (34/39), a 89,5 % (34/38) pro Pracoviště A vs Pracoviště B, Pracoviště A vs Pracoviště C a Pracoviště B vs Pracoviště C, v uvedeném pořadí. Hodnoty ANA mezi pracovišti byly 94,3 % (50/53), 91,2 %

Strana 7 / 11

14427CS Rev F

10.

(52/57), a 93,1 % (54/58) pro Pracoviště A vs Pracoviště B, Pracoviště A vs Pracoviště C a Pracoviště B vs Pracoviště C, v uvedeném pořadí. Následující tabulky Tabulka 16, Tabulka 17 a Tabulka 18 jsou prezentace výsledků 3 x 3 pro kaţdého odborného pracovníky zaloţené na klinickém skóre, kde 2+ a 3+ byly odděleny:

Tabulka 16. Pracoviště A vs Pracoviště B mezilaboratorní hodnoty shod analýzy 3 x 3 – PATHWAY HER2 (4B5) na přístroji BenchMark ULTRA s detekcí ultraView Universal DAB Detection Kit. Pracoviště B Pracoviště A

3+

2+

0, 1+

Celkem

3+

12

2

0

14

2+

0

6

2

8

0, 1+

0

1

25

26

12

9

27

48

Celkem

Celková procentuální shoda (OPA): n/N (%)

43/48 (89,6)

Tabulka 17. Pracoviště A vs Pracoviště C mezilaboratorní hodnoty shod analýzy 3 x 3 – PATHWAY HER2 (4B5) na přístroji BenchMark ULTRA s detekcí ultraView Universal DAB Detection Kit. Pracoviště C Pracoviště A

3+

2+

0, 1+

Celkem

12

1

1

14

2+

0

4

4

8

0, 1+

0

0

26

26

Odborný pracovník A

12

5

31

48

3+

84

11

1

96

2+

8

28

9

45

0, 1+

4

8

114

126

96

47

124

267


42/48 (87,5)

Tabulka 18. Pracoviště B vs Pracoviště C mezilaboratorní hodnoty shod analýzy 3 x 3 – PATHWAY HER2 (4B5) na přístroji BenchMark ULTRA s detekcí ultraView Universal DAB Detection Kit. Pracoviště C Pracoviště B

3+

2+

0, 1+

Celkem

3+

12

0

0

12

2+

0

5

4

9

0, 1+

0

0

27

27

12

5

31

48

Celkem


12.

Tabulka 19. BenchMark ULTRA vs BenchMark XT hodnoty shoda mezi platformami analýzy 3 x 3 – Odborný pracovník A. Přístroj BenchMark Přístroj BenchMark XT ULTRA

3+

Celkem

11.

na kaţdé pracoviště) pro barvení na barvicích automatických zařízeních VENTANA BenchMark XT a VENTANA BenchMark ULTRA za pouţití doporučených barvicích protokolů a detekce ultraView Universal DAB Detection Kit. Kontroly zahrnovaly PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides a druhé podloţní sklo kaţdého případu bylo nabarveno negativní činidlem Ig. Případy barvení z Pracoviště 1 a Pracoviště 2 byly rozděleny do čtyř sad podloţních skel, jedna sada po druhé, pro tři kvalifikované pracovníky (patology), jedno kvalifikovaného pracovníka na Pracovišti 1, jednoho na Pracovišti 2, a jednoho na Pracovišti 3. Patologové, bez znalosti stavu případu a barvicí platformy, vyhodnotili všechny čtyři sady podloţních skel a poskytli klinické skóre (např. 0, 1+, 2+, 3+) pro kaţdý případ. Výsledky analyzovala společnost Ventana. Hodnoty PPA (a niţší vazba dvoustranných intervalů spolehlivosti 95 %) pro barvení protilátky PATHWAY HER2 (4B5) na přístroji BenchMark ULTRA versus na přístroji BenchMark XT zaloţených na klinickém hodnocení pozitivní oproti, negativním byly 91,6 % (85,9), 91,2 % (85,3) a 94,9 % (89,3) pro Odborného pracovníka A, B a C, v uvedeném pořadí. Hodnoty NPA (a niţší vazba dvoustranných intervalů spolehlivosti 95 %) pro barvení protilátky PATHWAY HER2 (4B5) na přístroji BenchMark ULTRA versus na přístroji BenchMark XT zaloţených na klinickém hodnocení pozitivní oproti negativním byly 91,9 % (85,8), 93,8 % (88,3) a 99,3 % (96,3) pro Odborného pracovník A, B a C, v uvedeném pořadí. OPA hodnocení PATHWAY HER2 (4B5) za pouţití přístroje BenchMark ULTRA versus přístroje BenchMark XT zaloţených na analýze klinického hodnocení 2 x 2 pozitivní oproti negativním bylo 91,8 %, 92,5 % a 97,4 % pro Odborného pracovník A, B a C, v uvedeném pořadí. Prezentace 3 x 3 hodnot shody mezi platformami pro kaţdého odborného pracovníky zaloţená na klinickém skóre (0/1+, 2+, 3+) jsou zobrazeny v Tabulce 19, Tabulce 20 a Tabulce 21:

44/48 (91,7)

BenchMark ULTRA Reprodukovatelnost barvení v různé dny: Do části studie o reprodukovatelnosti barvení v různé dny (IDR) bylo začleněno 12 případů se záměrnou distribucí přibliţně tří (3) případů na kaţdé klinické skóre (0, 1+, 2+, 3+). Celkem pět cyklů na barvicích automatických zařízeních BenchMark ULTRA v jedné jediné instituci (Pracoviště C), část studie o reprodukovatelnosti barvení v různé dny (IDR) trvala minimálně 20 dní a to tak, ţe po sobě nikdy nenásledovaly dva dny barvení. Hodnoty IDR APA a ANA zaloţené na klinickém hodnocení barvení PATHWAY HER2 (4B5) na Pracovišti C během všech dní byly všechny 100 %. Hodnoty celkové procentuální shody (OPA) pro srovnání v různé dny zaloţená na klinických skóre byly 100 % pro kaţdé srovnání dne za dnem a pro všechny kombinované dny. Srovnávací studie barvicích platforem BenchMark ULTRA a BenchMark XT: Dvě barvicí laboratoře a tři interpretační pracoviště ve Spojených Státech se zúčastnily srovnávací studie platforem. Řezy podloţních skel 280 FFPE případů invazivního karcinomu prsu [přibliţně 70 případů z kaţdé kategorie vazby HER-2 (0, 1+, 2+, 3+)] byly náhodně distribuovány na dvě barvicí pracoviště (140 případů

2012-03-16

Strana 8 / 11

3+

Celkem

2+

0, 1+

Celková procentuální shoda n/N (%) (95 % CI)

Celkem

226/267 (84,6) (79,8-88,5)

Tabulka 20. BenchMark ULTRA vs BenchMark XT hodnoty shoda mezi platformami analýzy 3 x 3 – Odborný pracovník B. Přístroj BenchMark ULTRA Přístroj BenchMark XT Odborný pracovník B

3+

2+

0, 1+

Celkem

3+

64

2

1

67

2+

3

56

7

66

0, 1+

2

10

122

134

69

68

130

267

Celkem

Celková procentuální shoda n/N (%) (95 % CI)

242/267 (90,6) (86,5-93,6)

14427CS Rev F

Tabulka 21. BenchMark ULTRA vs BenchMark XT hodnoty shoda mezi platformami analýzy 3 x 3 – Odborný pracovník C. Přístroj BenchMark ULTRA Přístroj BenchMark XT Odborný pracovník C

3+

2+

0, 1+

Celkem

Tabulka 22. Odborný pracovníka A,iVIEW DAB Detection Kit vs ultraView Universal DAB Detection Kit detekční hodnoty shody analýzy 3 x 3 – PATHWAY HER2 (4B5) barvení na přístroji BenchMark ULTRA. iVIEW DAB Detection Kit ultraView Universal DAB Detection Kit detekce detekce 3+

2+

0, 1+

64

1

0

65

Odborný pracovník A

2+

2

45

1

48

3+

43

5

0

48

0, 1+

0

6

148

154

2+

3

17

6

26

66

52

149

267

0, 1+

0

3

59

62

46

25

65

136

Celkem

Celková procentuální shoda: n/N (%) (95 % CI)

Celkem

257/267 (96,3) (93,2-98,0)

Celková procentuální shoda: n/N (%) (95 % CI) 13.

14.

Celkem

3+

Reprodukovatelnost mezi patology ve srovnávací studii vzorků na platformách: Byla vypočítány pozitivní a negativní hodnoty shod pro dvoustranné skóre intervalů spolehlivosti 95 % pro šest moţných párových srovnání mezi odbornými pracovníky a pro kaţdou platformu. Pro přístroj BenchMark ULTRA, hodnoty PPA pro Odborné pracovníky A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 94,7 % (126/133), 98,2 % (111/113), 98,2 % (111/113), 89,4 % (126/141), 78,7 % (111/141) a 83,5 % (111/133), v uvedeném pořadí. Hodnoty NPA pro Odborného pracovníka A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 88,8 % (119/134), 80,5 % (124/154), 85,7 % (132/154), 94,4 % (119/126), 98,4 % (124/126) a 98,5 % (132/134), v uvedeném pořadí. Hodnota OPA byla nejvyšší mezi Odborným pracovníkem A a Odborným pracovníkem B (91,8 %) a nejniţší mezi Odborným pracovníkem B a Odborným pracovníkem C (91,0 %) a Odborným pracovníkem A a Odborným pracovníkem C (88,8 %). Pro přístroj BenchMark XT hodnoty PPA pro Odborné pracovníky A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 94,9 % (130/137), 98,3 % (116/118), 98,3 % (116/118), 90,9 % (130/143), 81,1 % (116/143) a 84,7 % (116/137), v uvedeném pořadí. Hodnoty NPA pro Odborného pracovníka A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 90,0 % (117/130), 81,9 % (122/149), 85,9 % (128/149), 94,4 % (117/124), 98,4 % (122/124) a 98,5 % (128/130), v uvedeném pořadí. Hodnota OPA byla nejvyšší mezi Odborným pracovníkem A a Odborným pracovníkem B (92,5 %) a nejniţší mezi Odborným pracovníkem B a Odborným pracovníkem C (91,4 %) a Odborným pracovníkem A a Odborným pracovníkem C (89,1 %).

Tabulka 23. Odborný pracovník B, iVIEW DAB Detection Kit vs ultraView Universal DAB Detection Kit detekční hodnoty shody analýzy 3 x 3 - PATHWAY HER2 (4B5) barvení na přístroji BenchMark ULTRA. iVIEW DAB Detection Kit ultraView Universal DAB Detection Kit detekce detekce Odborný pracovník B

Strana 9 / 11

3+

2+

0, 1+

Celkem

3+

32

0

0

32

2+

0

31

6

37

0, 1+

1

1

65

67

33

32

71

136

Celkem


128/136 (94,1) (88,8-97,0)

Tabulka 24. Odborný pracovník C, iVIEW DAB Detection Kit vs ultraView Universal DAB Detection Kit detekční hodnoty shody analýzy 3 x 3 – PATHWAY HER2 (4B5) barvení na přístroji BenchMark ULTRA. iVIEW DAB Detection Kit ultraView Universal DAB Detection Kit detekce detekce

Srovnávací studie detekce iVIEW DAB Detection Kit a ultraView Universal DAB Detection Kit : Pracoviště 1 skupina 140 FFPE případů invazivního karcinomu prsu [přibliţně 35 případů z kaţdé kategorie vazby HER-2 (0, 1+, 2+, 3+)] bylo pouţito ve srovnávací studii detekce iVIEW DAB Detection Kit a ultraView Universal DAB Detection Kit, při barvení PATHWAY HER2 (4B5) na barvicím automatickém zařízení BenchMark ULTRA. Dvě barvicí laboratoře a tři interpretační pracoviště ve Spojených Státech se zúčastnily srovnávací studie detekce. For PATHWAY HER2 (4B5) barvení protilátky na přístroji BenchMark ULTRA hodnota PPA mezi výsledky získanými za pouţití detekční metody iVIEW DAB Detection Kit a ultraView Universal DAB Detection Kit zaloţených na klinickém hodnocení (pozitivní, negativní) byly 95,8 % (68/71), 96,9 % (63/65) a 96,5 % (55/57) pro Odborné pracovníky A, B a C, v uvedeném pořadí a hodnoty NPA mezi detekčními metodami byly 90,8 % (59/65), 91,5 % (65/71) a 97,5 % (77/79) pro Odborné pracovníky A, B a C, v uvedeném pořadí. Hodnoty OPA mezi detekčními soupravami byly 93,4 % (127/136), 94,1 % (128/136) a 97,1 % (132/136) pro Odborného pracovník A, B a C, 15. v uvedeném pořadí. Prezentace 3 x 3 hodnot shody srovnání detekcí pro kaţdého odborného pracovníka zaloţená na klinickém skóre (0/1+, 2+, 3+) jsou zobrazeny v Tabulce 22, Tabulce 23 a Tabulce 24:

2012-03-16

119/136 (87,5) (80,9-92,0)

Odborný pracovník C

3+

2+

0, 1+

Celkem

3+

32

0

0

32

2+

0

23

2

25

0, 1+

0

2

77

79

32

25

79

136

Celkem


132/136 (97,1) (92,7-98,9)

Reprodukovatelnost mezi patology ve srovnávací studii vzorků detekce: Byly vypočítány pozitivní a negativní hodnoty shod pro dvoustranné skóre intervalů spolehlivosti 95 % pro šest moţných párových srovnání mezi odbornými pracovníky a pro kaţdou metodu. Pro iVIEW DAB Detection Kit, hodnoty PPA pro Odborného pracovníka A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 100,0 % (69/69), 98,2 % (56/57), 96,5 % (55/57), 93,2 % (69/74), 75,7 % (56/74) a 79,7 % (55/69), v uvedeném pořadí. Hodnoty NPA pro Odborného pracovníka A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 92,5 % (62/67), 77,2 % (61/79), 82,3 % (65/79), 100,0 % (62/62), 98,4 % (61/62) a 97,0 % (65/67), v uvedeném pořadí. Hodnota celkové shody byla nejvyšší mezi Odborným pracovníkem A a Odborným pracovníkem B (96,3 %) a nejniţší mezi Odborným pracovníkem A a Odborným pracovníkem C (86,0 %) a Odborným pracovníkem B a Odborným pracovníkem C (88,2 %). Pro ultraView Universal DAB Detection Kit, hodnoty PPA pro Odborného pracovníka A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 96,9 % (63/65), 14427CS Rev F

98,2 % (56/57), 98,2 % (56/57), 88,7 % (63/71), 78,9 % (56/71) a 86,2 % (56/65), v 12. uvedeném pořadí. Hodnoty NPA pro Odborného pracovníka A vs B, A vs C, B vs C, B vs A, C vs A a C vs B byly 88,7 % (63/71), 81,0 % (64/79), 88,6 % (70/79), 96,9 % (63/65), 98,5 % (64/65) a 98,6 % (70/71), v uvedeném pořadí. Celkové hodnoty 13. shod byly podobné pro kaţdý pár odborných pracovníků, 92,6 % (126/136), 88,2 % (120/136) a 92,6 % (126/136) pro Odborného pracovníka A vs B, Odborného 14. pracovníka A vs C a Odborného pracovníka B vs C, v uvedeném pořadí. Závěr: Údaje z těchto studií indikují, ţe primární protilátka PATHWAY HER2 (4B5) byla specifická a reproduktivní ve své schopnosti lokace příslušného zabarvení membrány pro normální a neoplastické tkáně. Srovnávací metoda údajů ukázala, ţe primární protilátka PATHWAY HER2 (4B5) je indikována jako pomůcka při posouzení pacientů s rakovinou prsu, u kterých je zvaţována léčba látkou Herceptin.

2.

3. 4. 5. 6.

Jestliţe pozitivní kontrola vykazuje slabší zabarvení, neţ se očekává, měly by být během stejného cyklu na automatu zkontrolovány i další cykly s pozitivní kontrolou, aby bylo moţné stanovit, zda je uvedené způsobeno primární protilátkou nebo některým z běţných sekundárních antigenů. Pokud je pozitivní kontrola negativní, je nutno ji zkontrolovat, aby bylo zajištěno, ţe podloţní sklo má správný štítek s čárovým kódem. Jestliţe je podloţní sklo opatřeno správným štítkem, je třeba během stejného cyklu na automatu zkontrolovat další cykly s pozitivní kontrolou, aby bylo moţné stanovit, zda je uvedené způsobeno primární protilátkou nebo některým z běţných sekundárních antigenů. Odběr, fixace nebo odstraňování parafínů z tkání mohlo být provedeno nesprávným způsobem. Odběr tkáně, její fixace a skladování musí probíhat správným způsobem. Jestliţe se nepodařilo odstranit všechen parafín, nemusí se barvení zdařit. Je třeba opakovat postup odstranění parafínu z tkání. Je-li zabarvení specifickou protilátkou příliš intenzivní, opakujte cyklus s kratší inkubační dobou vţdy o 4 minuty aţ do doby dosaţení poţadované intenzity barvení. Jestliţe dochází ke smývání řezů tkání z podloţního skla, zkontrolujte, zda jsou podloţní skla nabita kladným nábojem. Nápravné činnosti jsou uvedeny v kapitole Jednotlivé kroky postupu v Návodu k obsluze barvicího automatu. Můţete se rovněţ obrátit na místního zástupce podpory.

REFERENCE 1. 2.

3.

4.

5.

6. 7. 8.

9. 10.

11.

Akiyama T, et al. The product of the human c-erbB-2 Gene: A 185-kilodalton glycoprotein with tyrosine kinase activity. Science. 1986;232:1644-1646. Kraus MH, Popescu NC, Amsbaugh C, King RC. Overexpression of EGF receptorrelated proto-oncogene erbB-2 in human mammary tumour cell lines by different molecular mechanisms. EMBO J. 1987;6:605-610. Coons AH, and Kaplan MH. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method of detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 1950:91;1-13. Nakane PK, and Pierce GB Jr. Enzyme labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J. Histochem Cytochem. 1967;14:929931. Hsu SM, et al. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J. Histochem Cytochem. 1981;29:577-580. Dickson RB, and Lippman ME. Genes, Oncogenes, and Hormones. Boston: Kluwer Academic Publishers; 1992. Keatings L. et al. c-erbB-2 oncoprotein expression in mammary and extramammary Paget’s disease: an immunohistochemical study. Histopathology. 1990;17:234-247. Herceptin (Trastuzamab) [Package Insert]. EMEA (European Medicines Agency). http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR__Product_Information/human/000278/WC500074922.pdf. Published 01/03/2010. Updated 04/02/2011. Accessed October 2010. Roche PC. Immunohistochemical stains for breast cancer. Mayo Clin Proc. 1994;69:57-58. Charpin C, et al. c-erbB-2 oncoprotein detected by automated quantitative immunocytochemistry in breast carcinomas correlates with patients' overall and disease-free survival. Br J Cancer. 1997;75:1667-1673. Corbett IP, et al. NCL-4B5, a new monoclonal antibody recognizing the internal domain of the c erbB 2 oncogene protein effective for use on formalin-fixed, paraffinembedded tissue. J. Pathol. 1990;161:15-25.

2012-03-16

16. 17.

ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ 1.

15.

18. 19.

20. 21. 22.

23. 24. 25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

Nicholson RI, et al. Relationship between EGF-R, c-erbB-2 protein expression and Ki67 immunostaining in breast cancer hormone sensitivity. Eur J Cancer. 1993;29A:1018-1023. DePotter CR, et al. The expression of the neu oncogene product in breast lesions and in normal fetal and adult human tissues. Histopathology. 1989;15:351-362. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology, 2nd Edition. St. Louis, Missouri: The C.V. Mosby Company; 1980. Department of Health, Education and Welfare, National Institute of Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ No. 78-127, Current 13. August 16, 1976. College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, 2010. CLSI. Quality Assurance for Immunocytochemistry: Approved Guideline. CLSI document MM4-A- (ISBN 1-56238-396-5). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 USA, 1999. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech Histochem. 1991;66:194-199. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen. A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 1980;73:626-32. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: part 1. The technique and its pitfalls. Lab Med. 1983;14:767. Roche PC, Hsi ED. Immunohistochemistry-Principles and Advances. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th edition. In: NR Rose, ed. ASM Press; 2002. Thomson TA, Hayes MM, Spinelli JJ, Hiland E, Sawrenko C, Phillip D, et al. HER2/neu in breast cancer: interobserver variability and performance of immunohistochemistry with 4 antibodies compared with fluorescent in situ hybridization. Mod Pathol. 2001;14:1079-86. Kay EW, Walsh CJ, Cassidy M, Curran B, Leader M. C-erbB-2 immunostaining: problems with interpretation. J Clin Pathol. 1994;47:816-22. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, et al. Current Perspectives on HER2 Testing: A Review of National Testing Guidelines. Mod Pathol. 2003;16:173-182. Rhodes AJ, Sarson, et al. The reliability of rabbit monoclonal antibodies in the immunohistochemical assessment of estrogen receptors, progesterone receptors, and HER2 in human breast carcinomas. Am J Clin Pathol. 2010;134:621-32. van der Vegt B, de Bock GH, Bart J, et al. Validation of the 4B5 rabbit monoclonal antibody in determining Her2/neu status in breast cancer. Mod Pathol. 2009;22:879886. Mayr D, Heim S, Werhan C, Zeindl-Eberhart E, Kirchner T. Comprehensive immunohistochemical analysis of Her-2/neu oncoprotein overexpression in breast cancer: HercepTest (Dako) for manual testing and Her-2/neuTest 4B5 (Ventana) for Ventana BenchMark automatic staining system with correlation to results of fluorescence in situ hybridization (FISH). Virchows Archiv. 2009;454:241-8. Itoh H, Kato N, Serizawa A, Itoh T, Umemura S, Osamura RY. HER2 Rabbit Monoclonal Antibody 4B5 and Silver SISH: High Performance in Surgical Pathology for Appropriate Patient Care. Laboratory Investigation. 2009;89:48A. Powell WC, Roche PC, Tubbs R. A new rabbit monoclonal antibody (4B5) for the immunohistochemical (IHC) determination of the HER2 status in breast cancer: comparison with CB11, fluorescence in situ hybridization (FISH), and interlaboratory reproducibility. Appl Immunohistochem Mol Morph. 2008;16:569. Carbone A, Botti G, et al. Delineation of HER2 gene status in breast carcinoma by silver in situ hybridization is reproducible among laboratories and pathologists. J Mol Diagn. 2008;10: 527-36. Wolff AC, Hammond ME, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 2007;131:18-43.

DUŠEVNÍ VLASTNICTVÍ PATHWAY, ultraView, CONFIRM, NexES, BENCHMARK, VENTANA, a VENTANA logo jsou ochrannými známkami společnosti Roche. Všechny ostatní ochranné známky jsou majetkem příslušných vlastníků. Ventana Medical Systems, Inc. poskytuje konečnému uţivateli jednorázovou licenci v souladu s patenty USA, čísla 6045759, 6945128 a 7378058 a zahraničními stejnopisy. © 2012 Ventana Medical Systems, Inc.

Strana 10 / 11

14427CS Rev F

KONTAKTNÍ INFORMACE Ventana Medical Systems, Inc. 1910 E. Innovation Park Drive Tucson, Arizona 85755 USA +1 520 887 2155 +1 800 227 2155 (USA) www.ventana.com

Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D-68305 Mannheim Germany

2012-03-16

Strana 11 / 11

14427CS Rev F

neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody

Recommend Documents