T VA
EK
O
PÍ
R
O
Diagnostika polyomavirů
N
RNDr. Martina Saláková, Ph.D. Národní referenční laboratoř pro papillomaviry, Oddělení Imunologie, ÚHKT www.papillomavirus.cz
9.6.2015
Lidské polyomaviry virus
výskyt
komplikace
JCPyV
běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin, Blymfocytech
reaktivace při imunodeficitu (transplantace) terapie,AIDS), do CNS, progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML)
50-80%
BKPyV
běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin
reaktivace při imunodeficitu, hemoragická cystitida (HSCT), polyomavirová nefropatie (transplantace ledviny)
80-90%
KIPyV
respirační trakt, děti
respirační ?
55-90%
WUPyV
respirační trakt, děti
respirační ?
69-98%
MCPyV
kůže
karcinom z Merkelových buněk
45-80%
HPyV6
kůže
?
69-80%
HPyV7
kůže, sliznice
?
35-60%
TSPyV
kůže
trichodysplasia spinulosa při imunodeficitu
70-80%
HPyV9
sérum
?
18-50%
HPyV10
kůže, stolice
?
?
STLPyV, HPyV12
stolice
?
?
NJPyV
kůže
?
?
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
seroprevalence
T VA
N
EK
O
PÍ
R
O
Metody detekce polyomavirů
9.6.2015
Polyomaviry – diagnostika
VA
T
•Buněčné kultury - Kultivace viru je zřídka použita k detekci infekce virem JC a BK mimo výzkumném prostředí. Tyto viry rostou pomalu ve tkáňové kultuře, a citlivé buněčné linie nejsou snadno dostupné. Izolace virů z klinických vzorků může trvat několik týdnů až měsíců
R
O
•Cytologie moči - Přítomnost buněk se zvětšeným jádrem s jednou velkou bazofilní intranukleární inkluzních (decoy cells). Cytopatologické změny lze zaměnit s těmi, které jsou v důsledku zhoubného bujení, nebo s jinými viry, jako je adenovirus. Nerozlišuje JC a BK polyomavirus.
N
EK
O
PÍ
•Elektronová mikroskopie – Detekce virových částic v sedimentu moči nebo v jádrech oligodendrocytů v biopsii mozku.
9.6.2015
Virové partikule BK vylučované v moči, převzato Transplant and Hepatic Pathology Center of Excellence
Buňky infikované polyomavirem „decoy cells“, zvětšeno 60x, převzato dr Dorothy Rosenthal.
Polyomaviry – diagnostika
VA
T
•Serologie – Využití rekombinantně exprimovaného virového proteinu VP1 (virus like particles VLP) nebo části T-antigenu. Antigen připravený v bakulovirovém expresním systému, v kvasinkách, bakteriích nebo buněčných kulturách. Detekce IgG, IgM a IgA pomocí ELISA testů, neutralizačních testů, Luminex.
R
O
•Role HPyV serologie u pacientů po transplantaci – zatím málo dat. BK virová infekce po tranplantaci ledvin u BK séropozitivních pacientů, protilátky nechrání proti PyVAN, vliv virově specifických T-buněk
N
EK
O
PÍ
•Virově specifická T-buněčná odpověď – sledování množství T-buněk produkujících cytokiny po stimulaci specifickými virovými epitopy pomocí ELISPOT (The Enzyme-Linked ImmunoSpot ), intrabuněčné barvení cytokinů a průtoková cytometrie
Polyomaviry –velikost kapsidy 40-45nm
9.6.2015
Polyomaviry – diagnostika
VA
T
•Polymerázová řetězová reakce (PCR) - Detekce HPyV infekce v různých klinických materiálech s vysokou citlivostí a specifitou. •Kvalitativní výsledek - Důležitá interpretace výsledků. Klinická citlivost.
N
EK
O
PÍ
R
O
•Kvantitativní výsledek – Virová nálož vyjádřena jako Genome Equivalent (GEq) na ml referenčního vzorku nebo na počet diploidních hostitelských buněk. Pro hodnocení je důležitá signifikantní změna virové nálože, signifikantně vyšší virová nálož ( obecně akceptovaná změna virové nálože v plazmě a mozkomíšním moku >1 log Geq/ml a >2 log Geq/ml v moči Hirsch et al., Clin Microbiol Infect, 2014)
9.6.2015
qPCR standardizace
T
Mezinárodní společnosti, které zajišťují Externí hodnocení kvality (EHK) / zkoušení způsobilosti (PT) - International External Quality Assessment (EQA) / Proficiency Testing (PT)
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
- Poskytují podporu laboratořím, zaměřují na zlepšování kvality molekulární diagnostiky prostřednictvím externího hodnocení kvality (EQA), zkoušení způsobilosti (PT) a další podpůrné iniciativy v oblasti kvality molekulární detekce infekčních onemocnění
9.6.2015
O
VA
T
qPCR standardizace
PÍ
R
Collaborative study to evaluated the 1st WHO International Standard candidate for JC virus (JCV) NAT-based assays February 2015
N
EK
O
Collaborative study to evaluated the 1st WHO International Standard candidate for BK virus (BKV) NAT-based assays April 2015
→ Výsledky červen 2015
9.6.2015
T VA
N
EK
O
PÍ
R
O
Diagnostika polyomavirů v praxi
9.6.2015
HPyV onemocnění a diagnostika
VA
T
•HPyV způsobují vážné komplikace u pacientů po tranplantaci solidních orgánů (SOT), především po tranplantaci ledvin, pacientů po transplantaci kmenových krvetvorných buněk (HSCT), HIV/AIDS pacientů a pacientů s roztroušenou sklerózou podstupující biologickou léčbu (natalizumab).
R
O
•PyVAN - pacienti po transplantaci ledvin, u ostatních transplantovaných pacientů vzacné onemocněni •Progresivní multifokální leukoencefalopatie – u pacientů po tranplantaci, s RS a HIV/AIDS
O
•Trichodisplasia spinulosa
PÍ
•Hemoragická cystitida u příjemců HSCT
EK
•Karcinom z Merkelových buněk, nemelanomový karcinom kůže
N
•Infekce horních cest dýchacích, gastrointestinální onemocnění
9.6.2015
HPyV onemocnění a diagnostika
T
•Transplantovaní pacienti SOT, HSCT
O
PÍ
R
O
VA
•Před transplantací - žádná předtransplantační HPyV diagnostika (DNA, protilátky) není doporučená •Po tranplantaci - žádný rutinní skríning HPyV DNA/protilátek s výjimkou BKPyV u pacientů po tranplantaci ledvin (detekce BKPyV v moči a plazmě) - detekce HPyV při podezření na onemocnění spojené s polyomavirovou infekcí - pravidelná prohlídka kůže kvůli identifikaci zhoubných kožních onemocnění spojených s HPyV, jakož i melanomu a ne-melanomovému karcinomu kůže
EK
•Pacienti s roztroušenou sklerózou
N
• Před zahájením terapie natalizumaben musí být velmi pečlivě zvážena všechna rizika léčby, včasná diagnostika PML, stanovení JCPyV protilátek
•HIV/AIDS pacienti •Žádná HPyV diagnostika není doporučená 9.6.2015
T
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
Diagnostika polyomavirů v naší laboratoři
9.6.2015
T
HPyV serologie
O
VA
• VLP (BKPyV, JCPyV, MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9, MWPyV, KiPyV) připravené v bakulovirovém expresním systému, rekombinantní HPyV VP1 protein připraveny z referenčních plasmidů pomocí PCR s primery k VP1 oblasti (Bac-to bac systém, Invitrogene).
R
•Optimalizované ELISA testy pro všechny připravené VLPs
EK
O
PÍ
•VLP ELISA test- kontrolní séra při každém testování, hodnota cut-off (CO) je vypočtena zvlášť pro každý antigen / desky. Každý výsledek ELISA je prezentován jako poměr mezi absorbance vzorku a příslušné hodnoty CO (index OD). Pro potvrzení výsledků, vzorky v rámci 10% nad hodnotou CO, stejně jako asi jedna čtvrtina všech vzorků séra jsou testovány znovu. Pouze vzorky s opakovanými pozitivní výsledky jsou považovány za reaktivní.
50 kDa
9.6.2015
N
MCPyV BKV JCV MuPyV
R
O
VA
T
HPyV serologie
EK N 9.6.2015
MCPyV ~45 nm
100nm
HPyV7 VP1 VLPs (both 45 nm and 22 nm particles)
O
HPyV6 VP1 VLPs (22 nm diameter)
PÍ
100nm
BKPyV~45 nm
T
HPyV serologie
VA
• Séroprevalence lidských polyomavirů u zdravých dárců České republiky
88 69
66 57
60 50
O
40 30 20 10 0
PÍ
63
EK
Séroprevalence (%)
80
85
R
90
70
O
100
64 57
33
N
MCPyV BKPyV JCPyV HPyV6 HPyV7 HPyV9 MWPyV KiPyv
9.6.2015
TSPyV
T
HPyV DNA detekce
R
•fluorogení próby 5′-FAM-NNNNN-BHQ1-3′
O
VA
• Real time PCR pro BKPyV, JCPyV, MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9, MWPyV, KiPyV, WuPyV
N
EK
O
PÍ
•standardy
Schéma qPCR, převzato Wikipedia
9.6.2015
VA
• Neuroendokrinní karcinom kůže karcinom z Merkelových buněk
T
HPyV DNA detekce - kůže
R
O
• Imunohistochemie - V současné době se doporučuje vyšetřit nádor panelem protilátek, který zahrnuje CK 20, CK 7, TTF-1, NSE a/nebo neurofilamenta, případně chromogranin A. Výsledky imunohistochemie ale nemusí být jednoznačné.
N
EK
O
PÍ
•Detekce MCPyV DNA, kvalitativní qPCR, pro diagózu karcinomu z Merkelových buněk svědčí virová nálož ≥1 kopie virového genomu na buňku (Ota a spol.,2012)
Karcinom z Merkelových buněk, HE, 100x (A) a 400x(B) zvětšeno, převzato Jirásek a spol., 2009
9.6.2015
HPyV DNA detekce - kůže
Vzorek pohlaví věk v době dg. 1.
muž
80 let
1.b
9.6.2015
CM2B4
MCPyV DNA
p
p mozaika
p
x
nelze-technické problémy
p
lokalizace
Ck20
Ck7
TTF-1
CgA
NSE
pravé předloktí
p
0
0
p
recidiva
x
x
x
x
recidiva
O
1.a
VA
T
•karcinom z Merkelových buněk - porovnání imunohistochemie a MCPyV DNA detekce
x
x
x
x
p
p
p
x
0
0
p
p
ojediněle p
p
p
0
0
p
0
disperzně p
p
p
0
0
p
p
ojediněle p
p
p
0
0
p
p
50-60% p
p
p
0
0
p
p
p
p
lokalizace neuvedena
p
p fok
0
p
p
0
p
89 let
pravá tvář
p
0
0
0
p
0
0
žena
79 let
levá strana čela
p
0
0
p
0
50% p
p
muž
82 let
čelo-primární léze
p
0
0
p
p
ojediněle p
p
10.a
recidiva
0
0
0
0
p
0
0
10.b
recidiva
0
0
0
0
p
ojediněle p
0
lokalizace neuvedena
p
0
0
p
p
vykrájeno
0
dolní víčko dx.
p
0
0
p
p
0
0
levá paže
p
0
0
p
p
ojediněle p
p
pravá tvář
p
0
0
0
p
0
0
pravé stehno
p
0
0
p
p
p
p
lokalizace neuvedena
p fok
0
0
p
p
ojediněle p
0
lokalizace neuvedena
p
p fok
0
0
p
0
0
muž
65 let
levá gluteální krajina
3.
žena
76 let
pravá tvář
4.
muž
73 let
pravé předloktí
5.
žena
83 let
levé předloktí
6.
muž
48 let
levá paže
7.
žena
69 let
8.
žena
9. 10.
EK
O
PÍ
R
2.
žena
71 let
12.
žena
73 let
13.
žena
65 let
14.
žena
98 let
15.
muž
64 let
16.
žena
93 let
17.
žena
89 let
18.
žena
58 let
levá tvář
p
0
0
p
p
p
p
19.
muž
76 let
předloktí
p
0
0
p
p
p
p
N
11.
HPyV DNA detekce - kůže
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
•karcinom z Merkelových buněk - porovnání imunohistochemie a MCPyV DNA detekce
9.6.2015
MCC, IHC barvení protilátkou proti MCPyV Tag (CM2B4) , 10x , 20x, 40x, (MUDr T.Jirásek)
HPyV DNA detekce - kůže
VA
pacientka 71 let, excize suspektního basaliomu na nosním křídle vlevo, exprese CK-20, CD56, EMA, chromograninu, synaptofysinu a neuron-specifickou enolasu (NSE), závěr – na základě morfologického a aimunohistochemického nálezu uzavřeno jako karcinom z Merkelových buněk, tumor neexprimuje TTF-1, nelze s úplnou jistotou vyloučit metastázu malobuněčného karcinomu plic
R
O
1.
T
•karcinom z Merkelových buněk – případy řešené v NRL
O
Pacient 42 let, exize lymfatické uzliny pacienta s neznámým zdrojem primárního nádoru, exprese CK-7, CK-20, chromograninu, synaptofysinu
EK
1.
PÍ
MCPyV DNA detekce pomocí qPCR – 7 kopií virového genomu na buňku
N
MCPyV DNA detekce pomocí qPCR – 5 kopií virového genomu na buňku
9.6.2015
Ložisko čepičkovite pozitivity cytokeratinu 7 v cytoplazmě nadorovych buněk v jednom z vyšetřenych karcinomů, 400krát, Jirásek a spol., 2009
T
HPyV DNA detekce - kůže
Rok
Diagnóza
narození
žena
1942
ca z merkelových buněk
2
žena
1944
excize kůže, metastáza?
3
muž
1938
tumor pankreatu-meatstáza z plicního tu?
4
muž
1928
5
žena
6 7
R
1
MCPyV DNA
MCPyV DNA
virová nálož/buňku
+
1
-
0 0
+
1
1947
tumor pankreatu-metastáza z plicního tu?
-
0
žena
1946
metastáza mozku-primární tumor plíce?
žena
1952
8
muž
1956
9
muž
žena
12
muž muž
0
malobuněčný karcinom moč. měchýře
-
0
O
0
-
EK
muž
11
-
malobuněčný plicní karcinom
1947
malobuněčný plicní karcinom
-
0
1946
metastáza mozku-primární tumor plíce?
-
0
1931
metastáza mozku-primární tumor plíce?
-
0
1937
malobuněčný plicní karcinom
-
0
malobuněčný plicní karcinom
-
0
N
10
PÍ
-
excize kůže, metastáza?
13
9.6.2015
Pohlaví
O
Vzorek
VA
•Retrospektivní analýza pacientů s diagnózou malobuněčný plicní karcinom a kožními metastázami
1932
T
HPyV DNA detekce - kůže
VA
•Detekce dalších polyomavirů na kůži a ve výplachu úst u zdravých dobrovolníků
HPyV7
8%
72%*
4%
výplach úst
30%*
0%
N
sérum
0%
EK
stěr kůže
TSPyV
HPyV9
MWPyV
KiPyV
JCPyV
BKPyV
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
PÍ
HPyV6
O
testovaný materiál MCPyV
R
O
polyomavirus
0%
* Virová nálož méně než 1 kopie na buňku, signifikantně nižší virová nálož při porovnání s karcinomem z Merkelových buněk
9.6.2015
T VA
Mgr. Vojtěch Šroller , Ph.D
EK
O
PÍ
R
O
RNDr. Eva Hamšíková RNDr. Viera Ludvíková Mgr. Jana Stašíková
N
doc. MUDr. Tomáš Jirásek, Ph.D
T VA O
N
EK
O
PÍ
R
Děkuji za pozornost
28.11.2012
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
qPCR standardizace
9.6.2015
VA
T
Table 2. Recommendations for HPyV-specific pre-transplant testing of SOT donors and recipients
R
O
Pre-transplant testing of all SOT donors and all SOT recipients for any HPyV DNA in urine, blood or other clinical specimens is not recommended, because current data are not sufficient for guiding organ allocation, risk stratification, immunosuppressive therapy, screening modalities or prophylactic, preemptive or therapeutic intervention pre- or post-transplant (BIII)
EK
O
PÍ
For SOT recipients listed for kidney transplantation after terminal renal failure due to PyVAN in native or transplanted kidneys, testing of plasma BKPyV should be considered and should be undetectable prior to (re-)transplantation or at least have declined by at least >2 log10 GEq/mL compared with documented peak plasma loads (BIII)
N
Pre-transplant HPyV serology of SOT donors or SOT recipients is not recommended, because current data are not sufficient for guiding organ allocation, risk stratification, immunosuppressive therapy, screening modalities, or prophylactic, preemptive or therapeutic intervention pre- or post-transplant (BIII)
Pre-transplant testing of HPyV-specific T-cell responses in peripheral blood of SOT donors or SOT recipients is not recommended, because current data are not sufficient for guiding organ allocation, risk stratification, immunosuppressive therapy, screening modalities, or prophylactic, preemptive or therapeutic intervention modalities in SOT recipients (BIII)
9.6.2015
