Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 1
01/2009:1472
NATRII HYALURONAS Nátrium-hialuronát
(C14H20NNaO11)n [9067-32-7] DEFINÍCIÓ A hialuronsav nátriumsója, egy glükózaminoglükán, mely D-glükuronsav és Nacetil-D-glükózamin diszacharid-egységekből áll. Tartalom: 95,0–105,0% (szárított anyagra). Belső viszkozitás: a feliraton megadott érték 90–120%-a.
ELŐÁLLÍTÁS Kakastaréjból történő kivonással vagy Streptococcusokból, (Lancefield A és C csoportokból) fermentálással nyerhető. Előállításához a kórokozók mennyiségét minimalizáló vagy teljesen kiküszöbölő gyártási módszereket alkalmaznak. Amennyiben Gram-pozitív baktériumok fermentálásával állítják elő, az eljárásnak bizonyítottan csökkentenie kell vagy ki kell küszöbölnie a sejtfal pirogén, illetve gyulladáskeltő anyagait.
SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, igen nedvszívó por, illetve rostos halmazok.
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 2
Oldékonyság: vízben mérsékelten oldódik vagy oldódik; acetonban és etanolban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: a nátrium-hialuronát Ph.Eur. referenciaspektrumával. B. A nátriumion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.
VIZSGÁLATOK S oldat. 0,10 g szárított anyagnak megfelelő mennyiségű vizsgálandó anyaghoz R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatának 30,0 ml-ét adjuk, és a keveréket rázógépen, oldódásig kíméletesen kevertetjük (kb. 12 óra). Az oldat külleme. Az S oldat tiszta legyen (2.2.1). 600 nm-en az S oldat abszorbanciája (2.2.25) legfeljebb 0,01 lehet. pH (2.2.3): 5,0–8,5. A vizsgálandó anyagból R szén-dioxid-mentes vízzel – szárított anyagra vonatkoztatva – 5 mg/l töménységű oldatot készítünk. Belső viszkozitás. A nátrium-hialuronát erősen nedvszívó, a bemérés során nedvességtől védeni kell. Tompítóoldat (0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 M foszfát–tompítóoldat (pH 7,0)). 0,78 g R nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrátot és 4,50 g R nátriumkloridot R vízzel 500,0 ml-re oldunk (A-oldat). 1,79 g R dinátrium-hidrogénfoszfát-dodekahidrátot és 4,50 g R nátrium-kloridot R vízzel 500,0 ml-re oldunk (B-oldat). Az A- és a B-oldatot pH 7,0 eléréséig elegyítjük. Az elegyet zsugorított üvegszűrőn (4) megszűrjük (2.1.2). Vizsgálati oldat (a). A vizsgálandó anyag 0,200 g-ját (m0p) lemérjük (MEGJEGYZÉS: ez csak tájékoztató érték és az a) vizsgálati oldat első viszkozitásmérési eredménye alapján pontosítani kell) és 50,0 g (m0s) 4 °C-os tompítóoldattal 24 órán át 4 °C-on rázatjuk. Ezen oldat 5,00 g-ját (mlp) 100,0 g (mls) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. Ezt az oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) (2.1.2) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük. Vizsgálati oldat (b). Az a) vizsgálati oldat 30,0 g-ját (m2p) 10,0 g (m2s) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. Ezt az oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) (2.1.2) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük.
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 3
Vizsgálati oldat (c). Az a) vizsgálati oldat 20,0 g-ját (m3p) 20,0 g (m3s) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. Ezt az oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) (2.1.2) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük. Vizsgálati oldat (d). Az a) vizsgálati oldat 10,0 g-ját (m4p) 30,0 g (m4s) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. Ezt az oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) (2.1.2) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük. Meghatározzuk a tompítóoldat (t0), valamint a négy vizsgálati oldat átfolyási idejét (t1, t2, t3 és t4) 25,00±0,03 °C-on (2.2.9). A méréshez alkalmas Ubbelohde féle függőszintes kapilláris viszkozimétert használunk, tölcsér alakú kapillárisvéggel (jellemzői: műszerállandó kb. 0,005 mm2/s2, kinematikai viszkozitástartomány 1–5 mm2/s2, az R kapilláris belső átmérője 0,53 mm, a C gömb térfogata 5,6 ml, az N cső belső átmérője 2,8–3,2 mm). Valamennyi mérést ugyanazzal a viszkoziméterrel végezzük. Az átfolyási időt három párhuzamos méréssel állapítjuk meg. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az egyes mérések legfeljebb 0,35%-kal térnek el az átlagtól és ha t1 értéke t0 értékének 1,6–1,8-szerese. Ellenkező esetben változtatni kell az m0p tömeget, és meg kell ismételni a vizsgálatot. A relatív viszkozitások kiszámítása Minthogy a nátrium-hialuronát oldatok és az oldószer sűrűsége csaknem egyenlő, az ηri relatív viszkozitások (r1,r2,r3ésr kiszámíthatók a megfelelő oldatok ti kifolyási időinek (t1, t2, t3 és t4) és az oldószer t0 átfolyási idejének arányából, de számításba kell venni a kapillárisra vonatkozó kinetikus energia korrekciós tényezőt (B = 30 800 s3), az alábbiak szerint: ti t0
B t i2 B t 02
A koncentrációk kiszámítása Az a) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c1 koncentrációját a következő összefüggés alapján számítjuk ki: m0 p x (100 h) m1 p 25 100 100 (m0 p m0 s ) ( m1 p m1s )
ahol x
=
a „Tartalmi meghatározás” pont szerint megállapított százalékos nátrium-hialuronát-tartalom;
h
=
szárítási veszteség (%);
Natrii hyaluronas
25 =
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 4
1005 kg/m3 (a vizsgálati oldat sűrűsége 25 °C-on).
A b) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c 2 koncentrációját a következő összefüggés alapján számítjuk ki: c1
m2 p
m 2s m 2 p A c) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c3 koncentrációját a következő összefüggés alapján számítjuk ki: c1
m3 p m3s m3 p
A d) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c 4 koncentrációját a következő összefüggés alapján számítjuk ki: c1
m4 p m 4s m 4 p
A belső viszkozitás kiszámítása A belső viszkozitást [η] a legkisebb négyzetek elvén alapuló lineáris regressziós analízissel, a Martin egyenlet alkalmazásával számítjuk ki: 1 log r log k c c A m3/kg-ban kifejezett belső viszkozitást a tengelymetszet tizes alapú hatványértéke adja meg. Szulfatált glükózaminoglükánok: legfeljebb 1%, amennyiben a termék kakastaréjból történő kivonással készült. Perklórsavval, magasabb hőmérsékleten végzett műveleteknél megfelelő biztonsági intézkedésekre van szükség. Vizsgálati oldat. 50,0 mg szárított anyagnak megfelelő mennyiségű vizsgálandó anyagot egy 150 mm hosszú, 16 mm belső átmérőjű kémcsőbe mérünk és 1,0 ml R perklórsavban oldunk. Összehasonlító oldat. 0,149 g R vízmentes nátrium-szulfátot R vízzel 100,0 mlre oldunk. Az oldat 10,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. A hígított oldat 1,0 ml-ét 150 mm hosszú és 16 mm belső átmérőjű kémcsőbe töltjük, majd melegítőblokkban 90–95 °C-on elpárologtatjuk, és a maradékot 1,0 ml R perklórsavban oldjuk. A kémcsöveket, üveggyapot-pamattal lazán ledugaszolva melegítőblokkban vagy szilikonolaj fürdőben 180 °C-on addig melegítjük, amíg tiszta, színtelen folyadékot nem kapunk (kb. 12 óra). Ezután a kémcsöveket kiemeljük és szobahőmérsékletre hűtjük. Mindkét kémcsőbe R bárium-klorid 33,3 g/l töménységű oldatából 3,0–3,0 ml-t töltünk, a kémcsöveket lezárjuk, erőteljesen
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 5
összerázzuk, majd 30 percig állni hagyjuk. Ezután mindegyik kémcsövet még egyszer összerázzuk, és R vizet használva kompenzáló folyadékként, 660 nmen mérjük az oldatok abszorbanciáját (2.2.25). A vizsgálati oldat abszorbanciája nem lehet nagyobb, mint az összehasonlító oldaté (1%). Nukleinsavak. 260 nm-en az S oldat abszorbanciája (2.2.25) legfeljebb 0,5 lehet. Fehérje: legfeljebb 0,3%; parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag esetében legfeljebb 0,1%. Vizsgálati oldat (a). A vizsgálandó anyagból R vízzel – szárított anyagra vonatkoztatva – kb. 10 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Vizsgálati oldat (b). Az a) vizsgálati oldatból és R vízből 1+1 térfogatarányú elegyet készítünk. Összehasonlító oldatok. R szarvasmarha albuminból R vízzel 0,5 mg/ml töménységű alapoldatot készítünk. Az alapoldatból öt hígítást készítünk; a hígítások R szarvasmarha albuminra vonatkoztatott koncentrációja 5 és 50 g/ml között legyen. Kémcsövekbe egyenként 2,5 ml R vizet (üres kísérlet), 2,5 ml a) vizsgálati oldatot, 2,5 ml b) vizsgálati oldatot, illetve 2,5 ml összehasonlító oldatot mérünk, majd a kémcsövek tartalmához 2,5 – 2,5 ml frissen készített R3 réz(II)-tartarát–oldatot elegyítünk. Kb. 10 perc elteltével frissen készített R foszfor-molibdén-volfrámvsav–reagens és R víz egyenlő térfogatarányú elegyének 0,50–0,50 ml-ét elegyítjük a kémcsövek tartalmához. 30 perc múlva 750 nm-en mérjük az oldatok abszorbanciáját (2.2.25) az üres kísérleti oldattal szemben. Az öt összehasonlító oldattal nyert kalibrációs görbe segítségével meghatározzuk a vizsgálati oldatok fehérjetartalmát. Klorid (2.4.4): legfeljebb 0,5%. 67 mg anyagot 100 ml R vízben oldunk. Vas: legfeljebb 80,0 ppm. Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, II. módszer). Vizsgálati oldat. 0,25 g szárított anyagnak megfelelő mennyiségű vizsgálandó anyagot 1 ml R tömény salétromsavban vízfürdőn melegítéssel oldunk. Az oldatot lehűtjük és R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldatok. A vizsgálati oldattal azonos módon két összehasonlító oldatot készítünk, de 1,0 ill. 2,0 ml R vas–mértékoldatot (10 ppm Fe) adva a feloldott vizsgálandó anyaghoz. Fényforrás: vas alkalmazásával.
vájtkatód lámpa, 0,2 nm-es
Hullámhossz: 248,3 nm.
spektrális sávszélesség
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 6
Atomizáló egység: acetilén–levegő láng. Nehézfémek (2.4.8/F). legfeljebb 20 ppm; legfeljebb 10 ppm, parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag esetében. 1,0 g anyagot vizsgálunk. Az összehasonlító R ólommértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük.
oldatot
2,0 ml
Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 20,0%. 0,500 g anyagot R foszfor(V)oxid felett, 6 órán keresztü, 100–110 °C-on szárítunk. Mikrobiológiai szennyezés TAMC: elfogadhatósági követelmény: 102 CFU /g (2.6.12). A vizsgálathoz 1 g vizsgálandó anyagot használunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 0,05 NE/mg, parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag esetében, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást; kevesebb, mint 0,5 NE/mg, intraokuláris vagy intraartikuláris gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag esetében, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást. TARTALMI MEGHATÁROZÁS A glükuronsavtartalmat karbazolos reakcióval határozzuk meg az alábbiakban leírt módon. A-reagens. 0,95 g R dinátrium-tetraborátot 100,0 ml R tömény kénsavban oldunk. B-reagens. 0,125 g R karbazolt 100,0 ml R etanolban oldunk. Vizsgálati oldat. Három párhuzamos oldatot készítünk. A vizsgálandó anyag 0,170 g-ját R vízzel 100,0 g-ra oldjuk. Az oldat 10,0 g-ját R vízzel 200,0 g-ra egészítjük ki. Összehasonlító alapoldat. R foszfor(V)-oxid felett csökkentett nyomáson tömegállandóságig szárított (2.2.32) R D-glükuronsav 0,100 g-ját R vízzel 100,0 g-ra oldjuk. Összehasonlító oldatok. Az összehasonlító alapoldatból öt hígítást készítünk, úgy, hogy a hígítások R D-glükuronsavra vonatkoztatott koncentrációja 6,5– 65,0 g/g között legyen. 1-től 25-ig számozott, 25 kémcsövet jeges vízbe helyezünk. Az öt összehasonlító oldat mindegyikéből háromszor 1,0 ml-t mérünk az 1-től 15-ig számozott kémcsövekbe (összehasonlító kémcsövek), a három vizsgálati oldat mindegyikéből háromszor 1,0 ml-t mérünk a 16-tól 24-ig számozott kémcsövekbe (minta kémcsövek). A 25. kémcsőbe 1,0 ml R vizet töltünk (üres
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 7
kísérlet). Ezután 5,0–5,0 ml frissen készített, jeges vízben lehűtött A-reagenst pipettázunk mindegyik kémcsőbe. A kémcsöveket műanyag kupakkal szorosan lezárjuk, és összerázás után pontosan 15 percre vízfürdőre helyezzük, majd jeges vízben lehűtjük és mindegyikbe 0,20 ml B-reagenst mérünk. Újból lezárjuk a kémcsöveket, összerázzuk és ismét vízfürdőre helyezzük pontosan 15 percre. Ezután az oldatokat szobahőmérsékletre hűtjük és 530 nm-en mérjük az abszorbanciákat (2.2.25) az üres oldattal szemben. Az egyes összehasonlító oldatok abszorbanciáinak középértékével készített kalibrációs görbe segítségével meghatározzuk a vizsgálati oldatok D-glükuronsavkoncentrációinak átlagértékét. A nátrium-hialuronát százalékos tartalmát az alábbi kifejezésből számítjuk ki: cg cs
Z
100 401,3 100 h 194,1
ahol cg
=
a D-glükuronsav koncentrációk átlaga a vizsgálati oldatokban (mg/g);
cs
=
a vizsgálandó anyag koncentrációinak átlaga a vizsgálati oldatokban (mg/g);
Z
=
az R D-glükuronsavra megállapított százalékos C6H10O7tartalom,
h
=
szárítási veszteség;
401,3 =
a diszacharid-fragmens relatív molekulatömege,
194,1 =
a glükuronsav relatív molekulatömege.
ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytől és nedvességtől védve. Amennyiben az anyag steril, úgy légmentesen záró, garanciazáras tartályban.
FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni:
a belső viszkozitást;
az anyag eredetét;
hogy az anyag mely célra használható;
adott esetben, hogy az anyag alkalmas parenterális alkalmazásra, az intraartikuláris alkalmazást kivéve;
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3. - 8
adott esetben, hogy az anyag alkalmas parenterális alkalmazásra, beleértve az intraartikuláris alkalmazást is;
adott esetben, hogy az anyag alkalmas intraokuláris alkalmazásra.
