Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 1
01/2008:1472
NATRII HYALURONAS Nátrium-hialuronát
(C14H20NNaO11)n [9067-32-7] DEFINÍCIÓ A nátrium-hialuronát a hialuronsav nátriumsója. A hialuronsav D-glükuronsav és N-acetil-D-glükózamin diszacharid-egységekből álló glükózaminoglükán. Tartalom: 95,0–105,0% (szárított anyagra). Belső viszkozitás: a feliraton megadott érték 90–120%-a. ELŐÁLLÍTÁS A nátrium-hialuronát kakastaréjból történő kivonással vagy Streptococcusokból, (Lancefield A és C csoportokból) fermentálással nyerhető. Amennyiben Gram-pozitív baktériumok fermentálásával állítják elő, az eljárásnak bizonyítottan csökkentenie kell vagy ki kell küszöbölnie a sejtfal pirogén, illetve gyulladáskeltő anyagait. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, igen nedvszívó por, illetve rostos halmazok.
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 2
Oldékonyság: vízben mérsékelten oldódik vagy oldódik; acetonban és vízmentes etanolban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: nátrium-hialuronát Ph..Eur. referenciaspektrummal. B. A nátriumion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.
VIZSGÁLATOK S oldat. 0,10 g szárított anyagnak megfelelő mennyiségű vizsgálandó anyaghoz R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatának 30,0 ml-ét adjuk, majd a keveréket rázógépen, oldódásig kíméletesen kevertetjük (kb. 12 óra). Az oldat külleme. Az S oldat tiszta legyen (2.2.1). 600 nm-en az S oldat abszorbanciája (2.2.25) legfeljebb 0,01 lehet. pH (2.2.3): 5,0–8,5. A vizsgálandó anyagból R szén-dioxid-mentes vízzel – szárított anyagra vonatkoztatva – 5 mg/l töménységű oldatot készítünk. Belső viszkozitás. A nátrium-hialuronát erősen nedvszívó, a bemérés során nedvességtől védeni kell. Tompítóoldat (0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 M foszfát–tompítóoldat (pH 7,0)). 0,78 g R nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrátot és 4,50 g R nátriumkloridot R vízzel 500,0 ml-re oldunk (A-oldat). 1,79 g R dinátrium-hidrogénfoszfát-dodekahidrátot és 4,50 g R nátrium-kloridot R vízzel 500,0 ml-re oldunk (B-oldat). Az A- és a B-oldatot pH 7,0 eléréséig elegyítjük. Az elegyet zsugorított üvegszűrőn (4) megszűrjük. Vizsgálati oldat (a). A vizsgálandó anyag 0,200 g-ját (m0p) lemérjük (MEGJEGYZÉS: ez csak tájékoztató érték, és az a) vizsgálati oldat első viszkozitásmérési eredménye alapján pontosítani kell) és 50,0 g (m0s) 4 °C-os tompítóoldattal 24 órán át 4 °C-on rázatjuk. Az így nyert oldat 5,00 g-ját (mlp) 100,0 g (mls) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. A hígított oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük.
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 3
Vizsgálati oldat (b). Az a) vizsgálati oldat 30,0 g-ját (m2p) 10,0 g (m2s) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. A hígított oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük. Vizsgálati oldat (c). Az a) vizsgálati oldat 20,0 g-ját (m3p) 20,0 g (m3s) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. A hígított oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük. Vizsgálati oldat (d). Az a) vizsgálati oldat 10,0 g-ját (m4p) 30,0 g (m4s) 25 °C-os tompítóoldattal hígítjuk. A hígított oldatot 20 percig rázatjuk, majd zsugorított üvegszűrőn (100) szűrjük. A szüredék első 10 ml-ét elvetjük. Meghatározzuk a tompítóoldat (t0), valamint a négy vizsgálati oldat átfolyási idejét (t1, t2, t3 és t4) 25,00 ± 0,03 °C-on (2.2.9). A méréshez alkalmas Ubbelohde féle függőszintes kapilláris viszkozimétert használunk, tölcsér alakú kapillárisvéggel (jellemzői: műszerállandó kb. 0,005 mm2/s2, kinematikai viszkozitástartomány 1–5 mm2/s2, az R kapilláris belső átmérője 0,53 mm, a C gömb térfogata 5,6 ml, az N cső belső átmérője 2,8–3,2 mm). Valamennyi mérést ugyanazzal a viszkoziméterrel végezzük. Az átfolyási időt három párhuzamos méréssel állapítjuk meg. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az egyes mérések legfeljebb 0,35%-kal térnek el az átlagtól és ha t1 értéke t0 értékének 1,6–1,8-szerese. Ellenkező esetben változtatni kell az m0p tömeget, és meg kell ismételni a vizsgálatot. A relatív viszkozitások kiszámítása Minthogy a nátrium-hialuronát oldatok és az oldószer sűrűsége csaknem egyenlő, az ηri relatív viszkozitások (ηr1, ηr2, ηr3 és ηr4) kiszámíthatók a megfelelő oldatok ti kifolyási időinek (t1, t2, t3 és t4) és az oldószer t0 átfolyási idejének arányából, de számításba kell venni a kapillárisra vonatkozó kinetikus energia korrekciós tényezőt (B = 30 800 s3), az alábbiak szerint:
B t i2 η ri = B t0 − 2 t0 ti −
A koncentrációk kiszámítása Az a) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c1 koncentrációjának kiszámítása:
Natrii hyaluronas
c1 = m0 p ⋅
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 4
m1 p x 100 − h 1 ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ρ 25 100 100 m0 p + m0 s m1 p + m1s
ahol x = a „Tartalmi meghatározás” százalékos nátrium-hialuronát-tartalom,
pont
szerint
h
=
szárítási veszteség (%),
ρ25
=
1005 kg/m3 (a vizsgálati oldat sűrűsége 25 °C-on).
megállapított
A b) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c2 koncentrációjának kiszámítása: c2 = c1 ⋅
m2 p m2 s + m2 p
A c) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c3 koncentrációjának kiszámítása: c3 = c1 ⋅
m3 p m3 s + m3 p
A d) vizsgálati oldatban levő nátrium-hialuronát kg/m3-ben kifejezett c4 koncentrációjának kiszámítása: c4 = c1 ⋅
m4 p m4 s + m4 p
A belső viszkozitás kiszámítása A belső viszkozitást (η) a legkisebb négyzetek elvén alapuló lineáris regressziós analízissel, a Martin egyenlet alkalmazásával számítjuk ki:
⎛ η −1 ⎞ log ⎜ r ⎟ = log [η ] + k [η ] c ⎝ c ⎠
A m3/kg-ban kifejezett belső viszkozitást a tengelymetszet tízes alapú hatványértéke adja meg. Szulfatált glükózaminoglükánok. Amennyiben a termék kakastaréjból történő kivonással készült, meg kell felelnie az alábbi követelménynek is.
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 5
Perklórsavval, magasabb hőmérsékleten végzett műveleteknél megfelelő biztonsági intézkedésekre van szükség. Vizsgálati oldat. 50,0 mg szárított anyagnak megfelelő mennyiségű vizsgálandó anyagot egy 150 mm hosszú, 16 mm belső átmérőjű kémcsőbe mérünk és 1,0 ml R perklórsavban oldunk. Összehasonlító oldat. 0,149 g R vízmentes nátrium-szulfátot R vízzel 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 10,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. A hígított oldat 1,0 ml-ét 150 mm hosszú és 16 mm belső átmérőjű kémcsőbe töltjük, majd melegítőblokkban 90–95 °C-on elpárologtatjuk, és a maradékot 1,0 ml R perklórsavban oldjuk. A kémcsöveket, üveggyapot-pamattal lazán ledugaszolva melegítőblokkban vagy szilikonolaj-fürdőben 180 °C-on addig melegítjük, amíg tiszta, színtelen folyadékot nem kapunk (kb. 12 óra). Ezután a kémcsöveket kiemeljük, és szobahőmérsékletre hűtjük. Mindkét kémcsőbe R bárium-klorid 33,3 g/l töménységű oldatából 3,0–3,0 ml-t töltünk, a kémcsöveket lezárjuk, erőteljesen összerázzuk, majd 30 percig állni hagyjuk. Ezután mindegyik kémcsövet még egyszer összerázzuk, és R vizet használva kompenzáló folyadékként, 660 nm-en mérjük az oldatok abszorbanciáját (2.2.25). A vizsgálati oldat abszorbanciája nem lehet nagyobb, mint az összehasonlító oldaté (1%). Nukleinsavak. 260 nm-en az S oldat abszorbanciája (2.2.25) legfeljebb 0,5 lehet. Fehérje: legfeljebb 0,3%; parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag esetében legfeljebb 0,1%. Vizsgálati oldat (a). A vizsgálandó anyagból R vízzel – szárított anyagra vonatkoztatva – kb. 10 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Vizsgálati oldat (b). Az a) vizsgálati oldatból és R vízből 1 + 1 térfogatarányú elegyet készítünk. Összehasonlító oldatok. R szarvasmarha albuminból R vízzel 0,5 mg/ml töménységű alapoldatot készítünk. Az alapoldatból öt hígítást készítünk; a hígítások R szarvasmarha albuminra vonatkoztatott koncentrációja 5 és 50 μg/ml között legyen. Kémcsövekbe egyenként 2,5 ml R vizet (üres kísérlet), 2,5 ml a) vizsgálati oldatot, 2,5 ml b) vizsgálati oldatot, illetve 2,5 ml összehasonlító oldatot mérünk, majd a kémcsövek tartalmához 2,5–2,5 ml frissen készített R3 réz(II)tartarát–oldatot elegyítünk. Kb. 10 perc elteltével R víz és frissen készített
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 6
R foszfor-molibdén-volfrámsav–reagens egyenlő térfogatarányú elegyének 0,50–0,50 ml-ét elegyítjük a kémcsövek tartalmához. 30 perc múlva az üres kísérleti oldattal szemben 750 nm-en mérjük az oldatok abszorbanciáját (2.2.25). Az öt összehasonlító oldattal nyert kalibrációs görbe segítségével meghatározzuk a vizsgálati oldatok fehérjetartalmát. Klorid (2.4.4): legfeljebb 0,5%. 67 mg anyagot 100 ml R vízben oldunk. Vas: legfeljebb 80 ppm. Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, II. módszer). Vizsgálati oldat. 0,25 g szárított anyagnak megfelelő mennyiségű vizsgálandó anyagot 1 ml R tömény salétromsavban vízfürdőn melegítéssel oldunk. Az oldatot lehűtjük és R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldatok. A vizsgálati oldattal azonos módon két összehasonlító oldatot készítünk, de 1,0 ill. 2,0 ml R vas–mértékoldatot (10 ppm Fe) adva a feloldott vizsgálandó anyaghoz. Fényforrás: vas vájtkatód lámpa, 0,2 nm-es spektrális sávszélességel. Hullámhossz: 248,3 nm. Atomizáció: acetilén–levegő lánggal. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 20,0%. 0,500 g anyagot R foszfor(V)oxid felett, 100–110 °C-on 6 órán keresztül szárítunk. Mikrobiológiai szennyezés. Összes életképes aerob mikroorganizmus szám (2.6.12): legfeljebb 102 mikroorganizmus/g. A vizsgálathoz 1 g vizsgálandó anyagot használunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14). A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag szennyezettsége – abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást – kevesebb legyen, mint 0,5 NE/mg. Az intraokuláris vagy intraartikuláris gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag szennyezettsége – abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást – kevesebb legyen, mint 0,05 NE/mg.
TARTALMI MEGHATÁROZÁS
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 7
A glükuronsavtartalmat karbazolos reakcióval határozzuk meg az alábbiakban leírt módon. A-reagens. 0,95 g R dinátrium-tetraborátot 100,0 ml R tömény kénsavban oldunk. B-reagens. 0,125 g R karbazolt 100,0 ml R etanolban oldunk. Vizsgálati oldat. Három párhuzamos oldatot készítünk. A vizsgálandó anyag 0,170 g-ját R vízzel 100,0 g-ra oldjuk. Az oldat 10,0 g-ját R vízzel 200,0 g-ra egészítjük ki. Összehasonlító alapoldat. R foszfor(V)-oxid felett csökkentett nyomáson tömegállandóságig szárított (2.2.32) R D-glükuronsav 0,100 g-ját R vízzel 100,0 g-ra oldjuk. Összehasonlító oldatok. Az összehasonlító alapoldatból öt hígítást készítünk olyan módon, hogy a hígítások R D-glükuronsavra vonatkoztatott koncentrációja 6,5–65,0 μg/g között legyen. 1-től 25-ig számozott, 25 kémcsövet jeges vízbe helyezünk. Az öt összehasonlító oldat mindegyikéből háromszor 1,0 ml-t mérünk az 1-től 15-ig számozott kémcsövekbe (összehasonlító kémcsövek), a három vizsgálati oldat mindegyikéből háromszor 1,0 ml-t mérünk a 16-tól 24-ig számozott kémcsövekbe (minta kémcsövek). A 25. kémcsőbe 1,0 ml R vizet töltünk (üres kísérlet). Ezután 5,0–5,0 ml frissen készített A-reagenst pipettázunk mindegyik kémcsőbe. A kémcsöveket műanyag kupakkal szorosan lezárjuk, és összerázás után pontosan 15 percre vízfürdőre helyezzük, majd jeges vízben lehűtjük és mindegyikbe 0,20 ml B-reagenst mérünk. Újból lezárjuk a kémcsöveket, összerázzuk, és pontosan 15 percre ismét vízfürdőre helyezzük. Ezután az oldatokat szobahőmérsékletre hűtjük és 530 nm-en mérjük az abszorbanciákat (2.2.25) az üres oldattal szemben. Az egyes összehasonlító oldatok abszorbanciáinak középértékével készített kalibrációs görbe segítségével meghatározzuk a vizsgálati oldatok D-glükuronsav-koncentrációinak átlagértékét. A nátrium-hialuronát százalékos tartalmát az alábbi kifejezésből számítjuk ki:
cg cs
⋅Z ⋅
100 401,3 ⋅ 100 − h 194,1
ahol = cg (mg/g),
a D-glükuronsav koncentrációk átlaga a vizsgálati oldatokban
Natrii hyaluronas
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.0. - 8
cs = a vizsgálandó anyag koncentrációinak átlaga a vizsgálati oldatokban (mg/g), Z = tartalom,
az R D-glükuronsavra megállapított százalékos C6H10O7-
h
szárítási veszteség,
=
401,3 =
a diszacharid-fragmens relatív molekulatömege,
194,1 =
a glükuronsav relatív molekulatömege.
ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytől és nedvességtől védve. Amennyiben az anyag steril, úgy légmentesen záró, garanciazáras tartályban. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: −
a belső viszkozitást,
−
az anyag eredetét,
−
hogy az anyag mely célra használható,
−
adott esetben, hogy az anyag alkalmas parenterális alkalmazásra, az intraartikuláris alkalmazást kivéve,
−
adott esetben, hogy az anyag alkalmas parenterális alkalmazásra, beleértve az intraartikuláris alkalmazást is,
−
adott esetben, hogy az anyag alkalmas intraokuláris alkalmazásra.
