Nádorové markery vèera, dnes a zítra (1.èást)

Prof. MUDr. Jaroslav Masopust, DrSc. Ústav klinické biochemie a patobiochemie, 2. lékaøská fakulta, Univerzita Karlova v Praze

Nádorové markery vèera, dnes a zítra (1.èást) Rakovina, správnìji nádorové onemocnìní, je stará jako život sám; mùže se v urèité formì objevit u všech vícebunìèných organismù (živoèichù i rostlin). Byly nalezeny známky probìhlých nádorù lebky u pravìkých lidí nebo nádorù prsu u egyptských mumií 5000 let starých. Antické Øecko v osobì lékaøe Hippokrata jí dalo dokonce jméno „CANCER“. Laboratorní prùkaz nádorového onemocnìní se objevuje v odborné literatuøe už od poloviny 19. století, kdy ve støední Evropì zaèal vznikat obor klinické chemie. V té dobì nebyla ještì k dispozici laboratorní technika, takže testy spoèívaly na jednoduchých fyzikálnì chemických reakcích. Jako pøíklad mohu uvést prùkaz vzniku krystalkù kyseliny moèové, které se vytvoøí na bavlnìném vláknu ponoøeném jedním koncem do séra pacienta ve fázi tumorolýzy (kupø. pøi náhlém rozpadu blastù u chronické myeloidní leukemie). Dalším markerem pocházejícím z této doby je prùkaz tzv. Bence Jonesovy bílkoviny v moèi pøi zkoušce varem (Henry Bence Jones, 1845) (Zaèíná precipitovat pøi teplotì kolem 80°C a znovu se rozpouští pøi 90°C). Podstata této reakce nebyla tehdy vùbec známa, ale prùkaz a stanovení tohoto proteinu (monoklonální lehké øetìzce imunoglobulinù) citlivými a specifickými metodami patøí mezi dùležité testy v diferenciální diagnostice monoklonálních gamapatií. Od poèátku druhé poloviny 20. století nastává skuteèný rozmach studia vyšetøování tumorových markerù. U nás byla v té dobì velmi populární Brdièkova polarografická reakce. Po fyzikálnì chemické stránce šlo o polarografický záznam tzv. bílkovinné dvojvlny v nárazníkových roztocích solí Co. Její podstatou je katalýza vývinu vodíku vlivem sulfhydrylových 4

Labor Aktuell

a disulfidických skupin v bílkovinách zbývajících ve filtrátu po precipitaci kyselinou sulfosalicylovou. I když pùvodnì to mìl být test na „rakovinu“, už Brdièka upozoròoval, že mùže být pozitivní i u nenádorových onemocnìní (zánìty, žaludeèní vøed, infarkt myokardu atd.). Jak píše Homolka ve své „Klinické biochemii“ z roku 1969: Pozitivita Brdièkovy reakce u pacienta v klidovém stavu, bez teplot a s negativním klinickým nálezem nás bude vždy nutit, abychom mysleli na skrytý chorobný proces a eventuálnì nádor; negativita reakce však nebude takovýto proces vyluèovat. (Obr. 1)

Obr. 1: Polarografický záznam Brdièkovy filtrátové reakce

V té dobì byl navržen Sáblíkem komplex biochemických a hematologických testù (dvì desítky nespecifických bìžných vyšetøení) jako skríning nádorových onemocnìní. Komplexní test se pro nákladnost a malou výtìžnost neujal. Zato na publicitì získal prùkaz skrytého (okultního) krvácení ve stolici jako skríning kolorektálního karcinomu. Technika byla postupem èasu zdokonalena jak co do vyšší specifiènosti pro prùkaz krvácení z dolních úsekù støeva, tak co do odstranìní falešnì pozitivity, zpùsobené pøítomností nehemoglobinových látek dávajících peroxidasovou reakci.

Pøelom a nastartování rozvoje vyšetøování tumorových markerù nastal výzkumem tzv. nádorových antigenù tj. látek, kterými se liší nádorová buòka od buòky nebo tkánì zdravé. Ukázalo se však, že tento ideální princip je tìžko splnitelný, protože malé množství takovýchto antigenù, i když øádovì odlišné, tvoøí i buòky zdravé nebo nenádorové. Je to zpùsobeno podstatou vzniku nádorového onemocnìní. Dnes se totiž na nì díváme jako na genetické onemocnìní, pøi nìmž pøechod normální tkánì do stavu invazivní nádorové choroby trvá obvykle 5 - 10 let. Ovlivòují to jednak hereditární genetické faktory, jednak epigenetické zmìny. Progresi podporuje postupné (!) hromadìní zmìn, které navozují neregulovaný rùst, kupø. trvalou aktivací signální transdukce rùstového stimulu, alteraci kritických bodù bunìèného cyklu dìlení, deregulaci transkripèních faktorù, inhibici apoptózy, podporu nádorové angiogeneze a invazivity. (Obr. 2) Exprese genetických zmìn ale zaèíná v jedné nebo nìkolika málo buòkách (monoklonální teorie). Jde o nìkolikastupòový proces, kdy na úrovni chromosomù dochází k postupnému nahromadìní mutací (alterací) genù, kontrolujících proliferaci (dìlení), diferenciaci a zánik bunìk. První mutace znamená „proces vykopnutí“. Buòky s první (1.) a druhou (2.) mutací postupnì v nádorové tkáni pøerùstají nebo nahrazují buòky s 1. mutací. Další mutace (3., 4., ...) podnìcují bunìènou populaci k vìtší agresivitì. Subklonální genetická heterogenita nádoru je odrazem postupujícího vývoje nádorové tkánì. (Obr. 3) Aèkoli nìkteré formy nádorù jsou dìdièné (familiární nádorová onemocnìní),

ru je dostateèný pøísun živin a kyslíku, který musí být zajištìn vytvoøením cévního zásobení (nádorová neoangiogeneze). To co bylo øeèeno o postupném vývoji zmìn, které v koneèném stádiu vyústí do klinické formy tj. vlastního nádorového onemocnìní, znamená, že nádorové markery jsou rùzného druhu a mají i rùzný význam (informují o urèité situaci), jak vyplývá z jejich širší definice. Nádorové markery jsou laboratornì prokazatelné známky v biologických tekutinách, tkáních nebo buòkách, pomocí kterých je možno prokázat: - riziko vzniku, - pøítomnost - prognózu - úèinnost (škodlivost) terapie, - vznik metastáz nebo reziduální choroby nádorového onemocnìní. Obr. 2: Schéma vývoje tumorigeneze

vìtšina vzniká na podkladì mutace somatických bunìk a je zpùsobena endogenními chybami v replikaci DNA nebo jsou zmìny vedoucí k maligní transformaci navozeny úèinkem vnìjších podmínek (kancerogeny, virogeny, radiace). Jedna genetická zmìna však nestaèí navodit maligní transformaci buòky; ta obvykle vzniká až po nìkolika (5ti až 10ti) genových mutacích v prùbìhu øady let. Genová alterace vede ke vzniku nádorového fenotypu, kupø.: proliferace epitelové buòky → hyperplazie → adenom → dysplazie → karcinom „in situ“ → karcinom invazivní. Tento proces mùže trvat i øadu let. Prùbìh kancerogeneze bývá èlenìn do tøí stádií: (1) Iniciaèní stádium, které pøedstavuje prvotní genetickou událost, tj. mutaci urèitého kritického genu. Jde o období èasovì krátké, ale nevratné; iniciovaným buòkám pøináší rùstovou selekèní výho-

Obr.3: Klonální vývoj nádorových bunìk

du. Buòka tak získává potenciál maligní transformace; v tomto stádiu se mùže proces zastavit. (2) Promoèní stádium, které trvá léta, až desetiletí; postižené buòky (klon) jsou stimulovány ještì k intenzivnìjší proliferaci. Promoèní faktory samy o sobì nejsou však schopny vyvolat maligní nádorovou transformaci, jen ji podpoøit. Intenzita promoèních mechanismù musí dosáhnout urèitého stupnì, aby byl iniciovaný klon stimulován, a naopak odstranìní podpùrných faktorù mùže proces kancerogeneze zpomalit nebo i zastavit. (3) Stádium progrese je charakterizováno dalším postupným nahromadìním genetických i epigenetických zmìn. Nádor zùstává nejprve v místì svého vzniku, ale aktivací dalších faktorù se zaène šíøit do nejbližšího okolí (invaze) a cestou krevního obìhu na místa vzdálená (metastázy). Velmi dùležitou podmínkou pro rùst nádo-

Mùžeme je klasifikovat do nìkolika typù: (Tab. 1.)

Onkofetální antigeny Jde o proteiny, které mají svou fyziologickou funkci v embryonálním a fetálním období; po narození se jejich koncentrace v biologických tekutinách a tkáních výraznì sníží, ale v urèitém množství pøetrvává i nadále. Objeví se znovu se stoupající tendencí u nìkterých nádorù. Typickým pøedstavitelem je α1-fetoprotein (AFP), bílkovina, která u embryí tvoøí v krevní plasmì nejvìtší frakci, ve fetálním období je druhá za albuminem; po narození se velmi rychle snižuje a koncem 1. roku života je prokazatelná jen citlivými metodami (do 10 µg/l oproti 3 g/l u 14. týdenního fétu). Zvýšená produkce nastupuje zejména u primárních nádorù jater (hepatoblastom, hepatocelulární karcinom), u nìkterých embryonálních nádorù (teratoblastomy resp. nádory žloutkového váèku jako jsou nìkteré germinální tumory, vzácnì pak nìkteré karcinomy pankreatu a gastrointestinálního traktu). Jde o nádory, které vznikly maligní transformací bunìk produkujících v urèité fázi fetoprotein fyziologicky tj. buòky primitivního coelomu, buòky žloutkového váèku a hepatoblasty (viz tab. 2.). Odráží se to i ve fylogenezi: Játra jsou hlavním producentem AFP u savcù; u ptákù je to žloutkový váèek a u ryb støevo. Fetoprotein z hepatoblastù a fetoprotein z bunìk žloutkového váèku se liší ve Labor Aktuell

5

Onkoplacentární antigeny Tato skupina zahrnuje markery, které jsou produkovány za fyziologických okolností pøedevším buòkami trofoblastu a syncytiotrofoblastu; progresivnì se zvyšující hladina v cirkulaci pak mùže být známkou nìkterých nádorù (choriokarcinom, germinální nádory varlete, ménì èasto pankreatu, gastrointestinálního traktu, plic). Patøí sem lidský choriový gonadotropin (hCG) respektive nìkteré jeho fragmenty (volná β-podjednotka − β-hCG), SP-1-glykoprotein a další placentární proteiny. Rovnìž isoenzymy onkoplacentární alkalické fosfatasy (Reganùv nebo Nagao isoenzym prokazovaný u nìkterých hepatocelulárních karcinomù).

CA-antigeny

Tab. 1:

složení postranního sacharidového øetìzce. Projevuje se to rùznou afinitou k nìkterým lektinùm (konkanavalin A), což je možno použít i v diferenciální diagnostice. α1-fetoprotein se však mùže objevit ve zvýšené koncentraci i u nenádorových onemocnìní. Znaèné zvýšení provází virovou hepatitidu kojencù (hodnoty pøes 1000 g/l nejsou vzácností). Vysvìtluje se to tím, že hepatotrofní viry nabudí zvýšenou syntézu fetoproteinu v ostrùvcích hepatoblastù, které pøetrvávají v „dospìlé“ jaterní tkáni ještì krátce po narození. Rovnìž regenerující se jaterní tkáò se vyznaèuje vyšší produkcí fetoproteinu. Zvýšená hladina u tìhotných žen má svùj pùvod ve fetálních játrech. Vyšetøení AFP jako rizikového faktoru pro sekundární prevenci hepatocelulárního karcinomu má význam u pacientù s chronickou hepatitidou B nebo C a dále v nìkterých populacích Afriky a Asie.

Karcinoembryonální antigen (CEA) Je to rodina glykoproteinù s podobnými vlastnostmi, která pùvodnì sloužila jako marker kolorektálního karcinomu (Gold a Freedman, 1965). Brzy se však ukázalo, že je zvýšen u adenokarcinomu pankreatu a dalších nádorù trávicího ústrojí. V další klinické studie jej nalezli nejen u vìtšiny karcinomù (plic, mléèné žlázy, žluèníku,

6

Labor Aktuell

dìlohy, vajeèníkù, varlat, prostaty, moèového mìchýøe, ledvin, štítné žlázy, laryngu a hypofaryngu, meduloblastomu, glio-

Jde o poèetnou skupinu glykoproteinù mucinózního charakteru (CA je zkratka od „carbohydrate antigens“ nebo „carcinoma antigens“, èíslo za ní pak èíslo šarže vy-

Tab. 2: Hlavní místa tvorby α1-fetoproteinu v prùbìhu ontogeneze a fylogeneze ve vztahu k AFP-pozitivním nádorùm

blastomu), ale též u øady benigních afekcí (jaterní cirhóza, mamopatie, ulcerózní kolitida, plicní emfyzém) nebo u zdravých jedincù (kupø. kuøáci). Jeho patologické zvýšení se však objevuje až v pozdìjších stádiích nádorového onemocnìní; nehodí se proto pro skríning, ale mùže být dobrým prognostickým ukazatelem. Protilátka proti CEA znaèená isotopem byla použita i k lokalizaci nádoru v tìle.

brané nejvhodnìjší protilátky), které jsou prokazovány monoklonálními protilátkami pøipravenými pomocí techniky hybridomù. CA 19-9 Glykoproteinový antigen mucinózního typu, pøíbuzný antigenu krevní skupiny Lewis H. Je vyluèován žluèí, proto i mírná cholestáza mùže navodit zvýšení v séru. Patologicky je zvýšen u diferencovaných karcinomù slinivky bøišní, žluèového traktu, tlustého støeva koneèníku, žaludku,

dále u mucinózních karcinomù vajeèníkù, vzácnì u karcinomu endometria, prsu nebo plic. Zvýšení je ale též u nenádorových afekcí pankreatu hepatobiliárního systému (až 20%, u obstrukèního ikteru až 40%), dále u zánìtu støev, vajeèníkù, žaludku (5 - 10%). Asi 5 - 10% jedincù není Lewis-antigen pozitivní a tento antigen neprodukují (chybí enzym fukosyltransferasa, která je tøeba k pøemìnì z prekursoru). U tìchto jedincù na místo CA 19-9 je zvýšen jen prekurzor oznaèovaný jako CA 50. CA 125 Jde o glykoprotein fyziologicky tvoøený buòkami primitivního coelomu. Užívá se pøedevším k diagnostice serózních a nediferencovaných karcinomù ovaria; skríning je doporuèován u žen s hereditárním syndromem ovariálního karcinomu. Je vhodný pro sledování úèinnosti terapie i pro dlouhodobé sledování. Zvýšené hodnoty se vyskytují též u karcinomu prsu, plic nebo pankreatu. Zvyšující se hodnota u karcinomu prsu mùže pøi souèasném pleurálním výpotku signalizovat metastázy do plic. Mùže být však zvýšen u benigních afekcí ovaria, endometria, u hepatopatií a pankreatopatií. CA 15-3 Je to mucinózní glykoprotein produkovaný pøedevším žlázovým epitelem. Je užíván pro monitorování prùbìhu a úspìšnosti terapie karcinomu mléèné žlázy; nehodí se pro diagnostiku èasných fází, ale naopak je velmi vhodným indikátorem progrese (lymfatický systém, kostní metastázy). Èasto bývá zvýšen u nádorù gastrointerstinálního traktu, slinivky bøišní, bronchù, též u gynekologických malignit. Tak jako u vìtšiny nádorových markerù bývá „falešnì“ pozitivní též u nenádorových onemocnìní (hepatopatie, cholangitidy, gynekolologické afekce, mastopatie, nefropatie a další). CA 72-4 Jde glykoprotein mucinózního typu (antigen TAG 72) produkovaný fyziologicky v embryonálním období epitelovými buòkami GIT. Patologického zvýšení se užívá pro monitorování a diferenciální diagnostiku karcinomu žaludku, též dolní tøetiny ezofagu, tlustého støeva, pankreatu, eventuálnì mucinózních karcinomù vajeèníku. „Falešné“ zvýšení mùže být též u benigních afekcí (žaludek, støevo, mléèná žláza).

CA 27.29 Jde o antigen izolovaný z ascitu pøi metastázách karcinomu mléèné žlázy; vykazuje èásteènou shodu s epitopem CA 15-3. Užívá se podobnì jako CA 15-3. (monitorování metastáz karcinomu prsu). CA 549 Je to kyselý glykoprotein mucinózního charakteru, vhodný pro sledování metastazujícího karcinomu prsu; zvýšený bývá též u karcinomu ovaria (až v 50% pøípadù). CA 242 Byl navržen pro monitorování karcinomù pankreatu a tlustého støeva. Vykazuje menší nespecifickou pozitivitu. Další antigeny jako CA M26, CA M29, CA 195 nebo DU-PAN 2, CASA, MSA nejsou u nás bìžnì používané.

Enzymy Malignì transformované buòky tvoøí všechny enzymy, které potøebují ke svému metabolismu. Nìkteré z nich jsou exprimovány ve vìtším množství nebo mají charakter isoenzymù tvoøených v ontogeneticky mladších fázích (embryonální a fetální formy). Do základního spektra patøí neuron-specifická enolasa (NSE). Fyziologicky je tvoøena v nervové a plicní tkáni plodu a v dospìlosti v tkáních neuroendokrinního pùvodu. Zvýšená produkce se vyskytuje u neuroblastomu (ale též u dobøe diferencovaných ganglioneuromù), dále u meduloblastomu, retinoblastomu, feochromocytomu, u apudomù, melanomu, a zejména též u malobunìèných karcinomù plic; nìkdy u karcinoidu, gastrinomu, medulárního karcinomu thyreoidey, u seminomu nebo u adenokarcinomu ledvin a prostaty. Nejèastìjší indikací je sledování progrese neuroblastomu a nemalobunìèných karcinomù plic. Pozor však na možné zvýšení u nenádorových onemocnìní (plíce, játra). Laktátdehydrogenasa (LD) jako ubikviterní enzym je velmi nespecifickým markerem, ale její jiným zpùsobem nevysvìtlitelné zvýšení mùže svìdèit pro nádorové onemocnìní, pøedevším pro hemoblastózu (akutní leukemie, nonhodgkinský lymfom; isoenzym

LD5 bývá u metastáz do jater). Zvýšení bývá pozorováno též u dalších tumorù (neuroblastom, nádory varlete, prsu, GIT). Zvýšení koreluje s progresí nádoru. Isoenzym kreatinkinasy (BB nebo mitochondriální) bývá nalézán u karcinomu prostaty a malobunìèného nádoru plic, vzácnì u dalších malignit. Thymidylátkinasa (TK) katalyzuje fosforylaci thymidinu pomocí ATP na thymidinmonofosfát (TMP), který je klíèovým meziproduktem syntézy DNA. Její aktivita je proto známkou bunìèné proliferace (marker nádorové progrese) a také cílem zásahu nìkterých kancerostatik (5-fluorouracil, methotrexát). Stanovení je užiteèné pøi monitorování prùbìhu lymfomù, leukemií, myelomù, nemalobunìèných nádorù plic nebo tlustého støeva (pozor však na interferenci blokujících lékù). Kathepsiny jsou lyzosomální proteinasy, které odbourávají nepotøebné intracelulární proteiny; také z prohormonù odštìpují aktivní molekulu. Ve zvýšené míøe mohou být produkovány nìkterými nádorovými buòkami (karcinom mléèné žlázy, ovaria, žaludku, laryngu, kolon a rekta). Aktivitu serinové proteinasy má prostatický specifický antigen (PSA). Jeho fyziologickou úlohou je degradace a likvefakce semenogelinu v seminální plasmì

Labor Aktuell

7

pro odstranìní vizkozity, ale též hydrolýza vazebného proteinu-3 pro faktor podobný insulinu (IGFBP-3) a tím uvolnìní rùstového faktoru IGF-1. Patologické zvýšení nastává u karcinomu prostaty, ale též u benigní hypertrofie prostaty. K rozlišení tìchto dvou onemocnìní pøed bioptickým vyšetøením napomáhá stanovení a pomìr forem, v kterých se PSA nalézá po vyplavení do krevního séra. Pøevažující formou v seru je komplex PSA-α1-antichymotryp-

šetøení, masáž, ejakulace, transrektální sono, chirurgický zákrok atd). U karcinomu prostaty je architektura tkánì narušena, takže PSA je secernován pøímo do krevní cirkulace mnohem více než u benigní hypertofie, tím se vysvìtluje vyšší podíl komplexovaného PSA, jehož stanovení, respektive pomìr komplexPSA/celk.PSA má vìtší diskriminaèní hodnotu; nejnovìji pak stanovení enzymaticky aktivního PSA. (Tab. 3)

Tab. 3: Horní limit fyziologické hodnoty PSA v závislosti na vìku (rùzní autoøi)

sin, mnohem ménì je vázáno s α2-makroglobulinem. Volný PSA (fPSA) v séru i v tkáni je inaktivní forma, pravdìpodobnì proenzym (proPSA) nebo inaktivní zralý PSA, respektive enzymaticky naštìpený. Pomìr volný PSA k celkovému PSA (fPSA/tPSA) se užívá jako diskriminátor mezi hypertrofií a karcinomem (hodnoty nad 0,25 svìdèí spíše pro hypertrofii, hodnoty pod 0,16 pro karcinom pøi celkové koncentraci mezi 4 - 10 µg/l). Horní limit sérové hladiny celkového PSA, který je považován za suspektní z nádorového procesu, se liší podle vìku pacienta. Vyšetøení je však nutno provádìt v podmínkách bez pøedcházející (až týden) manipulace nebo dráždìní prostaty (rektální vy-

Byl zaveden i nový termín - BPSA, tj. PSA produkovaný buòkami benigní hypertrofie prostaty nikoliv buòkami karcinomu. U nìkterých pacientù s benigní hypertrofií tvoøí až 50% „volného“ (nekomplexovaného) PSA v séru; u jiných pacientù je to jen nepatrný podíl. Jde o inaktivní formu, pravdìpodobnì PSA naštìpený v místì lysinu-182 a 145. Pro diagnózu reziduální choroby po radikální terapii se užívá supersenzitivní test, který odhalí zvýšení bazálních množství PSA (hodnoty nad 0,1 µg/l jsou podezøelé z návratu choroby). Jako nový prognostický marker je nejnovìji doporuèován chromogranin A (indikátor neuroendokrinní aktivity); hodnoty v séru nad 60 µg/l spolu s hodnota-

mi PSA nad 10 µg/l jsou suspektní z extrakapsulární progrese.

Hormony Nádory vycházející z bunìk s endokrinní aktivitou mohou být hormon-produktivní. Kromì hCG, vyskytující se u nádorové transformace bunìk trofoblastu, je to ACTH produkovaný nìkterými nádory adenohypofýzy (jako prohormon s asi 5procentní biologickou aktivitou), ale také „ektopicky“ tj. mimo bìžnou lokalizaci endokrinní tkánì jako jsou malobunìèné karcinomy plic nebo nìkteré karcinomy pankreatu, žaludku, tlustého støeva a prsu. Kalcitonin je normálnì tvoøený C-buòkami štítné žlázy; jeho patologické zvýšení provází medulární karcinom thyreoidey; jeho hladina koreluje s velikostí nádoru i s výskytem jeho metastáz. Mùže se objevit též u karcinomu plic, jater, prsu, ledvin a též u karcinoidu. Z jiných hormonù produkovaných nádory to je parathyrin nebo parathyrin-like substance, dále, prolaktin, antidiuretický hormon, trijodthyronin, thyroxin, thyreoglobulin, thyreotropin a dlouhá øada dalších. Metabolity hormonù døenì nadledvin jako je stanovení kyseliny vanilmandlové a homovanilové v moèi je velmi užiteèné pro orientaèní diagnostiku neuroblastomu a feochromocytomu. Pro diagnostiku karcinoidu je velmi vhodné stanovení kyseliny 5-hydroxyindoloctové.

ROCHE - mezinárodní události a komentáøe n 16/04/2004 (Indianapolis, Ind.): Další spolupráce Roche Diagnostics a HealthTrust Purchasing Group (HPG). Roche Diagnostics se dohodla na tøíletém prodloužení stávající smlouvy o spolupráci s americkou spoleèností HPG, která je jedním z nejvìtších amerických dodavatelù zdravotnických potøeb, techniky a reagencií a smluvnì spolupracuje s více než 1000 amerických nemocnic, klinik a ambulantních lékaøù. Nová smlouva rozšiøuje spolupráci pøedevším v oblasti POCT a automatizo-

8

Labor Aktuell

vané analýzy moèi (CHESTRIP 101, CHEMSTRIP Criterion II, CHEMSTRIP urine Analyser a Urisys 2400). n 19/04/2004 (Basilej): Výrok soudu: MJ Research, Inc. (USA) zámìrnì vedla své zákazníky k porušování patentových práv Roche Diagnostics. Soud v Connectitutu uznal, že M. a Finneyovi, representující spoleènost MJ Research, Inc., zámìrnì vedli své klienty k porušování klíèových patentových práv Roche Diagnostics v oblasti využí-

vání PCR a souèasnì stanovil výši zpùsobené škody na 13.9 mil. USA dol. Soudní pøi proti MJ Research, Inc. vedli od r. 1998 Roche Diagnostics spoleènì se spoleènostmi Applied Biosystems a Applera Corp. pro porušování patentových práv v oblasti vývoje, výroby a distribuce technologie PCR a thermocyklerù. Další fáze soudní pøe, týkající se nepodloženého obvinìní Roche Diagnostics z porušování antimonopolního zákona, bude projednávána v èervenci 2004.