N022, P009, P511, K604. Doc. RNDr. Milan Gryndler, CSc

Univerzita J. E. Purkyně v Ústí nad Labem Přírodovědecká fakulta

MYKOLOGIE KBI/N022, P009, P511, K604

Doc. RNDr. Milan Gryndler, CSc.

Ústí nad Labem 2013 1

Obor:

1501R001 Biologie, 1501T001 Biologie

Klíčová slova:

Růst hub, fyziologie hub, pěstování hub, genetika hub, anaerobní houby, symbióza, biotechnologie, patogenní houby, toxiny

Anotace:

Houby jsou mikroorganismy s různorodými vlastnostmi, které nacházejí významné využití v řadě biotechnologií, jejich biotechnologický potenciál však pravděpodobně ještě není ani zdaleka využit. V současné době probíhá výzkum vlastností řady druhů hub a hledání dalších možností jejich využití. Předmět se proto zaměřuje zejména na ty aspekty mykologie, které nejsou probírány v jiných předmětech a které jsou důležité teoreticky nebo pro objasnění úlohy hub v přírodě i jejich význam pro člověka (ať už v pozitivním nebo negativním smyslu slova).

2

Mykologie - nauka o houbách Tento text je studijní oporou pro předmět „Mykologie“ vyučovaný na Katedře biologie UJEP. Je inspirací a sumou námětů pro studium, nelze jej v žádném případě považovat za výčet minimálních znalostí, postačujících ke složení zkoušky či získání zápočtu. Předmět předpokládá znalosti získané v kursu „Systém a fylogeneze nižších rostlin“ a navazuje na něj. Logicky by měly být zahrnuty také houby způsobující onemocnění rostlin. Ty jsou však pojednány ve speciálním kursu, takže nebyly zařazeny. K úspěšnému studiu je třeba extenzívní interakce s vyučujícím. Osnova 1. Historie znalostí o houbách 2. Vymezení hub jako skupiny organismů 3. Kolik druhů hub v přírodě existuje? 4. Diverzita hub 5. Fyziologie hub 5. 1. Základní fyziologická charakteristika hub 5. 2. Uhlíkatá výživa hub - zdroj energie 5. 3. Dusík ve výživě hub 5. 4. Další prvky - makroelementy a mikroelementy 5. 5. Organické látky esenciální povahy 5. 6. Těkavé látky - málo prozkoumaný faktor ovlivňující houbový organismus 6. Růst hub 6. 1. Teoretické modely růstu a jejich konfrontace s pozorováním 6. 2. Kvantifikace růstu hub 7. Houby jako destruenti - rozklad složitých organických látek 7. 1. Houby a rozklad lignocelulózového komplexu 7. 2. Bílá a hnědá hniloba dřeva 8. Pěstování hub člověkem 8. 1. Historie pěstování jedlých hub 8. 2. Příprava substrátu a pěstební technologie 8. 3. Teoretické i praktické poznámky k pěstování jedlých hub 9. Některé důležité aspekty genetiky hub 9. 1. Poznámky ke „klasické“ genetice hub 9. 2. Genetický základ sexuality hub 9. 3. Plasmidy hub 9. 4. Genetické manipulace hub 9. 5. Mykoviry 10. Komunikace houbové buňky s prostředím 10. 1. Obecné poznámky 10. 2. Membránové přenašečové systémy hub 10. 3. Jak lze pozorovat transportní pochody na cytoplazmatické membráně? 11. Houbové toxiny 12. Mykorhizní symbióza 12. 1. Obecné poznámky k mykorhizní symbióze 12. 2. Arbuskulární mykorhizní symbióza 12. 3. Orchideoidní mykorhizní symbióza 12. 4. Ektomykorhizní symbióza 12. 5. Erikoidní mykorhizní symbióza 12. 6. Ekologie mykorhizní symbiózy

3

13. Čarodějné kruhy 15. Mykoparasitismus - parasitismus hub na jiných houbách 16. Symbióza hub s živočichy 17. Anaerobní houby 18. Léčivé houby 19. Antibiotika - příklad praktického využití hub: Penicilin 20. Antibiotika - příklad praktického využití hub: Mucidin 21. Houby patogenní pro člověka 22. Biotechnologie využívající houby

1. Historie znalostí o houbách Za prvního mykologa bývá považován Ital P. A. Micheli (1679-1737), který pravděpodobně jako první pozoroval mikroskopem výtrusy kloboukatých hub a spory nižších hub (tzv. plísní) a uvědomil si, že jde o rozmnožovací částice. S houbami záměrně experimentoval - přenášel výtrusy na různé substráty a pozoroval růst mycelia. I když zůstal ve svém poznání dlouho osamocen, položil základy poznání hub jako svébytných organismů s životním cyklem. Houby byly již velmi záhy zkoumány jako původci chorob rostlin, o což se zasloužili Italové G. Targioni-Tozzetti (1712-1783) a F. Fontana (17301805). Šlo o zárodek prakticky orientované disciplíny fytopatologie. Velmi úzký vztah hub a rostlin se také projevil tím, že houby byly zahrnuty do působnosti botaniky a byly považovány za rostliny. Systematická mykologie dostala své základy v pracích C. H. Persoona (1755-1837) a E. M. Friese (1794-1878). Šlo zejména o popisy hub a jejich systematické uspořádání, založené na zpracování nálezů hub v přírodě a na snaze postihnout jejich morfologii. Mykologem světového formátu byl liberecký rodák A. K. J. Corda (1809-1849), který vynikl využitím mikroskopie při studiu hub. Kvalitativní skok zaznamenala mykologie v pracích bratrů Francouzů Ch. Tulasne (18161884) a L. R. Tulasne (1815-1885), kteří věnovali pozornost životním cyklům hub a souvislosti mezi pohlavním a nepohlavním stádiem askomycetů. Současně zaznamenáváme pod vlivem prací L. Pasteura (1822-1895) počátek snah o kultivaci hub za kontrolovaných podmínek a studium hub jako živých, aktivních organismů. V této oblasti se uplatnili H. A. de Bary (1831-1888) a M. S. Voronin (1838-1903). De Bary v roce 1864 objevil pohlavní rozmnožování (gametangiogamii) u houby Rhizopus nigricans. A. F. Blakeslee (1874-1954) definoval pojmy homothalismus a heterothalismus (sexualita se u homothalických hub realizuje v rámci jedince, u heterothalických druhů se realizuje v interakci dvou odlišně laděných jedinců). Na našem území má studium hub dlouhou a bohatou tradici. Kromě již zmíněného A. K. J. Cordy jsou počátky vědecké mykologie neoddělitelné od botanika F. M. Opize (17871858). Tito dva badatelé začali ve spolupráci s amatéry se systematickým studiem mykoflóry našeho území. Pozornost byla věnována i nebezpečným jedovatým houbám, které byly zpracovány v obrazovém atlasu lékaře prof. V. J. Krombholze (1782-1842), na jehož vzniku se podílel jako kreslíř i Corda. Zajímavou osobností české mykologie byl prof. J. Velenovský (1858-1949). Tento nesmírně agilní člověk nasbíral množství mykologického materiálu zejména v okolí

4

Prahy a publikoval dílo nazvané „České houby“, které obsahuje velké množství popisů druhů hub a je bohatě ilustrováno. Ukázalo se bohužel, že jde vesměs o popisy již známých druhů hub a že tedy nejde o popisy platné. Velenovského zanícení pro mykologii, i když působilo v pozdějších obdobích taxonomům potíže, přineslo veliký užitek tím, že se přeneslo na jeho žáka prof. K. Cejpa (1900-1979). Ten měl kromě studia lupenatých hub a nižších hub také široký přehled v mykologické systematice i v dalších aspektech mykologie. Projevilo se to vydáním brilantní dvoudílné učebnice nazvané „Houby“. Tato učebnice, i když je v současnosti v řadě hledisek zastaralá, nebyla dosud překonána co do přehlednosti i detailů podávaných k jednotlivým taxonům. Prof. Cejp byl významným pedagogem, který vychoval řadu následovníků. Ve druhé polovině 20. století se ve světě vyvíjela mykologie ve znamení objevu antibiotika penicilinu, který podnítil zejména studium mikroskopických anamorfních askomycetů. Důležité byly také tragické zkušenosti se závažnými důsledky masivního napadení některých zemědělských plodin houbovými patogeny, které způsobovaly lokální hladomory i v Evropě. Proto se významně rozvíjela také fytopatologie. Nejnověji, zejména v Asii a jmenovitě v Číně, zaznamenáváme bouřlivý rozvoj technologií pěstování jedlých hub a nezanedbatelný význam mají i technologie pěstování některých hub s léčivými účinky. To vše vyžaduje detailní znalosti o životních cyklech a strategiích hub a o jejich ekologii i fyziologii, které jsou dnes získávány s využitím nejmodernějších molekulárně genetických metod. Houby dnes slouží při průmyslové výrobě důležitých chemických látek a máme důvody se domnívat, že jsou vhodnými modelovými organismy použitelnými jako buněčné továrny („cell factories“), které by v budoucnu mohly sloužit k výrobě cizorodých peptidů a proteinů.

2. Vymezení hub jako skupiny organismů Houby jsou skupinou organismů, která je zdánlivě dobře definována. Při bližším pohledu však zjistíme, že jde o intuitivní názor, který je založen na empirické zkušenosti s určitými typickými skupinami hub. Ve skutečnosti je ale definice hub jako taxonomické skupiny (taxonu) obtížná přesto, že každá taxonomická skupina by měla mít závazný popis, který ji vymezuje. V případě hub se někdy uvádí, že takovým popisem je práce: Moore RT (1980) Taxonomic proposals for the classification of marine yeasts and other yeast-like fungi including the smuts. Botanica Marina 23: 361-373. Platnost a užitečnost tohoto popisu je však sporná, mj. i proto, že jde práci obtížně dostupnou, zastaralou a významem omezenou. Bude proto užitečné si houby přiblížit na základě charakteristických vlastností, které jsou při studiu hub různými systematiky respektovány. Je třeba mít na paměti, že pravděpodobně nejdůležitějším úkolem systematiky není „škatulkování“ (vzájemné odlišování) organismů, nýbrž postihnutí jejich vývojových vztahů, tedy vzájemné příbuznosti. Pro vymezení taxonu „Houby“ jsou důležité tyto charakteristické vlastnosti: Heterotrofní osmotrofní výživa. Fagotrofní výživa byla pravděpodobně ztracena. Buněčná stěna je přítomna a složena z polysacharidů, často obsahuje chitin. Syntéza aminokyseliny lyzinu probíhá přes dráhu kyseliny alfa-aminoadipové. Molekulárně genetické znaky.

5

Simpson a Roger (2004) považují houby za podskupinou říše Ophistokonta bez udané úrovně rankingu (hierarchické úrovně), společně s volně žijícími amébami (nukleariidami). Cavalier-Smith (1998) považuje houby za samostatnou heterotrofní říši s vyloučením všech amébovitých organismů. Hibbett et. al. (Mycological Research 111: 509-547, 2007) neřeší vymezení hub, mlčky přijímá systém Cavaliera-Smithe (1998). Hibbettova práce je přesto velmi uznávána zejména mezi molekulárními taxonomy. Jako klasifikační kritéria využívá geny pro alfa a beta tubulin, jaderné geny LSU, SSU, 5.8S rRNA, mitochondriální geny LSU, SSU, gen pro translační elongační faktor EF-1alfa a gen pro podjednotky RNA polymerázy II RPB1 a RPB2. Nespoléhá tedy na jediný znak a místo toho kombinuje řadu znaků, čímž dosahuje zvýšení spolehlivosti. Důsledkem aplikace molekulárně genetických znaků (podobnosti genu pro beta tubulin) je například překvapivý objev příslušnosti jednoduchých parazitických organismů dříve považovaných za prvoky, mikrosporidií, mezi houby (Keeling et al. 2000, Molecular Biology and Evolution 17: 23–31). V tomto případě morfologie zcela klame a pouze molekulárně genetické znaky projevují skutečnou vývojovou souvislost mikrosporidií s ostatními houbami. Paleontologické nálezy vyšších hub (askomycetů a basidiomycetů) jsou poměrně chudé a týkají se většinou dřevokazných hub nebo hub asociovaných s rostlinami, které lze někdy rozeznat v uhelných slojích, v petrifikovaných kořenových pletivech a v jantaru. Dobře zachovaná struktura plodnice fosilního askomycetu pochází z doby před asi 100 miliony let (křída). Mnohem starší jsou nálezy hub náležejících do oddělení Glomeromycota, které pocházejí z doby před cca 460 miliony let. Informace o paleontologických nálezech hub jsou tak útržkovité, že nedovolují souvisle rekonstruovat vývojové vztahy mezi jednotlivými skupinami hub.

3. Kolik druhů hub v přírodě existuje? Důležitou otázkou je odhad počtu druhů hub v přírodě. Je zřejmé, že známé druhy hub tvoří jen malou část skutečného celkového počtu druhů hub, tedy včetně těch dosud neznámých. Takový odhad je výzvou pro teoretiky i pozorovatele/taxonomy a je komplikován několika problémy. Prvním z nich spočívá v nejasnosti definice druhu u hub. Nelze zvolit takovou přesnou definici, která by byla použitelná pro všechny skupiny hub. Komplikací je například to, že nezřídka nejsme u hub schopni definovat ani biologické individuum (jedince) nebo mezi houbovými skupinami nacházíme propastné rozdíly v jejich genetické struktuře. Dalším problémem je praktická detekce hub v prostředí. Jen málo druhů hub lze odhalit prostým pozorováním (např. inventarizací plodnic). Také kultivační metody selhávají, protože kultivovat lze opět jen malou část hub. To samozřejmě zatěžuje odhad počtu druhů značnou chybou. Jedním ze způsobů odhadu počtu druhů je příklad takového odhadu u živočichů. Mora et al. (2011, PLoS Biol. 9(8) e1001+127) k tomu využili saturačních závislostí objevu různých taxonomických jednotek v čase. Po vynesení odhadovaného celkového vhodně transformovaného počtu vyšších taxonů proti taxonomické úrovni (rod, čeleď, řád, třída, oddělení) lze pozorovat lineární závislost, z níž vyplývá intuitivní schopnost taxonomů volit taxonomické úrovně tak, aby byly jejich vzájemné „vzdálenosti“ po dvojnásobně logaritmické transformaci přibližně ekvidistantní. V případě druhu však nelze tuto

6

„vzdálenost“ přímo určit, protože závislost počtu známých druhů na čase je velmi daleko od saturace (nelze spolehlivě popsat její křivost). Popisovaný odhad však spoléhá na to, že vzdálenosti mezi taxony jsou ve výše zmíněné závislosti ekvidistantní (intuice taxonomů), čili odstraněním transformace dat lze stanovit odhad počtu druhů. Jako všechny odhady počtu druhů je i tento odhad sporný, je zatížen řadou možná neopodstatněných předpokladů a je tudíž nepřesný. Jde však o zajímavé intelektuální cvičení. Odhady počtu druhů hub jsou ještě podstatně nepřesnější než odhady počtu druhů živočichů a pohybují většinou ve stovkách tisíc. Blackwell (2011, Am. J. Bot. 98: 426-438) uvádí, že pravděpodobný počet druhů hub by mohl být až 5.1 milionu. Tak velký počet druhů naznačují molekulárně genetické práce, zejména práce založené na masivně paralelním sekvenování amplikonů environmentální DNA. Houby se tak stávají skupinou, která je extrémně bohatá na druhy a která v tomto směru snese srovnání i s hmyzem. Odpovídá to extrémní variabilitě substrátů, které mohou být v přírodě houbami osídleny a využity. Budeme-li akceptovat pojetí hub podle Cavaliera-Smithe (2008) jako samostatné říše (s respektováním pozdějších změn), můžeme v ní odlišit skupiny zástupců s různou taxonomickou úrovní. Zejména lze vyčlenit výraznou skupinu pokročilých hub na úrovni podříše, zvanou Dikarya, která zahrnuje zástupce tvořící alespoň v některých stádiích životního cyklu hyfy s dvojjadernými buňkami. Patří sem stopkovýtrusé a vřeckovýtrusé houby (Basidiomycota resp. Ascomycota, úroveň oddělení). Mezi houby dále patří oddělení Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Glomeromycota a Microsporidia. Řadíme sem také polyfyletickou (umělou) skupinu Zygomycota, která dnes jako celek není uznávána a je tvořena několika skupinami hub nejistého zařazení.

4. Diverzita hub Diverzita je taxonomická rozmanitost. Hodnocení diverzity organismů (včetně hub) spočívá v hodnocení bohatosti jejich společenstev. Toto hodnocení je v případě hub zatíženo metodickými obtížemi při jejich detekci. Známe například houby kultivovatelné a nekultivovatelné a jen ty kultivovatelné (kterých je výrazná menšina) lze hodnotit kultivačními metodami. Výrazné zlepšení vypovídací hodnoty detekčních metod znamená zavedení molekulárně genetických postupů, zejména postupů sekvenačních (next generation sequencing). Tyto postupy kultivovatelnost organismu nepředpokládají. V optimálním případě by bylo při popisu diverzity na hodnocené lokalitě detekovat a kvantifikovat veškeré druhy hub, které se zde vyskytují. To je ale z praktických důvodů většinou nerealizovatelné. Velmi dobrým způsobem odhadu počtu druhů je tzv. rarefakční analýza, při níž do grafu vynášíme počet zjištěných druhů nebo tzv. operačních taxonomických jednotek (OTU) proti vzorkovacímu úsilí (počet vzorků, počet hodnocených sekvencí atd.). Získáme saturační křivku, z níž lze při dostatečné křivosti (dostatečné tzv. hloubce vzorkování) zjistit saturační hodnotu, tj. počet druhů či OTU. OTU je jakákoli detekovaná taxonomická jednotka s vnitřní konzistencí ale nejasné úrovně. Může jít např. o skupinu vzájemně podobných sekvencí s neznámou identitou. Při vzorkování nejprve zjišťujeme nové dosud nezaregistrované druhy či OTU velmi často. S postupem času (vzorkovacím úsilím, zvyšujícím se počtem analyzovaných vzorků) frekvence nálezů dosud nedetekovaných druhů/OTU klesá a křivka závislosti počtu nalezených druhů/OTU na vzorkovacím úsilí se zakřivuje, tedy nastává saturace.

7

Podrobná analýza řady pozorování ukazuje, že potřebné vzorkovací úsilí musí být velmi značné, máme-li na lokalitě zachytit např. 90% druhů a může vyžadovat tisíce až desítky tisíc analyzovaných sekvencí nebo vzorků. Tato skutečnost je pozoruhodná zejména proto, že mnoho např. ekologických prací, vyvozujících dalekosáhlé závěry o ekologii organismů, vychází z velmi malých souborů dat, kdy nedostatečné vzorkovací úsilí nedovoluje ani zdaleka vyhodnotit saturační úroveň. Takové práce nedávají dobrou představu o diverzitě sledované skupiny. V případě půdních druhů hub může počet jejich OTU dosahovat několika set v 1 gramu půdy.

5. Fyziologie hub 5. 1. Základní fyziologická charakteristika hub Fyziologie hub se zabývá studiem životních funkcí hub a jednotlivých pochodů v jejich těle (stélce). Protože mnohé z těchto pochodů jsou obecně platné pro živé organismy, uvedeme zde ty procesy, které jsou buď pro houby specifické, nebo jsou pro vysvětlení fyziologie hub podstatné. Některá z těchto témat jsou však společná i pro jiné obory biologie, především mikrobiologie. Největším českým odborníkem ve fyziologii hub je dr. Václav Šašek, který se v době svého působení v Mikrobiologickém ústavu ČSAV/AVČR fyziologii hub intenzívně věnoval. Části tohoto textu, které se věnují fyziologii hub, proto se svolením dr. Šaška vycházejí z jeho názorů a jím zpracovaných textů. Již bylo uvedeno, že se houby živí osmotrofně tím způsobem, že buď přijímají z prostředí jednoduché organické molekuly, které se zde vyskytují, nebo si tyto jednoduché molekuly v prostředí vyrábějí enzymatickou hydrolýzou složitějších látek, např. polysacharidů. K tomu mnoho hub produkuje příslušné extracelulární enzymy. Způsob výživy zodpovídá za charakteristický tvar houbové stélky i za mimořádnou závislost hub na vlhkosti vnějšího prostředí, které umožňuje difuzní šíření živin v prostředí. Zajímavou kapitolou fyziologie hub je tzv. oligotrofní růst. Je to růst, který probíhá v prostředí s extrémně nízkou koncentrací využitelných organických látek nebo minerálních živin. Růst byl dokonce pozorován v destilované vodě, do níž se organické látky mohly dostávat ze vzduchu v plynné formě a stopy minerálních látek v podobě prachových částeček. Pro houby je obecně charakteristické, že jsou schopné jako zdroj energie a živin využívat velmi rozmanité organické substráty. Některé druhy hub jsou však naopak často značně selektivní v nárocích na živiny a jsou schopné růst pouze na určitých substrátech. Tato jejich charakteristika je dána rozmanitostí jejich ekologických funkcí a nik, které zaujímají. Aby určitý substrát byla houba schopna využít, musí být splněny tři předpoklady. l. Houba musí být schopna syntetizovat a vylučovat enzymy potřebné pro hydrolýzu substrátu na malé molekuly, které může houba osmotrofním způsobem přijmout. Enzymová výbava houby proto odráží její ekologické funkce: např. celulolytické houby jsou vybaveny celulolytickými enzymy. 2. Houba musí mít transportní mechanismy pro přenos jednoduchých látek (například produktů enzymatického štěpení látek složitějších) do buňky. Vlastnosti transportní mechanismů (přenašečových sytémů lokalizovaných v cytoplazmatické membráně) také

8

určují kultivační vlastnosti určité houby a její schopnost kompetice o živiny s ostatními organismy v prostředí. 3. Houba musí být vybavena metabolickým aparátem potřebným pro zpracování absorbovaných molekul na zdroje energie nebo stavební jednotky pro syntézu látek potřebných pro růst a vývoj. Není-li splněn některý z těchto předpokladů, houba není schopna růstu v prostředí, které je jinak na živiny bohaté. Kromě toho může být příjem a metabolismus živin omezen vnějšími podmínkami prostředí.

5. 2. Uhlíkatá výživa hub - zdroj energie Uhlíkaté látky mají ve fyziologii hub dvě základní funkce: jsou zdrojem uhlíku pro syntézu metabolitů nezbytných pro růst a vývoj houby (sacharidy, proteiny, lipidy, nukleové kyseliny) a jejich oxidací získává houba zdroj energie nezbytný pro funkci základních životních procesů. Houby jako celek jsou schopné metabolizovat velice rozmanité uhlíkaté látky od malých molekul organických kyselin nebo monosacharidů až po složité polymery jakými jsou polysacharidy nebo lignin. Nejjednodušší sloučenina, kterou všechny houby dovedou využívat jako zdroj energie je monosacharid glukóza. Metabolismus glukózy uvnitř houbové buňky nastává prakticky ihned, protože houby mají všechny k tomu potřebné enzymy, tzv. enzymy konstitutivní. Další monosacharidy (fruktóza, manóza, galaktóza) jsou houbami obecně využívány dobře a nárůst biomasy je obdobný jako na glukóze, avšak metabolismus těchto cukrů začíná poněkud opožděně - příslušné enzymy se musí teprve nasyntetizovat (enzymy jsou substrátem indukovány a nazývají se proto adaptivní). Z pentóz mnohé houby dobře metabolizují xylózu, zatímco jen menší množství hub je schopné využívat arabinózu. Růst na disacharidech, oligosacharidech a polysacharidech vyžaduje syntézu hydrolytických enzymů, které jsou většinou (i když ne vždy) extracelulární. Protože tyto enzymy většinou nejsou konstitutivní, růst začíná až po určité fázi adaptace. Chybí-li tyto enzymy, houba substrát nemůže využít. Například většina hub k růstu dobře využívá jednotlivé monosacharidy, ale nikoli větší molekuly složené z těchto monosacharidových subjednotek. To dokumentuje zjištění u hub Rhizopus nigricans, Blakeslea trispora a Sordaria fimicola, které nerostou na sacharóze, i když glukózu i fruktózu jako substrát využívají dobře. Jsou ale známy případy, kdy houby přijímají di- i trisacharidy přenašečovým systémem. Z ekologického hlediska je způsob výživy hub rozlišen tím, z jakých zdrojů přijímají živiny. Houby saprotrofní rostou na mrtvých tělech rostlin nebo živočichů, anebo na zbytcích organického původu, které mohou být v různém stadiu rozkladu. Protože organickou hmotu dále rozkládají, jsou tyto houby nazývány rozkladači či destruenty. Houby spolu s baktériemi mají významnou funkci v koloběhu živin v přírodě, protože rozkládají všechen organický materiál, který se na zeměkouli v důsledku činnosti zelených rostlin stále vytváří. Podílejí se na vzniku humusu, organické látky postupně mineralizují. Tím vznikají látky, které se opět stávají živinami rostlin. Jiné houby získávají organické látky přímo z živých organismů. Pokud těmto organismům škodí, případně způsobí jejich smrt, jsou to paraziti. Parazitické houby bývají často specializovány na určitého hostitele, např. paraziti rostlin, jako jsou padlí, rzi

9

a sněti. Jiné houby vyvolávají nemoci u živočichů, včetně člověka (houby patogenní). Ale i u specializovaných parazitů nebo patogenů bývá zahrnuta v jejich životním cyklu saprofytická fáze, kterou většinou prožívají v půdě na zbytcích organického materiálu obdobného substrátu hostitele. U parazitických hub se někdy vytvářejí specializované útvary, které jim umožňují účinné napadení a využití hostitele. U rostlinných parazitů jsou to haustoria, což jsou rozvětvené hyfy uvnitř buněk hostitele, jimiž houba čerpá z hostitele živiny. Některé houby jsou dokonce schopné lovit drobné živočichy, jmenovitě háďátka, a to pomocí modifikovaných hyfových struktur. Tyto dravé houby mají na myceliu prstencovité smyčky složené z kontraktilních buněk. Když háďátko v půdě prstencem prolézá, buňky se smrští a zachycené háďátko se tak stane kořistí houby. Buňky prstence některých druhů hub se při podráždění nesmršťují a zeslizovatí a tím zvětší svůj objem. Živočich je tak v prstenci sevřen jako ve svěráku. V nejjednodušším případě stačí, když se živočich zaklíní v myceliu a houba má dostatek času proniknout do jeho těla. Zajímavým případem využívání jiných organismů je konzumace bakterií přítomných v nesterilním substrátu při pěstování žampiónů. Žampión produkuje lytické enzymy, kterými způsobuje rozpouštění bakteriálních buněk. Žampión tak uvolňuje z baktérií jednoduché látky, kterými se živí. Tento způsob výživy by bylo možné nazvat fakultativní bakteriofágií. Jestliže houba z hostitele čerpá živiny, avšak neškodí mu, naopak z tohoto spojení mají obě zúčastněné strany užitek, nejedná se o parazitismus, ale o symbiózu. V této symbióze mohou být houbovými partnery cévnaté rostliny, řasy nebo sinice, nebo dokonce i živočichové. Některé případy soužití jsou zmíněny dále. Houby mohou také obývat povrch těla živočicha nebo rostliny, případně jeho vnitřní orgány, aniž by svému hostiteli jakkoli škodil. Potom jde o komensalismus.

5. 3. Dusík ve výživě hub Pro růst a vývoj hub je nepostradatelným prvkem dusík. Houby potřebují dusík k syntéze rozmanitých sloučenin, jako jsou aminokyseliny, bílkoviny, purinové a pyrimidinové báze, nukleové kyseliny, glukosamin, chitin a různé vitamíny. Většina hub je schopná využívat jednoduché anorganické zdroje dusíku jakož i organické zdroje, především aminokyseliny. V houbové buňce aminokyseliny obvykle slouží jako donor dusíku pro syntézu složitějších molekul. Určitý zdroj dusíku, který houba přijímá z živného media, musí být v buňce přeměněn na aminokyselinu a až poté může být houbou dále využit. Lilly (1965) původně rozdělil houby do 4 skupin, podle toho, jaký typ zdroje dusíku jsou schopné utilizovat. První skupina v tabulce nemá dnes již opodstatnění. Vznikla na základě interpretace pokusů, které "dokazovaly", že některé houby jsou schopné fixovat vzdušný dusík. Dosti početné práce o fixaci dusíku houbami (především kvasinkami) byly koncem 60. let vyvráceny tím, že popsané pokusy byly opakovány za pečlivě kontrolovaných podmínek. Jako možné metodické chyby byly uvedeny: asimilace stopových zdrojů dusíku v atmosféře (NH3, NO, N2O), nepřesnost stanovování obsahu dusíku Kjeldahlovou metodou, kontaminace značeného 15N2 stopami 15NH3). Později byly publikovány výsledky o údajné fixaci dusíku myceliem houby Pleurotus ostreatus kultivovaném na slámovém substrátu. Ty vycházely ze zjištění, že na konci kultivace bylo v substrátu

10

absolutní množství dusíku vyšší než na počátku. Zde se velmi pravděpodobně jedná o fixaci dusíku baktériemi, které slámový substrát kontaminovaly. Substrát totiž nebyl sterilizován, ale pouze pasterizován a sporulující baktérie (z nichž některé druhy dusík fixují) v substrátu přežily. Nelze ovšem vyloučit i možnost nějaké symbiózy dusík fixujících prokaryot s uvedenou houbou. Pro prvé vysvětlení svědčí pozorování z přírody, že na hnijícím dřevu, kde je vyšší vlhkost, se uchycují a rostou baktérie, které jsou schopné dusík fixovat. Vylepšují tak dřevokazné houbě dusíkovou bilanci. Lze shrnout, že fixace dusíku byla prokázána pouze u prokaryot (některých baktérií a sinic), které jsou jako jediné dosud známé organismy vybaveny nitrogenázovým enzymovým komplexem redukujícím molekulu N2 na dvě molekuly NH3. Schopnost využívat nitrát má převážná většina hub (2. skupina). Nepatří sem však mnozí zástupci bazidiomycetů, dále řádu Blastocladiales a čeledi Saprolegniaceae, u nichž schopnost metabolizovat nitráty zjištěna nebyla. Ta totiž souvisí s aktivitou dvou enzymů - nitrát reduktázy a nitrit reduktázy. Nitrát reduktáza katalyzuje přenos elektronů z NADPH na nitrát. K tomu vyžaduje molybden a železo jako kofaktory. Bylo zjištěno, že tento enzym se účastní i přenosu nitrátů z prostředí do houbové buňky. Nitrit reduktáza, která se podílí na další redukci, je enzymem dosti zvláštním. Je schopna přenosu šesti elektronů z nitritů až na amoniak, a to jediným enzymatickým krokem. V dalším kroku dochází k inkorporaci amonných iontů do organických molekul, zejména aminokyselin. Důležitou funci má kyselina glutamová, jejíž vznik z kyseliny alfa-ketoglutarové je katalyzován enzymem glutamát dehydrogenázou. Z glutamátu může další aminací (za účasti enzymu glutamin syntetázy) vzniknout glutamin; nebo glutamová kyselina slouží jako donor amoniaku při syntéze ostatních aminokyselin transaminační reakcí. V této reakci glutamát (někdy i aspartát) předává svou aminoskupinu jiné alfa-keto kyselině. Jsou-li v živném mediu přítomny jako zdroj dusíku amonné soli, většina hub (3. skupina) je schopna je využívat jako jediný zdroj dusíku. Amonné ionty však hrají při růstu a vývoji některých hub i určitou regulační úlohu - při metabolismu bílkovin a tvorbě rozmnožovacích orgánů. Aktivita nitrát reduktázy je specificky indukována nitráty, avšak je potlačena přítomností amonných iontů v mediu. V živných mediích je často jako zdroj dusíku používán dusičnan amonný. Houby nejprve využijí ammoné ionty a až po jejich úplné spotřebě dojde k využívání nitrátu. To se přirozeně odráží i v průběhu pH media spotřeba amonných iontů je doprovázena poklesem pH. Většina hub (4. skupina) je schopná využívat jako zdroj uhlíku aminokyseliny, avšak ne všechny jsou využívány stejně. To souvisí se specifickou schopností transportu jednotlivých aminokyselin přes cytoplasmatickou membránu, protože se většinou jedná o aktivní transport. Využívání peptidů a proteinů kromě toho závisí na schopností produkce extracelulárních proteáz. Jen malý počet houbových druhů není schopen metabolizovat žádný anorganický zdroj N (houby patřící do 4. skupiny) a pro svůj růst nejčastěji vyžadují jako zdroj N glutamát nebo asparagin (někdy valin, cystein nebo leucin). Pro úplnost je třeba zmínit, že četné druhy hub jako zdroj N dovedou využívat i močovinu, protože produkují ureázu, která štěpí močovinu na oxid uhličitý a amoniak. Pokud je v prostředí amonná forma dusíku lze pozorovat oxidativní procesy působené houbami (oxidaci amonného dusíku na dusitan, snad až dusičnan) ale nepodařilo se prokázat, že takto uvolněná energie může být houbou skutečně využita. Chemolithotrofie tedy nebyla prokázána. Naproti tomu jsou některé houby v prostředí s velmi nízkou

11

dostupností kyslíku schopny redukovat dusičnan na N2O, nebo dusitan, čímž ve svém metabolismu regenerují oxidační ekvivalent.

5. 4. Další prvky - makroelementy a mikroelementy Kromě již zmíněného uhlíku a dusíku houby potřebují k růstu a vývoji ve větších množstvích další prvky, tzv. makroelementy, které získávají z různých zdrojů. Dva z nich (vodík, kyslík) jsou získávány z organických látek, CO2, O2 a H2O. Dalšími makroelementy jsou S, P, Mg, K a pro některé houby i Ca. Jako zdroj síry je většina hub schopná využívat sulfáty, které se dostávají do buněk aktivním transportem. V houbové buňce jsou sulfáty zabudovávány do organických molekul - některých aminokyselin, bílkovin a koenzymů. V některých houbách byla síra zjištěna dokonce i ve formě elementární, a to v klidových formách - konidiích, chlamydosporách a sklerociích, kde zřejmě působí jako faktor inhibující klíčení. Fosfor se v houbách vyskytuje ve formě fosfátů (H2PO4-, HPO42-). V této formě je integrální součástí makromolekul - DNA, RNA a fosfolipidů, jakož i menších molekul – NAD, NADP, FAD, vitaminu B12, thiaminpyrofosfátu, pyridoxalfosfátu a koenzymu A. Dále je obsažen v nukleotidech a deoxyribonukleotidech. Fosfor je úzce spojen s přeměnami energie v buňce, neboť jej obsahuje i nejdůležitější energetické „platidlo“: ATP. Buňky proto někdy tvoří zásoby velkého množství fosforu. Z důvodů neutralizace osmotického působení zásobních fosfátů může být v buňkách koncentrace volných fosfátů omezován jejich polymerizací, a tvorbou polyfosfátů ve vakuolách. Někdy jde o polyfosfáty hořečnaté. Do houbových buněk se fosfor dostává aktivním transportem především ve formě H2PO4- iontu. Všechny houby potřebují k růstu hořčík, který má četné regulační funkce. ATP a ADP v houbové buňce mají, vzhledem k negativnímu náboji fosfátové skupiny, afinitu k hořčíkovým iontům. Ionty hořčíku a manganu tvoří komplexy s nukleotidy a tak většina metabolických reakcí, které zahrnují přenos fosfátových skupin, vyžadují buď Mg2+ nebo Mn2+ jako kofaktory. Hořčík kromě toho ovlivňuje strukturu a funkci buněčných membrán. Hlavní role draslíku v houbách je v regulaci buněčného osmotického potenciálu, který ovlivňuje vstup vody do buňky a vznik turgoru nezbytného k růstu. Fyziologický účinek draselných iontů souvisí s transportními mechanismy. Draslík se rovněž váže na některé buněčné bílkoviny a aktivuje některé enzymy. Růst a rozmnožování mnohých hub ovlivňuje přídavek vápníku v kultivačním mediu. Vápník rovněž v mnohých případech ovlivňuje tvorbu rozmnožovacích orgánů hub. Vápník se v houbových buňkách váže na různé membrány a má vliv na funkci mikrotubulů a mikrofilamentů. Zdá se, že Ca není pro růst řady hub nepostradatelným prvkem, protože není obsažen v některých definovaných médiích určených pro houby. Snad může být nahrazen jiným dvojmocným kationtem, např. hořečnatým. Stopové prvky (mikroelementy), které většina hub potřebuje k růstu, byť ve velmi nízkých koncentracích jsou železo, měď, mangan, zinek a molybden. Všechny fungují jako kofaktory různých enzymů. Železo slouží jednak jako aktivátor některých enzymů,

12

jednak jako složka porfyrinů, které jsou důležité při přenosu elektronů. Rovněž měď funguje jako aktivátor některých houbových enzymů, především oxidáz. Koncentace mědi v živném mediu však musí být vyvážená, protože vyšší koncentrace působí na růst hub inhibičně. U většiny hub jsou ionty manganu transportovány do buňky stejnými přenašeči ako ionty hořčíku. Potřebou manganu se houby značně liší. V mnohých případech absolutní nedostatek manganu v kultivačním mediu vyvolává morfologické změny mycelia. Vysoké koncentrace iontů manganu v prostředí mohou někdy mít neobvyklé následky; např. u kvasinek vyšší koncentrace Mn iontů inhibuje jaderné dělení a zvláště replikaci mitochondriální DNA. Zinek, jehož funkce byla studována především u kvasinek, se podobně jako některé jiné divalentní kationty, nejprve adsorbuje na nabitá místa na plasmatické membráně, a pak je do buňky přenášen aktivním transportem. Zinek je funkční komponentou mnohých houbových enzymů, včetně těch, které se podílejí na syntéze DNA a RNA. Proto nepřítomnost zinku v kultivačním mediu má rozmanité fyziologické důsledky. Je potlačena syntéza nukleových kyselin a proteinů. U některých dimorfních hub zvýšená koncentrace zinku stimuluje tvorbu kvasinkovitých forem a konečně zinek ovlivňuje i produkci některých houbových metabolitů (např. kyseliny citronové nebo některých pigmentů). Molybden je potřebným kofaktorem pro aktivitu xanthin dehydrogenázy. Vyšší koncentrace molybdenu v mediu inhibují růst Saccharomyces cerevisiae tím, že se v mediu váží na glukózu. Kobalt se sice podílí na mnohých reakcích v houbových buňkách, jeho úloha však není dosud zcela jasná, protože enzymy, které jsou ionty kobaltu aktivovány, jsou rovněž aktivována jinými divalentními kationty. Úlohu mikroelementů lze shrnout asi následovně. Většinou fungují jako kofaktory enzymů. Většina poznatků byla získána na modelech kvasinek a proto, vzhledem k velké fyziologické variabilitě hub, nelze tyto poznatky úplně zobecňovat.

5. 5. Organické látky esenciální povahy Houby potřebují ke svému růstu a vývoji malá množství různých organických látek. Tyto látky neslouží jako živiny v pravém slova smyslu (jako jsou např. zdroje uhlíku, dusíku a minerálních látek), jsou však pro růst potřebné ve velmi nízkých koncentracích. Rozdíl mezi vitamíny a ostatními růstovými látkami je především v požadovaných koncentracích. U vitamínů je to koncentrace mikromolární nebo menší, u ostatních růstových látek je vyšší. Vitamíny fungují jako koenzymy, ostatní růstové látky jsou strukturálními elementy. Nároky na vitamíny se houby velice liší, a to nejen různé druhy, ale i kmeny jednoho druhu. Potřebnost vitamínů je někdy absolutní (daná houba bez příslušného vitamínu vůbec neroste) nebo částečná (přídavek vitamínu v mediu zvyšuje růst). Někdy potřebnost vitamínu ovlivňuje kultivační teplota a složení media, případě je potřeba vitamínu pouze v určitém vývojovém stadiu. Některé houby dovedou určitý vitamín syntetizovat z prekursorů, např. v případě thiaminu. Molekula thiaminu se skládá z pyrimidinového a thiazolového kruhu. Některé houby, mají-li v mediu obě tyto složky, z nich thiamin dovedou vyrobit, jiné potřebují pouze pyrimidinovou část a další zase pouze část thiazolovou. Obecně jsou pro houby nejdůležitějšími vitamíny thiamin, biotin, riboflavin, pyridoxin, niacin, pantothenová kyselina a listová kyselina. Z dosud dostupných informací nelze činit závěry, které by dávaly do souvislosti taxonomickou příslušnost nebo ekologickou charakteristiku hub a jejich požadavky na různé vitamíny. Z růstových látek houby nejčastěji vyžadují inositol, dále některé mastné kyseliny, rostlinné hormony a některé těkavé látky.

13

Z vitamínů houby nečastěji potřebují thiamin (vitamín B1). Thiamin funguje ve formě thiaminpyrofosfátu jako koenzym pro několik enzymů, které v metabolismu houbové buňky katalyzují odstranění a přenos aldehydických skupin. U obtížně kultivovatelných hub se v kultivačních médiích používá ve vysokých koncentracích dokonce až 100 mg/l. Na druhém místě, co do četnosti požadavků hub, je biotin (vitamín H). V aktivní formě je biotin kovalentně spojen se zbytkem lysinu na aktivních místech určitých karboxyláz. Tento biotin-lysin komplex funguje jako koenzym při přenosu CO2 nebo karboxylových skupin. Biotin je kofaktorem pro acetyl-CoA karboxylázu, čímž hraje důležitou roli při syntéze lipidů. Biotin je u některých hub nepostradatelnou složkou kultivačních médií. Působí obtíže při přípravě médií, protože je termolabilní (nesnáší autoklávování) a jeho zásobní roztok se proto musí sterilizovat filtrací a přidávat do částečně vychladlého média. Riboflavin (vitamín B2) je součástí flavinových koenzymů, které se podílejí na přenosu elektronů. Pyridoxin (vitamín B6) je kofaktorem enzymů pro transaminační reakce. Niacin (nikotinová kyselina) je v houbové buňce konvergován na nikotinamid a jako takový je klíčovou součástí koenzymů nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) a nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP). Protože nikotinamidová složka je schopná reverzibilních oxidačních a redukčních změn, jsou tyto koenzymy klíčové při reakcích spojených s přenosem elektronů. Z mnohých enzymů, které vyžadují NAD/NADH, jsou důležité glukóza-6-fosfát dehydrogenáza, glycerolaldehyd-3-fosfát zvláště dehydrogenáza, isocitrát dehydrogenáza, nitrát reduktáza a NAD dehydrogenáza respiračního řetězce přenosu elektronů. Pantothenová kyselina je komponentou koenzymu A (CoA) a jako taková je důležitá při přenosu acetylových (CH3CO-) skupin. Jedním z nejdůležitějších CoA derivátů je acetyl-CoA (CH3CO-CoA), který hraje ústřední roli při syntéze a degradaci sacharidů, mastných kyselin, steroidů a aminokyselin. Listová kyselina, respektive její deriváty, jsou důležitými koenzymy v přenosu jednotek s jedním uhlíkem. Při formulaci kultivačních médií je třeba věnovat vitamínům zvláštní pozornost, protože i jejich příliš vysoká koncentrace způsobuje zhoršení nebo až zástavu růstu. Z dalších růstových látek je nutné na prvém místě jmenovat inositol. Je to plně hydroxylovaný derivát cyklohexanu, jehož jeden ze stereoisomerů - myoinositol - má v metabolismu hub funkci růstové látky. Někdy je zařazován mezi vitamíny, i když jeho primární funkce je jako strukturální komponenta určitých fosfolipidů. Jsou to fosfolipidy buněčné membrány a inositol hraje roli při syntéze polysacharidů tvořících buněčnou stěnu. O některých mastných kyselinách bylo zjištěno, že jejich nízká koncentrace v kultivačním mediu stimuluje růst a ovlivňuje vývoj některých druhů hub. Protože mnohé houby jsou původci rostlinných chorob, byl sledován účinek rostlinných hormonů, především giberelinů a auxinů, na růst a vývoj hub. V nízkých koncentracích mnohdy tyto látky vykazovaly stimulační účinky. Mají také zřejmě nějaký význam při morfogenezi plodnic.

5. 6. Těkavé látky - málo prozkoumaný faktor ovlivňující houbový organismus Různé těkavé látky (jejich struktura však většinou není známa) projevily stimulační nebo inhibiční, někdy i morfogenetický vliv na růst některých hub. Např. těkavé látky z čerstvého dřeva často brzdily růst některých dřevokazných hub, zatímco těkavé látky ze dřeva, které bylo teplotně ošetřeno, jejich růst stimulovaly. Na rozdíl od vitamínů mechanismus účinku růstových látek většinou není znám. Poměrně významnou látkou mezi těkavými látkami je etylén, tzv. hormon stárnutí a zrání rostlin. Zdá se, že etylén

14

ovlivňuje chování některých fytopatogenních hub a hub ektomykorhizních a je možné, že může ovlivňovat sezonalitu chování hub. Bylo také pozorováno, že růst arbuskulárních mykorhizních hub je značně ovlivňován oxidem uhličitým. Oxid uhličitý má také vliv na produkci a vývoj zárodků plodnic (primordií) makromycetů, například u pěstovaných žampionů. Protože studium vlivu těkavých látek na houby je po metodické stránce mnohem složitější, než studium netěkavých rozpustných látek (někdy jsou označovány jako látky difusibilní), máme o nich velmi málo znalostí.

6. Růst hub 6. 1. Teoretické modely růstu a jejich konfrontace s pozorováním Modely mikrobiálního růstu (čistého výtěžku metabolismu určitého organismu) jsou nejčastěji odvozeny ze způsobu rozmnožování jednobuněčných mikroorganismů předpokládajícího dělení buněk, např. u bakterií. Tento model předpokládá, že po určité tzv. generační době dochází k rozdělení mateřské buňky na dvě buňky dceřiné. Výsledkem je exponenciální závislost počtu buněk (idealizovaný diskrétní model) nebo biomasy (spojitý model) na čase. V případě hub takový model nelze použít, protože růst hub se realizuje apikálním prodlužováním hyf a nikoli dělením buněk. Spojitý model exponenciálního růstu je však možné akceptovat u kvasinkovitých organismů rozmnožujících se pučením. Nejjednodušším případem růstu houbové biomasy je růst lineární, kdy množství vytvořené biomasy je úměrné délce časového intervalu, po který růst probíhal. Tento případ odpovídá například jednoduchému apikálnímu prodlužování hyfy bez větvení. Lze jej v umělých podmínkách modelovat, v přírodě však není obvyklý a obvykle indikuje, že růst je limitován omezeným konstantním množstvím některé důležité živiny či esenciálního růstového faktoru. Hypotetickým příkladem růstu je růst dvourozměrný, kdy expanze biomasy houby probíhá v nekonečně tenké vrstvě substrátu s konečnou plošnou koncentrací živiny. Větvení rostoucího mycelia v dvourozměrném modelu probíhá tak, aby toto mycelium právě využilo lokálně dostupné živiny se zanedbatelnou difuzí. Aby byla tato podmínka splněna, stačí, aby bylo indukováno laterální větvení rostoucí hyfy vzrůstem koncentrace živin, které je způsobeno příliš nízkou absorpcí rostoucím apexem (nízkou hustotu absorbující biomasy). Takto je zajištěna konstantní koncentrace v celé kolonizované ploše (dvourozměrném prostoru). Jsou-li rychlost prodlužování hyf v čase i prahová koncentrace živin spouštějící větvení hyf konstantní (=stálé vlastnosti organismu), je výsledná závislost biomasy na čase mocninnou funkcí, tedy: je úměrná druhé mocnině času. Model růstu v trojrozměrném prostoru, který je postaven na předpokladech analogických předpokladům modelu dvojrozměrného, poskytuje opět mocninnou funkci závislosti biomasy na čase, přičemž biomasa je v tomto případě úměrná třetí mocnině času. V reálném světě nemůže ze zřejmých důvodů přesně platit dvojrozměrný model růstu a i zmíněný trojrozměrný model je idealizovanou situací. Realističtější model má prvky růstu trojrozměrného (probíhá v trojrozměrném prostoru) i dvojrozměrného (mycelium osidluje

15

povrch substrátu, po němž se povrchově šíří, má však nenulovou tloušťku, viz kolonie houby na Petriho misce). Jeho matematický popis je navíc komplikován významným vlivem difuze živin i metabolických zplodin a heterogenitou prostředí. K tomu přistupují komplikace dané vlastnostmi toho kterého organismu: agregací hyf (tvorba myceliálních provazců, rhizomorf), tvorbou specializovaných struktur (diferenciace hyf na explorativní a absorpční, tvorba myceliálních ložisek). Modely růstu houbové biomasy proto zpravidla nejsou fundamentální (vyplývající z teoretických předpokladů) ale empirické (matematickými prostředky aproximující pozorované hodnoty).

6. 2. Kvantifikace růstu hub Obtížnou praktickou otázkou je experimentální kvantifikace růstu. Jen ve výjimečných případech je možné růst mycelia měřit přímo, například vážkovým způsobem, kdy je čisté mycelium usušeno a zváženo. Tento případ nastává téměř pouze v laboratorních tekutých kulturách hub. Pokud má mycelium nějaké jednoznačné morfologické charakteristiky (barvitelnost, rozměry, tloušťka buněčné stěny, charakteristické přehrádkování), kterými je možné jej spolehlivě odlišit, lze použít mikroskopickou kvantifikaci délky a objemu mycelia. To se provádí například při stanovení koncentrace mycelia arbuskulárních mykorhizních hub v půdě. Toto stanovení je velmi pracné. Mnohem častější je případ, kdy mycelium prorůstá pevný substrát a nelze jej vyčistit a tím zpřístupnit pro přímé stanovení. V takovém případě je třeba použít nepřímé metody stanovení, které jsou vždy zatíženy větší chybou než stanovení přímé. Tyto metody jsou založeny na kalibraci biomasy houby vůči nějaké složce mycelia, kterou lze z materiálu snadno extrahovat a kvantifikovat. Takovou látkou je například N-acetyl-glukózamin, který lze získat kyselou hydrolýzou houbového chitinu (je obsažen v buněčné stěně většiny hub). Další možností je extrakce ergosterolu, který je specifickou složkou cytoplazmatické membrány hub a je často používán ke kvantifikaci celkové houbové biomasy. Je také možné analyzovat mastné kyseliny, které jsou specifické pro houby (tzv. signature fatty acids: 16:1ω7, 18:1ω7). V případě mastných kyselin specifických pro houby je možné volbou vhodných metodických postupů odlišit mastné kyseliny přítomné ve fosfolipidech buněčných membrán od mastných kyselin přítomných v zásobních triglyceridech. Fosfolipidové mastné kyseliny pak kvantifikují biomasu mycelia (buněčné povrchy), zatímco mastné kyseliny v triglyceridech referují o fyziologickém stavu mycelia (tvorba zásob). Tímto způsobem nelze odlišit více houbových taxonů. Biomasa se zde stanovuje a hodnotí jako celek. Samostatnou kapitolou při stanovení biomasy je stanovení na základě DNA, kterou lze obvykle ze substrátu účinně extrahovat. Ke vlastní kvantifikaci pak je vhodná metoda kvantitativní PCR. Zde je potřeba použít specifické primery a obvykle je možné kvantifikovat jen omezený počet taxonů.

16

7. Houby jako destruenti - rozklad složitých organických látek 7. 1. Houby a rozklad lignocelulózového komplexu Saprotrofní houby mají v přírodě nezastupitelnou úlohu jako rozkladači různých organických látek, počínaje jednoduchými sacharidy a aminokyselinami a konče složitými proteiny a lignocelululózovým komplexem. Zejména lignocelulózový komplex je velmi odolný vůči rozkladu a tvoří významnou část dřevní hmoty a lesního i stepního opadu. Pro stromy opadavého lesa je typické sezónní opadávání listů, které způsobuje hromadění organické hmoty se snadno dostupnými živinami. Je jen málo skupin organismů, které jsou schopny lignocelulózový komplex rozkládat, jde většinou o houby z oddělení Basidiomycota nebo Ascomycota. Největší koncentrace biomasy půdních saprotrofních hub nacházíme do hloubky několika centimetrů, což odpovídá akumulaci opadu a koncentraci dostupné organické hmoty. Po rozkladu snadno dostupných organických látek je substrát osídlen celulolytickými druhy, například Trichoderma spp., které způsobují rozklad celulózy a hemicelulóz. Po spotřebování celulózy a hemicelulóz nastává rozklad ligninu lignolytickými houbami, které patří zejména k lupenatým basidiomycetům (Mycena, Clitocybe ...), ale i k mikroskopickým houbám (Humicola, Phialophora ...). Při rozkladu ligninu se uvolňují využitelné látky, na nichž se živí další doprovodné houby patřící nejvíce k askomycetům a imperfektním houbám. Rozklad lesního opadu na humus trvá minimálně 3 roky a závisí na kvalitě opadu (druhu rostlin, které jej produkují) a na klimatických faktorech (teplotě a vlhkosti). Houby jsou schopny produkovat extracelulární enzymy, které jim umožňují degradovat lignocelulózový komplex. Celulóza, která je nejrozšířenějším polysacharidem v pletivech rostlin, představuje pro houby podstatný zdroj uhlíku. Molekula celulózy se skládá asi z 8 - 12 tisíc glukózových podjednotek spojených beta-D-glykozidickou vazbou mezi uhlíky C1 a C4. Mnohé patogenní i saprotrofní houby produkují celulázy, což je soubor enzymů, které se podílejí na štěpení celulózy až na glukózové podjednotky. Jde o 1,4-betaglukanázu, celobiohydrolázu a 1,4-beta-glukosidázu, které se podílejí na degradaci celulózy a oxidázy, peroxidázy a enzymy produkující peroxid vodíku, které se podílejí na degradaci ligninu. Aktivita těchto extracelulárních enzymů může být použita jako měřítko degradační aktivity mikrobiálního společenstva kolonizujícího substrát. Lignin je po celulóze druhým nejrozšířenějším organickým polymerem na zemi. Tvoří 15 - 35 % dřevní hmoty. Lignin obaluje vlákna celulózy a je příčinou odolnosti dřeva proti mechanickým i biologickým činitelům. Lignin se samotný v přírodě nevyskytuje, pouze ve spojení s celulózou (lignocelulózový komplex). Makromolekula ligninu obsahuje aromatické subjednotky koniferylalkohol, kumarylalkohol a sinapylalkohol, které jsou nepravidelně pospojovány různými typy vazeb v trojrozměrnou síť. Na rozdíl od celulózy se lignin nepodařilo izolovat ze dřeva v nezměněné formě, což by bylo potřebné pro studium mechanismu jeho biodegradace. Druhou složitostí je, že houby, které rozkládají lignin, jej nedovedou metabolizovat jako jediný zdroj uhlíku, pouze za přítomnosti dalších přístupných uhlíkatých látek, jako je celulóza, celobióza nebo glukóza. Třetí, a hlavní problém tkví v nepravidelné struktuře makromolekuly ligninu - je to heteropolymer spojený různými typy chemických vazeb a je tedy nepravděpodobné, že by jeden typ enzymu mohl způsobit významnější depolymerizaci.

17

Velmi koncentrovaný lignocelulózový komplex nacházíme ve dřevě. Zároveň je tento substrát výrazně homogennější než opad, což znamená, že umožňuje vznik menšího počtu ekologických nik a je tedy kolonizován podstatně chudším společenstvem mikroorganismů než opad. Celulóza poskytuje lignocelulózovému komplexu pevnost, lignin způsobuje jeho odolnost vůči rozkladu. Rozklad dřeva proto probíhá velmi pomalu. V první fázi rozkladu, která trvá i několik let, dochází ke kolonizaci dřeva myceliem hub. Ve druhé fázi dřevo ztrácí mechanické vlastnosti a „řídne“. Ve třetím, konečném stádiu se rozložená hmota rozpadá a je zabudována do půdy. Dřevní hmotu nejvíce rozkládají basidiomycety z třídy Agaricomycetes.

7. 2. Bílá a hnědá hniloba dřeva Rozeznáváme 2 způsoby rozkladu. Houby mohou produkovat pouze celulolytické enzymy. V tomto případě rozkládaná hmota hnědne (nebo červená), protože v ní rozkladem stoupá relatívní obsah ligninu. Tento typ hniloby se nazývá hnědou hnilobou a je způsobován například houbami Fomitopsis pinicola, Gloeophyllum sepiarium, Piptoporus betulinus nebo Serpula lacrymans. Druhý typ rozkladu nastává tehdy, když je houba schopna produkovat nejen celulolytické ale i lignolytické enzymy. To je případ druhů Pleurotus ostreatus, Schizophyllum commune, Fomes fomentarius nebo Trametes versicolor. Tento typ hniloby nazýváme bílou hnilobou a příslušné houby pak lignikolními houbami. I když studiu mechanismu rozkladu ligninu houbami bílé hniloby je v posledních letech věnováno mimořádné úsilí, celý proces není ještě zcela objasněn. Nejvíce studovaným modelem je druh Phanerochaete chrysosporium, pro jehož ligninolytické účinky jsou podmínky podrobně popsány (především je vyžadován vyšší parciální tlak kyslíku v atmosféře a limitace dusíkem v živném medium). Je zatím sporné, zda i ostatní, méně dobře prostudované houby bílé hniloby, vyžadují stejné fyziologické podmínky. Je pozoruhodné, že u mnohých studovaných hub bílé hniloby byly zjištěny značné rozdíly ve složení ligninolytického komplexu, přitom však všechny tyto houby jsou schopné intenzívně lignin rozkládat. Z hlediska ochrany životního prostředí, respektive nápravy škod, které na životním prostředí napáchal člověk, je významné zjištění, že houby bílé hniloby jsou schopné, kromě molekul ligninu, štěpit i jiné aromatické látky, včetně těch, které jsou významnými polutanty životného prostředí (polychlorované bifenyly, polycyklické aromatické uhlovodíky, chlorfenoly, chlorligniny, polychlorované dioxiny, DDT, trinitrotoluen a další). Při rozkladu těchto látek se totiž uplatňuje stejný komplex enzymů, jímž houby štěpí lignin. Nejvíce poznatků v tomto směru bylo opět získáno studiem houby Phanerochaete chrysosporium, avšak i další druhy hub bílé hniloby připadají (vedle baktérií) v úvahu pro dekontaminaci znečištěných půd a vod. Lze tak soudit z toho, jak rychle se tato část environmentální mikrobiologie rozvíjí.

8. Pěstování hub člověkem 8. 1. Historie pěstování jedlých hub Houby jsou odedávna složkou lidského jídelníčku. Člověk pěstuje jedlé houby po řadu století. Máme o tom 1400 let staré doklady z Číny, kde se pravděpodobně pěstovala dřevokazná houba rodu ucho (Hirneola). Pěstování hub v Asii však zřejmě probíhalo již

18

dříve. V Evropě máme náznaky svědčící o pěstování hub u Plinia Staršího s prvního století n. l. Určitou brzdou rozvoje pěstování hub v Evropě byl názor, že houby jsou cosi nečistého. Houbami jako organismy a způsobem jejich rozmnožování a pěstování se poprvé vědecky zabýval neapolský šlechtic Giambattista della Porta (1535-1615) v díle Magia Naturalis. O větším rozmachu pěstování hub v Evropě pak lze hovořit v době vlády francouzského krále Jindřicha IV. Navarského koncem 16. a začátkem 17. století, jehož rozsáhlé ekonomické aktivity v Severní Americe stimulovaly dovoz teplomilného ovoce a zeleniny, které byly v královských zahradách pěstovány v pařeništích. V těchto pařeništích zárověň plodily i houby, zřejmě žampióny. Máme o tom zmínky v literárním díle o zahradnictví sepsaném královským zahradníkem N. de Bonnefonsem (1650). Technologie pěstování žampiónů se postupně rozšiřovala, až bylo kolem roku 1810 zavedeno pěstování žampiónů v opuštěných podzemních vápencových lomech na periferii Paříže. Způsob pěstování spočíval nejprve na využívání dlouhých podlahových záhonů („oslí hřbety“), postupně byly vyvinuty technologie pěstování žampiónů v policích, v bednách, v pytlích, ve vysokých záhonech a v lisovaných blocích. Cílem tohoto vývoje bylo zlepšování ekonomické efektivity procesu, jeho zlevňování a zvyšování výnosů. Pěstování hub, má-li být ekonomicky životaschopné, vyžaduje za dnešních podmínek trhu s houbami buď velmi levnou pracovní sílu, nebo nákladné investice do zařízení a distribuce. V případě pěstování žampiónů to platí obzvláště.

8. 2. Příprava substrátu pro žampióny a pěstební technologie Před vlastním započetím pěstebního procesu je třeba připravit substrát. Surovinami pro jeho přípravu jsou zpravidla živočišné výkaly jako zdroj dusíku (například koňský hnůj, kejda nebo drůbeží podestýlka), sláma (hlavní zdroj energie), různé organické příměsi, sádra a voda. Jednotlivé složky se smísí a podrobí dvoufázovému fermentačnímu procesu. V první fázi fermentace dojde k narušení slámy, k jejímu částečnému rozložení a k rozmnožení některých termofilních mikroorganismů (fermentace probíhá při samozáhřevu na 78-82 ºC). Vzhledem k tomu, že jde o aerobní proces (substrát je při fermentaci provětráván), nejde o pravou fermentaci (kvašení), termín „fermentace“ je zde použit z konvenčních důvodů, je zažit. Při první fázi fermentace se zvyšuje v substrátu koncentrace amoniaku. Ten se částečně podílí na desinfekci substrátu, je však ve vysokých koncentracích toxický pro žampion. Po proběhlé první fázi fermentace substrát nemá dostatečnou selektivitu pro žampión a obsahuje zárodky živočišných škůdců a konkurenčních plísní. Amoniak a zárodky nežádoucích mikroorganismů se zneškodní ve druhé fázi fermentace, kdy dojde k pasterizaci a v substrátu převládne společenstvo termotolerantních mikroorganismů. Druhá fáze fermentace je opět aerobní. Obě fáze přípravy substrátu trvají dohromady asi 10 až 12 dnů. Vyrobený substrát se ihned očkuje žampiónovou sadbou a distribuuje např. do pěstebních polic, kde se inkubuje - rozmnožuje se v něm mycelium žampiónu. Tato fáze trvá asi 15 až 17 dnů. Pak je zpravidla překryt krycí zeminou a další týden inkubován. Teplota vzrůstá až k 27 ºC. Následuje chladový šok, kdy je substrát ochlazen větráním o několik stupňů, což způsobí nasazení tvorby plodnic. V průběhu následujících 3 až 4 týdnů pak nastávají zpravidla 3 sklizňové vlny.

19

Popsaná technologie pěstování žampiónů využívá nesterilní směsný substrát. Technologie pěstování jiných druhů hub se od tohoto procesu výrazně liší například substrátem (dřevní houby pěstované na dřevě nebo pilinových substrátech) nebo sterilitou (využívají se zpravidla substráty tepelně sterilizované). Můžeme sledovat zřetelnou tendenci využívat různé zemědělské odpady jako suroviny pro výrobu pěstebních substrátů a zároveň využití vyplozených substrátů jako organických hnojiv. Výrobu hub tak lze považovat za bezodpadovou technologii. Dnes je pěstování hub ve světovém měřítku gigantickým průmyslem, v němž je vedoucí zemí Čína. Pěstují se kromě žampiónů dále hlívy, kukmáky, ucha, houževnatec jedlý, penízovka sametonohá a další druhy. Sortiment pěstovaných druhů se postupně rozšiřuje. V roce 2011 se podle údajů FAO na celém světě vyprodukovalo 7.7 milionu tun jedlých hub v hodnotě 14 miliard dolarů.

8. 3. Teoretické i praktické poznámky k pěstování jedlých hub Houby se pěstují především pro jejich plodnice (které však tvoří pouze část celé stélky). Ve většině případů neznáme mechanismy a faktory spouštějící fruktifikaci, protože z genetického hlediska jde o vzácný děj, jehož studium dosud není metodicky zvládnuto. Překvapivě ani u žampiónu nejsme schopni dosáhnout fruktifikace za definovaných podmínek in vitro a je třeba ji indukovat přítomností půdy a vhodných mikroorganismů. Fruktifikace je posloupnost růstu a diferenciace nepravých pletiv, která postupně dávají vznik výtrusorodé vrstvě (rouško) a vedou ke zvětšování a tvarovým změnám plodnice. Protože je diferenciace složitý proces, musí být řízen, organizován. Zdá se, že alespoň u některých modelových případů je řízen látkami s účinky podobnými účinkům rostlinných růstových regulátorů. Je velmi málo prostudován. Ektomykorrhizní houby (viz níže) potřebují od rostlinného partnera látky nutné pro tvorbu plodnic. Chemická podstata těchto látek není dosud známa, a to je příčinou proč zatím nedovedeme (a patrně ještě delší dobu nebudeme umět) pěstovat třeba hřiby ke kulinářským účelům způsobem, jakým se pěstují např. žampióny. Pěstování hub ve velkém závisí v prvním kroku na laboratorní kultuře houby (izolát, „kmen“). Tato laboratorní kultura je postupně namnožena na vhodném substrátu (zpravidla sterilní obilky) do objemu, který postačuje k inokulaci konečného substrátu. Toto inokulum se nazývá jako „spawn“. Mycelium ze spawnu prorůstá a kolonizuje konečný substrát, který přeměňuje se značným výtěžkem na vlastní biomasu. Při manipulaci s izoláty a jejich využití pro kultivaci je třeba respektovat sexualitu hub, protože pro úspěšnou fruktifikaci je třeba kombinovat vzájemně kompatibilní kmeny. Izoláty hub jsou nejsnadněji získávány z explantátů plodnic. Takové izoláty basidiomycetů jsou dikaryotní a obsahují proto kompletní informaci pro tvorbu plodnice. Mohou být proto jednoduše použity pro množení inokula. Jinak je tomu u askomycetů, které se vyskytují ve formě monokaryotních mycelií a k dikaryotizaci dochází až při oplození askogonu anteridiem. Z oplozeného askogonu vyrůstají dikaryotní askogenní hyfy, které se větví a apikálně se na nich tvoří vřecka (asky). Ostatní části v plodnice jsou monokaryotní, tvořené jedním párovacím typem mycelia, který nazýváme typ mateřský, a který v plodnici zásadním způsobem převládá. Při explantaci plodnice pak získáme s velmi vysokou pravděpodobností kulturu právě

20

tohoto mateřského párovacího typu. Chceme-li získat u takovéto houby plodnice (askokarp v případě askomycetů), musíme při inokulaci vždy kombinovat 2 různé párovací typy tak, aby po oplození mohl vznikout plnohodnotný plodný dikaryon (askogenní hyfy).

9. Některé důležité aspekty genetiky hub 9. 1. Poznámky ke „klasické“ genetice hub Dikaryotní houby (Basidiomycota, askogenní hyfy u oddělení Ascomycota), i když jsou v haploidním stavu (dikaryotní buňky obsahují haploidní jádra), chovají se jako diploidní, protože obsahují 2 sady genů. U askomycetů, které tvoří vřecka, v nichž probíhá redukční dělení i následné mitózy s dělícím vřeténkem orientovaným souběžně s podélnou osou vřecka, je možná tzv. tetrádová analýza. Protože při redukčním dělení nastává crossing over, tedy výměna částí chromatid oddělujících se chrómozómů, je možné výhodně sledovat genetickou vzdálenost nějakého genu nejen od centromery, ale i od některého genu, který se projeví přímo na vlastnostech diferencovaných askospor (barva askospory). Tato genetická (a přeneseně i fyzická) vzdálenost je úměrná pravděpodobnosti crossing overu mezi těmito lokusy. Velmi zajímavý a unikátní fenomén, s nímž se setkáváme u askomycetů, je parasexualita (parasexuální cyklus). Je to alternativa k pohlavnímu rozmnožování, která byla nalezena poprvé u hub rodu Aspergillus v polovině 20. století. Parasexuální cyklus spočívá v tom, že monokaryotní buňky různých mycelií spolu mohou splývat. Děje se to tak, že se vytvářejí mezihyfové spoje (anastomózy), v nichž splývá cytoplazma obou mycelií. Tak se získá mycelium s buňkami obsahujícími jádra obou rodičovských linií. V případě, že se jedná o jádra, která jsou geneticky odlišná, hovoříme o tzv. heterokaryonu. Heterokaryotické mycelium má vlastnosti dárce i příjemce, přičemž pro tyto vlastnosti platí pravidla ovládající fenotypovou dominanci a recesivitu genů. Aspergillus se žlutými konidiemi se kombinuje ve směsné kultuře s Aspergillem se zelenými konidiemi za vzniku heterokaryotní kolonie, která produkuje konidiofory. Na konidioforech se vytváření konidie. Konidie jsou u Aspergillu jednojaderné (tj. každá konidie obsahuje jen jedinou alelu genu pro barvu) a tato alela ovládá barvu pouze „své“ konidie. Heterokaryóza se zde projeví tak, že se na jediném konidioforu tvoří konidie obou barev. V heterokaryonu mohou splynout dvě rozdílná jádra a tím nastává diploidizace. Diploidní mycelium pak produkuje na konidioforech diploidní konidie, z nichž každá nese vlastnosti obou rodičovských mycelií. Postupně mitotickou redukcí se u původně diploidního mycelia snižuje počet chromozómů až na haploidní stav. Tak může docházet ke kombinaci různých chrómozómů od různých rodičovských mycelií v jednom jádře. Může ale proběhnout také tzv. mitotický crossing over, při němž dojde ke vzájemné výměně částí dvou homologních chromozómů. V tom případě se kombinují vlastnosti obou rodičovských mycelií v jediném chromozómu.

21

9. 2. Genetický základ sexuality hub Pohlavnost hub je ovládána geneticky. Heterothalické askomycety mají bipolární sexualitu, která je řízena tzv. MAT geny. U většiny askomycetů (vyšší askomycety) rozpoznáváme 2 tzv. párovací typy MAT1 a MAT2, tj. 2 pohlaví. To, zda je mycelium pohlavně laděno jako MAT1 nebo MAT2 záleží na tom, jaké geny jsou lokalizovány v tzv. „mating-type locus“, lokusu určujícím párovací typ. Tento lokus se nazývá MAT1 a není alelický, tj. nenese různé alely téhož genu, ale jeho obsah i organizace je u obou párovacích typů naprosto odlišná, jde o tzv. idiomorfy. Tyto 2 verze lokusu MAT1 se u heterothalických druhů nazývají MAT1-1 a MAT1-2. Idiomorfa MAT1-1 odpovídá fenotypu MAT1 a obsahuje gen pro tzv. α-doménu (α-box), idiomorfa MAT1-2 odpovídá fenotypu MAT2 a obsahuje gen pro tzv. „high mobility group domain“ (HMG-box). Tyto MAT proteiny působí jako transkripční faktory spouštějící pohlavní cyklus. U homothalických askomycetů jsou většinou geny kódující α-box a HMG-box v jediném lokusu (lokus MAT1 u Cochliobolus homomorphus), jen výjimečně jsou umístěny na dvou různých místech genomu (lokusy MAT1 a MAT2 u Emericella nidulans). Nižší askomycety mají poněkud odlišnou funkci pohlaví určujících genů. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae rozeznáváme 2 párovací typy MATa a MATα. Tyto párovací typy vždy exprimují jeden typ feromonu a jeden typ feromonového receptoru, který přijímá feromon opačného párovacího typu. Buňky párovacího typu MATa exprimují feromon nazývaný a-faktor (směs dvou 12-ti aminokyselinových lipopeptidů) a receptor Ste2p, buňky MATα produkují feromon nazývaný α-faktor (13-ti aminokyselinový peptid) a receptor Ste3p. Pokud receptor přijme příslušný feromon, dochází k iniciaci signální kaskády zastavující buněčný cyklus („cell cycle arrest“) a ústící do transkripční aktivace genů zúčastněných v procesu plazmogamie a karyogamie. Mnohem složitější je sexualita u basidiomycetů. Tyto houby mají více až velice mnoho párovacích typů, které jsou definovány různými kombinacemi feromonů a receptorů. Například druh Schizophyllum commune má v přírodě tisíce párovacích typů. Rozpoznání sexuálního partnera a sekvence událostí vedoucí až k formování plodnice a meióze vyžaduje funkci dvou na sobě nezávislých genových komplexů nazývaných A a B. Každý z těchto komplexů obsahuje 2 lokusy: Aα a Aβ v případě komplexu A a Bα a Bβ v případě komplexu B. Každý z těchto 4 lokusů existuje v mnoha variantách. U lokusu Aα známe 9 různých variant, u lokusu Aβ jich známe 32 a u lokusů Bα a Bβ je známo po 9 variantách. Teoreticky je tedy možné, aby tato houba existovala ve 23328 párovacích typech (pohlavích). Aby byl vzniklý heterokaryon fertilní, je třeba, aby se původní primární mycelia lišila alespoň v jednom ze dvou lokusů komplexu A a současně alespoň v jednom ze dvou lokusů komplexu B.

9. 3. Plasmidy hub U hub je známa řada cytoplazmatických genetických elementů, plasmidů, které jsou možná u hub podobně časté jako bakteriální plasmidy u bakterií. Replikují se odděleně od genomu. Důležitou skutečností je to, že jen malá část houbových plasmidů je skutečně přítomna ve volné cytoplazmě (plasmid 2µm ze Saccharomyces cerevisiae, killer plasmidy Kluyveromyces lactis), naprostá většina je přítomna v mitochondriích. Dále, plasmidy hub jsou mnohem častější než plasmidy jiných eukaryorních organismů, zdá se, že houby jsou v tomto směru mezi eukaryotními organismy výjimečné. Houbové

22

plasmidy mohou mít buď formu lineární, nebo formu kruhovou. Kruhová forma je u hub velmi vzácná a vyskytuje se u rodu Neurospora. Jeden z proteinů kódujících párovací typ u houby Absidia glauca byl nalezen také na cirkulární molekule DNA, která je přítomna ve volné cytoplazmě. Přítomnost některých plasmidů v myceliu má vztah k jeho senescenci. Mycelium bez plasmidu nepodléhá senescenci (je schopno růst po neomezenou dobu ve dlouhé trubici s živným médiem. Inkorporace mitochondriálních plasmidů (ARmarDNA, ARkalDNA u Neurospora spp.) způsobuje senescenci pravděpodobně tím, že porušuje strukturu genů, které ztrácejí funkci. Mycelium tak postupně ztrácí životaschopnost, růst se zastavuje nastává senescencence.

9. 4. Genetické manipulace hub Houby jsou z praktického hlediska důležitými objekty genetické manipulace. Jedním z nejdůležitějších biotechnologicky využívaných mikroorganismů je kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Mimo výrobu alkoholu a pekárenství se uplatňuje jako produkční mikroorganismus při výrobě léčiv získávaných s využitím klonovaných genů. K tomu bylo ale potřeba nalézt vhodný transformační systém a klonovací vektor, který po zavedení do kvasinkové buňky zajistí exprexi žádoucích genů (heterologní exprese). Jako tyto vektory se využívají různě pozměněné varianty již zmíněného plasmidu 2µm (tzv. kvasinkové epizomální plasmidy, YEps), které se vyskytují u většiny kmenů Saccharomyces cerevisiae. Plasmid 2µm je jedním z mála plasmidů nacházejících se volně v cytoplazmě buněk eukaryotních organismů. Má délku 6 kbp a v buňce se vyskytuje v 70 až 200 kopiích. V buňce se replikuje. Některé připravené varianty tohoto plasmidu se replikují jak v kvasinkách, tak i v bakteriích Escherichia coli a v obou organismech mohou být také selektovány. Homologní rekombinací může být celý plasmid integrován do genomu kvasinky a může se z něj rekombinací opět uvolnit. Transformovaná buňka může být zdrojem rekombinantních peptidů, ale transformace není dokonale stabilní. Existují další vektory, které se nemohou v buňce samostatně replikovat a aby způsobily selektovatelnou transformaci, musejí být zabudovány do genomu, jsou to tzv. kvasinkové integrační plasmidy (YIps). To znamená, že získání transformantů je obtížnější než v předchozím případě. Transformanty jsou však velmi stabilní. K transformaci hub lze využít schopnost bakterie Agrobacterium tumefaciens indukovat tumory u dvouděložných rostlin, přičemž této transformace je dosaženo integrací genů ovládajících tvorbu rostlinných růstových látek. K tomuto účelu bakterie nese veliký Ti (tumor inducing) plasmid, který nese genovou výbavu potřebnou při vlastní transformaci i geny, které se integrují do genomu hostitele. Tyto geny jsou shromážděny v úseku plasmidu, který se nazývá T-DNA a je ohraničen specifickými krátkými nukleotidovými motivy. Vše, co je uzavřeno mezi těmito motivy, je integrováno do genomu hostitele. Ti plasmid je však příliš velký na to, aby s ním bylo možné jednoduše manipulovat. Proto byl rozdělen na 2 funkčně odlišné části: velký helper plasmid, který nese geny potřebné při procesu transformace a je trvale přítomen v buňkách bakterie (nese svůj specifický selekční marker) a vektor nesoucí další selekční marker a T-DNA, který je dostatečně malý na to, aby s ním bylo možno bez komplikací manipulovat. T-DNA může být nahrazena DNA, která má být vnesena do hostitele. Protože tento je transformační

23

element rozdělen na 2 zmíněné části, je označován jako o tzv. binární vektor. Binární vektory jsou běžně užívány ke genetické transformaci rostlin. Ukázalo se, že je-li helper plasmid dostatečně virulentní (když účinně zajišťuje přenos TDNA do buňky), může být použit nejen ke transformaci rostlin ale také hub. Dokonce bylo zjištěno, že i selekční markery užívané pro selekci transformantů rostlin mohou být účinné pro selekci transformantů hub. Tímto způsobem byla získána řada transformantů hub různých druhů.

9. 5. Mykoviry Zajímavými genetickými elementy, které se vyskytují u hub všech oddělení, jsou mykoviry. Jejich genetická informace je zapsána na dvouřetězcové RNA (dsRNA). Infekce mykoviry se může projevovat viditelnými příznaky, a nebo (velmi často) může zůstat bez symptomů. Mohou se vyskytovat v cytoplazmě nebo mohou být striktně vázány na mitochondrie. Jedna skupina mykovirů, mitoviry, upoutala pozornost badatelů, protože může podstatně ovlivňovat virulenci patogenních hub tím, že zpomaluje jejich růst a sporulaci. Většina mitovirů je známa z fytopatogenních hub jako např. Ophiostoma, Cryphonectria, Botrytis, měně víme o mitovirech kolonizujících rody Sclerotinia, Thanatephorus, Thielaviopsis, Helicobasidium, Tuber a Glomus. Tento nepoměr je způsoben právě potenciální možností využívat mitoviry při kontrole virulence patogenů. Mykoviry lze v houbách detekovat tím, že z nich vyextrahujeme celkovou RNA, která však bývá znečištěna DNA. Proto je třeba tuto DNA odstranit naštěpení enzymem DNÁzou. Pak se odstraní jednořetězcová RNA naštěpením nukleázou S1 a dvouřetězcová RNA se denaturuje a reverzní traskripcí převede na cDNA.

10. Komunikace houbové buňky s prostředím 10. 1. Obecné poznámky Jako všechny živé organismy musí i houby komunikovat s prostředím. Tato komunikace je komplexním jevem a je založena na fyzikálních a chemických interakcích. Kromě výměny signálů (informace) musí houbová buňka přijímat z prostředí živiny a naopak musí do prostředí vylučovat zplodiny metabolismu. Většina těchto procesů je řízena geneticky a spočívá např. na membránových receptorech nebo přenašečových systémech (transportérech). Přenašečové systémy jsou proteinové struktury lokalizované v lipidových membránách, které jsou zodpovědné za proces přenosu určité látky (skupiny látek) z jedné strany membrány na druhou (z vnějšího prostředí do buňky nebo naopak). Přenos může probíhat ve směru koncentračního gradientu (usnadněná difuze) nebo proti němu za spotřeby energie (aktivní transport) ve formě ATP, gradientu jiné látky (často protonů) nebo na úkor energie elektrického potenciálu na membráně.

24

Vlastní přenos látky z prostředí do buňky lze zhruba popsat Ohmovým zákonem (usnadněná difuze) nebo, jde-li o reakci katalyzovanou přenašečovým systémem, matematickým popisem formálně odpovídajícím rovnici Michaelise-Mentenové, popisující enzymovou reakci. Jde o saturační kinetiku popsanou maximálně možnou hodnotou rychlosti přenosu a konstantou poloviční saturace, což je taková koncentrace přenášené látky vně buňky, při níž se rychlost přenosu rovná polovině rychlosti maximálně možné.

10. 2. Membránové přenašečové systémy hub Přenašeče jsou různě specifické, specializované na různé látky. Známe přenašečové systémy pro sacharidy, aminokyseliny, nukleotidy, minerální kationty a anionty. Zvláštním případem látek jsou plyny, které jsou rozpustné v tucích, a proto snadno procházejí lipidovými membránami. Tím je zajištěno, že oxid uhličitý může snadno odcházet z buňky a kyslík do ní může snadno vstupovat. Přenašečové systémy do značné míry určují a vysvětlují kultivační vlastnosti a požadavky jednotlivých organismů. Například některé kvasinky mají vysoké hodnoty maximální rychlosti příjmu sacharidů a vysoké hodnoty konstanty poloviční saturace. Proto mohou růst velmi rychle, ale v přírodě je jejich růst omezen na prostory s vysokou koncentrací cukrů. Naproti tomu některé vláknité půdní houby mají nízké hodnoty maximální rychlosti příjmu sacharidů a nízké hodnoty příslušné konstanty poloviční saturace, což znamená, že sice rostou pomalu, ale mohou využívat i velmi nízké koncentrace cukrů v prostředí. Některé kovové prvky (železo) tvoří velmi špatně rozpustné sloučeniny a nejsou tudíž ve formě volného iontu pro živé organismy prakticky dostupné. Organismy včetně některých hub musí pro zefektivnění příjmu těchto prvků vytvářet tzv. siderofory, které působí jako chelatační činidla a udržují tak daný prvek v roztoku a tudíž přístupný pro houbu.

10. 3. Jak lze pozorovat transportní pochody na cytoplazmatické membráně? Přenos elektricky nabitých iontů přes membránu lze charakterizovat jako prostorový elektrický proud (=pohyb elektrického náboje), jehož orientace je dána polohou příslušných přenašečových systémů na membráně. Prostorové proudy kolem metabolicky aktivní buňky lze elektrometricky detekovat. Tak lze lokalizovat například rozdiferencované části jednobuněčných stélek specializované na generaci membránového potenciálu a části specializované na aktivní transport, který je tímto potenciálem poháněn. Za zmínku stojí způsob, jakým lze prostorové elektrické kolem houbové (i jiné) buňky detekovat. Detekce se provádí pomocí tzv. vibrující sondy. Je to platinová kulička mikroskopických rozměrů, která se vibračním způsobem periodicky přemisťuje mezi dvěma krajními polohami, které jsou od sebe vzdáleny několik desítek mikrometrů. V krajní poloze sondy je vždy změřen elektrický potenciál a potenciály v obou krajních polohách se integrují. Tím je dosaženo zásadního potlačení šumu, který by jinak měření znehodnotil. Vzhledem k tomu, že tímto způsobem lze změřit rozdíl potenciálů obou krajních poloh sondy a zároveň je znám elektrický odpor prostředí (média), lze podle Ohmova zákona určit proud, který v prostředí teče. Změnami krajních poloh sondy

25

vzhledem k buňce lze elektrické pole i proudové hustoty v okolí buňky „ohmatat“ a tím určit, ve kterých částech buňky/stélky/hyfy dochází ke generaci proudu a ve které k jeho spotřebě. U hub byla prokázána cyklická elektrická aktivita, která připomíná produkci akčních potenciálů u nervových buněk živočichů. Tato elektrická aktivita byla zaznamenávána metodickými prostředky obvyklými v neurofyziologii. Bylo ukázáno, že některé dřevokazné houby (Armillaria bulbosa) reagují změnou frekvence změn polarizace cytoplazmatické membrány na přítomnost využitelného substrátu (dřeva). Pokud bylo ke kultuře přidáno čerstvě nařezané dřevo, frekvence akčních potenciálů vzrostla, pokud bylo odstraněno, opět klesla. To bylo pozorováno opakovaně.

11. Houbové toxiny Houby působí na své prostředí produkcí řady látek, produktů sekundárního metabolismu, které mohou být vysoce biologicky aktivní. Mohou například působit jako alelopatika, látky potlačující růst jiných organismů, a tím omezovat přítomnost konkurenčních organismů v prostředí. To je pravděpodobně případ některých houbových toxinů, i když toto působení není příliš běžné, protože se toxiny většinou v přírodě vyskytují jen v nízkých koncentracích a jsou také imobilizovány na sorpčním půdním komplexu. Poměrně vysoké koncentrace toxinů však nacházíme tam, kde je velká koncentrace biomasy houby, například v plesnivých potravinách, v plodnicích hub nebo v laboratorních kulturách. Průmyslově důležitou skupinou houbových toxinů jsou námelové alkaloidy, skupina látek produkovaná houbami Claviceps purpurea (paličkovice nachová) a Claviceps paspali, které byly v minulosti hrozbou při výrobě chleba z napadeného žita obsahujícího sklerocia paličkovice, tzv. námel. Po požití takového chleba nastávala vážná otrava, která končila útrapami a smrtí, pokud postižení neměli možnost změnit stravu. Projevovala se mj. křečemi a stažením cév, které v končetinách působilo zhoršení prokrvení a končilo snětí. Tato otrava měla často až epidemický charakter a znamenala vážný společenský problém. Námelové alkaloidy, deriváty kyseliny lysergové a klaviny, mají dnes využití v medicíně a některé jsou zneužívány při výrobě drog (LSD). Další důležitou skupinou houbových toxinů jsou aflatoxiny, které byly pojmenovány po houbě Aspergillus flavus, která způsobovala úhyn drůbeže krmené krmivem kontaminovaným právě touto houbou. Aflatoxinů je známo několik druhů, z nichž nejnebezpečnější jsou aflatoxiny B1 a B2. Jsou produkovány některými druhy rodu Aspergillus, mají karcinogenní účinky, poškozují játra a imunitní systém. Některé druhy rodů Penicillium a Aspergillus produkují další toxin patulin, který bývá přítomen v plesnivém ovoci. Je také karcinogenní a poškozuje slezinu a játra. Plesnivé obilí a siláž často obsahují toxiny trichoteceny. Jsou produkovány houbami rodů Fusarium, Trichoderma, Myrothecium a Trichotecium. Jejich nejdůležitejším účinkem je poškození trávicího ústrojí a tzv. toxickou aleukii, která má vysokou úmrtnost. Toxiny tohoto typu mají na svědomí smrt velkého množství lidí v bývalém Sovětském svazu po 2. světové válce, v jejím průběhu a pravděpodobně také v období Leninovy tzv. „nové ekonomické politiky“, tedy období společenského chaosu, kdy obilí zůstávalo přes zimu

26

nesklizené na poli a využito bylo až na jaře, kdy však již bylo kontaminováno houbami produkujícími toxiny. Toxiny velkých hub (tj. druhů produkujících plodnice) způsobují otravy houbařům. Za nejjedovatější houbu je označována Amanita phalloides (muchomůrka zelená). Obsahuje peptidické toxiny amanitiny (amatoxiny) a falloidiny (falotoxiny). Alfa-amanitin blokuje transkripci (syntézu mRNA) tím že inhibuje RNA-polymerázu II. Falloidiny nevratně poškozují jaterní buňky. Otrava začíná 6 až 12 hodin (někdy i po více než 24 hodinách) po požití houby a projevuje se nevolností, zvracením, průjmy. Tyto příznaky jsou později komplikovány selháním ledvin a jater se žloutenkou - tzv. faloidní neboli hepatorenální syndrom. Léčba je velmi obtížná až téměř nemožná, i když francouzský lékař P. Bastien dokázal bez úhony 3x přežít dobrovolnou otravu smrtelnou dávkou Amanita phalloides tím, že po vypuknutí příznaků dostal injekci vitamínu C a antibiotiky si vydesinfikoval střeva. Smrtelná dávka pro dospělého člověka je cca 50 g čerstvých plodnic. Velmi zákeřné jsou otravy působené látkami obsaženými v některých pavučincích, orelaniny. Z lékařského hlediska jde o tzv. nefrotoxický syndrom s nevolností, bolestmi hlavy a břicha a nadměrným močením. Důvodem smrti je poškození ledvin. U Cortinarius orellanus (pavučince plyšového) nastávají příznaky otravy nejdříve 4 den po požití. Pacienti umírají většinou po dvou až třech týdnech ale je znám případ úmrtí i po 161 dnech léčení. Smrtelná dávka pro dospělého člověka je 30 g čerstvých plodnic. Některé houby (Inocybe patoullardii) způsobují tzv. muskarinový typ otravy, který se projevuje zvýšeným pocením a sliněním, dušností, poruchami vidění, zúženými zornicemi, změnami rychlosti srdečního tepu a bolestmi břicha. Muskarinový typ otravy je poměrně častý. Příslušný toxin se nazývá muskarin a působí na receptory parasympatických nervových zakončení. Muskarin se vyskytuje v malém množství také u Amanita muscaria. Amanita muscaria a Amanita pantherina obsahují jako hlavní toxiny kyselinu ibotenovou, muscimol a muskazon. Způsobují tzv. pantherinový neboli psychotonický syndrom - působí na centrální nervový systém. Otrava nastává velmi rychle po požití. Účinky této houby byly ve středověku využívány při rituálních obřadech a pro vyprovokování bojovné nálady u některých skandinávských a sibiřských národů. Účinky na psychiku a vnímání byly zaznamenány také u jiných druhů hub, z nichž nejpopulárnější jsou účinky lysohlávek (Psilocybe spp.). Tyto účinky jsou způsobovány psychotropními látkami psilocybinem a psilocinem. Kult užívání lysohlávek je znám u indiánů z jižní a střední Ameriky, kde byl přísně společensky regulován a měl náboženský a léčitelský význam. Lysohlávky lze snadno kultivovat i za velmi primitivních podmínek, proto se staly oblíbenou a vyhledávanou drogou. Při otravě nastávají bolesti hlavy, poruchy rovnováhy a dostavuje se pocit štěstí (může být doprovázen pocitem změněného vědomí a vnímání) nebo deprese a zlost, vše může být kombinováno s halucinacemi. Užívání těchto hub může vést k psychózám a rozštěpení osobnosti a pravděpodobně i k cévním příhodám. Otrava hnojníkem inkoustovým (Coprinus atramentarius) je zajímavá tím, že nastává pouze tehdy, jestliže je za několik hodin po tepelně zpracované houbě požit alkohol. Způsobuje ji toxin koprin. Příznaky otravy se projevují několik minut po požití alkoholu jako silné zažívací potíže (zvracení), které jsou komplikovány bolestmi hlavy, třesavkou a

27

bušením srdce. Jde vlastně o silnou kocovinu, kdy se v těle vlivem působení toxinu na enzym aldehyddehydrogenázu hromadí toxický acetaldehyd.

12. Mykorhizní symbióza 12. 1. Obecné poznámky k mykorhizní symbióze Pojem „mykorhiza“ pochází z 19. století a byl poprvé použit pro popis soužití houby a kořenu rostlin a již v této době existovala představa o fyziologické funkci tohoto soužití. Dnes tento termín používáme jednak pro určitý způsob soužití houby a kořene rostliny, jednak pro označení orgánu vzniklého modifikací kořene přítomností houby. Chceme-li od sebe tyto pojmy odlišit, je vhodné pro způsob soužití zavést označení „mykorhizní symbióza“. Původně byla mykorhizní symbióza považována za jakýsi mimořádný jev v přírodě, avšak postupem času se ukázalo, že je tomu naopak. Vyskytuje se u více než u 95 % rostlinných druhů Ve druhé polovině 20. století byly znalosti o mykorhizní symbióze shrnuty profesorem J. L. Harleyem. Dnes rozlišované typy mykorhizní symbiózy většinou vycházejí právě z jeho práce. Rozeznáváme endomykorhizní a ektomykorhizní typ symbiózy podle toho, zda houba proniká do vnitřního prostoru buňky nebo zůstává v mezibuněčných prostorech. Důležitým faktem je to, že mykorhizní symbióza se odehrává výhradně v kořenové pokožce (rhizodermis) a v primární kořenové kůře. Jen velmi málo rostlinných druhů nežije v mykorhizní symbióze.

12. 2. Arbuskulární mykorhizní symbióza Arbuskulární mykorhizní symbióza je fylogeneticky nejstarším typem mykorhizní symbiózy a pravděpodobně také nejstarším typem symbiózy, v níž se účastní houby. Vznikla v období před 460-410 miliony let a první náznaky výskytu organismů, které jsou velmi pravděpodobně předky dnešních arbuskulárních mykorhizních hub, byly zjištěny u suchozemských mechorostů. Zde však pravděpodobně ještě nelze hovořit o mykorhizní symbióze, stejně jako v případě kolonizace kůry rhizomů rostlin oddělení Rhyniophyta. U této posledně jmenované skupiny rostlin však již docházelo k masívní kolonizaci a fyziologická funkce tohoto soužití mohla být již velmi podobná dnešní arbuskulární mykorhizní symbióze. Zcela potvrzenou máme arbuskulární mykorhizní symbiózu u antarktických cykasů o stáří vyšším než 200 milionů let. Arbuskulární mykorhizní symbióza je primárním (univerzálním) a nejvíce rozšířeným typem mykorhizní symbiózy. U některých skupin rostlin byla nahrazena jiným typem mykorhizní symbiózy (např. ektomykorhizní symbiózou u mnoha dřevin mírného pásu). Některé skupiny ji pravděpodobně ztratily sekundárně tím, že začaly produkovat pro mykorhizní houby toxické látky (čeleď Brassicaceae). Arbuskulární mykorhizní houby patří do oddělení Glomeromycota, které čítá asi 250 druhů. Velmi rozšířenými druhy jsou např. Glomus mosseae a Glomus intraradices. Jsou to obligátně biotrofní organismy, které potřebují hostitelskou rostlinu k tomu, aby mohly uzavřít svůj životní cyklus. Mycelium je u těchto hub nepřehrádkované (pokud se přehrádky tvoří, je to důsledek stárnutí mycelia, stresu či oddělování spor). Metabolicky

28

aktivní mycelium tedy typicky obsahuje velké množství jader a dalších organel ve společné cytoplazmě. Tyto organizmy tvoří chlamydospory velkých rozměrů. V jediné spoře bylo nalezeno, podle druhu mykorhizní houby, od jednoho tisíce až do dvaceti tisíc jader. Vzhledem k tomu, že u arbuskulárních mykorhizních hub neznáme pohlavní rozmnožování, je otázkou, jak se udržuje diverzita genomu v myceliu a jak jsou z něj odstraňovány nevýhodné změny vzniklé např. mutací. V důsledku rychlého růstu hyf a jejich malého objemu by také mělo dojít k rychlé ztrátě některých typů jader, a tudíž k nevratným změnám na molekulární úrovni. Jedním z mechanizmů zabraňujících náhodné ztrátě části genomu může být již zmíněná výměna jader v důsledku mezihyfových anastomóz. Nepohlavní způsob rozmnožování u arbuskulárních mykorhizních hub přetrvává pravděpodobně již z velmi vzdálené minulosti. Genetická struktura těchto hub totiž neumožňuje tvorbu gamet, geneticky reprezentujících mateřský organizmus. To, že se jedná o nepohlavně se rozmnožující organizmy přežívající po několik set milionů let bez podstatných evolučních inovací, protiřečí základním evolučním teoriím, které učí, že nepohlavně se množící organizmy nutně hromadí ve své genetické informaci chyby, které od určitého množství znemožňují další existenci svého nositele. Absence pohlavního rozmnožování (sexu) po dlouhou dobu znemožňuje škodlivé mutace vyředit za pomoci rekombinačních procesů. Je možné, že arbuskulární mykorhizní houby (podobně jako například některé imperfektní askomycety a bazidiomycety) kompenzují nepříznivé vlivy nepohlavního rozmnožování tak, že rekombinaci zajišťují pomocí parasexuality, kdy dochází k přenosu jader mezi hyfami prostřednictvím hyfových spojů, anastomóz. Hyfy těchto hub tvoří v půdě rozsáhlou síť, jejíž jednotlivé větve se mohou vzájemně propojovat pomocí anastomóz. Houba proniká pomocí apresorií do kořene. Podle charakteru kolonizace kořene rozlišujeme 2 typy infekce: typ Paris a typ Arum, který je častější. Rostlina se může kolonizovat jednak myceliem existujícím v půdě, jednak klíčními hyfami vyrůstajícími z vyklíčivší chlamydospory. Specifita výběru partnerů v arbuskulární mykorhizní symbióze je velmi nízká. Jeden a tentýž druh mykorhizní houby může žít v symbióze s velmi širokou škálou hostitelských rostlin a naopak. Diagnostickou strukturou arbuskulární mykorhizní symbiózy je arbuskula. Je to intracelulární útvar, vzniklý dichotomickým větvením hyfy, která pronikla do buňky. Při průniku je perforována buněčná stěna kořenové korové buňky, nedochází však k narušení cytoplazmatické membrány, která se před pronikající a větvící se hyfou neustále vchlipuje. Vzniklý útvar je velmi komplexní a vyplňuje velkou část buňky. Má velký specifický povrch a je místem intenzívní výměny hmoty, energie a informace. Ve fyziologicky aktivní arbuskule nastává zejména předávání fosforu od houby k rostlině. Arbuskula prochází senescentním cyklem: zhruba po týdnu aktivního života nastává lyze jemnějších struktur arbuskuly, která je pravděpodobně uskutečněna rostlinou. Po ní zůstane v cytoplazmě buňky amorfní zbytek po materiálu arbuskuly uzavřený ve vakuole a pahýl nejsilnějších větví arbuskuly. Arbuskulární mykorhizní symbióza se vyskytuje u většiny kulturních rostlin: cukrové třtiny, kukuřice, obilnin, brambor, sóji a u mnoha dalších druhů rostlin pěstovaných jako zeleniny, ovoce nebo technické plodiny. Z toho je zřejmá důležitost této mykorhizní symbiózy pro agroekosystém.

29

12. 3. Orchideoidní mykorhizní symbióza Je typem mykorhizní symbiózy rostlin řádu Orchidales. Charakteristickou vlastností orchidejí je tvorba velmi malých semen prakticky bez zásobních látek. Po vyklíčení semene se proto musí klíční rostlina (protokorm) napojit na síť mycelia orchideoidní mykorhizní houby, která je schopna jí zásobovat živinami. Orchideoidní mykorhizní houba má vysoký saprotrofní potenciál a je schopna rozkládat a využívat půdní organickou hmotu. Pravděpodobně je schopna žít v půdě jako saprotrof i v nepřítomnosti orchideje. Ve stadiu protokormu však nelze ještě hovořit o mykorhizní symbióze, neboť rostlina nemá vytvořen kořen. Po vytvoření kořenového systému nastává typická orchideoidní mykorhizní kolonizace, kdy mykorhizní houba proniká do cytoplazmy buněk v hlubších vrstvách kořenové kůry. Cytoplazmatická membrána opět zůstává nenarušena a vchlipuje se před pronikajícími hyfami. V cytoplazmě se tak vytváří komplexní hyfový smotek (peloton), podléhající senescentnímu cyklu, který se může i několikrát opakovat. Tomuto majoritnímu typu mykorhizní kolonizace orchidejí říkáme typ tolypofágní. Vzácně se vyskytuje ještě typ ptyofágní, kdy hyfy v cytoplazmě nevytvářejí peloton, ale z jejich apexů se odškrcují membránové měchýřky (ptyozómy), které jsou cytoplazmou využívány. Tento typ mykorhizní symbiózy není téměř prostudován a byl popsán u několika málo tropických orchidejí. Nejznámější orchideoidní mykorhizní houbou je Rhizoctonia solani, anamorfní basidiomycet, a v tomto typu mykorhizní symbiózy žije řada dalších zejména basidiomycetů (orchideoidní mykorhizní houby Rhizoctonia repens a R. mucoroides byly poprvé popsány a izolovány počátkem 20. století. V průběhu doby byly převážně z kořenů orchidejí izolovány další druhy rhizoktonií, např. Rhizoctonia solani nebo Rhizoctonia goodyeare-repentis. Anamorfní druh Rhizoctonia solani, který tvoří orchideoidní mykorhizy, se dnes člení na anastomózní skupiny. Náležitost nějakého izolátu k určité anastomózní skupině je určena podle toho, jak je tento izolát schopen tvořit hyfové spoje (anastomózy) se sérií srovnávacích izolátů. Těchto anastomózních skupin je známo celkem 13 (AG-1 až AG-12 a AG-BI) a uvnitř nich lze pozorovat také určitou podobnost sekvencí ITS oblasti rDNA . Anamorfní rod Rhizoctonia v jeho nejširším pojetí, který zde souhrnně nazýváme rhizoktonie či rhizoktoniové izoláty, dnes můžeme označit za skupinu, do níž patří nejvíce druhů hub vytvářejících orchideoidní mykorhizy. Na základě morfologických znaků vegetativního mycelia byl později tento rod rozčleněn do několika opět anamorfních rodů, například Epulorhiza, Ceratorhiza nebo Moniliopsis. Dlouho však nebylo zřejmé, zda jsou tyto houby schopny tvořit také pohlavní stadia a k jakým perfektním druhům případně náleží. V 60. letech 20. století byla vyvinuta a úspěšně použita kultivační metoda, která u některých izolátů vyprovokovala tvorbu pohlavních struktur. Metoda spočívá v překrytí agarové kultury sterilizovanou zeminou, umožňující občasnou fruktifikaci těchto izolátů, a tím i platný popis jejich pohlavně úplného neboli perfektního stadia (podle pravidel platných v mykologii mají anamorfní a teleomorfní stadium téhož houbového organizmu dvě různá platná jména). K jednotlivým anamorfním rodům tak byla přiřazena tato jména: Tulasnella (= anamorfní stadium Epulorhiza), Sebacina (= Epulorhiza), Ceratobasidium (= Ceratorhiza), Thanatephorus (= Moniliopsis) a Waitea (= Moniliopsis) ještě dříve, než mohly být tyto anamorfy identifikovány geneticky. Tak jako všechny ostatní dosud poznané taxony hub vytvářející

30

orchideoidní mykorhizy, i všechny „rhizoktoniové“ izoláty patří mezi stopkovýtrusé houby. Fyziologická funkce orchideoidní mykorhizní symbiózy není tak jednoduše popsatelná jako funkce symbiózy u protokormu. Zřejmě zde dochází k obousměrnému přenosu minerálních živin i organického uhlíku. Známe také mykorhizní symbiózu nezelených orchidejí neschopných fotosysntézy (hlístník hnízdák), kdy dochází k výživě rostliny uhlíkem a energií prostřednictvím houby. Tento způsob výživy se nazývá mykotrofie. Význam orchideoidní mykorhizní symbiózy je podtržen tím, že orchideje vytvářejí malý počet tlustých kořenů, které tak mají malý specifický povrch a tudíž samy o sobě nedostatečně zajišťují absorpci živin z půdy. Velká závislost orchidejí na jejich mykorhizní symbióze je jedním z důvodů jejich obtížného umělého množení. Při něm se využívá inokulace pěstebního substrátu mykorhizní houbou a následného výsevu semen. Tato technologie je zejména v případě orchidejí mírných pásů nedořešená a její výsledky jsou nejisté.

12. 4. Ektomykorhizní symbióza V ektomykorhizní symbióze žije zhruba 2000 rostlinných druhů, většinou stromů a keřů, zejména v lesích mírného pásu a v severských (boreálních) ale i v tropických lesích (včetně lesů tvořených bobovitými rostlinami), a odhadem se jí účastní přinejmenším 5000 druhů bazidiomycetů a askomycetů. Typicky se na ploše lesa (i monokulturního) o velikosti 0,1 hektaru nachází asi 13–35 druhů ektomykorhizních hub. Jiné údaje hovoří o 66 druzích (roční průměrná hodnota) ektomykorhizních hub s nadzemními plodnicemi na ploše 0,15 hektaru, přičemž počet druhů saprotrofních bazidiomycetů s nadzemními plodnicemi nalezených na téže ploše byl jen poloviční. Mykorhizní houba neproniká do vnitřních prostor buněk rhizodermis ani kořenové kůry. Po kolonizaci jemného postranního kořene dojde k poškození vrcholového meristému s následným narušením prodlužovacího růstu a zvýšenému tloustnutí. Může také dojít ke změnám větvení. Takto vzniklá struktura je na povrchu kryta hyfovým pláštěm a v mezibuněčných prostorech primární kořenové kůry obsahuje hyfy, které tvoří Hartigovu síť. Ektomykorhizy mívají kyjovitý tvar a jejich morfologie se u různých kombinací hostitel-mykorhizní houba poněkud liší. Jsou myceliem propojeny s půdním prostředím. Ektomykorhizní houby patří v naprosté většině mezi askomycety a basidiomycety. Mají velmi různou specifitu: známe zcela nespecifické houby (Cenococcum geophilum) i houby s absolutní specifitou (Suillus grevillei žije pouze v symbióze s modřínem). Mají také velmi různý saprotrofní potenciál. Některé z nich nelze kultivovat na umělých živných médiích (Cortinarius, Russula), některé další lze naproti tomu kultivovat velmi snadno (Boletus, Laccaria). Zdá se, že tento typ mykorhizní symbiózy vznikl nezávisle hned několikrát (možná mnohokrát) a že je fylogeneticky nestabilní. Některé vývojové linie pravděpodobně v průběhu vývoje několikrát změnily životní strategii (symbiotická vs. nesymbiotická). Biomasa mycelia (včetně mycelia v mykorhizách) může nabývat značných hodnot. Odhaduje se, že v lesní půdě se na 1 hektaru plochy nachází asi 800 kg mycelia. Biomasa ektomykorhizních hub zde může tvořit asi jednu třetinu celkové mikrobiální biomasy a je

31

také zodpovědná za přítomnost asi jedné třetiny rozpuštěné organické hmoty v půdním roztoku. Vzhledem k tomu, že do půdy rozvádí značné množství uhlíkatých látek z kořenů rostlin, může být důležitým faktorem ovlivňujícím koloběh zejména uhlíku v ekosystému. Zároveň je zřejmé, že biomasa ektomykorhizních hub je faktor významně ovlivňující vlastnosti půdního prostředí, které obývá.

12. 5. Erikoidní mykorhizní symbióza V erikoidní mykorhizní symbióze žije velká většina zástupců rostlin řádu Ericales. Tyto rostliny se vyznačují velmi jemnými kořeny s potlačenou kořenovou kůrou. Z toho vyplývá, že erikoidní mykorhizní symbióza spočívá v kolonizaci zejména buněk kořenové pokožky - rhizodermis - houbovými strukturami. Erikoidní mykorhizní symbióza je dalším endomykorhizním typem symbiózy, tj. houba proniká do buněk kořenové kůry hostitele. Je pravděpodobně poněkud více specifická (tj. partneři – hostitelská rostlina a izolát mykorhizní houby – jsou vzájemně více vybíraví), než je tomu u arbuskulární mykorhizní symbiózy a ve většině případů i u symbiózy ektomykorhizní. Jistá volnost ve výběru rostlinného partnera však byla také pozorována. Erikoidní mykorhizní houba Hymenoscyphus ericae byla totiž například zjištěna ve rhizoidech řady foliózních játrovek. Po izolaci houby a po kolonizačních pokusech in vitro bylo prokázáno, že houba tvořila jak normální mykorhizy erikoidního typu, tak i žila v symbióze s rhizoidy játrovky. Jde o důkaz, že jedna a táž symbiotická houba je schopna tvořit symbiózu jak s cévnatými, tak i s bezcévnými rostlinami. Erikoidní mykorhizní symbióza vznikla pravděpodobně před zhruba 140 miliony let a zdá se, že se houboví partneři vyvinuli ze saprotrofních askomycetů. Bylo to odhadnuto pomocí molekulárně-genetické analýzy mykorhizních hub. Je typická pro kyselé prostředí s velmi nízkými koncentracemi živin a jejich pomalým oběhem.

12. 6. Ekologie mykorhizní symbiózy Mykorhizní houba působí na rostlinu tak, že propojuje její kořen s půdním prostředím a ovlivňuje jeho fyziologii. Zejména se uplatňují 3 vlastnosti mykorhizní houby: 1) vláknitý tvar mycelia, který umožňuje efektivní transport látek, 2) malé rozměry (průměr) hyf, umožňující využívat půdní prostory které nejsou v dosahu kořene a 3) těsný, přímý, nezprostředkovaný kontakt s hostitelskou rostlinou. Tyto vlastnosti mycelia vysvětlují pozorované experimentální zlepšení růstu rostliny způsobené zlepšenou minerální výživou, lepším přísunem vody nebo zvýšenou odolností proti chorobám. Tyto změny mají ekologické důsledky - zlepšení kompetiční schopnosti hostitelské rostliny. Protože některé mykorhizní houby jsou velmi málo specifické ve výběru hostitelských rostlin, mycelium mykorhizních hub (myceliální kontinuum) může propojovat velmi nepříbuzné rostliny (např. dřeviny s trávami). V takovém případě může docházet k výměně energií bohatých uhlíkatých látek mezi bohatě rostoucími rostlinnými druhy a druhy malého vzrůstu, které by jinak trpěly např. nedostatkem světla. To může vést k omezení kompetice uvnitř společenstva mykorhizních rostlin a zvětšení jeho druhové rozmanitosti.

32

Mykorhizní symbióza je pravděpodobně nejméně významná v primární sukcesi při dostatku živin a absenci stresu (ruderální rostlinná společenstva). Ruderální společenstvo je postupně nahrazeno přechodným společenstvem kompetičně úspěšných rostlin, které jsou více závislé na mykorhizní symbióze. Konečné, klimaxové stádium vývoje rostlinného společenstva je charakteristické velkou odolností proti stresu a zároveň vysokou závislostí rostlin na mykorhizní symbióze.

13. Čarodějné kruhy Výskyt plodnic saprotrofních i ktomykorhizních makromycetů může být organizován na okrajích kruhů. Kdysi se myslelo, že jde o místa vyšlapaná vílami či čarodějnicemi, proto označení „čarodějné kruhy“. Tyto kruhy mají rozměry od desítek centimetrů do sta metrů a jsou nejlépe patrny výšky (např. na letištích). Kruhy se mohou rozpadat na oblouky nebo pruhy. Růst plodnic v kruzích je znám u desítek druhů hub. Nejznámějším případem je Marasmius oreades, špička travní. Původní bodová kolonie se v trávě zvětšuje a mycelium produkuje toxické látky (kyanovodík) které travní porost silně poškozují tak, že rostliny odumírají. Tím se uvolňují do půdy minerální živiny (dusík), které jsou přeživším rostlinám k dispozici. Proto rostliny, které přežily, rostou bujněji a jsou tmavě zelené. Uprostřed kruhu mycelium stárne a odumírá a uvolněná plocha je opět kolonizována původním travním společenstvem. Protože růst mycelia probíhá směrem od centra kruhu, čarodějný kruh se postupně zvětšuje. Průměr kruhu je pak úměrný stáří kolonie houby. Zdá se, že některé houbové kolonie mají podle velikosti a rychlosti růstu stáří více než 600 let. Tento charakter růstu je pravděpodobně velmi častý ale jen někdy se projevuje změnami prostředí, které lze vizuálně postřehnout. Rychlost růstu čarodějných kruhů se liší podle druhu houby a podle půdních podmínek, teplot a vlhkosti. Může být v nepříznivých podmínkách nepatrná ale pokud jsou podmínky vhodné pro růst mycelia, může dosahovat desítek centimetrů i více než 1 metr ročně (například u druhu Langermannia gigantea, vatovec obrovský).

14. Lišejníky: zvláštní případ soužití hub s řasami nebo sinicemi Dalším známým příkladem soužití hub s jinými organismy jsou lišejníky. Toto soužití mezi houbou (mykobiontem) a fotosyntetizujícím mikroorganismem (fotobiontem), kterým je buď zelená řasa, nebo sinice, je nazýváno lichenismus. Nově vzniklý podvojný organismus je schopen žít na takových místech, kde by žádný z partnerů samostatně žít nemohl, např. na holých skalách. Fotobiont tvoří fotosyntézou cukry a jiné organické látky (pokud je fotobiontem sinice, uplatňuje se i její schopnost fixovat vzdušný dusík), houba dodává vodu a minerální živiny, které získává naleptáváním hornin. Symbióza obou složek se projevuje i v nepohlavním rozmnožování lišejníků, při němž se tvoří rozmnožovací orgány složené z mykobionta i fotobionta. Lišejníky, kterých je popsáno asi 14 000 druhů, tvoří pouze ekologickou skupinu; charakter stélky a pohlavní rozmnožování většinou určuje houba a proto jsou lišejníky ve fylogenetickém systému řazeny do systému hub (lichenizované houby). V přírodních

33

podmínkách rostou lišejníky velmi pomalu, stélka se zvětší jen o několik mm za rok. Obdobná je situace i při jejich umělé kultivaci v laboratorních podmínkách, i když některé druhy rostou v laboratoři rychleji než v přírodě. V laboratoři se podařilo vypěstovat mykobionta i fotobionta odděleně a pěstovat je v čistých kulturách. Dokonce byly provedeny umělé syntézy lišejníků z jednotlivých partnerů. Z ekologického hlediska jsou lišejníky nesmírně důležitými činiteli při primárním zvětrávání hornin a vzniku půdy. Houba je velmi odolná vůči výkyvům teplot a vlhkostí, což jí umožňuje se udržet na povrchu zvětrávaného materiálu. Vytváří zde organickou vrstvu, která umožňuje kolonizaci dalšími organismy. Některé druhy lišejníků jsou bioindikátory znečištěného ovzduší; zvláště citlivě reagují na oxid siřičitý, a proto se již mnohé druhy ve městech nevyskytují.

15. Mykoparasitismus - parasitismus hub na jiných houbách Mykoparasitismus je poměrně častým jevem. Odhaduje se, že asi 3000 druhů hub parazituje na jiných houbách. Nekrotrofní parazitické houby nejprve svými toxiny zabijí hostitelskou buňku a pak se z jejích zbytků živí saprotrofně, k čemuž mají důkladnou enzymovou výbavu. Tak je tomu u mnoha půdních mikroskopických hub, například u rodu Trichoderma a druhu Clonostachys rosea (Gliocladium roseum). Biotrofní paraziti neusmrcují hostitelskou buňku, ale vysílají do ní specializovaný orgán (haustorium) nebo hyfy, kterými čerpají výživu. V posledních desetiletích se mykoparazitické houby využívají v biologickém boji s fytopatogenními houbami. Nejúčinnějším způsobem aplikace je inokulace půdy sporami mykoparazitické houby. Tímto způsobem se aplikují spory hub rodu Trichoderma v boji proti fytopatogenním druhům rodů Verticillium, Sclerotinia, Botrytis a Fusarium. Plodnice makromycetů bývají často napadány mykoparazitickými houbami. Nejznámějším případem je napadení plodnic stopkovýtrusé houby Scleroderma citrinum (pestřec obecný) hřibem cizopasným (Xerocomus parasiticus). Podobně jsou také podzemní plodnice u rodu Elaphomyces (jelenka) napadány vřeckovýtrusou houbou Cordyceps ophioglossoides (housenice cizopasná). Velmi známé jsou zlatožluté povlaky mikroskopické houby Apiocrea chrysosperma (nedohub zlatovýtrusý) na přezrálých plodnicích Xerocomus chrysenteron (hřibu žlutomasého).

16. Symbióza hub s živočichy Existuje rovněž symbióza hub se zástupci živočišné říše. V těchto případech je nutno chápat termín symbióza velmi obecně, protože se často jedná o určité područí, v kterém houba žije, i když na druhé straně se živočišný partner často o houbu velmi pečlivě stará. Většinou tak živočichové (jedná se převážně o zástupce hmyzu) obcházejí svou neschopnost metabolizovat celulózu a lignin. Symbiotická houba může žít v interakci z živočichem tak, že buď obývá vnitřní prostor jeho těla po celý život (endosymbióza) nebo se vyskytují na jeho povrchu. Uvnitř buněk měňavek žijí houby rodu Cochlonemus a Endocochlus, v tělních dutinách kroužkovců se vyskytují rody Catenaria a Nematoctonus. Endosymbiózy jsou nevíce rozšířené u hmyzu.

34

Houby mohou žít ve zvláštních buňkách mycetocytech které mohou být organizovány v orgánech zvaných mycetomata. Brouci ze skupiny Scolytinae (kůrovci) si v rostlinných pletivech vytvářejí chodbičky, v nichž pěstují asociované houby. Jde o mutualistický vztah, v němž brouk využívá symbiotickou houbu jako zdroj potravy a jako ochranu proti obranným látkám, kterými rostlina reaguje na napadení broukem. Houba je naopak broukem přenášena a očkována do nově osídlených prostor. Přísně vzato, tato asociace obsahuje ještě další složky - jiné houby, roztoče, kvasinky a bakterie. Síla vazby mezi broukem a je velmi různá, od volného vztahu až po naprostou závislost (houba bez brouka z prostředí zmizí, brouk se živí výhradně houbou). Zcela závislí na houbě jsou tzv. ambrosioví brouci, kteří se zavrtávají do xylemu mrtvých stromů a jsou schopni trávit pouze houbovou biomasu, jenž jim poskytuje steroly, které neumějí sami syntetizovat. Ambroziový způsob života představuje velmi výhodnou evoluční inovaci, protože v průběhu evoluce vznikl nezávisle několikrát. Umožňuje broukům osídlovat široké spektrum hostitelských rostlin. Ambróziové houby (Raffaelea) tvoří v chodbičkách (galeriích) ambrosiovou vrstvu, která musí být broukem udržována a ten na ní spásá konidie. Brouk přenáší inokulum houby v tzv. mykangiích. Lýkožraví kůrovci se naprotitomu živí rostlinnými pletivy, která mohou kombinovat s myceliem hub. Často spolupracují s fatopatogenními houbami, které jim usnadňují průnik do rostliny (Ophiostoma, Ceratocystis). Samičky některých pilořitek, jejichž larvy žijí ve dřevě, mají mezi články zadečku kapsovité útvary mycetangia obsahující houby. Při kladení vajíček se vajíčka infikují houbou a tím je zajištěna kontinuita soužití. Vylíhnuté larvy vyžírají ve dřevě chodbičky, přičemž částečný rozklad dřevní hmoty a její stravitelnost jsou zajišťovány právě houbami rodů Stereum, Amylostereum a Cerrena. Velmi známé je soužití jihoamerických mravenců rodu Atta s houbami, které si mravenci pěstují v podzemních pěstírnách (zahrádkách), které zásobují nastřihanými listy. Mravenci se živí výhradně houbami, jsou na nich zcela závislí. Jsou nazýváni listokazy, protože okusují listy stromů, a to mnohdy ve velkém měřítku. Tito mravenci se specializují na jednotlivé úkony spojené s pěstováním hub, a navíc jsou své určité funkci přizpůsobeni i stavbou těla. Dělba práce je následující: jedni mravenci vylezou na strom a přehryžou stopky listů. Pod stromem druhá skupina mravenců velkými kusadly vykrajuje okrouhlé kousky. Další skupina - nosiči - přenáší tyto kousky listů do mraveniště. Mraveniště, které je zpravidla rozsáhlé a zasahuje několik metrů pod zem, je rozděleno na poschodí s velkým počtem sklípků. Nosiči svůj náklad ukládají v horních poschodích, kde jej zpracují mravenci - drtiči. Ti kusadly kousky listů rozmělňují. Zaočkování houbou provedou příslušníci další profese, kteří ze sklípků, kde již houba roste, přenesou kousky podhoubí a nasadí je do připraveného substrátu. Substrátem houba rychle prorůstá, mravenci jej pravidelně postřikují svými výměšky a na jeho povrchu okusují mycelium. Z konečků okousaných vláken začnou vyrůstat zvláštní zduřelé měchýřky, bohaté na bílkoviny. Ty jsou jedinou potravou všech příslušníků mraveniště. Pokud mravenci o substrát pečují, udržují v něm monokulturu jediného houbového druhu. Jakmile mraveniště opustí, je substrát rychle kolonizován různými druhy hub. Houby z mraveniště se podařilo izolovat do čisté kultury a vypěstovat do stadia plodnic. Nejznámější druh byl popsán jako Rozites gangliophora. Podobně se chovají také jihoameričtí termiti. Využívají přitom rozkladu dřeva a trávy enzymy hub. Termiti se živí požíráním dřeva a různých rostlinných zbytků. Protože

35

nejsou schopni trávit lignocelulózový materiál, řeší to tak, že v termitištích na substrátu ze svých výkalů pěstují houby, které požírají a k trávení pak využívají houbou produkované celulázy. Tak se udržuje v trávicím traktu, v prostředí hnízda i ve zpracovávaném materiálu vysoká koncentrace rozmnožovacích částic houby. Na povrchu termitiště se objevují plodnice hub, které vyrůstají ze substrátu bohatého na živiny. Tyto plodnice, které jsou mnohdy značně veliké (průměr klobouku až 30 cm), s oblibou sbírají domorodci a je možno je vidět na trzích v některých oblastech Asie (např. v Thajsku). Tyto bazidiomycety byly určeny, zařazeny do rodu Termitomyces a je celkem popsáno na 30 druhů. Kromě druhů rodu Termitomyces byly v substrátu nalezeny i dva druhy patřící do rodu Xylaria.

17. Anaerobní houby Široce zakořeněná představa o houbách jako striktně aerobních organismech není přesná. Velmi známým příkladem, který porušuje toto zažité pravidlo je řada kvasinek, které jsou běžně schopny žít v anaerobním prostředí. Existuje ale také významné oddělení vláknitých hub zvané Neocallimastigomycota, které zahrnuje striktně (obligátně) anaerobní organismy, které se vyskytují v zažívacím traktu některých velkých savců, například skotu. Jde o mikroorganismy, které na základě molekulárně genetických znaků jednoznačně patří mezi houby. Důležitou modifikací (adaptací na anaerobní podmínky) je absence mitochondrií, které jsou nahrazeny hydrogenozómy. V úzkém smyslu slova nazýváme anaerobními houbami právě oddělení Neocallimastigomycota. Dlouho však nebylo jasné, o jaké organismy se jedná. Předpokládalo se, že jde o prvokyjednobuněčné živočichy. Badatelé totiž v obsahu bachoru nacházeli po požití potravy prvokům podobné jedno- i vícebičíkaté zoospory. Ostatní struktury těchto organismů (mycelium, sporangia), které jsou skryty v pevných částečkách potravy, unikaly pozornosti až do roku 1974, kdy byly C. G. Orpinem poprvé definitivně identifikovány, i když byly zprvu považovány za chytridiomycety. Rozlišujeme druhy se stélkou monocentrickou a stélkou polycentrickou. Zástupci těchto hub náležejí například do rodů Neocallimastix, Orpinomyces, Piromyces, Anaeromyces. U skotu se vyskytují v bachorové šťávě. Není přesně známo, jakým způsobem je zažívací trakt mladých zvířat kolonizován. Bachor jako životní prostor obývaný anaerobními houbami je velmi specifické prostředí. Kyslík se zde nevyskytuje, oxidačně redukční je záporný (-300 až -350 mV), panují zde tedy silně redukční podmínky. pH je slabě kyselé až neutrální (6-7). Teplota je proti savčí tělesné teplotě mírně zvýšená (38-42 ºC), což je způsobeno uvolňováním tepla při intenzívních biochemických reakcích. Bachor obsahuje složité mikrobiální společenstvo, v němž anaerobní houby zajišťují rozklad převážně polysacharidových složek potravy a uvolňují cukry, molekulární vodík, etanol, oxid uhličitý a organické kyseliny. Některé z těchto látek jsou využity zvířetem, jiné jsou dále zpracovány bakteriální složkou bachorového společenstva, čímž vzniká značné množství metanu. Teoreticky a potenciálně i prakticky je zajímavý způsob, jakým anaerobní houby rozkládají polysacharidy včetně celulózy. Využívají k tomu tzv. celulozóm, modulární bílkovinnou strukturu, která obsahuje bílkovinnou kostru, na niž se váží organizující bílkoviny zvané dokeriny, které umožňují vazbu aktivních enzymových složek celulozómu: celuláz, xylanáz, glukanáz ... Na hlavní bílkovinnou kostru se však váží také

36

CBD (cellulose binding domains), které váží celý celulozóm na povrch rozkládaného substrátu, kde jej koncentrují a tím zvyšují účinnost rozkladu. Podobné celulozómy byly popsány u anaerobních bakterií Clostridium cellulovorans. Celulozóm má velmi nadějný praktický potenciál pro využití při zcukřování rostlinné biomasy.

18. Léčivé houby Houby se používaly, podobně jako léčivé rostliny, k léčení od starověku. Ve staré Číně se používal v ženském lékařství námel, využívalo se jeho vasokonstrikčních účinků. Číňané také dlouho znají housenici čínskou (Ophiocordyceps sinensis), kterou užívají jako posilující prostředek a prostředek posilující imunitu. Další důležitou léčivou houbou je paličkovice nachová, námel. I když námel používali i staří Řekové, evropská medicína se stavěla k houbám jako léčivům spíše odmítavě. Lze říci, že léčivých účinků hub si cenila východní medicína mnohem více. Tato situace se odráží i do současnosti, i když se v posledních desetiletích mění. Houby se však zařazují mezi tzv. doplňky stravy, tj. prostředky bez deklarovaného léčivého účinku. Jejich nevýhodou je často zbytečně přemrštěná cena, která může omezit jejich dostupnost. Léčivé houby se dnes používají buď jako tzv. „nutriceutical“, tedy samostatně užívaný preparát (sušená biomasa nebo extrakt), nebo jako tzv. „nutraceutical“, kdy se užívají jako příměs do stravy. Odhaduje se, že existuje asi 10000 druhů makromycetů (druhů tvořících makroskopické plodnice). Z nich asi 20 druhů se dnes používá jako léčivých. V roce 1999 se ve světě obchodovalo léčivých hub asi za 6 miliard dolarů, z toho připadalo asi 1.5 miliardy dolarů za nejvíce užívaný druh - Ganoderma lucidum (lesklokorku lesklou). Pokud nebereme v úvahu antibiotika, je ekonomicky významných čistých preparátů vyráběných z léčivých hub jen několik. Jde o lentinan, schizophyllan a krestin. Lentinan je čistý polysacharid izolovaný z plodnic a mycelia Lentinula edodes (shii-take, houževnatec jedlý). Má protinádorové účinky a působí nepřímo stimulací imunitní odpovědi. Používá se injekčně jako podpůrný přípravek v kombinaci s jinými léčivy. Krestin je protein-polysacharidový komplex extrahovaný z mycelia Trametes versicolor (outkovka pestrá). Kromě stimulace imunity také přímo brzdí růst některých nádorů. Schizophyllan je polysacharid z mycelia Schizophyllum commune, který opět stimuluje imunitu a potlačuje růst některých nádorů. Zkouší se také polysacharid z Ganoderma lucidum. Ganderma lucidum (lesklokorka lesklá) a několik příbuzných druhů rodu Ganoderma je po staletí velmi populární v Číně. Uměle se pěstuje a užívá se jako tonikum i jako prostředek pro podporu imunity. Má protinádorové účinky. Mechanismus účinku působení houbových polysacharidů na imunitu je velmi složitý a je předmětem intenzívního výzkumu. Struktura beta(1,3)-vazby na hlavním řetězci polysacharidu, kombinovaná s vazbou beta(1,6), která umožňuje větvení polysacharidu, podmiňuje biologickou aktivitu celé makromolekuly. V tenkém střevě stimuluje lymfoidní tkáň zvanou Peyerovy plaky a tím podporuje imunitní reakci. Houba Lentinula edodes snižuje hladinu cholesterolu v krvi. Za tuto aktivitu je pravděpodobně zodpovědná látka eritadenin, která se v houbě vyskytuje. Další látkou, která snižuje krevní cholesterol je lovastatin přítomná v Pleurotus ostreatus.

37

Léčivou houbou, jejíž pěstování a konzumace doznaly bouřlivý rozvoj v posledním desetiletí v Číně je housenice červená, Cordyceps militaris. Jde o houbu, jejíž účinky jsou ze všech léčivých hub nejlépe prostudovány. Houba napadá housenky některých druhů motýlů a pod zemí, když se přemění v kukly, je prorostou a mumifikují. Kukla je bohatá na organické látky a proto musí houba zajistit, aby ji nezkonzumovaly jiné půdní mikroorganismy. Dosahuje toho pravděpodobně produkcí řady sekundárních metabolitů, které potlačují růst konkurenčních mikroorganismů. Kromě beta-glukanu, který je mezi houbami obecně rozšířen, tak obsahuje jako hlavní účinnou látku kordycepin. Chemicky jde o nukleotid 3-deoxyadenosin, který má slabé antibiotické účinky a řadu dalších doložených vlastností. U této konkrétní látky byly prostudovány účinky na funkci imunitního systému a řadu dalších tělních systémů. Je známo, že se účastní odpovědi na některé virové infekce a velmi pravděpodobně zvětšuje odolnost organismu proti nádorovým onemocněním. V některých případech těchto účinků je přímo známa jejich molekulární podstata. Kordycepin podstatně ovlivňuje tvorbu bílkovin (proteinů) tím, že předčasně a nesprávně ukončuje jejich syntézu v ribozómu. Je to způsobeno nesprávným zkrácením molekul mediátorové RNA, která za normálních podmínek nese kompletní informaci o struktuře produkované bílkoviny. Organismus je pak podstatně oslaben a je oslaben tím více, čím více proteinů produkuje. Rostoucí mikroorganismy produkují hodně proteinů a mohou být proto kordycepinem senzibilizovány („zcitlivěny“) pro jiná (dosud neznámá) antibiotika, která housenice snad vyrábí a která dosud neumíme extrahovat. Způsob, jak si housenice chrání „svoji“ mumifikovanou kuklu je mnohotvárný, houba se pravděpodobně nespoléhá jen na jedinou ochrannou látku či strategii. Je proto možné, že nám kromě kordycepinu poskytne ještě některé další zajímavé produkty, které s touto ochranou souvisí.

19. Antibiotika - příklad praktického využití hub: Penicilin Penicilin je považován za první antibiotikum objevené A. Flemingem. Ve skutečnosti bylo již před objevem penicilinu objeveno několik jiných antibiotických látek (sparassol) a sám Fleming nebyl schopen penicilin účinně izolovat, chemicky popsat a testovat. Byl pouze schopen pozorovat jeho účinky in vitro. Tyto práce se datují do roku 1928, kdy Fleming působil jako lékař v jedné z Londýnských nemocnic. Penicilin byl izolován, charakterizován a testován H. Floreym v Oxfordu, kde byla zavedena před 2. světovou válkou jeho pokusná výroba. Problém s výrobou penicilinu spočívá v tom, že jde o slabou kyselinu, která je zároveň v kyselém vodném prostředí velmi nestabilní. Pokud je však vodný roztok penicilinu (např. kultivační tekutina po kultivaci houby Penicillium notatum) okyselen a ihned důkladně promísen s vhodným nepolárním, vodou nemísitelným rozpouštědlem, přejde penicilin (který není v kyselém prostředí disociován) kvantitativně do nepolární fáze, v níž může být odpařením zkoncentrován. Tohoto principu bylo využito při izolaci penicilinu. Nestabilita penicilinu v kyselém prostředí byla odstraněna chemickou modifikací, takže je možné jej aplikovat perorálně, aniž by byl zničen silně kyselým prostředím žaludku. Z obavy před tím, že by mohl být penicilin ukořistěn Němci při jejich předpokládané invazi do Anglie, byly práce na penicilinu přesunuty do USA, kde byla také postupně zavedena jeho průmyslová výroba. Práce na výzkumu a zavádění penicilinu značně

38

podpořily vážnost, rozvoj a podporu mykologie jako vědního oboru (C. Thom, K. B. Raper). Penicilin působí na rostoucí Gram-pozitivní (v menší míře na někt. Gram-negativní) bakterie, u nichž indukuje buněčnou lyzi. Je to způsobeno poruchou stavby buněčné stěny bakterie, která ztrácí mechanickou integritu a osmotické síly pak způsobí rozpad buňky. Výhodou penicilinu a jeho moderních derivátů je jejich velmi nízká toxicita pro živočišné organismy. Nevýhodami jsou možné alergické reakce a snadný vznik rezistence u cílových mikroorganismů.

20. Antibiotika - příklad praktického využití hub: Mucidin Mucidin je jediné klinicky užívané antibiotikum československého původu. Bylo objeveno skupinou dr. Vladimíra Musílka v Mikrobiologickém ústavu ČSAV v Praze v 60. letech 20. století. Toto antibiotikum produkuje dřevokazná houba Oudemansiella mucida (slizečka porcelánová). Působí proti jiným houbám. Na rozdíl od penicilinu je mucidin chemicky stabilní a velmi málo rozpustný ve vodě. Jeho příprava spočívá v extrakci (vytřepání) do vhodného nepolárního rozpouštědla a v jednoduché purifikaci. Protože byl mucidin aplikován zevně, bylo možné používat i surový extrakt z kultury houby. K měření antibiotické aktivity mucidinu v extraktech se využívá tzv. titrační plotny, což je vrstva vhodného živného agarového média obsahující homogenně rozptýlené zárodky vhodného testovacího organismu, například kvasinky rodu Candida. V médiu se korkovrtem vytvoří jamky, do nichž se pipetuje testovaný extrakt případně ředící řada standardního roztoku antibiotika. Antibiotikum difunduje do okolního média a jeho koncentrace klesá se vzdáleností od jamky. Aktivita antibiotika se projeví tak, že v okolí jamky nenastane růst testovacího organismu. Velikost této inhibiční zóny odpovídá koncentraci antibiotika v jamce. Mucidin působí na řadu vláknitých hub i kvasinkovitých organismů často mnohem lépe, než ostatní antibiotika (např. fungicidin). V jeho přítomnosti dochází k poruchám růstu, buňky mají abnormální tvar a na ultrastrukturní úrovni je patrné zásadní poškození mitochondrií. Bylo zjištěno, že mucidin blokuje dýchací řetězec tím, že blokuje přenos elektronů z cytochromu b na cytochrom c1. Mucidin se vyráběl ve fermentorech a aplikoval se pod jménem Mucidermin ve formě zásypu, masti nebo spreje. Byl ve své době velmi žádaným antibiotikem. Jeho výroba byla ukončena Koncem 70. let 20. století z neznámých důvodů. O něco později byla produkce chemicky identického antibiotika objevena zahraničními badateli u penízovky nahořklé (Strobilurus tenacellus) pod názvem strobilurin A. Priorita dr. Musílka nebyla uznána a strobilurin A dal jméno celé skupině antibiotik, tzv. strobilurinových antibiotik. Tato antibiotika mohou být efektivně získávána chemickou syntézou bez účasti biologického produkčního procesu a jejich chemická stavba může být podle potřeby modifikována. Tak byla například firmou Bayer zvýšena rozpustnost antibiotika do té míry, že může být používáno jako systemické - pronikající do celého

39

organismu. Používá se však nikoli v humánní nebo veterinární medicíně ale při ochraně rostlin (obilnin a zeleniny).

21. Houby patogenní pro člověka Choroby působené houbami nazýváme mykózy a podle toho, zda jsou povrchové nebo, napadají vnitřní prostředí organismu je označujeme jako invazívní (systemické) nebo neinvazívní (nesystemické). Lze proti nim bojovat řadou antifungálních léčiv (Amfotericin B, Thiabendazol, 5-fluorocytosin, Ketokonazol, Itakonazol, Flukonazol). Účinná léčiva mají někdy závažné vedlejší účinky a často vyžadují i speciální způsoby podání (injekce, infuze). Mykózy, které se rozvinou zejména do systemické podoby jsou velmi vážné zejména u imunodeficientních pacientů a pacientů s medikamentózně potlačenou imunitou (posttransplantační stavy) nebo se silnými dávkami antibiotik. Mezi invazívní mykózy patří aspergilózy, blastomykózy, kandidózy, kokcidiomykózy, kryptokokózy, histoplazmózy, parakokcidiomykózy, sporotrichózy a zygomykózy. Jsou velmi nebezpečné zejména u pacientů s imunodeficiencí. Aspergilózy jsou působeny askomycety rodu Aspergillus. Mají vysokou úmrtnost. Je možné je detekovat pomocí specifických galaktomannanů v krvi. Známe například cerebrální aspergilózu (napadení mozku), sinuitidu (napadení kostních dutin obličejové části hlavy), nebo keratitidu (napadení oční rohovky). Známy jsou i popáleninové infekce - sekundární kolonizace místa popálenin. Nejčastější formou mykóz u člověka jsou kandidózy. Houby rodu Candida jsou normální součásti mikroflóry povrchu těla, kde se chovají jako komensálové a člověk má proti nim vysokou přirozenou imunitu. To je případ druhů Candida parapsilosis a Candida guilliermondii. Mohou ale napadat plíce (kandidózní pneumonie), ústní dutinu, břišní dutinu (peritonitida) a řadu vnitřních orgánů včetně žlučníku, jater, urogenitální soustavy i centrální nervovou soustavu. Kandidózy, působené nejčastěji druhem Candida albicans, jsou velmi různorodé. Časté jsou vulvovaginální infekce přenášené pohlavní cestou. Candida jako původce lidského onemocnění byla poprvé jednoznačně rozpoznána při záměrném vyvolání infekce inokulací pravděpodobně právě houby Candida albicans do vaginy těhotné ženy Hausmannem v roce 1875. Vaginální kandiózy jsou častější u těhotných žen (30%) než u žen ostatních (5%) a jsou významně častější u žen užívajících některé druhy orální antikoncepce. Známy jsou také kolonizace penisu, kde vytvářejí infekční ložiska a způsobují leze tkání. Nepříjemné jsou kandidózy ústní dutiny (zejména u dětí), jícnu, žaludku i ostatních částí zažívacího traktu. V ústech se projevují jako nepřehlédnutelné světlé povlaky například na jazyce, dásních nebo patře apod. Mohou být jako mukokutánní infekce přítomny na velké části povrchu těla. Jsou známy případy, kdy se lokální infekce kůže projevuje tvorbou granulomatózních výrůstků bizarních tvarů. Dalším onemocněním působeným houbami jinak normálně přítomnými v komensální tělesné mykoflóře jsou kryptokoky. Cryptococcus neoformans je nejdůležitějším houbovým patogenem člověka. Lze jej v krvi detekovat podle extracelulárních polysacharidů. Kryptokokózy mají velkou úmrtnost a jsou nebezpečné pro imunodeficientní pacienty. Cryptococcus způsobuje plicní infekce, infekce centrální

40

nervové soustavy, okultní onemocnění prostaty odolné vůči léčbě, genitální léze, hepatitidu, thyroiditidu, sinusitidu, infekce slinných žláz, zánět hltanu, infekci žlučníku a žlučovodů, enteritidu, peritonitidu, mastitidu (ta je známa i u dobytka, který se nakazí kontaminovaným dojícím strojem, je kvůli ní veterinárně vyšetřován). Cryptococcus může způsobovat závažné osteolytické léze a artritidu. Mezi neinvazívní mykózy patří chromoblastomykóza, oční mykózy (mykotická keratitida), lobomykóza (masívní napadení končetin), mycetomata, kožní mykózy, onychomykózy (na nehtech), piedra (ložiskové napadení vlasů), pityriasis versicolor (pigmentované plochy pokožky) a tinea (napadení kůže na různých částech těla). Nejznámějším neinvazívním onemocněním je tinea. Rozeznáváme několik forem podle toho, jakou část těla postihují. Např. tinea pedis postihuje chodidla a meziprstní prostory na nohách, kde způsobuje nepříjemné praskání kůže. Jde o infekční onemocnění způsobované houbami Trichophyton rubrum nebo Trichophyton mentagrophytes. Postihuje asi 15% lidské populace. Stejnými houbami je způsobena i tinea corporis, která postihuje kůži, kde vytváří mapy se začervenalým okrajem. Často bývá na člověka přenesena ze zvířat.

22. Biotechnologie využívající houby Biotechnologie jsou technologie, které využívají organismy k získání produktů jiných, než je biomasa těchto organismů. Houby jsou využívány zejména v řadě biotechnologií souvisejících s potravinářstvím, farmaceutickým průmyslem, nebo s výrobou některých organických látek. Nejstarší houbovou biotechnologií je pravděpodobně výroba alkoholu (etanolu). Organizovaná výroba etanolu v podobě kvašených nápojů začala asi před 10000 lety na Středním východě a v Persii. Šlo zřejmě o výrobu kvašených alkoholických nápojů z medu, tedy něco na způsob medoviny. Později, asi před 8000 lety se na Středním východě začaly vyrábět kvašené nápoje z vinných hroznů, šlo tedy o počátky výroby vína. Je možné, že zkvašování bylo využíváno jako způsob konzervace šťávy. Zhruba před 5000 lety již ve Středomoří probíhal čilý obchod s vínem. Před cca 2800 lety se potom začalo v Indii vyrábět ječné a rýžové pivo. Kvašené nápoje jsou známy také ze staré Číny, Babylónie, Egypta a z řady území předkolumbovské jižní a střední Ameriky. Ve středověku znala Evropa medovinu, pivo a víno. K výrobě alkoholu se používá pivní kvasinka Saccharomyces cerevisiae, kterou řadíme mezi vřeckovýtrusé houby. Je schopna běžně zkvašovat cukry až do koncentrace etanolu asi 8 až 10%. Tzv. hlubokoprokvašující rasy kvasinek dosahují koncentrace etanolu kolem 18%. Toto omezení je způsobeno tím, že etanol je ve vysokých koncentracích toxický i pro samotné kvasinky (má konzervační účinky). Na přelomu 10. a 11. století objevili alchymisté v lékařské škole v Salernu (Itálie), že destilací vína je možné získat čistší a silnější alkoholický nápoj, destilace tak byla využita ke zvýšení koncentrace alkoholu. Proces destilace však již předtím znali Řekové a Arabové. Opakovanou destilací je možné koncentraci etanolu dále zvyšovat až na 96%, což je koncentrace etanolu v azeotropní směsi s vodou. Další zvyšování jeho koncentrace je možné s využitím sušidel (tzv. absolutní alkohol).

41

Do vlastní kvasné reakce vstupují monosacharidy (nikoli však všechny monosacharidy), například glukóza. Aby mohl být takto zpracován škrob, musí být nejprve rozštěpen na glukózové jednotky enzymem amylázou. Proto je před započetím kvasného procesu při výrobě piva nejprve potřeba rozštěpit škrob. Využívá se k tomu amylázy z klíčícího ječmene a výsledkem tohoto procesu (sladování) je slad, který již obsahuje velké množství glukózy, která může být zkvašena. Glukóza vstupuje do procesu anaerobní glykolýzy, který umožňuje získat z jedné molekuly glukózy 2 molekuly ATP. Toto je důvod, proč anaerobní glykolýza probíhá: je zdrojem energie pro organismus žijící v anaerobním prostředí. Výsledkem anaerobní glykolýzy je kromě uvedených dvou molekul ATP také pyruvát (2 molekuly pyruvátu na jednu molekulu glukózy). Kromě toho se uvolní 2 atomy vodíku, jejichž elektrony redukují 2 molekuly NAD+ za vzniku 2 molekul NADH (přenašeč redukčního ekvivalentu). Pokud se má energie z anaerobní glykolýzy získávat kontinuálně, pak by to znamenalo, že buňka by musela mít neomezený zdroj NAD+ a musela by mít možnost neomezeného hromadění NADH, což není reálně možné. Proto se musí vznikající NADH recyklovat, musí předávat svůj redukční ekvivalent na nějakou další molekulu a tím se oxidovat. Vhodnou molekulou, která je schopna tento redukční ekvivalent přijmout je naštěstí pyruvát pocházející z glykolýzy, který je schopen se redukovat přijetím 2 elektronů vodíků přenášených NADH. Produktem této redukce pyruvátu je právě etanol. Vzhledem k tomu, že využití energie ve zkvašované glukóze prostřednictvím anaerobní glykolýzy je velmi neefektivní (čistý výtěžek pouhých 2 molekul ATP), vznikající etanol je energeticky velmi bohatou látkou a lze jej aerobní oxidací dále využít jako zdroje energie. Při alkoholickém kvašení nevzniká pouze etanol ale také řada vedlejších produktů, z nichž některé jsou žádoucí (různé vonné a chuťově významné látky), ale jiné mohou být škodlivé. Takovou škodlivou látkou je vyšší aromatický alkohol tryptophol (2-(1H-indol3-yl)ethanol). Jako sekundární produkt fermentace se vyskytuje ve víně i v pivu. Je látkou, kterou kvasinky využívají jako signální molekulu ve vzájemné komunikaci typu „quorum sensing“. Způsobuje spánek (produkuje ho také např. Trypanosoma brucei, původce spavé nemoci). Je genotoxický a způsobuje mutace, a pravděpodobně poškozuje játra, kde také může vznikat. V přírodě nejrozšířenější organická látka - celulóza - je polymerem glukózy. V principu je tedy možné z celulózy získat glukózu a jejím zkvašením pak etanol, který lze použít jako paliva ve výbušných motorech. Význam potenciálního využití celulózy pro výrobu etanolu je tedy evidentní. Problém spočívá v tom, že celulózu je třeba před fermentací nejprve hydrolyzovat na glukózové jednotky (tzv. zcukření, sacharifikace). K hydrolýze se buď využívá silných kyselin za vysokých teplot nebo houbových celulolytických enzymů. V obou případech jde o procesy velmi drahé, které ekonomicky diskvalifikují průmyslové využití celulózy jako suroviny pro výrobu etanolu. V principu však tomuto využití nic nebrání, je třeba vyřešit značné technické obtíže spojené s procesem zcukření. Tímto problémem se ve světě zabývá řada výzkumných programů (vládou podporovaná kanadská firma Iogen). Houbové organismy mohou být využity jako buněčné továrny, „cell factories“. Podle legislativy USA je kvasinka Saccharomyces cerevisiae považována za obecně bezpečný organismus („Generally Recognized As Safe“, GRAS). Znamená to, že se u ní nepředpokládá patogenní působení nebo jiné nebezpečné chování. Ona a několik

42

podobných hub, které mají tento status, proto může být používána k produkci rekombinantních proteinů a metabolitů použitelných např. pro farmaceutické účely. Kvasinky mohou ve své proteinové frakci obsahovat až několik desítek procent žádaného rekombinantního proteinu. Saccharomyces cerevisiae v současnosti umožňuje heterologní produkci lidského interferonu, lidského epidermálního růstového faktoru, lidského hemoglobinu a dalších proteinů. Tímto způsobem se také vyrábí povrchový antigen viru hepatitidy B, který je využíván pro bezpečnou výrobu vakcíny. Určitou nevýhodou je to, že Saccharomyces cerevisiae příliš vznikající protein glykosyluje. Z tohoto důvodu se hledají další organismy, které zajišťují glykosylaci probíhající v míře podobné glykosylaci v lidské buňce. Takovým organismem je kvasinka Pichia pastoris. Problémem je zde ale to, že tato kvasinka není uznána jako GRAS. Nicméně slouží k efektivní výrobě hirudinu, což je inhibitor thrombinu, který je používán k omezení srážlivosti krve. Houbové organismy se používají ke komerční produkci mnoha heterologně exprimovaných enzymů používaných v potravinářství, v pracích prostředcích a v kožedělném, textilním a papírenském průmyslu. Dále se touto cestou vyrábějí enzymy používané pro léčebné a diagnostické účely. Velmi široce potravinářsky používaným enzymem produkovaným houbou Aspergillus niger var. awamori, který původně pochází z hovězího dobytka, je renin (chymosin), který se používá jako syřidlo. V pracích a čistících prostředcích a v kožedělném průmyslu se používají lipolytické enzymy, které zde mohou být kombinovány s proteázami, oxidázami a peroxidázami. Obvykle jde o houbové enzymy exprimované v jiné houbě. K heterologní produkci rekombinantních proteinů se kromě výše zmíněných houbových organismů dále používají kvasinky Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica a Kluyveromyces lactis a také vláknité houby Aspergillus nidulans a Trichoderma reesei. Výhodou těchto vláknitých hub je vhodná míra glykosylace produkovaných proteinů a zejména to, že umožňují žádané produkty produkovat extracelulárně. V tom případě je velmi usnadněná izolace a purifikace produktu.

43