ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ
N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie
Název úlohy:
Metody IDEXX využívající technologii definovaného substrátu
Vypracováno v rámci projektu:
Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie
PIGA číslo projektu
C_VŠCHT_2015_013 iFIS číslo 217 17 5642 projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D.
Řešitel Spoluřešitelé Rok zpracování:
Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová 2015
1
Metody IDEXX využívající technologii definovaného substrátu
Oblast použití: Tato metoda platí pro stanovení koliformních bakterií, Escherichia coli, enterokoků a bakterií Pseudomonas aeruginosa v dezinfikovaných i nedezinfikovaných vodách (povrchových, pitných, podzemních, odpadních apod.). Mez detekce a mez stanovitelnosti: Teoretická mez detekce je 1 KTJ/100 ml. Mez stanovitelnosti jsou 3 KTJ/100 ml pro 95% pravděpodobnost kladného výsledku za podmínek použití 100 ml vzorku. Pracovní rozsah: Pro Quanti-Tray (51 komůrek)platí rozsah koncentrací 1 až 200 organismů ve 100 ml. Pro QuantiTray/2000 (96 komůrek) je rozsah koncentrací od 1 do 2 419 organismů ve 100 ml vzorku. Stanovený ukazatel: Metoda Colilert je testem průkaznosti na přítomnost koliformních bakterií a Escherichia coli v pitné vodě. Existuje verze Colilert-18 umožňující zjištění výsledků přítomnosti koliformních bakterií a Escherichia coli již po 18 h expozice. Metoda odpovídá požadavkům stanovení ukazatele dle ČSN EN ISO 9308-1 pro stanovení koliformních bakterií a Escherichia coli. (Metoda Colisure se používá v případě detekce koliformních bakterií a Escherichia coli v odpadních, zakalených a znečištěných vodách.) Metoda Enterolert-E je metoda detekce enterokoků ve vodě (Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis), její použití je v souladu s požadavky normy ČSN ISO 7899-2. Existuje verze Enterolert-DW určená přímo pro pitnou vodu. Metoda Pseudalert je určená pro detekci bakterií Pseudomonas aeruginosa v souladu s požadavky normy ČSN ISO 16 266. Podstata zkoušky: Metody jsou založené na podstatě klasických metod nejvíce pravděpodobnějšího počtu, tzv. MPN (Most Probable Number). Namísto standardního nasazení vzorků s činidlem do zkumavek dle modelu MPN zde probíhá rozdělení směsi vzorku a činidla do plat Quanti-Tray (popř. QuantiTray/2000). Směs je rozdělena do jednotlivých komůrek automaticky zatavovačkou Quanti-Tray Sealer. Po inkubaci je počet pozitivních komůrek pomocí přiložené tabulky převeden na nejpravděpodobnější koncentraci organismů (MPN). Obecně jsou použité metody rychlé, snadné a v mnoha případech i přesné na určení počtu koliformních bakterií a Escherichia coli (Colilert), enterokoků (Enterolert), Pseudomonas aeruginosa (Pseudalert). Pozitivní reakce je dána vybarvením komůrek plata (popř. plastové lahvičky v případě metody P/A), které je způsobeno reakcí na přítomnost specifického enzymu.
2
Vyhodnocení testů je založeno na následujících barevných reakcích:
U koliformních bakterií a Escherichia coli je indikace založena na přítomnosti enzymu -galaktosidázy. Přítomné bakterie Escherichia coli používají enzym -glukoronidázu na štěpení metyl-umbelliferyl--D-glukuronidu, což se projevuje v UV 365 nm modrou fluorescencí.
U metody Colisure je enzym -glukoronidáza využit na štěpení chlorofenyl red--Dgalaktopyranosidu.
U enterokoků je využíváno reakce na přítomnost enzymu -glukosidázy.
U pseudomonád se využívá detekce přítomných bakterií v UV 365 nm.
Doba a teplota kultivace se řídí typem použitého substrátu. Přístroje a pomůcky:
Pipety s možností aplikace objemu 1 a 10 ml, jednorázové špičky.
Bunsenův kahan.
Zatavovačka IDEXX, gumové podložky (součást sady k zatavovačce).
Plata Quanti-Tray a Quanti-Tray/2000.
Sterilní plastové lahvičky.
Termostaty (na požadované teploty – dle ukazatele).
UV lampa pracující při 365 nm.
MPN tabule pro vyhodnocení výsledků (viz příloha 1 a 2).
Chemikálie:
Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Tato voda se používá i pro potřeby ředění vzorku.
Reakční činidla pro Colilert: WP020 (20 reakcí), WP0200 (200 reakcí).
Reakční činidla pro Colilert-18: WP020-18 (20 reakcí), WP0200-18 (200 reakcí).
Reakční činidla pro Colisure: WCLS20 (20 reakcí), WCLS200 (200 reakcí).
Reakční činidla pro Enterolert: WENT020 (20 reakcí), WENT0200 (200 reakcí).
Reakční činidla pro Pseudalert: WENT020 (20 reakcí), WENT0200 (200 reakcí).
Protipěnivý roztok (WAFDB) o objemu 20 ml, který lze aplikovat až na 400 vzorků.
Postup zkoušky:
Nejprve se předehřeje zatavovací zařízení Quanti-Tray Sealer.
Do sterilní (plastové) lahvičky se nalije 100 ml neředěného popř. patřičně naředěného vzorku vody. K ředění je možné použít destilovanou vodu.
K objemu 100 ml se přidá obsah činidla (média) pro detekci cílového organismu (WP020 a WP200 pro Colilert, WP020-18 a WP200-18 pro Colilert-18, WCLS20 a WCLS200 pro Colisure, WENT020 a WENT200 pro Enterolert).
V některých případech, kdy vzorek stále pění, lze použít i protipěnivý roztok. 3
Po promíchání a rozpuštění obsahu v lahvičce se celý objem přelije do plata Quanti-Tray (popř. Quanti-Tray/2000). Plato se umístní do gumové podložky dodávané k zatavovačce (typ plata musí odpovídat typu použité gumové podložky, jinak dojde k vylití obsahu plata do zařízení). Plato s gumovou podložkou se vloží do předehřátého zařízení zatavovačky a zataví se (viz obr. 1).
Zatavená plata se po určitou dobu kultivují v termostatu při teplotě určené cílových organismem: o
Colilert se kultivuje po dobu 24 h při teplotě 35 - 37 (± 0,5) °C, u Colilert-18 je doba zkrácena na 18 h. Colisure, který se vyhodnocuje po 24 h lze odečíst i po 48 h.
o
Enterolert-E a Enterolert-DW se kultivuje při teplotě 41 (± 0,5) °C po dobu 24 h.
o
Pseudalert se kultivuje při teplotě 38 (± 0,5) °C po dobu 24 h.
Obr. 1. Vzhled použitých plat. Vlevo pro 51 komůrek, vpravo pro 96 komůrek.
Vyhodnocení zkoušky:
Pravděpodobný počet mikroorganismů se zjistí převedením počtu pozitivních reakcí v komůrkách plata Quanti-Tray (51 komůrek) a Quanti-Tray/2000 (49 velkých komůrek a 48 malých komůrek) na index MPN dle převodních tabulek dodávaných výrobcem (zde příloha 1 a 2).
Pozitivní reakci u metody Colilert a Colilert-18 vykazuje žluté zabarvení komůrek, což je indikace přítomnosti koliformních bakterií. Escherichia coli modře fluoreskuje pod UV lampou při 365 nm.
U metody Colisure je pozitivní reakcí změna barvy z původně žlutě zabarvených komůrek na fialovočervenou. Přítomné bakterie Escherichia coli se vyznačují pod UV lampou při 365 nm modrou fluorescencí.
Pozitivní reakci u metody Enterolert-E vykazuje modrou fluorescenci pod UV lampou při 365 nm.
U metody Enterolert-DW je změna barvy komůrek z původní modré na zelenou indikací pozitivní reakce.
Pozitivní reakci u metody Pseudalert vykazuje modrou fluorescenci pod UV lampou při 365 nm.
Uvádění výsledků: Výsledky se uvádí jako MPN na 100 ml vzorku. V případě ředěného vzorku je nutné použité ředění ve výsledku zohlednit.
4
Příloha 1 – MPN tabule pro vyhodnocení pozitivních reakcí při použití plata s 51 komůrkami (zdroj: www.idexx.com/water)
5
Příloha 2 – MPN tabule pro vyhodnocení pozitivních reakcí při použití Quanti-Tray/2000 (zdroj: www.idexx.com/water)
6
Příloha 2 – MPN tabule pro vyhodnocení pozitivních reakcí při použití Quanti-Tray/2000 (zdroj: www.idexx.com/water) - pokračování
7
Příklad 1 – Vyhodnocení testu Enterolert-DW Zadání: Zjistěte početní zastoupení enterokoků ve vzorku odpadní vody. Do lahvičky na 100 ml aplikujte objem 10 ml z původního vzorku. Řešení:
Při přípravě vzorku, ředění a kultivaci se postupuje dle pokynů uvedených v tomto návodu. Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky.
Spočítají se pozitivní velké komůrky a pozitivní malé komůrky. Pozitivní komůrky mají žlutozelenou barvu, negativní komůrky jsou modře zabarvené (nezreagovaly).
Dle přílohy 2 se zjistí odpovídající MPN index.
V tomto případě, byly označeny všechny negativní komůrky symbolem „N“, ty jsou z vyhodnocení vyloučeny. Počet velkých pozitivních komůrek je 38 (do počtu se započítává i ta, skrz kterou se nalévá vzorek), počet malých pozitivních komůrek je 15. Po odečtu z MPN tabule: 100,8 MPN/100 ml.
Nutné je uvažovat i použitý objem vzorku (zde 10 ml). Výsledek je 1 008 MPN/100 ml.
N N
N
N N N
N
N
N N
N N N
N
N
N N
N N
Plato po ukončení kultivace.
N
N
N N N N
N
N
N N
N N
N
N
N N
N N N
N N N
N N
N
Plato po ukončení kultivace – vyznačené negativní komůrky. 8
Příklad 2 – Vyhodnocení testu Colilert Zadání: Zjistěte početní zastoupení koliformních bakterií a Escherichia coli u vzorku odpadní vody. Do lahvičky na 100 ml aplikujte objem 10 ml z původního vzorku. Řešení:
Postupuje se dle pokynů uvedených v tomto návodu. Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky.
Spočítají se pozitivní velké komůrky a pozitivní malé komůrky. Pozitivní mají žlutou barvu a jsou koliformními bakteriemi.
Plato se přiloží pod UV lampu a spočítají se modře svítící komůrky, které jsou E. coli.
Dle přílohy 2 se zjistí odpovídající MPN index.
Počet pozitivních (žlutých) komůrek indikujících přítomnost koliformních bakterií je 49 velkých a 41 malých, po odečtu z MPN tabule: 1203,3 MPN/100 ml. Po vystavení plata UV lampě, modře fluoreskující indikující přítomnost E. coli, je 48 velkých a 19 malých, po odečtu z MPN tabule: 260,3 MPN/100 ml.
Nutné je uvažovat i použitý objem vzorku (zde 10 ml). Výsledek je 12 033 MPN/100 ml koliformních bakterií a 2 603 MPN/100ml E. coli.
Plato po ukončení kultivace – pozitivní komůrky jsou žlutě zabarvené a indikují přítomnost koliformních bakterií.
Plato pod UV lampou, modře fluoreskující komůrky indikují přítomnost Escherichia coli.
9
Příklad 3 – Vyhodnocení testu Pseudalert Zjistěte početní zastoupení pseudomonád ve vzorku odpadní vody. Do lahvičky na 100 ml aplikujte objem 10 ml z původního vzorku. Řešení:
Postupuje se dle pokynů uvedených v tomto návodu. Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky.
Po ukončení doby kultivace se přistoupí k vyhodnocení zkoušky.
Plato se vystaví UV lampě a spočítají se pozitivní velké komůrky a pozitivní malé komůrky, které fluoreskují modře.
Dle přílohy 2 se zjistí odpovídající MPN index.
V tomto případě, byly označeny všechny velké negativní komůrky symbolem „N“, ty jsou z vyhodnocení vyloučeny. Počet velkých pozitivních komůrek je 40 (do počtu se započítává i ta, skrz kterou se nalévá vzorek), počet malých pozitivních komůrek je 5. Po odečtu z MPN tabule: 85,7 MPN/100 ml.
Nutné je uvažovat i použitý objem vzorku (zde 10 ml). Výsledek je 857 MPN/100 ml.
N N N
N
N N N
N
N
Plato po ukončení kultivace.
Plato pod UV lampou, modře fluoreskující komůrky indikují přítomnost pseudomonád. 10
Použitá literatura:
Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32 www.idexx.com/water (on-line, 13.04.2015)
11
