ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ
N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie
Název úlohy:
Hydrobiologie: Biologický rozbor - Stanovení biosestonu
Vypracováno
Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř
v rámci projektu:
hydrobiologie a mikrobiologie
PIGA číslo projektu
C_VŠCHT_2015_013 iFIS číslo 217 17 5642 projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D.
Řešitel Spoluřešitelé Rok zpracování:
Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová 2015
1
Hydrobiologie: Biologický rozbor - Stanovení biosestonu
Oblast použití: Stanovení je kvalitativní (taxonomickou) a kvantitativní (či jen semikvantitativní) analýzou biosestonu povrchových, pitných, podzemních a odpadních vod. Podstata zkoušky: Metoda je založena na zahuštění organismů odstředěním určitého objemu vody a jejich kvalitativním a kvantitativním nebo semikvantitativním stanovení. Ve vzorku pitné vody se v případě potřeby provede také odlišení živých organismů. Přístroje a pomůcky:
Centrifugační zkumavky na 10 ml kónicky zúžené, s ostrou špičkou s kalibrací na 0,1 ml; 0,2 ml; 0,5 ml; 1,0 ml a 10,0 ml.
Laboratorní odstředivka s výkyvným rotorem
Mikroskop s křížovým stolkem a fluorescenční nástavec.
Pasteurova pipeta (jednorázová plastová).
Počítací komůrka Cyrus I (alternativně Cyrus II).
Preparační jehla.
Chemikálie:
Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost.
Etanol.
Pentahydrát thiosíranu sodného, Na2S2O3·5H2O, roztok 1,8 % (hmotnostní zlomek).
Lugolův roztok.
Imerzní olej.
Odběr a úprava vzorků: Vzorky se odebírají podle pokynů uvedených v ČSN EN ISO 5667-1, ČSN EN ISO 5667-3, ČSN ISO 5667-4, ČSN ISO 5667-5, ČSN ISO 5667-6, ČSN ISO 5667-10 a ČSN ISO 5667-11. Pokud se odebírají vzorky vody, která byla chlorována, musí vzorkovnice obsahovat činidlo k neutralizaci zbytků chloru. Do každé vzorkovnice se přidává na každých 100 ml jejího objemu 0,1 ml 1,8 % (m/m) roztoku pentahydrátu thiosíranu sodného (Na2S2O3·5H2O). Vzorkovnice se naplní do 4/5 objemu. Vzorek se zpracuje co nejdříve po odběru, nejpozději do 24 h. Dopravuje se v chladicí brašně a do doby zpracování se uchovává ve tmě při teplotě 1 C až 5 C.
2
Není-li možné vzorek zpracovat do 24 h nebo vyžaduje-li to účel rozboru, fixuje se ihned při odběru několika kapkami Lugolova roztoku. Vzorek po fixaci má mít slabě žluté zbarvení. Vzorky určené pro odlišení živých organismů se nesmí fixovat. Postup zkoušky:
Temperace vzorku: Před vlastním rozborem se vzorek, pokud je odebírán za nízkých teplot nebo uchováván v lednici, nechá vytemperovat na laboratorní teplotu 20 °C až 25 °C. K vytemperování obvykle stačí doba nutná pro přípravu pracovní plochy a všech pomůcek nutných ke zpracování vzorku.
Promíchání vzorku: Vzorek se důkladně promíchá protřepáním.
Centrifugace: Do centrifugační zkumavky se odměří 10 ml důkladně promíchaného vzorku. Odstřeďuje se při 2 000 otáčkách/min po dobu 5 min při použití rotoru s poloměrem 0,08 m. Doběh odstředivky nesmí být brzděn. Při použití rotoru jiného poloměru, se počet otáček přepočte podle vzorce (1):
n2
2
n1 r1 r2
3,2 105 r2
(1)
kde n jsou otáčky rotoru/min, r je poloměr rotoru v m, index 1 vyjadřuje původní stav, index 2 vyjadřuje změněný stav.
Slití vzorku: Po odstředění se voda ze zkumavky slije do čisté nádoby rychlým otočením dnem vzhůru, bez zvíření sedimentu. Voda ulpělá na stěnách se spojí se zbytkem opakovaným krátkým odstředěním. Odstředěný zbytek se upraví Pasteurovou pipetou na vhodný objem (např. 0,1 ml až 1 ml). K úpravě objemu se použije voda po odstředění. Pro pitnou vodu se obvykle používá úprava odstředěného zbytku na objem 0,2 ml.
Přenesení vzorku na rastr počítací komůrky: Obsah se důkladně ale opatrně promíchá opakovaným nasáváním Pasteurovou pipetou (ne probubláváním) nebo rychlou rotací preparační jehlou. Kapka homogenizovaného vzorku se Pasteurovou pipetou rychle přenese na mřížku počítací komůrky Cyrus (viz obr. 1) předem vyčištěné etanolem a překryje krycím sklem, které se připevní svorkami. Přebytečná voda, uniklá do bočních kanálků, se odstraní vyfouknutím. Provede se kvalitativní (determinace) a kvantitativní stanovení.
Počítaní a determinace: Při počítání organismů se preparát prohlédne a propočítá při malém zvětšení. Velké a pohyblivé organismy (vířníci, nauplia) se propočítávají na celé ploše komůrky. Preparát se propočítá při základním zvětšení 200krát až 250krát; pokud se nepropočítává celá komůrka, doporučuje se pro vyrovnání rozdílů v nerovnoměrném rozmístění organismů na ploše komůrky propočítávat jednu střední a dvě okrajové části komůrky. Velmi drobné organismy (např. pikoplankton) se počítají při zvětšení 400krát až 450krát, pokud to dovolí pracovní vzdálenost silnějšího objektivu. Pro počítání pikoplanktonu se doporučuje použít fluorescenční mikroskop. Stanovení pikoplanktonu je orientační. Zvláštním případem je vegetační zbarvení, kdy je ve vzorku přes 50 000 organismů v 1 ml. Kapka důkladně 3
promíchaného vzorku se přenese Pasteurovou pipetou na mřížku komůrky, přiklopí se krycím sklíčkem a propočte se buď celá mřížka anebo jen její část, a přepočte se na 1 ml. Kvantitativní stanovení počtu organismů v hustých kulturách nebo přírodních vzorcích se provede bez předchozího zahuštění, nebo po naředění odstředěnou nebo filtrovanou vodou z lokality nebo kultivačním médiem. Determinace obtížně určitelných a velmi drobných organismů se provádí na podložním sklíčku za většího zvětšení včetně použití imerzního objektivu, protože rozměry a optické vlastnosti komůrek toto neumožňují. Pod mikroskopem se spočítají organismy (jedinci nebo buňky) na celé ploše komůrky, nebo na části její plochy podle jejich hustoty. Poznámka 1: Za jedince se považuje samostatná buňka (nezáleží na její velikosti), dále cenobium nebo kolonie do velikosti 100 μm a vlákna do délky 100 μm. Cenobia, kolonie a vlákna překračující uvedené rozměry se vyjadřují jako jejich násobky. U koloniálních nálevníků, vířníků a drobných mnohobuněčných živočichů se počítá každý jedinec zvlášť. Pokud to vyžaduje účel rozboru, počítají se jednotlivé buňky (hodnocení technologických procesů, podklad pro stanovení objemové biomasy apod.). Poznámka 2: Obsahuje-li vzorek větší množství organismů snadno podléhajících destrukci (typicky zástupci skupiny Cryptophyceae, Chrysophyceae) nebo organismy špatně sedimentující (i v menším množství; typicky sinice vodních květů), je třeba část vzorku fixovat Lugolovým roztokem a znovu odstředit.
Obr. 1. Počítací komůrka Cyrus I (vlevo) a Cyrus II (vpravo), pohled na rastr a rozměry polí.
Poznámka 3: Alternativně lze použít počítací komůrku Cyrus II, která se od komůrky Cyrus I liší především menší hloubkou. Mřížka je přehlednější než u jiných typů komůrek. Menší hloubka umožňuje počítání drobnějších organismů (bezbarví bičíkovci apod.), dále je vhodná pro vzorky s vysokou koncentrací biosestonu, pro odpadní vody a vzorky aktivovaného kalu. Počítací komůrka Cyrus II není vhodná pro počítání vzorků pitné a podzemní vody a běžně oživených vzorků povrchové vody. Malý objem komůrky (0,005 ml) zvyšuje variabilitu výsledků.
4
Fluorescence: Rozlišení biologického stavu (tj. odlišení živých organismů) se u autotrofních organismů provede na základě autofluorescence chlorofylu-a; u ostatních podle morfologického stavu buněk, struktury protoplastu a znaků fyziologické aktivity (např. pohyb, podnětová reakce). Rozlišení biologického stavu na základě autofluorescence není vhodné pro sinice. Fluorescenční odlišení živých autotrofních organismů s obsahem chlorofylu-a se provádí po osvětlení fluorescenční lampou při zařazeném excitačním filtru propouštějícím vlnové délky v rozsahu 450 nm až 490 nm. Fyziologické odlišení organismů při dané vlnové délce excitačního záření (450 nm až 490 nm) využívá absorpčního maxima fotosyntetického pigmentu chlorofylu-a v této oblasti. Nutnou podmínkou pro pozorování autofluorescence chlorofylu-a je zařazení emisního filtru propouštějícího záření o vlnové délce nad hranici 605 nm, tj. záření v červené oblasti. Použití spektrálních filtrů pro jinak vymezený rozsah emitovaného záření není přípustné. Při této fluorescenční sestavě je u živých organismů s obsahem chlorofylu-a pozorována autofluorescence v červené oblasti, tj. červené zbarvení (viz obr. 2). Rozlišení biologického stavu se provádí co nejdříve po naplnění komůrky. Při pozorování autofluorescence chlorofylu-a je nutné pracovat při utlumeném nebo zcela vypnutém procházejícím světle. Lze postupovat dvěma způsoby. Pro případ menší četnosti organismů v komůrce (většina pitných vod) je nutné postupovat následujícím způsobem: Komůrka se prohlíží v procházejícím světle a při nálezu každého organismu se ověří biologický stav osvícením fluorescenční lampou při současném nastavení předepsaných filtrů. Červeně zbarvené organismy se považují za živé. V případě větší četnosti organismů v komůrce lze postupovat i následujícím způsobem: Nejprve se propočítá celá komůrka (nebo její část) v procházejícím světle, a pak se stejná část komůrky prohlédne ještě při osvícení fluorescenční lampou při současném nastavení předepsaných filtrů a spočítají se živé (červeně zbarvené) organismy.
a
b
c
Obr. 2. Použití fluorescenčního nástavce pro zjištění vitality fototrofních organismů. Řada snímků nahoře byla pořízena pod procházejícím světlem v mikroskopu a řada snímků dole byla pořízena po zapojení fluorescenční lampy. Červeně svítící pigmenty značí vitální jedince (a) rozsivka Nitzschia acicularis, (b) rozsivka Nitzschia palea, (c) rozsivka Stephanodiscus hantzschii.
5
Vyhodnocení zkoušky:
Počet jedinců nebo buněk X v 1 ml vzorku se vypočte podle vzorce (2): X
a K nzV
(2)
kde a je počet jedinců nebo buněk v n čtvercích, n je počet vyšetřených čtverců, z je zahuštění vzorku (podle 4.6.1 je rovno 10 až 100), K je celkový počet čtverců v komůrce (Cyrus I: K = 1 600; Cyrus II: K = 2 500), V je objem komůrky, v ml (Cyrus I: V = 0,01 ml; Cyrus II: V = 0,005 ml). Uvádění výsledků: Výsledky se uvádějí v počtech jedinců nebo buněk v 1 ml vzorku.
6
Příloha 1 – Příklady vyjadřování počtu u některých organismů Vyjadřování výsledků v jedincích je metodicky poměrně jednoduché a většinou snadno použitelné pro většinu mikroskopických organismů. Přesto je při zpracovávání vzorků možné narazit na nejednoznačné případy, pro které se doporučuje následující řešení: - kolonie Asterionella formosa (další organismy tvořící hvězdicovité kolonie). U těchto organismů může být délka buněk větší než 50 μm a potom kolonie překračuje velikostní hranici 100 μm. Přesto se v těchto případech pro zjednodušení považuje kolonie vždy jen za jednoho jedince, přestože při důsledné aplikaci 100 μm pro délku vláken resp. plochu kolonií by se jednotlivé kolonie měly vyjadřovat jako násobky (tj. obvykle jako dva jedinci). - cenobia zelených řas větší než 100 μm (např. u rodu Pediastrum nebo zelených bičíkovců rodu Eudorina nebo Volvox) nebo některé kolonie tvořící zlativky (např. Uroglena nebo Synura). Podobně jako v předchozím bodu je vždy jedna kolonie/cenobium považována za jednoho jedince bez ohledu na velikost. - kompaktní celek dvou rozdílných organismů. V případech, kdy je na planktonní řase/sinici přisedlý jiný organismus (typicky parazitické mikromycety nebo epifytičtí bezbarví bičíkovci na planktonních rozsivkách, sinice nebo řasy žijící ve slizu jiných sinic), počítají se vždy parazitické/epifytické organismy (bez ohledu na jejich počet) jako jeden jedinec. Organismus, na kterém jsou tyto parazitické/epifytické organismy přisedlé, se počítá samostatně jako další jedinec. - vláknité organismy s výrazně nepravidelně zkroucenými vlákny (typicky sinice Anabaena lemmermannii nebo některé Anabaena flos-aquae) nebo pravidelně vinuté (spirální forma Aulacoseira granulata, Anabaena circinalis apod.) se vždy odhadují podle plochy, nikoli podle délky vlákna; - volně spojená vlákna centrických rozsivek (typicky Stephanodiscus) se považují za jednoho jedince; - v počítací komůrce rozpadlé kolonie (např. uvolnění jednotliví bičíkovci z koloniálních zlativek Synura nebo Dinobryon) se považují za jednoho jedince, pokud je zjevné, že pocházejí z jedné kolonie. Pro některé mikroskopické organismy může být vyjadřování v jedincích velmi problematické z hlediska následné interpretace a výsledek bez doplňujících údajů by mohl být zavádějící. Proto se doporučuje následující postup: - u koloniálních sinic (především rod Microcystis), pokud není součástí rozboru také stanovení sinic v buňkách (např. podle ČSN 757717), by mělo být zaznamenáno, o jak velké kolonie se jedná a zda není část kolonií rozpadlá na jednotlivé buňky (což se poměrně často stává např. u Microcystis ichthyoblabe); - pokud se vyskytují ve významné míře organismy velmi drobné (některé kokální zelené řasy nebo sinice) nebo naopak velké (např. obrněnky Ceratium nebo některé větší eugleny) a protokol neobsahuje počty jednotlivých taxonů, mělo být alespoň u těchto organismů např. v poznámce uvedeno, že se ve vzorku vyskytují a jaké míře; - při výskytu snadno rozpadavých rozsivek (typicky Asterionella, volně spojená vlákna centrických rozsivek např. Stephanodiscus) je vhodné uvádět souběžně počty buněk jedinců i počty buněk.
Počítání jedinců v některých ne zcela jasných případech uvádí názorně obrazové tabule.
7
Příloha 1 – Příklady vyjadřování počtu u některých organismů (pokračování) Organismy na jednotlivých obrázcích jsou v různých zvětšeních. Červené čtverce mají stranu o délce 100 µm a vyznačují na obrázcích, kde to má význam, jednoho jedince. A) 1 jedinec - centrické rozsivky volně spojené do rozpadavých vláken jsou považovány za jednoho jedince, pokud nepřekročí délku 100 µm. B) 1 jedinec - centrické rozsivky zjevně spojené slizem do dvojic jsou považovány také za jednoho jedince, i když se buňky bezprostředně nedotýkají. C) 2 jedinci - tři bezbarví bičíkovci na centrické rozsivce jsou počítáni jako jeden jedinec, centrická rozsivka pak jako další jedinec. D) 3 jedinci – centrická rozsivka, parazitická mikromyceta a bezbarvý bičíkovec se schránkou (na rozdíl od obr. C se jedná o různé taxony). E) 20 jedinců – 9 jedinců sinice Anabaena lemmermannii a 11 jedinců přisedlých nálevníků (podle poznámky pod čarou č. 3 se počítají jeden nálevník jako jeden jedinec). F) 37 jedinců – 30 jedinců Microcystis aeruginosa (podle plochy) a 7 jedinců přisedlých nálevníků (viz obr. E).
8
Příloha 1 – Příklady vyjadřování počtu u některých organismů (pokračování) Organismy na jednotlivých obrázcích jsou v různých zvětšeních. Červené čtverce mají stranu o délce 100 µm a vyznačují na obrázcích, kde to má význam, jednoho jedince. G) 2 jedinci – u sinic s pravidelně zkrouceným vlákny (zde Anabaena compacta) se jedinci počítají podle plochy. H) 3 jedinci – obdobný případ jako u obr. G u vláknité centrické rozsivky se zkroucenými vlákny Aulacoseira granulata. I) 2 jedinci – v případě pohyblivé rozsivky Nitzschia acicularis se nejednalo o spojené buňky, ale jen o jejich „náhodné setkání“ v počítací komůrce. J) 1 jedinec – na rozdíl od obr. I se jedná o ještě kompaktní celek dvou buněk po dělení u rozsivky rodu Fragilaria. K) 1 jedinec – rozpadlá (až v počítací komůrce) kolonie zlativky rodu Synura (z této kolonie pravděpodobně i pochází ji odlehlá buňka vlevo dole). L) 1 jedinec – obdobně jako výlučně hvězdicovité kolonie tvořící organismy (typicky Asterionella) se doporučuje počítat i podobnou rozsivku Diatoma tenue, která však tvoří i jiné než hvězdicovité kolonie.
9
Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32 ČSN 75 7712 Kvalita vod – Biologický rozbor – Stanovení biosestonu, 2012.
10
