ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ
N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie
Název úlohy:
Kultivační stanovení: Stanovení mikromycet (plísní a kvasinek)
Vypracováno v rámci projektu:
Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie
PIGA číslo projektu
C_VŠCHT_2015_013 iFIS číslo 217 17 5642 projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D.
Řešitel Spoluřešitelé Rok zpracování:
Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová 2015
1
Kultivační stanovení: Stanovení mikromycet (plísní a kvasinek)
Oblast použití: Stanovení mikromycet (plísní a kvasinek) lze použít pro jakékoliv vzorky vod. Po vhodné úpravě vzorku a metody záchytu lze stanovení použít i pro stěry, nárosty či pro případ kontroly vzdušného spadu na plochu misky se selektivním agarovým médiem. Mez detekce a mez stanovitelnosti: Teoretická mez detekce je 1 KTJ/1 ml, tj. nález jedné kolonie na ploše Petriho misky při očkování 1 ml vzorku. Mez stanovitelnosti jsou 3 KTJ/1 ml pro 95% pravděpodobnost kladného výsledku za podmínek očkování 1 ml vzorku. (Obdobně platí i pro filtraci určitého objemu vzorku.) Pracovní rozsah: Pracovní rozsah je od 0 KTJ/1 ml. Shora pracovní rozsah není omezen, objem vzorku lze i filtrovat, možné je použití desetinného ředění vzorku. Stanovený ukazatel: Mikromycety (kvasinky, plísně), drobnohledné houby, jsou z hlediska jejich primárního výskytu v hodnoceném prostředí autochtonními anebo alochtonními organismy. Autochtonní organismy jsou v případě, kdy je voda pro ně přirozeným prostředím, jako alochtonní je označujeme, kdy se ve vodě vyskytují sekundárně ve formě spor a trvalých buněk. Přímé stanovení mikromycet, jako ukazatele kvality pitné vody, není legislativou vyžadováno. Podstata zkoušky: Metoda spočívá ve stanovení mikromycet v povrchových vodách metodou přímého výsevu, kdy se na povrch pevného média naočkuje objem vzorku. Kultivace probíhá po dobu 5 až 7 dnů při teplotě 20 až 25 C. Počítají se kolonie plísní, které se v případě potřeby mikroskopicky prověřují. Z celkového počtu kolonií vyrostlých na médiu se vypočte počet kolonie tvořících jednotek v objemu vzorku. Obdobným způsobem lze provést i stanovení mikromycet metodou membránových filtrů, za použití filtrů o velikosti pórů 0,45 m a objemu 100 ml a 10 ml vzorku vody, který se filtruje paralelně. Součástí stanovení je i mikroskopické posouzení vyrostlých kolonií, u hyf mikromycet se používá aplikace laktofenolu dle Amanna k mikroskopickému preparátu. Metoda s laktofenolem se používá spolu s fázovým kontrastem, pokud tento fázový kontrast není při mikroskopování k dispozici, obohatí se laktofenol modří. Tím je preparát nejen konzervován, ale i obarven, živé hyfy jsou intenzivně modré. Přístroje a pomůcky:
Analytické váhy citlivost 0,01 g.
Autokláv (121 ± 3) °C.
Bakteriologické kličky. 2
Bunsenův kahan.
Drigalskiho tyčinky.
Erlenmayerovy láhve, lahve DURAN 45 se šroubovým uzávěrem.
Filtrační zařízení s vývěvou SARTORIUS.
Membránové filtry o průměru 50 mm a velikosti pórů 0,45 m.
Mikroskopická skla (podložní, krycí).
Mikroskop.
Pinzety.
Pipety s možností aplikace objemu 1 ml (popř. 0,1 ml a 0,5 ml – dle povahy vzorku a potřeby), jednorázové špičky.
Stereolupa.
Sterilní plastové Petriho misky o průměru 60 mm a 90 mm.
Termostat 25 – 30 °C.
Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Tato voda se používá i pro potřeby ředění vzorku.
Sabouraudův agar s chloramphenicolem (HiMedia M1067).
Dichloran glycerol médium pro xerophyta (HiMedia M1129).
Laktofenol dle Amanna.
Methylenová modř.
Ředící roztok (fyziologický roztok).
Postup zkoušky:
Temperace vzorku: Před vlastním rozborem se vzorek, pokud je odebírán za nízkých teplot nebo uchováván v lednici, nechá vytemperovat na laboratorní teplotu 20 °C až 25 °C. K vytemperování obvykle stačí doba nutná pro přípravu pracovní plochy a všech pomůcek nutných ke zpracování vzorku.
Promíchání vzorku: Vzorek se musí dokonale promíchat intenzivním protřepáním, aby se bakterie rovnoměrně rozptýlily v celém objemu vzorku.
Volba vhodného objemu vzorku: Zkoušený objem vzorku nebo zředěného vzorku má být volen tak, aby na/v kultivačním médiu v Petriho misce průměru 9 cm vyrostlo nejvýše 30 až 300 kolonií Přímé očkování 1 ml vzorku se používá u čistých surových vod. Zde se vyhodnocuje i nižší počet než 30 kolonií. Zřeďují se vzorky více znečištěných vod (surových, ze studní, odpadní). Stupeň zředění se určuje u známých vzorků podle zkušenosti z předcházejících rozborů, u vzorků neznámého složení se připravuje stupňů ředění více. Pro každý stupeň zředění se užívá zřeďování v poměru 1:10. Zřeďování se provádí v lahvičkách obsahujících 9 ml sterilního ředícího roztoku přidáním 1 ml vzorku neředěného nebo již zředěného v nižším stupni. Lahvička se uzavře a promíchá se intenzivním protřepáním. 3
Kultivace. Metoda přímého výsevu: Na dvě misky, na povrch pevného agarového média, se paralelně naočkuje objem 0,5 ml vzorku, který se krouživými pohyby rovnoměrně rozvrství, či rozetře Drigalskiho tyčinkou. Kultivace probíhá po dobu 5 až 7 dnů při teplotě 20 až 25 C tak, že jsou misky víčkem vzhůru. Od třetího dne kultivace se misky kontrolují, přitom se nesmí otvírat. Kultivace probíhá po dobu 5 až 7 dnů při teplotě 20 až 25 C tak, že jsou misky víčkem vzhůru. Od třetího dne kultivace se misky kontrolují, přitom se nesmí otvírat.
Obr. 1. Příklad stěru sterilní vatovou tyčinkou z plochy porostlé plísněmi s následnou aplikací tyčinky přímo na plochu SBA média, kultivace 7 dní. Pohled na vzdušné mycelium vyrostlých kolonií rodů Penicillium, Alternaria. Metodu lze považovat za metodu přímého výsevu.
Kultivace. Metoda membránové filtrace: Zapojí se filtrační přístroj a vývěva. Plamenem kahanu se vysterilizuje pevný, porézní disk spodní části filtrační nálevky. Sterilní pinzetou se na něj umístí sterilní membránový filtr a upevní se sterilní nálevka. Při zavřeném kohoutu vývěvy se nalije nebo odpipetuje do nálevky požadovaný objem vzorku. Z důvodů eliminace nasátí mikroorganismů ze vzduchu se na nálevku umístí filtrační papír. (Tento filtrační papír se umisťuje vždy po převedení patřičného objemu vzorku, dále následuje profiltrování vzorku.) Následuje otevření výpustného kohoutu spodní části nálevky a pomocí vakua vývěvy se vzorek přefiltruje. Po odsátí celého objemu vody se odstraní nálevka a membránový filtr se přenese sterilní pinzetou na pevné kultivační médium v Petriho misce. Filtr se klade pozvolna tak, aby nevznikly mezi kultivačním médiem a filtrem vzduchové bubliny (viz obr. 2). Kultivace probíhá po dobu 5 až 7 dnů při teplotě 20 až 25 C tak, že jsou misky víčkem vzhůru. Od třetího dne kultivace se misky kontrolují, přitom se nesmí otvírat.
Kultivace. Metoda spadu na plochu misky: Otevřená miska se ponechá minimálně po dobu 15 min exponovat na vzduchu. Kultivace probíhá po dobu 5 až 7 dnů při teplotě 20 až 25 C tak, že jsou misky víčkem vzhůru. Od třetího dne kultivace se misky kontrolují, přitom se nesmí otvírat (viz obr. 3). V mikrobiologické praxi se metoda stanovení mikroorganismů spadem používá pro potřeby zjištění úrovně kontaminace laboratorního prostoru. Aplikace této metody je součástí systému zajištění správné laboratorní praxe, v rámci akreditace laboratoří a dále ověření toho, zda je prostředí, ve kterém se provádí mikrobiologické analýzy, je skutečně dostatečně dezinfikované a sterilní. Míra pokryvnosti plochy misky se vztahuje k ploše objektu, ve kterém byl spad hodnocen. 4
Obr. 2. Příklad kultivace plísní na membránovém filtru po filtraci objemu 10 ml vzorku. Jedná se o stejný typ vzorku, vlevo je kultivace na Sabouraudově agaru a vpravo je kultivace na Dichloran glycerol médiu. Vzhled některých kolonií plísní má jiný charakter (zabarvení, struktura).
Obr. 3. Příklad kultivace plísní metodou spadu na plochu misky se Sabouradovým médiem. Obdobný vzhled mají i misky s přímým výsevem vzorku.
5
Mikroskopické vyšetření kolonií: Nativní preparát se připraví tak, že se na podložní sklo (může být i s jamkou) kápne sterilní destilovaná voda, do ní se preparační jehlou vloží část mycelia, obarví se methylenovou modří, přiloží se krycí sklíčko. Tímto způsobem se zabarví plazma sledovaného objektu. Polotrvalý preparát se připraví tak, že se na podložní sklo kápne kapka etanolu a do něho se vloží část mycelia mikromycet. Přidá se kapka laktofenolu, ale materiál se nefixuje, přikryje se krycím sklíčkem (případně vzniklé bublinky lze odstranit rychlým protažením preparátu nad plamenem). Tím je preparát nejen konzervován, ale i obarven, hyfy jsou modré. Alternativně lze použít i methylenovou modř (je vhodná pro pozorování kvasinek).
Vyhodnocení zkoušky:
Kolonie vyrostlé na/v médiu se počítají proti světlu stereolupy (stolní lampy) a tmavému podkladu. Odečtené kolonie se označují na dně misky fixem nebo počítací tužkou. Při paralelním stanovení se počítá průměr. Odečtený počet kolonií se podle stupně zředění přepočte na 1 ml vzorku vody.
V nezředěném vzorku se udává celkový počet kolonií i v tom případě, že vyrostlo méně než 30 kolonií na misce.
Ve zředěném vzorku se uvádějí výsledky pouze z ředění, kde na miskách vyrostlo 30 až 300 kolonií.
Jestliže vyrostlo i v nejvyšším stupni ředění (-n) více než 300 kolonií a stanovení nelze zopakovat, uvádí se do protokolu >300 x 10n v 1 ml.
Misky, na nichž došlo v důsledku nesprávné volby zředění k nadměrnému růstu kolonií (nad 300), se označují jako nepočitatelné a nevyhodnocují se. Nevyhodnocují se a jako přerostlé se označují misky, u nichž na větší části plochy nebo na celém povrchu došlo k růstu obřích kolonií.
Kolonie se prověřují pod stereolupou a dále i pod mikroskopem (viz obr. 4 a 5). Na přesnější identifikaci kmenů se používá metoda přeočkování kolonií a příprava čistých kultur na Sabouraudově agaru. Počítají se kolonie vláknitých plísní, uvádí se charakter jejich vzhledu a bravy, např. hladké, hrubé, s brázdami, lesklé, matné, krémové a bělavé, žluté, oranžové, červené, zelené, šedé, černé apod. Posuzuje se vzhled vyživovacího (substrátového) i vzdušného mycelia, přítomnost exsudátu, pigmentace uvolněné do půdy (viz tabulka 1). Z obou prověřených misek se zjištěný počet kolonií sečte a celkový počet kolonií se uvádí na objem vzorku.
V případě přímé exponace misky otevřené na vzduchu se vyhodnocuje počet vytvořených kolonií pomocí denzity. Míra pokryvnosti plochy misky se vztáhne k ploše objektu, ve kterém byl spad hodnocen. Např. pro potřeby zjištění úrovně sterilního prostředí v mikrobiologické laboratoři by neměl být počet kolonií na misce o průměru 90 mm větší než 1 (tj. 160 KTJ/m2 místnosti).
Uvádění výsledků:
Výsledky se uvádí jako počet KTJ na zpracovaný objem vzorek, např. 1 ml vzorku.
V případě ředěného vzorku je nutné použité ředění ve výsledku zohlednit.
6
Tabulka 1. Příklad hodnocení vzhledu kolonie na mediu a mikroskopické struktury plísně (taxony) Taxon
Vzhled kolonie na médiu
Mikroskopická kultura
Mucor
Plstnaté, 2 mm vysoké, většinou Sporangiofory větvené, kolumela bílé, později tmavě zbarvené. bez apofýzy, límeček.
Rhizopus
Šedé mycelium.
Absidia
Bílé vysoké porosty, přesleny, Sporangia hruškovitá, starší šedá a namodralá. přehrádka.
Cunninghamella
Bílé, podobné později žluté.
Chrysosporium
Bílá, šedá, růžová, fialová, Hruškovité spory, větvené konidiofory. většinou světlé zabarvení, svazčité, vločkovité, zrnité, kopečky, pigment vylučuje do média, žlutá spodní strana.
Acremonium
Nízké, plstnaté, vlhce sliznaté, Přesleny, podobné rodu Fusarium, bílé, růžové, oranžové. jednobuněčné a oválné konidie.
Botrytis
Šedé, chmýřité, tmavá sklerocia, po stranách černé štětečky.
Trichoderma
Bílé, vatovité, rychle rostoucí, Fialidy lahvovité v přeslenech, mycelia chuchvalcovitá. v pravém úhlu k nosné větévce. Sametový porost a krátké Štětečky v 1 přeslenu (sekce konidiofory (Velutina), vlnatý Monoverticillata, podr. Aspergiloides). porost (Lanata), provazcovitý 2 až 3 přesleny nad sebou – podle hlavní osy vzhled (Funiculosa), svazčité souměrné konidioforu (sekce Biverticillata(Fasciluta). Barvy modrozelené, žlutozelené, někdy exsudáty, Symmetrica, podr. Biverticillium), nesouměrné (sekce Biverticillatavrstevnatost apod. Asymmetrica, podr. Penicillium). 3 a více přeslenů (sekce Polyverticillata, podr. Furcatum). Sametový, zrnitý, vlnatý, Měchýřek s fialidami a konidiemi. vločkovitý vzhled kolonie, žluté až hnědé vzdušné.
Penicillium
Aspergillus
Větvené mycelium, stolony, rhizoidy, kolumela s apofýzou.
rodu
apofýza,
Mucor, Konidie s ostny.
Humicola
Bílé, šedé až šedočerné.
Na hyfách se tvoří a chlamydospory.
Cladosporium
Kolonie zvlnělé, plstnaté, Citrónovité žlutozelené, šedo až tmavě zúžené. zelené.
Helminthosporium
Tmavě hnědé až černohnědé
Alternaria
Substrátové hnědě až černě Konidie se širokou bazální a úzkou zabarvené, olivově hnědé až apikální částí. černošedé porosty.
Fusarium
Světlé, plstnaté a vatovité, Konidiofory větvené, mikrokonidie spodní strana pestré barvy. oválné a makrokonidie rohlíčkovité.
konidie,
Konidie tmavě a článkované.
aleuriospory ke
koncům
zabarvené
7
Obr. 4. Příklad častých typů taxonů mikromycet identifikovaných pod mikroskopem. Horní řada, fotografie vlevo: Penicillium, vpravo: Astergillus. Fotografie uprostřed Rhizopus. Dolní řada, fotografie vlevo: Alternaria (zďovité konidie), vpravo: Fusarium (rohlíčkovité konidie). 8
Obr. 5. Příklad kvasinek identifikovaných pod mikroskopem. Zde rod Hansenula.
9
Příloha 1 – Příklad morfologie rodu Penicillium a Aspergillus Příklad posuzování vzhledu a mikroskopické struktury.
kolonie
zástupce
rodu
Penicillium
podle
makroskopické
Sekce velutina: sametový povrch → Penicillium citrinum, P. digitatum, P. roquefortii Sekce lanata: vlnatý povrch → Penicillium camemberti Sekce funiculosa: vločkovitý, provazcovitý povrch → Penicillium terrestre Sekce fasciculata: svazčitý povrch → Penicillium italicum Sekce divaricata: široce rozevřené odstávající. Penicillium citrinum: modrozelené kolonie, žlutý exsudát, paprsčité rýhy. Penicillium digitatum: žlutozelené, spodní strana hnědá (citróny). Penicillium glabrum: šedozelené, rýhování, vrstevnatost, bezbarvý až oranžový exsudát. Penicillium glandicola: žlutozelené, modrozelené, drsný povrch. Penicillium chrysogenum: drsný, rýhy i na spodní straně, žlutohnědý exsudát, do agaru vypouští pigmenty. Příklad posuzování vzhledu a mikroskopické struktury.
kolonie
zástupce
rodu
Aspergillus
podle
makroskopické
Aspergillus candidus: bílé povlaky přechází v krémově žlutou. Aspergillus clavatus: vyšší růst na agarech, kyjovité měchýřky. Aspergillus flavus: žlutozelené vlnaté kolonie, spodní strana žlutohnědá. Aspergillus fumigatus: zelenomodré nízké kolonie uprostřed kouřovitý odstín. Aspergillus nidulellus: sametové kolonie, spodní strana purpurová až tmavočervená. Aspergillus ochraceus: nízké žluté a oranžové, zrnité, spodní strana žlutá. Aspergillus niger: kolonie bílé, později zhnědnou, až zčernají. Aspergillus repens: žlutozelené a šedozelené kolonie.
10
Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32
11
