MUDr. Renata Procházková, PhD.
I.
Úvod do problematiky
II.
Krvetvorba
III.
Krevní buňky - funkce, morfologie
IV.
Růstové faktory
V.
Možnosti využití v praxi/výzkumu
Nauka o krvi – hematologie (haima –krev + logos- rozmluva) Studuje krev, krvetvorné orgány, krvetvorbu za normálních a patologických stavů 400 p.n.l. – Empedokles: krev = život
-
-
Krev – tělesná tekutina Krevní oběh (1628 – W. Harwey) Krev plní úlohu jen tehdy, když se v těle pohybuje = dutý systém cév (intaktní endoteliální vrstva) + srdeční pumpa
Množství v organismu: cca 5 litrů 70 – 75 ml/kg váhy – dospělí 80 – 85 ml/kg váhy – děti Část buněčná - 45 % Část tekutá - 55 % (Hippokrates 4. stol. p.n.l. - rozdělení krve na vrstvy)
-
Voda – 90 % Anorganická složka Na +, K + Ca2+, Mg2+ Fe Bikarbonát, fosfát Cl
Rovnováha ICT,ECT Srážení krve Funkce svalů, nervů Krvetvorba, fce enzymů Acidobazická rovnováha pH 7,4
Krevní buňky Červené krvinky Bílé krvinky erytrocyty leukocyty 5.1012/l 4-10.109/l
granulocyty neutrofil
bazofil
Destičky trombocyty 140-400.109/l
agranulocyty eozinofil monocyt lymfocyt
Erytrocyty
Leukocyty
Trombocyty
Přenos kyslíku
Obranné procesy Tvorba imunoglobulinů Buněčná imunita Zánětlivé procesy
Zástava krvácení a regenerace cév
-
-
Proces tvorby krvinek v krvetvorných orgánech - 2 fáze prenatální (předporodní) postnatální (poporodní) odlišná krvetvorba a místa tvorby krvinek Prenatální krvetvorba
-
-
Začíná ve velmi raném období těhotenství 3 období: Mezoblastové: 3.-10. týden gravidity Hepatolienální: po 6. týdnu, trvá až do porodu Dřeňové: od 20. týdne
Po narození krvetvorba jen v kostní dřeni. Všechny krevní elementy vznikají z hematopoetických kmenových buněk.
Hematopoéza probíhá ve vysoce komplexním mikroprostředí kostní dřeně. Hnízda kmenových buněk (stem cell niche). Vysoce regulovaný proces.
Probíhá v kostní dřeni od kmenových buněk přes buňky progenitorové až po buňky diferencované (erytrocyty, leukocyty, trombocyty). Hemopoetická / Pluripotentní kmenová buňka Progenitorová kmenová buňka
Prekurzorové buňky Zralé buňky krvetvorby
HSC: Hemopoetic Stem Cell Schopnosti HSC: dlouhodobá obnova krvetvorby
nekonečná sebeobnova/nesmrtelnost diferenciace do všech vývojových řad krevní tkáně = pluripotence (ale ne do buněk jiných tkání) migrace z kostní dřeně do periferní krve a zpět Transplantace kostní dřeně = transplantace hematopoetických kmenových buněk
HSC= 1: 10 000 – 100 000 mononukleárních buněk kostní dřeně
schopna diferenciace do 1 či více bb. řad neschopna sebeobnovy > bb. ve fázi S buněčného cyklu citlivá na růstové faktory
Hemopoetická / Pluripotentní kmenová buňka Progenitorová kmenová buňka
Prekurzorové buňky
CFU: Colony Forming Unit CFU-GEMM CFU-GM BFU-E CFU-E CFU-G CFU-M CFU-Meg
Granulocyte Erytrocyte Macrophage Megakaryocyte
myelopoeza
Granulocyte Macrophage
makrofágy, granulocyty
Burst Forming Unit Erythroid
erytrocyty erytrocyty
Granulocyte
granulocyty monocyty
Megakaryocyte
megakaryocyty
Zralé buňky krvetvorby
CFU-GEMM CFU-GM BFU-E CFU-E CFU-G CFU-M CFU-Meg
myelopoeza makrofágy, granulocyty erytrocyty erytrocyty granulocyty monocyty megakaryocyty
Krvetvorba- neustálý, plynutý a rovnoměrný děj. Multifaktoriální proces, řada faktorů a látek. Faktory: - povaha a metabolický stav bb. - vlivy prostředí - mikroprostředí kostní dřeně Látky: - hemopoetické růstové faktory (cytokiny) - nervové a humorální vlivy - přívod nezbytných látek (Fe, vit. B12…)
- růstové faktory
- interleukiny, interferony - chemokiny, regulační proteiny = nositelé určitých signálů hematopoetické transkripční faktory jako vykonavatelé těchto signálů
Původně popsány na základě schopností podporovat růst kolonií hemopoetických buněk in vitro. CSF – Colony Stimulating Factor Umožňují dělení a vyzrávání mateřských bb. Jejich působením se zahájí diferenciace do příslušné krvetvorné řady (1 i více). Interferony a interleukiny a další: přímé působení na primitivní progenitorové buňky (např. IL-1,3,6, 11).
Dnes známo několik desítek RF. Rekombinantní příprava.
Využití v klinické praxi: Epo a G-CSF.
Signální (glyko)proteiny
Vážou se na specifické receptory
produkované širokým spektrem buněk mikroprostředí kostní dřeně (leukocyty, fibroblasty, osteoblasty, endotelie, adipocyty, dendritické buňky aj.)
nacházející se na povrchu buněk kostní dřeně.
Vazbou cytokinu na receptor dochází k přenosu signálu do jádra, aktivaci cílových transkripčních faktorů a ovlivnění exprese cílových genů.
CSF SCF Stem cell factor Epo Erytropoetin GM-CSF G-CSF M-CSF TPO trombopoetin interleukin IL-1 IL-3
IL 6
místo působení pluripotentní KB červená krevní řady progenitory granulo a makrof krevní řady progenitory granulocytární řady progenitory makrofágové řady prekurzory megakaryocytů
místo působení megakaryocyty a B bb., progenitory všech vývojových řad krvetvorby "multi -CSF" myeloidní řada
Přehled regulační role jednotlivých cytokinů Hematopoeza
Cytokiny
Erytropoeza
Epo, SCF, IGF-1, IL-9, IL-3, Tpo, IL-20, SDF-1
Megakaryopoeza
Tpo, IL-3,IL-11, LIF, SCF, Epo, FL
Vývoj žírných buněk
IL-3, SCF, IL-10
Vývoj eozinofilů
IL-5, IL-3, GM-CSF, SCF
Granulopoeza
G-CSF, GM-CSF, IL-3, SCF, IL-6, FL, SDF-1
Vývoj makrofágů
M-CSF, GM-CSF, IL-3, FL, SDF-1
Vývoj lymfocytů
IL-7, FL, SCF, SDF-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-15,..
.
Proces tvorby a vývoje červené krvinky v erytroidní řadě. Funkcí erytropoezy je zajistit dostatek erytrocytů pro potřeby organizmu. Regulace zpětnou vazbou (počet erytrocytů x hypoxie). Ŕízení - erytropoetin – podněcuje diferenciaci BFU-E a CFU-E v erytroblasty. Vyzrávání buněk: biochemicko – morfolofické změny.
CFU-GEMM BFU-E CFU-E Proerytroblast – jemný chromatin, velké
jádro s jadérky,
vysoká basofilie cytoplazmy Bazofilní
normoblast – tvorba hemoglobinu Polychromatofilní normoblast Ortochromní normoblast - již se nedělí Retikulocyt - přechodná buňka mezi jadernými nbl a erytrocyty Erytrocyty – bezjaderné bb. ztráta jádra odškrcením ve stadiu oxyfil.normoblastu vývoj 5–6 dní, v periferní krvi: 120 ± 20 dní
1. SPECIFICKÉ MIKROPROSTŘEDÍ - kostní dřeň 2. SUBSTRÁTY PRO STAVBU ERYTROCYTŮ: ◦ ◦ ◦ ◦
železo (tvorba hemu), aminokyseliny (bílkoviny) kys. listová (syntéza DNA), vit. B6 - pyridoxin (syntéza hemu) vit. B2 - riboflavin (normální fce a přežití ERY) vit. B12 – cyanokobalamin: (syntéza NK), jeho využití v organismu záv. na vnitřním faktoru (GP tvořený parietál. bb. žaludku, chrání vit. B12 před účinky tráv. enzymů
3. RŮSTOVÉ FAKTORY: cytokiny – interleukiny: IL-1, IL-2, IL-3 – nejdůležitější pro krvetvorbu, IL-4, IL-6, IL-9, IL-11) ◦ SCF – faktor kmenových buněk ◦ CSF – kolonie stimulující faktor ◦ interferony – inhibiční fce (omezují proliferaci krvetvorných buněk) ◦ EPO (erytropoetin) – hlavní regulační faktor erytropoezy
-
Glykoprotein
65 AK zbytků + 4 oligosacharidové řetězce
hormon, tvořen v ledvinách – (90%) v játrech – hepatocyty a Kupfferovy bb. (x fetál. vývoj: hlavně játra)
indukuje a urychluje proliferaci a
diferenciaci erytroidních bb.
1. VYUŽITÍ: Rekombinantní EPO produkovaný zvířecími buňkami se využívá v klinické praxi: léčba anémie spojené s postižením ledvin stimulace tvorby ERY pro případnou autologní transfúzi během plánovaných operací
2. ZNEUŽITÍ: Vrcholový sport – doping : EPO zvyšuje výkonnost ( x úmrtí několika atletů a cyklistů) EPO zvýší viskozitu krve –hrozí ucpávání cév, vznik trombů a infarkt myokardu nebo mozková příhoda) Jeho použití je zakázáno od r.1989, avšak testy umožňující kontrolu jeho zneužívání jsou k dispozici teprve od roku 2000 (použity na olympijských hrách v Sydney).
Granulomonocytární řada - granulocyty - monocyty Mateřská bb. – CFU-GM GM-CSF, G-CSF
Postupné změny:
-
Zmenšování bb. Poměr jádro/cytoplazma Zmenšení a změny tvaru jádra Tvorba granulí – azurofilní, specifická
CFU-GEMM CFU-GM CFU-G Myeloblast (A)
Promyelocyt (B): primární granula –
Myelocyt (C,G,K): mizí jadérka, objevují
hrubá azurofilní, jasně červená
se sekundární granula – neutrofilní: tmavě fialová granula – eozinofilní: oranžová granula – bazofilní: tmavě modrá až černá
Metamyelocyt (D,H,L)
Tyč (E,I,M)
Granulovaný segment (F,J,N)
během 6 – 17 dnů přežívání v periferní krvi: neutrofily 8 - 10 hod, eosinofily a bazofily 3 - 4 dny
CFU-GEMM CFU-GM monoblast promonocyt monocyt
jemná struktura chromatinu, velmi jemná azurofilní granula během 2 – 2,5 dne nevyzrávají ve dřeni fixní makrofágy – tzv. histiocyty putující fagocytující makrofágy
CFU-GEMM CFU-Meg
-
-
-
megakaryoblast (A) promegakaryocyt (B) megakaryocyt - buňka v kostní dřeni již se nedělí granulární (C), zralý (D) jádro mgc s trombocyty (E) jemný chromatin přetrvává i ve zralých megakaryocytech trombocyty (F) během 4 – 5 dní z 1 megakaryocytu až 2 000 – 4 000 destiček do obv. krve denně 4 . 1011 destiček (1/3 zásobní pool) přežívají v krvi cca 10 dní
Pluripotentní kmenová buňka lymfoblast prolymfocyt lymfocyt: T, B, NK přežívají 4 roky/10 let po antigenní stimulaci se B lymfocyty mění v plasmatické bb. – produkce protilátek
Humorální
Trombopoetin (TPO) – hlavní regulátor IL -1, IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF, G-CSF, EPO, FGF (růstový faktor fibroblastů) SCF
Stimul pro trombopoezu – pokles trombocytů
a) b)
aktivace trombopoezy: Proliferace megakaryoblastů Vyzrávání megakaryoblastů
Krevní buňky Červené krvinky Bílé krvinky erytrocyty leukocyty 5.1012/l 4-10.109/l
granulocyty neutrofil
bazofil
Destičky trombocyty 140-400.109/l
agranulocyty eozinofil monocyt lymfocyt
bezjaderné buňky bikonkávního tvaru struktura uzpůsobena opakovaným deformacím v cévní stěně (7,2μm 2μm ) membrána erytrocytu – elastická, pevná - membránový skelet: kontraktilní bílkoviny spotřeba ATP (glykolýza ) - k udržení buněčné struktury membrány - pro aktivní transport sodíková pumpa morfologické změny – provázejí anemie aj. funkce: - přenos O2 a CO2 mezi plícemi a tkáněmi - udržení stálého pH krve
7,2 μm
-
2 μm
-
-
-
-
Červené krevní barvivo Izolován v r. 1865 Složitá krevní bílkovina Vyplňuje zralý erytrocyt Umožňuje přenos kyslíku Fyziologicky: Hb embryonální (Hb Gower) Hb plodový (HbF – fetální) Hb dospělých (HbA- adult) Jiné složení řetězců, afinita ke kyslíku
Hemoglobin (Hb)
Hematokrit (Ht)
Počet erytrocytů (RBC)
Střední objem erytrocytu (MCV)
– přímo měřený parametr na hematologických analyzátorech – v g/l
– poměr objemu erytrocytů k objemu celé krve – parametr vypočítaný z počtu erytrocytů a MCV Ht = RBC x MCV – závisí na věku, pohlaví a rase – přímo měřený parametr na hematologických analyzátorech – počet ery. 1012/l přímo měřený parametr – ve fentolitrech (fl)
–
počtu erytrocytů (Hb, Ht) anémie počtu erytrocytů polyglobulie zhoubné bujení červené řady erytroleukémie rozpad erytrocytů – hemolytické anemie anemie: Hb < 120 g/l ženy < 130 g/l muži
vždy jaderné, vys. obsah H2O v obvodové krvi – fyziologicky: neutrofilní tyče 0 – 5 % neutrofilní segmenty 45 – 70 % eosinofilní segmenty 0 – 7 % bazofilní segmenty 0 – 2 % monocyty 2 – 12 % lymfocyty 20 – 45 %
dle morfologického hlediska: - dle přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických granulí v cytoplazmě : granulocyty – polymorfonukleáry (neutrofilní, eozinofilní, bazofilní) agranulocyty – mononukleáry (lymfocyty, monocyty) z imunologického hlediska: fagocyty - makrofágy (monocyty, histiocyty) - mikrofágy (granulocyty) imunocyty - lymfocyty (B a T, NK buňky) - plazmatické buňky
-
-
Hlavní funkce leukocytů = v imunitním systému obrana organizmu proti cizorodým látkám fagocytóza = pohlcování a rozkládání pohlcených částic:
granulocyty (neutrofily, eozinofily), monocyty a makrofágy imunitní odpověď tvorba protilátek (B-lymfocyty, plazmocyty) přímé působení krevních buněk na cizí buňky nebo částice, tyto buď usmrtí nebo rozloží
(T-lymfocyty, NK buňky)
specifická protilátková odpověď (B-lymfocyty) specifická buněčná odpověď (T-lymfocyty) přirození zabíječi (NK buňky) A – malý lymfocyt B – střední lymfocyt C – lymfocyt se zářezem v jádře D - střední lymfocyt E – lymfocyt s výběžky z cytoplazmy a normálním jádrem F – vřetenovitý lymfocyt G – velký lymfocyt H - velký lymfocyt I – velký lymfocyt J – reaktivní lymfocyt K – velký lymfocyt s azurofilní granulací L – velký lymfocyt s azurofilní granulací
Nejmenší částice v krvi Heterogenní populace složená z PLT různé velikosti, tvaru, hustoty Bezjaderná diskoidní tělíska/buněčné fragmenty Tvar PLT se mění dle stupně aktivace
-
Periferní oblast: plazmatický obal, glykokalyx, membránové a
-
submembránové struktury (interakce PLT s mimobuněčným prostředím) Oblast solubilního gelu: pás mikrotubulů, submembránové filamenty, mikrofilamenty (základní jednotka PLT kontraktilního systému) Oblast organel: denzní granula, alfa granula, mitochondrie
-
Membránové systémy:
-
Metabolické a strukturální odlišnosti od ostatních krevních buněk/specifické schopnosti PLT podléhají řadě interakcí – se složkami plazmy nebo narušeným povrchem endotelu. Výsledkem je aktivace trombocytu. Metabolické a morfologické změny Adhese k jiným než destičkovým povrchům Agregace – vzájemné shlukování Sekrece (i GF) Retrakce – smršťování agregovaných PLT
-
Zástava krvácení Zprostředkují interakce mezi krví a cévní stěnou Primární hemostáza primární krevní zátka Fosfolipidový povrch pro navázání koagulačních faktorů závislých na vit. K sekund.krevní zátka Aktivace plazmatických koagulačních faktorů Vliv na správnou funkci endotelu Hojivé procesy – PLT nosiči řady proteinů, zejména GF syntetizovaných megakaryocyty
-
-
-
Growth Factors (GF) Proteiny syntetizované rozsáhlou skupinou buněk mezenchymálního původu. Specificky se vážou na receptory buněčných membrán – cílem je buněčná proliferace/diferenciace. GF přísně specifické x stimulace více bb. typů. Objev: počátek 90 let – i první pokusy s terapeutickým využitím. Optimalizace hojení a zrychlení reparace – rozsáhlý výzkum.
-
Význam pro oblast regenerace pojivových tkání: Faktory syntetizované megakaryocyty -uvolněné GF podporují v organismu buněčnou diferenciaci, proliferaci, transkripci specifických proteinů, chemotaxi a další procesy nutné pro regeneraci tkání.
Porušení tkáňové integrity vyvolává dynamickou kaskádu reparace – fáze: 1. Hemoragická aktivace PLT s jejich degranulací a adhezí je ukončena hemostázou a chemotaxí zánětlivých buněk 2. Zánětlivá infiltrace neutrofily, makrofágy a lymfocyty produkce specifických cytokinů, chemotaxe 3. Reparace uvolnění řady proteinů v místě léze 4. -
Remodelace Uvolnění růstových faktorů (syntetizované megakaryocyty, plazmatické)
chemotaxe, proliferace mezenchymálních buněk a proteosyntéza vazba RF na receptory buněčné membrány intracelulární aktivace proliferace a proteosyntézy
Aplikované růstové faktory (PRP) působí v organismu obdobně: -
Zahajují chemotaxi, proliferaci, angioneogenezi, proteosyntézu, reparaci a remodelaci poškozené tkáně.
-
Ve zvýšené koncentraci v poškozené tkáni v místě leze proces reparace a regenerace výrazně urychlují.
-
Silně redukují zánětlivou část kaskády.
-
Tkáň se hojí bez výrazných otoků (rychlejší angioneogeneze)
-
Snížená bolestivost.
-
Efekt ovlivněn obsahem růstových faktorů.
-
-
-
-
-
-
90. léta 20. století Stomatochirurgie - příprava pro implantaci dentálních implantátů Ortopedie, traumatologie – osteosyntézy, primární sutury ran, osteochondrální defekty, aloplastiky kloubů Dermatologie – kožní defekty, popáleniny, diabetická noha, dekubity Oční lékařství Terapeutický benefit pro pacienty: Omezení rizika nákazy (autologní materiál) Zkrácení doby hojení poškozených tkání Snížení bolestivosti Snížená spotřeba farmak (ATB, antiinflamatorika, analgetika)
Autologní materiál 1. Příprava PRP -
-
Odběr venózní krve a následná centrifugace Separátory krevních buněk Speciální přístroje
2. Formy aplikace -
-
PRP – přímé užití Destičkové lyzáty Kompozitní gely V kombinaci s dalšími materiály
Zpracování na lisu
Výsledek – Přípravky
Jak trombocyty použít? - Aktivované (trombin, CaCl2) x neaktivované ? - Optimální forma použití - Otázka obsahu růstových faktorů -
Porovnatelnost jednotlivých studií Standardizace přípravy PRP
-
Regulation (EC) No 1394/2007/EC on advanced therapy medicinal products
Klasifikace ATPMs:
1. buněčná terapie - trombocyty: Zák. 378/2007 Sb., Vyhl 143/2008 Sb. - kmenové buňky: Zák. 296/2008 Sb., Vyhl. 422/2008 Sb. 2. produkty tkáňového inženýrství - nanovlákna: Zák. 123/2000 Sb. Třeba stanovisko SÚKL klinická studie x zařazení přípravku http://www.sukl.cz/zdravotnicka-zarizeni/formularzadosti-o- zarazeni-pripravku Nedodržení pravidel: možnost pokuty, forenzní dopad
-
-
-
-
Committee for Advanced Therapy (CAT) www.ema.europa.eu klasifikace, certifikace,hodnocení a vědecký poradenství 2004 – 2010: 250 klinických studii, 170 dozorů Některé státy EU: národní regulace problematiky Doporučena klasifikace ATMP na národní úrovni
dozor,
