mTORC1 and C2 komplexhez köthető aktivitás különbségek és ennek jelentősége humán lymphomákban és leukémiákban Sebestyén A, Márk Á, Nagy N, Hajdu M, Csóka M*, Sticz T, Barna G, Nemes K*, Váradi Zs*, Kopper L Semmelweis Egyetem I. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet és II. Gyerekklinika
3,5 2,74
3
kezeletlen Rapamycin
3,1 2,9
3 2,5 2
P-4EBP1 ELISA
P-4EBP1 ELISA OD
2,5 1,53 1,5 1 0,52 0,5
2 1,4 1,5 0,8
1
0,55 0,5
0,07
0,004
0,04
0,02
0 0.nap 15. nap 33.nap jó prognózis
0.nap 33.nap 3 hónap relapszus rossz prognósis
0,72 0,1
0,05
0 2. beteg
5.
21.
22.
ALL sejtek magas mTOR aktivitás, bizonyos érték felett várható rossz prognózis, Még itt a C1/C2 aktivitás arányokat nem tudjuk, most kezdjük a vizsgálatokat , de az in vitro short term rapamycin érzékenységben talált különbségek utalnak rá, hogy egyedi különbségeket mutathat és a rossz prognózisú betegek esetében az esetleges jövőbeni inhibitor alkalmazások előtt mindenképp érdekes szempont lehet ennek megállapítása
PLOSOne Nemes K, Sebestyén A et al. 2013
mTOR – mammalian target of rapamycin
Stressz Amino savak
Energia ellátottság
oxigén Rapamycin Makromolekulák bioszintézise Fehérje szintézis Lipid szintézis
Növekedési faktorok mTOR aktivitás
citoszkeleton Sejtciklus progresszió Növekedés
Anyagcsere glikolízis Glükóz felvétel Autofágia
Túlélés
• mTOR jelút elemeit érintő mutációk (PI3K, RHEB, AKT1,2,3 –aktiváló mutáció; PTENinaktiváló mutáció). • A humán rosszindulatú daganatok mintegy 50%-ában konstitutívan aktivált az mTOR jelút. • Hematológiai malignitásokban leírt magas mTOR aktivitás • AML (hátterében RTK és N-RAS, K-RAS mutációk) -Levis et al 2003, Ahmad et al 2011 • CML, B-ALL (BCR-ABL fúziós fehérje áll a hátterében)-Kharas 2005 • MM-ben fokozott AKT aktivitás - Pene et al 2002 • Köpenysejtes lymphomák és veserákok esetén az mTOR gátlás már a klinikai gyakorlat része
Fehérje, lipid szintézis,autofágia, energiaháztartás, anyagcsere
citoszkeleton túlélés/anyagcsere
Cél:
Lymphomák, bizonyos leukémiák mTOR aktivitásának karakterizálása mTOR aktivitás két komplex mennyiségének, aktivitásának mTOR inhibitor érzékenység meghatározása
Vizsgálati lehetőségek – Módszerek: fehérje szinten: szöveti
minták v. vér, csontvelő - IHC, TMA, ELISA, Western blot primer leukémia sejtek, ly-le sejtvonalak kezelése mTORI-okkal in vitro, in vivo Lymphoma TMA 100 esettel DLBCL 80 eset HL 80 eset 50 gyerekkori ALL
primer ALL sejtek Sejtvonalak (DLBCL és HL is) Lymphoma xenograftok (DLBCL, HL és BL)
Rapamycin (C1) NVP-BEZ235 (dual-mTORC1 és PI3K gátlás) PP232 (C1 és C2 gátló) proliferáció, apoptózis vizsgálat xenograft tumor növekedésének vizsgálata
P S6 P
NYCS
MCL
BL Gyermekkori ALL minták vizsgálata (>40 eset)
pS6 DLBCL
pS6 HL
pS6 ALCL
P-4EBP1 ELISA OD
3
0. nap 33.nap *
2,5
1,65 2 1,5
threshold score 0,67 OD: 1,11
1 0,5
0,15 0,07
0 Jó prognózis
pmTOR
pmTOR
Rossz prognózis
pp70S6K
CLL
MZL
ALL
pp70S6K
pp70S6K
pS6
PLOSOne Nemes K, Sebestyén A et al. 2013
Diffúz nagy B sejtes lymphomák vizsgálata Non-GC:
GC:
68 eset (50 nonGC, 18 GC) Karakterizálás Han, Tally, Choi A non-GC esetek 80%-ában magas mTOR aktivitást, a GC altípus alacsony mTOR aktivitást mutatott. mTOR+ non-GC Rictor overexpresszió nélkül
p-S6
mTORC1 !!
Rictor
p-mTOR
Raptor
mTOR+ non-GC Rictor overexpresszióval
mTORC2 !! mTOR + (emelkedett/magas aktivitás)
mTOR(alacsony aktivitás) Rictor
Modern Pathol. Sebestyén A et al. 2012
Raptor
100% 80% 60%
mTOR (32 eset)
BHD1 – DLBCL sejtvonal mTOR inhibitor érzékenység vizsgálata in vitro
40% mTOR + (18 eset)
60
54
48
42
36
30
24
18
12
6
0
0%
idő (hónap)
100%
20 ap o p tózis%
20%
15 10 5 0 kontroll
R
NVPBEZ235
PP242
72h
3,85
5,5
12,8
6,2
96h
6,95
4,9
14,9
10,3
120h
5,4
7,45
16,2
14,05
80% mTOR – és mTOR + Rictor overexpresszióval (28 eset)
60% 40%
mTOR + Rictor overexpresszióval (22 eset)
20%
Modern Pathol. Sebestyén A et al. 2013
60
54
48
42
36
30
24
18
12
6
0
0% idő (hónap)
• A Hodgkin lymphomák 92%-a magas mTOR aktivitást mutatott 77/83
Vizsgálatba bevont betegek túlélése (%) mTOR-
6/83
mTOR+
HL, p-S6 IHC
HL, p-S6 IHC p=0,42
Csak 1 esetben tudtunk Rictor overexpressziót kimutatni, ami arra utal, hogy az mTORC2 komplex expressziója aHL-ekre nem jellemző
KMH2- HL sejtvonal, xenograft mTORI érzékenysége 30
* 25
Tumortérfogat (mm3)
* Apoptózis ap o p to s is% %
20
15
10
5
HL, Rictor IHC BMC Cancer Márk Á. et al. 2013
0 control R Kontroll R
D
D
D+R VV
D+R
V+R EtoEto Eto+R Eto+R
V+R
Igazoltuk mTORC2 komplex elemeinek overexpressziója, aktivitása rosszabb prognózis
mTOR aktivitás emelkedés lehet terápiás célpont nemcsak köpenysejtes lymphomában, hanem nonGC-DLBCL-ek (mTORC1 v. mTORC2) HL-ek (mTORC1) és ALL-ek esetében is,
p-S6+S6 ~mTORC1 aktivitás
Ehhez szükséges igazolni a magas mTOR aktivitást, illetve vizsgálni a két komplex mennyiségét (mTORC1 inhibitorok már egyre könnyebben elérhetőek, de… Jönnek az újgenerációs inhibitorok)
mTOR+Rictor ~mTORC2 komplex mennyisége
Piros: pontszerű reakció Zöld: sejtmagok autofluoreszcencia
BHD1 sejtvonal (DLBCL)
DEV sejtvonal (HL)
Könnyebb IHC alapú megállapításához lehetőség talán lesz!! - Duolink
KÖSZÖNÖM I .Patológia Intézetben kollégáimnak! Hemato-onkológus klinikusoknak!
