MS

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE ANALISIS MEDROKSIPROGESTERON ASETAT DALAM PLASMA DARAH MANUSIA MENGGUNAKAN UPLC XEVO TQD-MS/MS Drs. Agus Taufiq, M.Si., Ade Heri Mulyati, M.Si., Amalia Sabila Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan

SUMMARY Drug has an important role in public health service. Nowadays, many drug manufactures produce generic drug because the price of patent drug is relatively expensive. The quality of generic drugs is expected equivalennt to the quality of patent drugs. Bioavailability and bioequivalence (BA/BE) is the test that performed for the generic drug quality control. BA/BE test is performed using the method of analysis that can provide the valid data. Therefore for increasing the efficiency and sensitivity analysis method the optimization and validation of analytical method are performed. One of the drug is required by Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) to perform test BA / BE is medroxyprogesterone acetate. In the human body, medroxyprogesterone acetate absorbed into the bloodstream. The purpose of this study is to determine the optimum conditions of medroxyprogesterone acetate analysis in human plasma by UPLC Xevo TQD-MS/MS and further test the validity of the method of analysis. Research methodology that performed are determination of moleculelar weight and parameters of multiple reaction monitoring (MRM), determination of the composition of the mobile phase, mobile phase flow rate determination, systems suitability test, and optimization of extraction process and validation of analytical methods. The analysis method that performed is by extracting medroxyprogesterone acetate from blood plasma and measured using UPLC and Xevo TQD-MS / MS. Validation of analysis methods include the parameters of precision, accuracy, carry over, short term stability, long term stability, freeze and thaw stability, dilution, selectivity, matrix effect, stability of sample in autosampler (post-preparative) .Validasi method of analysis in this research refers to EMA guideline. The analytical method validation results showed that human blood plasma blank give response selectivity test. Lower Limit of Quantification test meet the requirements that is the analyte signal > 5x blank signal. Linearity of calibration curve is more than 0.99. Accuracy (% different) and precision (% CV) test meet the requirements that are ± 15% for low, medium and high sample test concentration while the lowest concentration is ± 20%. The analytical method validation results demonstrate the validity of the method to analysis medroxyprogesterone acetate in blood plasma samples derived from human. Keywords: Optimization, Validation, medroxyprogesterone acetate, Blood Plasma, Xevo TQD UPLC-MS/MS 1

untuk mengacu pada pedoman European Medicines Agency selain meningkatkan sensitivitas pengukuran lebih pada LLOQ. Sebelum digunakan, metode penentuan kadar analit dalam plasma harus divalidasi terlebih dahulu untuk menguji kualitas obat generik dibandingkan terhadap obat paten dengan hasil yang teruji keabsahannya. Salah satu obat generik yang banyak tersedia di Indonesia dan harus dilakukan uji BA/BE adalah medroksiprogesteron asetat. Medroksiprogesteron asetat merupakan salah satu obat yang berfungsi sebagai alat kontrasepsi. Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis diuraikan dan didefinisikan sebagaimana cara penentuannya (Harmita dalam Stella, 2011). Parameter-parameter validasi yang harus dilakukan diantaranya adalah selektivitas, carry over, batas bawah kuantifikasi (LLOQ), kurva kalibrasi, akurasi, presisi, dilution, efek matriks, dan stabilitas.

PENDAHULUAN Penanganan dan pencegahan berbagai penyakit tidak dapat dilepaskan dari tindakan terapi dengan obat atau farmakoterapi. Beberapa obat di Indonesia terutama obat paten relatif mahal bagi masyarakat menengah ke bawah. Oleh karena itu, banyak produsen obat berlomba-lomba membuat obat generik. Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) yang bertindak sebagai regulator obat di Indonesia mensyaratkan studi bioavailabilitas/bioekivalensi (BA/BE) untuk mengendalikan mutu obat generik. Bioavailabilitas menunjukkan suatu pengukuran laju dan jumlah obat yang aktif terapetik yang mencapai sirkulasi umum. Sedangkan bioekivalensi produk obat (ekivalensi farmasetik atau alternatif) adalah suatu sediaan yang laju dan jumlah absorpsinya tidak berbeda secara bermakna apabila diberikan dalam dosis dan kondisi percobaan yang sama. Sampel darah yang digunakan dalam studi diperoleh dari subyek sehat (subyek yang telah diperiksa kondisi kesehatannya terlebih dahulu) pada studi BA/BE, kemudian dipisahkan plasmanya untuk dianalisis kadarnya dengan menggunakan metode analisis yang sudah tervalidasi (Anonimus dalam Aji, 2011). Di dalam tubuh manusia, medroksiprogesteron asetat terserap dalam aliran darah yang di dalamnya terdapat plasma darah atau cairan darah. Dengan kata lain, medroksiprogesteron asetat dapat dianalisis dalam plasma darah. Metode penetapan kadar medroksiprogesteron asetat sebelumnya, telah dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi liquid-liquid extraction (LLE) dengan instrumen HPLC-MS/MS menggunakan detektor quattro micro. Metode tersebut perlu dioptimasi lagi

BAHAN DAN METODE A. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pipet mikro 20-200 µL dan 100-1000 µL, disposable plastic pipette tips (yellow tips 5-200 µL), disposable plastic pipette tips (blue tips 200-1000 µL), ultramicro balance Sartorius, pompa vakum Sartorius, turbovap, tabung reaksi 10 mL dan 15 mL, labu ukur 10 mL, stirrer plate, magnetic 2

stirrer, vortex mixer, microsyringe Hamilton (10 µL, 100 µL), sentrifugasi mikro Hettich, sentrifugasi universal Hettich Zentrifugen 320, autosampler glass vials and caps, UPLC-MS/MS Waters Xevo TQD Acquity UPLC ® H Class.

menghasilkan peak dengan intensitas energi yang tinggi dan stabil untuk metode scanning. Disiapkan larutan standar medroksiprogesteron asetat dan nipasol dengan konsentrasi tertentu. Masingmasing standar diinjeksikan ke dalam sistem UPLC-MS/MS. Ditentukan parameter standar untuk mode MRM seperti ionization mode ES+, nilai desolvation temperature, nilai source temperature, serta voltase pada cone dan collision untuk medroksiprogesteron asetat dan nipasol. Peak yang memiliki puncak paling tinggi menunjukkan zat yang dimaksud (zat target) dan dapat diketahui massa (MS Scan) medroksiprogesteron asetat dan nipasol dan massa pecahan (Daughter Scan) medroksiprogesteron asetat dan nipasol.

B. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquabides, metanol, asetonitril, asam format, plasma darah manusia (blanko), methyl tert-butyl ether (TBME), heksana, etil asetat, eter, 2propanol, standar primer medroksiprogesteron asetat dan standar primer nipasol. C. Metode Penelitian Metode penelitian yang dilakukan meliputi studi pustaka metode analisis medroksiprogesteron asetat dalam plasma darah manusia, penentuan massa molekul dan optimasi parameter multiple reaction monitoring (MRM), penentuan komposisi fase gerak, penentuan laju alir fase gerak, uji kesesuaian sistem, dan optimasi proses ekstraksi serta validasi terhadap metode analisis meliputi parameter presisi, akurasi, carry over, stabilitas jangka pendek, stabilitas jangka panjang, stabilitas beku dan cair, dilution, selektivitas, matrix effect, stabilitas autosampler (post preparative).

2. Penentuan Komposisi Fase Gerak Larutan induk medroksiprogesteron asetat diencerkan hingga konsentrasi tertentu lalu diinjeksikan ke dalam sistem UPLC Xevo TQD-MS/MS dengan komposisi fase gerak asam format 0,1% : asetonitril dengan beberapa komposisi variasi sebagai berikut : 1. asam format 0,1% : asetonitril (15:85) 2. asam format 0,1% : asetonitril (20:80) 3. asam format 0,1% : asetonitril (30:70) Untuk pemilihan metode, laju alir yang digunakan sebesar 0,2 mL/menit dan hasil elusi dideteksi sesuai m/z dan kondisi yang diperoleh saat penentuan massa molekul. Larutan campuran yang mengandung medroksiprogesteron asetat dengan konsentrasi tertentu diinjeksikan ke dalam sistem UPLC Xevo TQDMS/MS lalu dicatat waktu retensi dan dibandingkan nilai tailing factor, dan presisi (% CV) enam kali penyuntikan dari variasi laju alir fase gerak tersebut. Persyaratan untuk tailing factor adalah <2 dan % CV dari enam kali injeksi sebesar < 5%.

D. Optimasi Metode Analisis 1. Penentuan massa molekul dan optimasi parameter multiple reaction monitoring (MRM) parameter Penentuan massa molekul analit mengacu pada pustaka yang telah didapat sebelumnya. Penentuan massa molekul dan optimasi parameter MRM ini dilakukan untuk menentukan massa molekul serta temperatur maupun voltase pada parameter MRM yang 3

6. P6 : Etil asetat Larutan pengekstrak yang digunakan dalam metode analisis harus menghasilkan % recovery yang tinggi dan konsisten, rasio signal/noise untuk LLOQ > 10 serta linearitas yang memenuhi persyaratan yaitu > 0,99.

3. Penentuan Laju Alir Fase Gerak Dengan menggunakan komposisi fase gerak optimum yang telah ditentukan pada penelitian sebelumnya, larutan campuran yang mengandung medroksiprogesteron asetat dengan konsentrasi tertentu diinjeksikan ke dalam sistem UPLC Xevo TQD-MS/MS dengan komposisi fase gerak terpilih. Variasi laju alir yang dilakukan adalah 0,2 mL/menit, 0,3 mL/menit dan 0,4 mL/menit. Dicatat waktu retensi dan dibandingkan nilai tailing factor dan presisi (% CV) enam kali injeksi dari variasi laju alir fase gerak tersebut.

6. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis terhadap metode yang telah dikembangkan meliputi parameter selektivitas, carry over, LLOQ, kurva kalibrasi, akurasi, presisi, dilution, efek matriks, dan stabilitas.

4. Uji Kesesuaian Sistem Larutan campuran yang mengandung medroksiprogesteron asetat dengan konsentrasi tertentu diinjeksikan sebanyak enam kali ke dalam sistem UPLC Xevo TQD-MS/MS dengan laju alir dan komposisi fase gerak terpilih, kemudian dicatat waktu retensi dan presisi pada enam kali penyuntikan. Uji kesesuaian sistem memenuhi syarat jika nilai tailing factor <2 dan % CV yang diperoleh dari enam kali injeksi sebesar <5%.

HASIL DAN PEMBAHASAN A. Optimasi Metode Analisis 1. Penentuan Massa Molekul dan Optimasi Parameter Multiple Reaction Monitoring (MRM) Penentuan massa molekul dilakukan untuk menentukan massa molekul medroksiprogesteron asetat dan massa pecahannya. Penentuan massa molekul juga dilakukan terhadap nipasol sebagai standar internal. Penentuan massa molekul dilakukan dengan menyuntikkan larutan medroksiprogesteron asetat dan nipasol dengan konsentrasi tertentu ke dalam spektroskopi massa, kemudian ditentukan kondisi optimal dari parameter MRM. Kondisi optimal untuk medroksiprogesteron adalah ES+, source temperature 150 0C, desolvation temperature 450 0C, cone 50 volt dan collision 15 volt. Kondisi optimal untuk deteksi nipasol pada spektroskopi massa adalah ES+, source temperature 150 0C, desolvation temperature 450 0C, cone 15 volt, collision 10 volt. Spektrum yang dihasilkan menunjukkan massa molekul

5. Optimasi proses ekstraksi Ekstraksi medroksiprogesteron asetat dalam plasma darah manusia dilakukan setelah uji kesesuaian sistem telah memenuhi syarat, dilakukan dengan membuat sebuah kurva kalibrasi yang diekstraksi dengan perekasi organik. Optimasi proses ekstraksi dilakukan dengan beberapa variasi komposisi pengekstrak : 1. P1 : TBME : heksana (2:3) 2. P2 : TBME : heksana (1:1) 3. P3 : TBME 4. P4 : Heksana 5. P5 : Eter 4

dan massa pecahan. Spektrum yang dihasilkan menunjukkan massa molekul dan massa pecahan. Massa molekul medroksiprogesteron asetat yang dideteksi oleh spektroskopi massa adalah 387,20 dan massa pecahannya adalah 327,20. Massa molekul nipasol yang dideteksi oleh spektroskopi massa adalah 180,80 dan massa pecahannya adalah 139,20.

Fase Gerak

Asam format 0,1% : asetonitril (15:85)

Asam format 0,1% : asetonitril (20:80)

Asam format 0,1% : asetonitril (30:70)

MPA

Nipasol

MPA

Nipasol

MPA

Nipasol

Tailing factor

1,33

1,00

1,33

1,25

1,21

1,00

Rata-rata area

8107

3952

14029

8924

18872

20580

% CV area

2,51%

4,22%

4,19%

3,38%

2,91%

2,82%

Data pada tabel 1 menunjukkan bahwa metode ketiga adalah metode yang terbaik, yaitu fase gerak asam format 0,1% : asetonitril (30:70) karena dapat menghasilkan pemisahan yang baik dengan luas area puncak yang besar, bentuk puncak yang simetris dan tajam serta memenuhi persyaratan untuk tailing factor sebesar 1,21 untuk medroksiprogesteron asetat dan 1,00 untuk nipasol serta % CV dari enam kali suntikkan sebesar 2,91% untuk medroksiprogesteron asetat dan 2,82% untuk nipasol. 3. Penentuan Laju Alir Fase Gerak Setelah menentukan komposisi fase gerak terbaik, berikutnya dilakukan penentuan laju alir sistem kromatografi. Penentuan laju alir fase gerak dilakukan untuk mendapatkan waktu pemisahan yang cepat namun dapat menghasilkan pemisahan yang baik. Larutan standar medroksiprogesteron asetat dan nipasol dalam pelarut murni diinjeksikan ke dalam UPLC Xevo TQDMS/MS menggunakan komposisi fase gerak terbaik dengan laju alir yang digunakan semula adalah 0,2 mL/menit kemudian divariasikan menjadi 0,3 mL/menit dan 0,4 mL/menit. Data hasil pemilihan laju alir fase gerakk ditunjukkan pada tabel 2 di bawah ini.

2. Penentuan Komposisi Fase Gerak Setelah menentukan massa molekul dan massa pecahan medroskiprogesteron asetat beserta nipasol, berikutnya dilakukan penentuan komposisi fase gerak. Penentuan komposisi fase gerak dilakukan untuk mendapatkan metode pemisahan yang terbaik. Larutan standar medroksiprogesteron asetat dan nipasol dalam pelarut murni diinjeksikan ke dalam UPLC Xevo TQD-MS/MS menggunakan beberapa variasi metode. Metode ke-1 menggunakan fase gerak asam format 0,1% : asetonitril (15:85), metode ke-2 menggunakan fase gerak asam format 0,1% : asetonitril (20:80), metode ke-3 menggunakan fase gerak asam format 0,1% : asetonitril (30:70). Laju alir yang digunakan sebesar 0,2 mL/menit. Untuk mengetahui zat yang memiliki waktu retensi lebih singkat dilakukan dengan menginjeksikan larutan medroksiprogesteron asetat dan nipasol menggunakan metode analisis yang pertama sebagai kondisi awal. Berdasarkan pengamatan, nipasol memiliki waktu retensi yang lebih singkat daripada medroksiprogesteron asetat. Tabel 1. Data hasil pemilihan fase gerak untuk analisis medroksiprogesteron asetat (MPA) dalam plasma darah manusia

Tabel 2. Data Hasil Pemilihan Laju Alir Fase Medroksiprogesteron Asetat Dalam Plasma Darah Manusia 5

Gerak

Untuk

Analisis

Data pada tabel 2 menunjukkan bahwa laju alir 0,2 mL/menit dapat menghasilkan pemisahan yang baik dengan luas area puncak yang besar, bentuk puncak yang simetris dan tajam serta memenuhi persyaratan untuk tailing factor sebesar 1,06 untuk medroksiprogesteron asetat dan 1,07 untuk nipasol serta % CV dari enam kali suntikkan sebesar 0,72% untuk medroksiprogesteron asetat dan 1,69% untuk nipasol sehingga laju alir terpilih adalah 0,2 mL/menit.

Tabel 3. Data Hasil Uji Kesesuaian Sistem Fase Gerak

Asetonitril-asam format 0,1% (30:70), laju alir 0,2 mL MPA

Nipasol

Tailing factor

1,06

1,12

Rata-rata area

16818

22238

% CV area

1,11%

0,75%

1,4

0,8

Waktu retensi

5. Optimasi Proses Ekstraksi Setelah menentukkan metode pemisahan yang terbaik, dilakukan optimasi proses ekstraksi medroksiprogesteron asetat dalam plasma darah manusia. Optimasi proses ekstraksi dilakukan untuk menetukan pengekstrak terbaik untuk metode analisis medroksiprogesteron asetat dalam plasma darah manusia. Pada metode ini digunakan ekstraksi cair-cair untuk memisahkan analit dari senyawa lain yang mengganggu analisis. Melalui ekstraksi cair-cair, dipisahkan sampel antara dua larutan (fase) yang tidak bercampur satu sama lain. Dalam ekstraksi caircair biasanya terdapat dua fase, yaitu fase air dan Dalam ekstraksi cair-cair biasanya terdapat dua fase, yaitu fase air dan fase lainnya adalah pelarut organik. Senyawa yang bersifat hidrofilik akan

4. Uji Kesesuaian Sistem Setelah menentukan komposisi fase gerak dan laju alir terbaik dilakukan uji kesesuaian sistem. Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memberikan jaminan bahwa sistem kromatografi yang digunakan akan berlangsung baik selama analisis berlangsung. Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan menyuntikkan larutan medroksiprogesteron asetat dan nipasol sebanyak enam kali menggunakan metode terpilih. Dari hasil penyuntikkan diketahui waktu retensi dan luas area masing-masing zat kemudian dihitung nilai % CV area tiap zat dan tailing factor.

6

bergabung dengan fase air, sedangkan fase yang bersifat hidrofobik akan bergabung bersama

pelarut organik yang cenderung non polar dibandingkan air.

Tabel 4. Perbandingan % recovery dan koefisien korelasi (r) kurva kalibrasi dari enam pengekstrak Pengekstrak

% Recovery

Koefisien korelasi (r)

P1

91,94%

0,6363

P2

95,69%

0,9932

P3

73,23%

0,9900

P4

87,78

0,6051

P5

69,86

0,9842

P6

15,83

0,9177

Parameter validasi yang dilakukan yaitu selektivitas, carry over, batas terendah kuantifikasi (LLOQ), kuurva kalibrasi, presisi dan akurasi, dilution, efek matriks dan stabilitas. Data hasil validasi metode analisis medroksiprogesteron asetat dalam plasma darah manusia menggunakan UPLC Xevo TQD-MS/MS dapat diihat pada hasil tiap parameter validasi berikut :

Data pada tabel 4 menunjukkan perbandingan % recovery dan koefisien korelasi (r) kurva kaibrasi dari enam pengekstrak. Dari hasil penelitian diperoleh ekstraktan yang terbaik untuk analisis medoksiprogesteron asetat adalah TBME : heksana (1:1). Ekstraksi menggunakan TBME : heksana (1:1) menghasilkan % recovery sebesar 95,69%, rasio signal/noise untuk LLOQ sebesar 37.630 dan koefisien korelasi (r) kurva kalibrasi sebesar 0,9932. 6. Validasi Metode Analisis Metode analisis medroksiproesteron asetat dalam plasma darah manusia yang didapat dari penelitian ini harus diuji keabsahannya terlebih dahulu sebelum digunakan untuk analisis rutin. Untuk membuktikan keabsahan metode uji tersebut dilakukan validasi metode analisis.

7

No.

Parameter Validasi

Hasil

Kriteria Penerimaan (EMA)

1

Selektivitas

Persen interferensi analit 0,00%, persen interferensi standar internal 0,00% s.d 2,88%

Respon <20% LLOQ untuk analit dan <5% untuk standar internal

2

Carry over

Respon analit dan standar internal 0,00%

Respon <20% LLOQ untuk analit dan <5% untuk standar internal

3

LLOQ

Sinyal analit ≥5x

Sinyal analit sampel LLOQ minimal lima kali sinyal dari sampel blanko

4

Linieritas kurva kalibrasi

r = 0,9962 s.d 0,9982

Koefisien korelasi (r) sebesar ≥ 0,99 dan persen different untuk standar kalibrasi adalah sebesar ± 15% kecuali untuk LLOQ sebesar ±20%.

% different = -8,90% s.d 15,00% 5

Presisi dan akurasi

% different = -14,78% s.d 15,69% % CV = 3,28% s.d 13,97%

Persen CV ≤ 20% untuk konsentrasi terendah dan ≤ 15% untuk konsentrasi sedang, rendah dan tinggi. Persen different -20% s.d 20% untuk konsentrasi terendah dan -15% s.d 15% untuk konsentrasi sedang, rendah dan tinggi

6

Dilution

% different = 0,27% s.d 6,68%

Persen different -15% s.d 15%

7

Matrix effect

% CV = 3,56% s.d 14,50%

Persen CV standar internal dinormalisasi MF ˂15%

8

Stabilitas % different = -9,14% s.d 0,00%

Persen different -10% s.d 10%

a.

Stabilitas larutan kerja standar dan standar internal pada suhu ruang (20-28 0C)

b.

Stabilitas larutan kerja standar dan standar internal pada suhu

% different = 0,00% s.d 3,86%

Persen different -10% s,d 10%

penyimpanan (2-8 0C) c. Stabilitas pembekuan dan pencairan sampel d. e. f.

Stabilitas sampel pada suhu ruang (20-28 0C) Stabilitas sampel pada suhu penyimpanan (-20 ± 5 0C) Stabilitas sampel dalam autosampler (post preparative)

% different = -9,59% s.d 11,41% Persen different -15% sd 15% % different = -14,90% s.d 8,33% % different = -14,80% s.d 12,47% % different = -14,12% s.d 4,93%

Persen different -15% s.d 15%

Persen different -15% s.d 15%

Persen different -15% s.d 15%

8

diminumkan kepada manusia yang sehat lalu diambil darahnya pada waktu-waktu tertentu, dimulai dari jam ke-0 sebelum meminum obat hingga waktu eliminasi obat dalam tubuh. Hasil analisis disajikan dalam bentuk kurva hubungan waktu pengambilan darah dengan konsentrasi.

Konsentrasi medroksiprogesteron asetat (ppt)

7. Aplikasi Metode Analisis Metode analisis yang telah diuji keabsahannya dapat diaplikasikan langsung untuk analisis sampel plasma darah manusia yang mengandung medroksiprogesteron asetat. Obat paten dengan sediaan injeksi maupun tablet mengandung medroksiprogesteron asetat 3000 2500 2000

1500 1000 500 0 0

20

40 Waktu (jam)

60

80

Gambar 1. Kurva serapan medroksiprogesteron dalam darah manusia syarat persen CV ± 15% untuk konsentrasi rendah, sedang, tinggi dan ± 20% untuk konsentrasi terendah. Larutan standar medroksiprogesteron asetat dan nipasol stabil pada penyimpanan 2-8 0 C selama 32 hari. Larutan medroksiprogesteron asetat, nipasol dan sampel yang mengandung medroksiprogesteron asetat dapat dianalisis pada suhu ruang hingga 6 jam. Sampel plasma darah yang mengandung yang mengandung medroksiprogesteron asetat dapat disimpan dalam suhu penyimpanan selama 96 hari. Berdasarkan hasil yang diperoleh metode analisis tersebut bersifat valid dan layak digunakan karena memenuhi persyaratan guideline EMA (EMA, 2011).

KESIMPULAN DAN SARAN Hasil optimasi metode analisis menunjukkan bahwa metode dapat diperbaharui dan ditingkatkan sensitivitas serta efisiensi waktu analisisnya dari run time 13 menit menjadi 2 menit. Dari optimasi tersebut diperoleh metode optimal menggunakan pengekstrak TBME:heksana (1:1), fase gerak asetonitril:asam format 0,1% (70:30), laju alir 0,2 mL/menit. Hasil validasi metode analisis menunjukkan bahwa plasma darah manusia blanko tidak memberikan respon pada uji selektivitas. Linieritas memenuhi syarat lebih besar atau sama dengan 0,99. Uji akurasi memenuhi syarat persen different ±15% untuk konsentrasi rendah, sedang, tinggi dan ± 20% untuk konsentrasi terendah. Uji presisi memenuhi 9

Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2011. Kriteria dan Tata Laksana Registrasi Obat. Jakarta : BPOM RI.

DAFTAR PUSTAKA Aji, Ganjar Bayu. 2011. Validasi Metode Analisis Domperidon Dalam Plasma Darah Manusia Menggunakan LC-MS/MS. Bogor : Universitas Pakuan.

Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2015. Kepentingan Informatorium Nasional. Jakarta : BPOM RI.

Anonimus. 2005. Drug Bank. http://www.drugbank.ca/drugs/D B00603 diakses pada tanggal 24 Februari 2015 pukul 02.45

ChemAxon. 2011. Properties viewer of ρ-hydroxypropyl benzoat. http://www.chemicalize.org diakses pada 24 Februari 2015 pukul 12.30

Anonimus. 2011. Tandem Quadrupole MS Detector for Routine Analysis Gives Laboratories Maximum Productivity With Minimum Effort. Denver : Waters.

ChemAxon. 2011. Properties viewer of medroxyprogesterone acetate. http://www.chemicalize.org diakses pada 24 Februari 2015 pukul 12.30 Day, R.A dan Underwood. 1994. Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi 6. Jakarta : Erlangga.

Anonimus. 2012. Contraception. King Edward Memorial Hospital. Perth : Women and Newborn Health Service King Edward Memorial Hospital.

European Medicines Agency. 2011. Guideline on Bioanalytical Method Validation.

Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Edisi 4. Diterjemahkan oleh Farida Ibrahim. Jakarta : UI Press.

Food and Drug Administration. 2001. Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation.

Aryani NLD. 2005. Penetapan Nilai Parameter Lipofolitas (Log P, jumlah tetapan π Hansch dan tetapan F Rekker) asam pipemidat. Jurnal Ilmu Sains dan Teknologi. 1(2): 93-100.

Harahap, Yahdiana. 2010. Peran Bioanalisis Dalam Penjaminan Kualitas Obat dan Peningkatan Kualitas Hidup Pasien. Depok : Universitas Indonesia. Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York (US): McGraw Hill

Augustine MS, Bonny AE, Rogers LK. 2014. Medroxyprogesterone acetate and Progesterone Measurement in human Serum: Assesment of Contraceptive Efficacy.RI.

Merck Index. 2001. An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 10

Shargel, Leon dan Andrew B. C. Yu. 1985. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan Edisi Kedua. Diterjemahkan oleh Dr. Fasich, Apoteker dan Dra. Siti Sjamsiah, Apoteker. Surabaya. Universitas Airlangga. Stella. 2011. Optimasi dan Validasi Metode Analisis Isoniazid dan Pirazinamid Dalam Tablet 4 Fixed Dose Combination (4FDC) Dalam Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Depok. Universitas Indonesia. Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR. 2004. Fundamentals of Analytical Chemistry 8th Edition. Brooks/Cole (CA): Sauders College Publishing. Reddy, T. Sunil Kumar et al. 2012. Ultra Performance Liquid Chromatography: An Introduction And Review. India. International Journal of Pharmaceutical Research & Analysis.

11