MS

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2013-2014

ONTWIKKELING EN VALIDATIE VAN EEN METHODE VOOR DE KWANTIFICATIE VAN ANTIPSYCHOTICA IN PLASMA VIA UHPLC-MS/MS

Isolde GEUNS Eerste Master in de Farmaceutische zorg

Promotor Prof. Dr. Apr. C. Stove

Commissarissen Prof. Dr. Apr. W. Lambert Dr. Apr. S. Wille

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2013-2014

ONTWIKKELING EN VALIDATIE VAN EEN METHODE VOOR DE KWANTIFICATIE VAN ANTIPSYCHOTICA IN PLASMA VIA UHPLC-MS/MS

Isolde GEUNS Eerste Master in de Farmaceutische zorg

Promotor Prof. Dr. Apr. C. Stove

Commissarissen Prof. Dr. Apr. W. Lambert Dr. Apr. S. Wille

AUTEURSRECHT

« De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. »

28 mei 2014

Promotor

Auteur

Prof. Dr. Apr. C. Stove

Isolde Geuns

COPYRIGHT

"The author and the promoters give the authorization to consult and to copy parts of this thesis for personal use only. Any other use is limited by the laws of copyright, especially concerning the obligation to refer to the source whenever results from this thesis are cited.”

28 mei 2014

Promotor

Auteur

Prof. Dr. Apr. C. Stove

Isolde Geuns

SAMENVATTING Antipsychotica zijn geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van psychotische verschijnselen, zoals schizofrenie. In het laboratorium van het Nationaal Instituut voor Criminalistiek en Criminologie (NICC) wordt een extractie en detectie methode ontwikkeld voor de kwantificatie van antipsychotica in plasma. Deze methode zal toegepast worden in forensische onderzoeken waarbij staalvolume vaak een beperkende factor is.

Het eerste luik van deze masterproef behandelt de optimalisatie van de ultrahoge druk vloeistofchromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie (UHPLC-MS/MS) parameters en de staalvoorbereiding. Tijdens de optimalisatie van de staalvoorbereiding wordt het staal waarin de antipsychotica zich bevinden, onderworpen aan een eiwitprecipitatie, een vloeistof-vloeistof extractie en een vaste fase extractie. De methoden worden onderling vergeleken op basis van hun extractie efficiëntie en hun matrix effect. Aan de hand van deze parameters en omwille van praktische redenen werd gekozen voor een vaste fase extractie met een kationuitwisselingsmechanisme. Een mooie chromatografische scheiding werd bekomen met behulp van een Acquity UPLC® BEH kolom met gradiëntelutie. De detectie gebeurde met een tandem quadrupool massaspectrometer in multiple reaction monitoring-modus. Deze techniek onderscheidt zich door de hoge gevoeligheid en selectiviteit.

Het tweede luik bestaat uit de validatie van de methode volgens internationaal aanvaarde richtlijnen. De selectiviteit, lineariteit, accuraatheid, precisie, kwantificatielimiet, extractie efficiëntie, matrix effect en stabiliteit worden bepaald.

Er kan besloten worden dat een kwantitatieve methode is ontwikkeld voor droperidol, desmethylclozapine, haloperidol, olanzapine, quetiapine, 7-OH-quetiapine, risperidon en 9OH-risperidon. We kunnen spreken van een semi-kwantitatieve methode voor amisulpride, aripiprazol, clozapine, flupentixol, desmethylolanzapine, levomepromazine, pimpamperon, prothipendyl, sertindol, sulpiride, tiapride

en zuclopentixol aangezien niet aan alle

validatiecriteria werd voldaan. Bromperidol kan enkel kwalitatief bepaald worden wegens de lage accuraatheid en precisie (bias = ± 45 %, precisie = ± 42 %). Verder onderzoek is noodzakelijk. Dit onderzoek kan beschouwd worden als de basis voor de verdere ontwikkeling van een methode voor de kwantificatie van antipsychotica.

DANKWOORD

In de eerste plaats wil ik mijn begeleidster Dr. M. Del Mar Ramírez-Fernandez bedanken voor de dagelijkse begeleiding in het laboratorium en de goede raad.

Dr. Apr. S. Wille wil ik graag bedanken voor het nalezen en corrigeren van mijn masterproef en het beantwoorden van mijn vele vragen.

Bij deze wens ik ook mijn promotor, Prof. Dr. Apr. C. Stove, te bedanken voor de algemene leiding bij deze masterproef.

Graag wens ik ook het NICC te bedanken voor deze unieke kans en in het bijzonder de vakgroep toxicologie voor de aangename werksfeer en samenwerking.

Als laatste wil ik mijn vriend, zus en ouders bedanken voor de steun waarop ik elke dag kon rekenen.

INHOUDSOPGAVE

1.

INLEIDING .............................................................................................................. 1

1.1.

ANTIPSYCHOTICA ................................................................................................. 1

1.1.1. Algemeen ............................................................................................................. 1 1.1.2. Schizofrenie ......................................................................................................... 2 1.1.3. Indeling antipsychotica ...................................................................................... 4 1.1.4. Werkingsmechanisme en bijwerkingen ........................................................... 8 1.1.5. Kwantitatieve analyse van antipsychotica ....................................................... 9 1.2.

STAALVOORBEREIDING .................................................................................... 10

1.2.1. Eiwitprecipitatie ............................................................................................... 10 1.2.2. Vloeistof-vloeistof extractie (LLE) .................................................................. 10 1.2.3. Vaste fase extractie ........................................................................................... 11 1.3.

DETECTIEMETHODEN ........................................................................................ 13

1.3.1. Ultra hoge druk vloeistofchromatografie ....................................................... 13 1.3.2. Tandem massaspectrometrie: MS/MS ........................................................... 14

2.

ONDERZOEKSOBJECTIEVEN ......................................................................... 18

3.

MATERIALEN EN METHODEN ....................................................................... 19

3.1.

REAGENTIA EN SOLVENTEN ............................................................................ 19

3.2.

STOCKOPLOSSING ............................................................................................... 19

3.3.

WERKOPLOSSINGEN ........................................................................................... 19

3.4.

OPLOSSINGEN VOOR STAALVOORBEREIDING EN UHPLC-ANALYSE ... 20

3.5.

PLASMA .................................................................................................................. 21

3.6.

APPARATUUR ....................................................................................................... 21

3.6.1. Weegschaal, vortex, centrifuge, vacuümkamer, verdampingstoestel, vacuümcentrifuge, filter ................................................................................... 21 3.6.2. Uhplc-ms/ms ..................................................................................................... 21

3.7.

METHODEONTWIKKELING ............................................................................... 22

3.7.1. Optimalisatie MS/MS parameters .................................................................. 22 3.8.

STAALVOORBEREIDING .................................................................................... 23

3.8.1. Eiwitprecipitatie ............................................................................................... 24 3.8.2. LLE .................................................................................................................... 24 3.8.3. SPE..................................................................................................................... 24 3.9.

VALIDATIE ............................................................................................................ 25

3.9.1. Selectiviteit ........................................................................................................ 25 3.9.2. Lineariteit van de kalibratiecurve .................................................................. 25 3.9.3. Accuraatheid en Precisie.................................................................................. 26 3.9.4. LOQ ................................................................................................................... 27 3.9.5. De extractie efficiëntie ...................................................................................... 27 3.9.6. Het matrix effect ............................................................................................... 28 3.9.7. Het carry-over effect ........................................................................................ 28 3.9.8. Stabiliteit ........................................................................................................... 28

4.

RESULTATEN EN DISCUSSIE .......................................................................... 29 4.1.

METHODEONTWIKKELING ............................................................................... 29

4.1.1. UHPLC parameters ......................................................................................... 29 4.1.2. Optimalisatie MS/MS parameters .................................................................. 30 4.2.

STAALVOORBEREIDING .................................................................................... 31

4.2.1. Extractie efficiëntie en matrix effect ............................................................... 31 4.3.

VALIDATIE ............................................................................................................ 34

4.3.1. Selectiviteit ........................................................................................................ 34 4.3.2. Lineariteit van de kalibratiecurve .................................................................. 35 4.3.3. Accuraatheid en Precisie.................................................................................. 40 4.3.4. LOQ ................................................................................................................... 43 4.3.5. De extractie efficiëntie ...................................................................................... 44 4.3.6. Het matrix effect ............................................................................................... 45 4.3.7. Het carry-over effect ........................................................................................ 47 4.3.8. Stabiliteit ........................................................................................................... 48

5.

CONCLUSIE EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN .......................................... 50

6.

LITERATUURLIJST ............................................................................................ 51

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

CID: botsingsgeïnduceerde dissociatie DC: gelijkstroom EPS: extrapiramidale bijwerkingen ESI: elektrospray ionisatie FDA: Food and Drug Administration HCl: zoutzuur HPLC: hoge druk vloeistofchromatografie IS: interne standaard LC: vloeistofchromatografie LLE: vloeistof-vloeistof extractie LOQ: kwantificatielimiet m/z: massa over lading verhouding MeOH: methanol MRM: Multiple Reaction Monitoring MS: massaspectrometer NaOH: natriumhydroxide NICC: Nationaal Instituut voor Criminalistiek en Criminologie RE: relatieve fout RF: radiofrequentie RSD: relatieve standaarddeviatie RT: retentietijd rpm: rotaties per minuut SPE: vaste fase extractie TQD: tandem quadrupool detector UHPLC: ultrahoge druk vloeistofchromatografie UHPLC-MS/MS: ultrahoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie

1. INLEIDING 1.1. ANTIPSYCHOTICA 1.1.1. Algemeen

Antipsychotica zijn geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van psychotische verschijnselen waarvan schizofrenie de belangrijkste is. Schizofrenie is een chronische ziekte en wordt beschouwd als één van de ernstigste psychiatrische aandoeningen. [1,2] Deze ziekte treft wereldwijd ongeveer 24 miljoen mensen. [3] Het risico op het ontwikkelen van schizofrenie is bij mannen en vrouwen even groot, maar mannen hebben een grote kans tussen 15 en 25 jaar, bij vrouwen is er een piek tussen 25 en 35 jaar. [1]

Het eerste antipsychoticum chloorpromazine (zie figuur 1.1) werd in 1952 door de Franse chirurg Henri-Marie Laborit gebruikt als anestheticum omwille van een anti-histamine en een sterk psycholeptisch effect. Na het vaststellen van deze resultaten werd de stof door Delay en Deniker toegepast op patiënten met psychosen. De resultaten waren opmerkelijk zodat chloorpromazine in 1953 na goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) op de markt werd gebracht. De eerste antipsychotische geneesmiddelen werden aangeduid met de term neuroleptica. In 1962 werd het atypische antipsychoticum clozapine (zie figuur 1.1) ontdekt, maar wegens de afwezigheid van de extrapiramidale1 bijwerkingen (EPS), die kenmerkend zijn voor de neuroleptica, werd dit niet goedgekeurd door het FDA. Uiteindelijk kwam clozapine in 1972 dan toch op markt, maar verdween al snel na het vaststellen van de vele ernstige bijwerkingen. In 1990 werd het terug toegelaten, maar onder strenge voorwaarden. [2] 1

2

Figuur 1.1: 1) Chloorpromazine, het eerste antipsychoticum 2) Clozapine, het prototype van de atypische antipsychotica [4]

1

extrapiramidale bijwerkingen zijn bewegingsstoornissen veroorzaakt door een functiestoornis ter hoogte van het extrapiramidale systeem dat verantwoordelijk is voor de automatische bewegingen en de spiertonus.

1

De ontwikkeling van nieuwe antipsychotica verloopt relatief traag aangezien de neurobiologische processen die aan de basis liggen van schizofrenie en psychosen nog altijd niet volledig opgehelderd zijn. [5] 1.1.2. Schizofrenie

De ziekte wordt gekenmerkt door onvoorspelbare, recidiverende psychotische opstoten, die gepaard gaan met positieve en negatieve kenmerken. Het risico op schizofrenie is afhankelijk van genetische, psychologische en sociale factoren. Deze factoren kunnen leiden tot hersenbeschadiging, wat dan weer andere veranderingen met zich meebrengt zoals metabole neurotransmitterdisfuncties. De diagnose kan gesteld worden aan de hand van enkele criteria zoals DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) en ICD-10 (International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems). Deze classificatiesystemen vereisen de aanwezigheid van wanen, hallucinaties en/of verwardheid bij helder bewustzijn. [1,2] 1.1.2.1.Symptomen

De symptomen worden onderverdeeld in positieve, negatieve, cognitieve en affectieve symptomen. Hallucinaties, wanen, illusionaire vervalsingen en formele denkstoornissen worden beschouwd als positieve symptomen. Negatieve symptomen gaan gepaard met psychische uitvallingsverschijnselen zoals het verlies van initiatief en creativiteit, vervlakking van het gevoelsleven en vermijden van contacten. [1] Bij cognitieve symptomen heeft de patiënt last van aandacht- en concentratiestoornissen. Vaak zijn er ook problemen met de taal, het geheugen en verloopt het uitvoeren en plannen van taken moeizaam. [2] Het onderscheid tussen negatieve en affectieve symptomen is vaak onduidelijk. Affectieve symptomen omvatten angst, depressie en suïcidale gedachten. [6] 1.1.2.2.Oorzaak

Aanvankelijk werd gedacht dat een overactiviteit van het dopaminerge systeem in de basale ganglia aan de basis lag van het ontstaan van schizofrenie. Deze hypothese komt voort uit het werkingsmechanisme van de klassieke antipsychotica, maar is ook gebaseerd op het feit dat dopamine-agonisten, zoals levodopa en amfetamine, kunnen leiden tot het ontstaan van schizofrenie. Later bleek de oorzaak complexer. Een afgenomen dopaminerge activiteit 2

ter hoogte van het prefrontale corticale gebied en een verhoogde activiteit in het mesolimbisch gebied lijkt meer toepasselijk. [2,7]

Dopamine is belangrijk voor de ideale verhouding tussen het signaal (= de juiste informatie) en de ruis (= overbodige informatie). Door de verhoogde activiteit in het mesolimbisch gebied bereikt een overmaat aan informatie de hersenen. Het onderscheid tussen belangrijke en overbodige informatie valt weg, zo ook het onderscheid tussen verbeelding en realiteit. Deze stoornis is verantwoordelijk voor de positieve symptomen. De negatieve symptomen worden veroorzaakt door een gebrek aan dopamine in de prefrontale corticale gebieden, daar dit ook een negatieve invloed heeft op de balans tussen signaal en ruis. [2] Een duidelijker beeld van de oorzaken van schizofrenie wordt weergegeven in figuur 1.2. A

B

Cognitieve symptomen

Affectieve symptomen

Figuur 1.2: A) De verhoogde dopaminerge activiteit in het mesolimbisch gebied B) De afgenomen dopaminerge activiteit in de prefrontale corticale gebieden [6]

Disfuncties ter hoogte van andere receptoren worden ook waargenomen. Zowel een teveel aan serotonine in de hersenen als een verstoring van de interactie tussen het dopamine- en serotoninesysteem dragen bij tot het uitlokken van de typische symptomen. Deze hypothese ontstond na het opklaren van het werkingsmechanisme van de atypische antipsychotica zoals clozapine. Dit prototype is een zwakke dopamine en een sterke serotonine antagonist. [1,2,7]

3

1.1.3. Indeling antipsychotica

De antipsychotica zijn sterk lipofiel en basisch. Hun moleculair gewicht bevindt zich tussen de 200 en 500 Da. Typerend zijn ook de snelle absorptie, het hoog first-pass effect en de sterke binding aan de plasmaproteïnen. De informatie weergegeven in tabel 1.1 is ook relevant bij het monitoren van antipsychotica, dit wordt verder besproken in § 1.1.5. [8]

Tabel 1.1: Een overzicht van de therapeutische en toxische concentraties van de antipsychotica en hun belangrijkste eigenschappen [8-14] Fb (% )

T1/2 (h)

Therapeutische concentratie (mg/l)

Toxische concentratie (mg/l)

13-16

17

12-20

0,100-0,400

10,000

-

4,9

> 99

60-80

0,100-0,450

-

dehydroaripiprazole

/

2-4

0,002-0,010

-

-

90

20-36

0,001-0,020

-

-

12-16

0,350-0,600

0,800 -1,300

desmethylclozapine

2

appr.0,050

-

19-39

0,001-0,015

-

-

14-41

0,005-0,015

0,050-0,100

-

> 90

20-80

0,020-0,150

0,500

10-20

93

30-60

0,020-0,080

0,200-1,000

N-desmethylolanzapine

/

/

17-22

0,100-0,500

0,600

-

9,4

/

hoog

10-20

0,050-0,200

0,500-1,000

6,8

8-12

83

7

0,075-0,500

1,800-7,000

Component

MG (g/mol)

pKa

Vd (L/kg)

Amisulpride

369,5

9,4

Aripiprazol

448,5

7,6

Benperidol

381,4

8,8

5,2

Bromperidol

420,3

8,6

20,0

Clozapine

326,8

7,6

1,6

95

Droperidol

379,4

7,5

1,7

85-90

Flupentixol

434,5

8,5

/

99

Haloperidol

375,9

8,3

18-30

90

Levomepromazine

328,5

9,2

Olanzapine

312,4

7,4

Pimpamperon

375,5

8,0

Prothipendyl

285,4

Quetiapine

383,2

Actieve Metaboliet

7-OH-quetiapine 7-OH-N-desalkylquetiapine

Risperidon

410,5

8,2

0,7-2,1

89

3

0,004-0,030

0,080

9-OH-risperidon

9-OH-risperidon

426,5

8,2

5-9

74

20-30

0,012-0,060

0,015-0,060

-

S ertindol

440,9

8,8

20-40

99

55-90

0,050-0,100

-

-

S ulpiride

341,4

9,0

2,7

40

8-14

0,040-0,600

3,800

-

Tiapride

328,4

9,1

1,5

40

2,9-3,6

1,000-2,000

-

Zuclopentixol

401,0

6,1

15-20

98

12-30

0,002-0,010

0,050-0,100

-

De antipsychotica worden onderverdeeld in twee subklassen, de typische of de klassieke en de atypische antipsychotica. Deze klassen kunnen van elkaar worden onderscheiden op basis van hun effect op de negatieve symptomen en op de aanwezigheid van bijwerkingen, maar vergelijkende studies zijn tot nu toe niet beschikbaar. [15-17] De blokkade van de dopamine D2 receptoren en het daarmee gerelateerd gunstig effect op de positieve symptomen hebben beide subklassen gemeenschappelijk. [15]

De typische antipsychotica bestaan uit verbindingen met sterk uiteenlopende chemische structuren en worden weergegeven in figuur 1.3 en tabel 1.2. Ze worden onderverdeeld in fenothiazinen

(1),

azofenothiazinen

(2),

thioxanthenen

(3),

butyrofenonen

(4),

difenylpiperidinen (5) en de benzamides (6). [2,18]

4

2

3

1

Figuur

1.3:

Overzicht

azofenothiazinen

6

5

4

van

de

3) thioxanthenen

typische

antipsychotica

4) butyrofenonen

1)

fenothiazinen

2)

5) difenylpiperidinen

6)

benzamides [4]

Tabel 1.2: Aanvullende informatie bij figuur 1.3 Groep

Antipsychotica

1. Fenothiazine

levomepromazine

-C6H14N

2. Azofenothiazine

prothipendyl

-C4H12N

3. Thioxantheen

flupentixol

-C9H18N2O

-CF3

zuclopentixol

-C9H18N2O

-Cl

bromperidol

-C11H13BrNO

-F

droperidol

-C12H12N3O

-F

haloperidol

-C11H13BrNO

-F

pimpamperon

-C11H20N3O

-F

benperidol

-C12H14N3O

-F

fluspirileen

-C8H8N2O

-F

pimozide

-C7H5N2O

amisulpride

- C7H14N

-OCH3

sulpiride

- C7H14N

-OCH3

-SO2NH2

tiapride

- C6H14N

-OCH3

-CH3SO2

4. Butyrofenon

5. Difenylpiperidine

6. Benzamide

R1

R2

R3

R4

-OCH3

-NH2

-C2H5SO2

5

De atypische antipsychotica worden nu beschouwd als eerste keuze bij de behandeling van psychotische stoornissen aangezien ze minder bijwerkingen veroorzaken. Figuur 1.4 geeft een overzicht van de belangrijkste atypische antipsychotica in België op de markt. [17,18]

Cl

H3C

1

Cl

N

22

N

N

N O

O

H N

N N H

CH3 N O

3

N

N

N

N

H3C

F

SH

CH3

S

N H

H2C

4

N

O

N OH

H3C O

N

5

N

6 N

Cl

N

N OH

S

N NH

Figuur 1.4: De belangrijkste atypische antipsychotica verkrijgbaar in België: (1) aripiprazol (2) clozapine (3) olanzapine (4) risperidon (5) sertindol (6) quetiapine [4]

Een onderverdeling van de antipsychotica op basis van de receptoraffiniteit wordt weergegeven in tabel 1.3. De affiniteit ter hoogte van de noradrenaline-, histamine-, acetylcholine- en 5HT2 receptoren wordt vergeleken met het antidopaminerg effect. [19]

6

Tabel 1.3: De affiniteit voor de verschillende types receptoren. -2 geeft aan dat het effect te verwaarlozen is ten opzichte van het antidopaminerg effect, +2 wijst op een overheersend effect. [19] Stofnaam

Chemische groep

Farmacologische eigenschappen t.o.v. antidopaminerg effect anti-NA2

anti-His3

anti-Ach4

anti-5HT25

Amisulpride

benzamide

-2

-2

-2

-2

Aripiprazol

dihydroquinoline

/

/

/

/

Benperidol

butyrofenon

-1

-2

-2

-1

Bromperidol

butyrofenon

-1

-2

-2

-2

Clozapine

dibenzodiazepine

+2

+2

+1

+2

Droperidol

butyrofenon

=

-2

-2

-1

Flupentixol

thioxantheen

-1

-1

-1

-1

Fluspirileen

difenylbutylpiperidine

-2

-2

-2

-1

Haloperidol

butyrofenon

-1

-2

-2

-2

Levomepromazine fenothiazine

/

/

/

/

Olanzapine

thioenobenzodiazepine

+1

+2

+1

+1

Penfluridol

difenylbutylpiperidine

-1

-2

-2

-2

Pimozide

difenylbutylamine

-1

-2

-2

-2

Pimpamperon

butyrofenon

+1

-2

-2

+2

Prothipendyl

fenothiazine

/

/

/

/

Risperidon

benzisoxazool

+1

+1

-2

+2

Sertindol

imidazolidinon

+1

-2

-2

+2

Sulpiride

benzamide

-2

-2

-2

-2

Tiapride

benzamide

/

/

/

/

Quetiapine

dibenzodiazepine

+1

+2

=

=

Zuclopentixol

thioxantheen

=

-1

-2

-1

2

anti-noradrenerg anti-histaminerg 4 anti-cholinerg 5 anti-serotonerg 3

7

1.1.4. Werkingsmechanisme en bijwerkingen

Zoals in voorgaande weergegeven spelen de neurotransmitters dopamine, serotonine, noradrenaline, histamine, muscarine en acetylcholine een belangrijke rol bij de behandeling van psychosen. De dopaminebanen waarop de antipsychotica inwerken bevinden zich in verschillende hersengebieden. De bezetting van de receptoren ter hoogte van het mesolimbisch gebied zorgt voor een daling van de positieve symptomen. Een vermindering van de negatieve symptomen is dan weer een gevolg van de blokkade van de D2-receptoren in het mesocorticaal gebied. Samen zijn deze effecten grotendeels verantwoordelijk voor de antipsychotische werking. De tubero-infundibulaire dopaminebanen staan in voor de regulatie van de prolactinesecretie. Aangezien dopamine de secretie remt, geven antipsychotica aanleiding tot hyperprolactinemia, wat ernstige gevolgen kan hebben zoals galactorroe6, amenorroe7, gynaecomastie8, infertiliteit bij de vrouw en impotentie bij de man. De blokkade ter hoogte van het striatum zorgt dan weer voor de EPS. [7] Voorbeelden van EPS zijn dystonie9, acathisie10 en parkinsonisme11. Deze bijwerkingen zijn dosisgerelateerd en kunnen verholpen worden door een reductie van de dosis of door de inname van een anticholinergicum. [2,7] Figuur 1.5 geeft een beeld van de ligging van de verschillende hersengebieden.

Figuur 1.5: Een overzicht van de verschillende hersengebieden [12] 6

afscheiding van vocht/melk uit de borst uitblijven van menstruatie 8 abnormale ontwikkeling van borstweefsel bij de man 9 motorische stoornis met als belangrijkste kenmerk onwillekeurige spiercontracties 10 motorische onrust 11 ziekteverschijnsel waarvan de klachten lijken op die van de ziekte van Parkinson 7

8

EPS komen tot stand wanneer de bezetting van de D2-receptoren hoger ligt dan 80 %. [20] De atypische antipsychotica dissociëren sneller van de receptor en zorgen zo voor een lagere bezetting en minder bijwerkingen. Deze klasse is zowel een antagonist van de dopamine D 2receptoren als van de serotoninereceptoren, meer bepaald de 5HT2A-receptoren. Dit zorgt dan weer voor een verbetering van de negatieve symptomen en een vermindering van de EPS. [1,21]

Daarnaast leidt een blokkade van de histamine- en noradrenalinereceptoren voor sedatie. De bezetting van de muscarine- en acetylcholinereceptoren reduceert de EPS. [1] Gewichtstoename

wordt

serotoninereceptoren.

veroorzaakt

Tachycardie,

door droge

de

blokkade

mond,

van

slaperigheid,

de

histamine-

en

mictiestoornissen,

misselijkheid, visusstoornissen en obstipatie treden op bij de binding aan de muscarine- of de acetylcholinereceptoren. [1] 1.1.5. Kwantitatieve analyse van antipsychotica

Het monitoren van antipsychotica kan nuttig zijn om de farmacotherapie te optimaliseren en de mortaliteit en morbiditeit te verlagen. [22] Zowel genetische factoren als leeftijd, geslacht, eetgewoonten, rookgedrag, therapietrouw, het tegelijk voorkomen van andere aandoeningen en polyfarmacie kunnen de oorzaak zijn van de variabele plasmaconcentraties tussen de verschillende patiënten. Een normale dosis kan bij de ene persoon zorgen voor bijwerkingen terwijl de andere persoon geen effect ondervindt. [8]

Een belangrijke genetische factor is het genetisch polymorfisme van de metaboliserende enzymen. Antipsychotica zijn lipofiele geneesmiddelen en zijn sterk onderhevig aan metabolisatie. De biotransformatie wordt grotendeels gekatalyseerd door het cytochroom P450 enzymsysteem. [23] Het verschil in enzymactiviteit is de belangrijkste oorzaak van de interindividuele variabiliteit. Een trage metaboliseerder ondervindt sneller bijwerkingen dan een snelle metaboliseerder, die dan eerder geen effect ondervindt. [8]

Een bijkomende reden voor het monitoren van antipsychotica is het nauwe therapeutische venster van de klassieke antipsychotica. De therapeutische concentratie en de concentratie waarbij bijwerkingen optreden, liggen dicht bijeen. De atypische antipsychotica daarentegen hebben een breed therapeutisch venster. [23] 9

Verder worden in de forensische toxicologie matrices gecontroleerd op de aanwezigheid van antipsychotica aangezien ze een belangrijke rol kunnen spelen in de doodsoorzaak. De aanwezigheid van antipsychotica kan ook het vermoeden van mentale stoornissen bevestigen, wat aanleiding kan geven tot het plegen van criminele feiten. [24] 1.2. STAALVOORBEREIDING

In de analytische toxicologie wordt gebruik gemaakt van complexe biologische matrices zoals bloed (serum en plasma), urine, weefsels en alternatieve matrices zoals haar. Staalvoorbereiding kan worden beschouwd als een cruciale stap die zorgt voor de gewenste selectiviteit en sensitiviteit. De aanwezige interfererende componenten worden verwijderd. Deze kunnen leiden tot overbelading van de kolom, vervuiling van de massaspectrometer (MS) en verhoging of verlaging van de intensiteit van het signaal. Veel gebruikte methoden zijn eiwitprecipitatie, vloeistof-vloeistof extractie (LLE) en vaste fase extractie (SPE). [25,26] 1.2.1. Eiwitprecipitatie

Eiwitten kunnen interfereren met de componenten tijdens de scheidings- en detectieprocedure. Ook zijn vele antipsychotica sterk gebonden aan plasmaproteïnen waardoor een fractie van de totale hoeveelheid antipsychotica niet beschikbaar is voor analyse. [4] Dit kan verholpen worden door de binding tussen eiwit en analiet te verbreken en de eiwitten te elimineren. Het voordeel van deze techniek is de eenvoud en snelheid waarmee deze kan toegepast worden om biologische matrices, bestaande uit een brede waaier aan componenten, op te zuiveren. [27] De lage selectiviteit is dan weer nadelig. [28]

Verschillende precipitatiemethoden zijn voorhanden. De eiwitten slaan neer ten gevolge van denaturatie. Dit verlies aan secundaire en tertiaire structuur wordt tot stand gebracht door het toevoegen van zuren, zouten, organische solventen en metaalionen. [25,28] 1.2.2. Vloeistof-vloeistof extractie (LLE)

Bij de extractie wordt gebruik gemaakt van twee niet mengbare vloeistoffen. Er vindt een selectieve verdeling plaats tussen een polaire waterige fase en een apolaire organische fase. Aangezien antipsychotica lipofiele componenten zijn en dus een grote affiniteit zullen vertonen voor de organische fase kan deze techniek toegepast worden. [30] De keuze van het 10

organisch solvent, de pH van de waterige fase en de volumeverhouding tussen beide fases hebben een invloed op de verdeling. De nadelen van deze techniek, ten opzichte van andere methoden, zijn de lage selectiviteit, de lage extractie efficiëntie en de nood aan een groot monstervolume. [30,31] Deze techniek wordt niet toegepast bij de extractie van componenten met sterk uiteenlopende polariteit. [25] 1.2.3. Vaste fase extractie

SPE is een snelle en selectieve vorm van staalvoorbereiding. [32] Deze techniek wordt toegepast om gewenste substanties aan te concentreren en interfererende componenten te verwijderen. Zowel SPE als vloeistofchromatografie (LC) werken volgens hetzelfde principe, bij beide vindt een scheiding plaats op basis van de affiniteit voor de vaste fase in de kolom. [30] Bij het vergelijken van SPE met LLE wordt geconcludeerd dat SPE verscheidene voordelen biedt. Zo zorgt dit voor een betere specificiteit, reproduceerbaarheid en opzuivering. Deze techniek kan ook geautomatiseerd worden. [29]

De selectie van de stationaire fase is heel belangrijk. Bij deze keuze spelen de hydrofobe, de polaire en de ionogene eigenschappen van zowel de vaste fase als het analiet een belangrijke rol. [32] In wat volgt wordt een overzicht gegeven van de meest voorkomende extractiemechanismen. Normale fase extractie maakt gebruik van een polaire stationaire fase en een niet-polaire mobiele fase. Hier is het retentiemechanisme gebaseerd op de interacties tussen de polaire groepen van het analiet en de vaste fase. Een niet-polaire stationaire fase en een polaire mobiele fase wordt aangewend bij een omgekeerde fase extractie. Niet-polaire interacties zoals Van Der Waals of dispersiekrachten bepalen het retentiemechanisme. Deze methode wordt toegepast wanneer de component waarin men geïnteresseerd is niet-polaire of matig polaire eigenschappen heeft. Het laatste mechanisme, de ionenuitwisseling SPE, is gebaseerd op elektrostatische aantrekkingskrachten tussen de functionele groepen van de component en die gebonden op de silica. Beide moeten geladen zijn, de pH speelt hier dus een belangrijke rol. Aanpassingen van de pH leidt tot het optimaliseren van de retentie en de elutie. [32]

Rekening houdend met de eigenschappen van de antipsychotica kan zowel de omgekeerde fase als de ionenuitwisseling SPE worden toegepast. Hydrofobe interacties ontstaan tussen de antipsychotica en de stationaire fase van een omgekeerde fase extractie. Bij het gebruik van 11

een kationuitwisselaar worden elektrostatische interacties gevormd met de positieve ladingen van de antipsychotica die ontstaan bij lage pH aangezien dit basische componenten zijn. [29]

SPE kan worden onderverdeeld in vijf stappen zoals weergegeven in figuur 1.6. Initieel wordt gestart met het activeren van de functionele groepen van de vaste fase. Hierna volgt de conditioneringsstap. Het doel van deze stap is het creëren van een omgeving die vergelijkbaar is met deze van het staal. Na het laden van het monster kan het analiet adsorberen aan de vaste fase. Niet alleen het analiet zal adsorberen, vaak bevinden er zich in de matrix nog componenten met een affiniteit voor de vaste fase. De wasstap zal deze ongewenste matrixcomponenten zoveel mogelijk verwijderen met behulp van een solvent met een hogere elutiesterkte dan het solvent dat werd gebruikt bij het laden van het monster. De zwak gebonden matrixcomponenten zullen elueren terwijl het analiet en de eventueel sterk gebonden matrixcomponenten achterblijven. Tot slot zal een sterk solvent de interacties tussen het analiet en de vaste fase verbreken zodat de gewenste component de kolom verlaat. Het is mogelijk dat er nog altijd matrixcomponenten aanwezig zijn die eventueel interferenties kunnen veroorzaken tijdens de detectie. Om dit te vermijden wordt gebruik gemaakt van een eluens dat net niet sterk genoeg is om de interacties tussen de nog aanwezige sterk gebonden matrixcomponenten en de vaste fase te verbreken zodat idealiter enkel het analiet waar interesse in is, elueert. Een verdere opzuivering behoort ook tot de mogelijkheden. [26] Contaminanten Analiet

1

2

3

4

Figuur 1.6: De verschillende stappen van een SPE 1) Activeren functionele groepen + conditioneren 2) laden monster 3) wassen 4) elueren [33]

12

1.3. DETECTIEMETHODEN

Antipsychotica worden voorgeschreven in kleine dosissen en zijn sterk onderhevig aan metabolisatie in het lichaam. Dit heeft als gevolg dat de plasmaconcentraties zeer laag zijn. Het is dus noodzakelijk dat de bioanalytische technieken voor de detectie van antipsychotica zeer gevoelig, nauwkeurig en selectief zijn.

Gaschromatografie wordt zeer weinig toegepast. Antipsychotica zijn hydrofoob en nietvluchtig en daarom meer geschikt voor LC. Capillaire elektroforese is ook een mogelijke analytische scheidingstechniek, maar door de hoge detectielimiet kan dit niet worden toegepast bij de antipsychotica. De scheidingsmethoden kunnen gekoppeld worden aan massaspectrometrie, ultraviolet detectie, fluorescentie detectie, elektrochemische detectie en stikstof-fosfor detectie. Door de hoge gevoeligheid, stabiliteit en selectiviteit wordt gekozen voor de combinatie van ultrahoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie. (UHPLC-MS/MS) [24] 1.3.1. Ultra hoge druk vloeistofchromatografie

UHPLC staat voor ultrahoge druk vloeistofchromatografie. Deze techniek is vergelijkbaar met de hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC), maar door het gebruik van kolommen met een pakkingsmateriaal met een lagere diameter (1,7 µm i.p.v. 5 µm) en een hogere druk zorgt UHPLC voor een hogere resolutie, sensitiviteit en snelheid. Dit kan verklaard worden door de Van Deemter vergelijking (HETP = Adp + B/u + C( dp)² u) die een verband beschrijft tussen de snelheid van de mobiele fase en de plaathoogte (HETP) wat een maat is voor de kolomefficiëntie. Dit wordt grafisch weergegeven in figuur 1.7. Bij een partikelgrootte kleiner dan 2,5 µm wordt een stijging van de kolomefficiëntie vastgesteld die ook niet meer afneemt bij een toename van de vloeisnelheid. [34]

Figuur 1.7: Verband tussen de plaathoogte en de vloeisnelheid [35] 13

Een UHPLC systeem is opgebouwd uit een reservoir, een pomp, een injector, een kolom en een detector. Het staal wordt met behulp van de mobiele fase over de kolom geleid, waar de scheiding van de componenten gebeurt. Deze wordt bepaald door de snelheid waarmee ze doorheen de kolom bewegen en is afhankelijk van hun affiniteit voor de stationaire fase. Bij een sterke aantrekking ten opzichte van de stationaire fase zal de component een grotere elutietijd hebben.

Klassiek kan er gesproken worden van twee types stationaire fases: de normale fase UHPLC en de omgekeerde fase UHPLC. Een sterk polaire stationaire fase wordt gebruikt bij normale fase UHPLC. Een minder tot niet polaire stationaire fase wordt toegepast bij omgekeerde fase UHPLC. Beide stationaire fases bestaan uit een silicalaag waarop functionele groepen zijn gebonden. Een polaire stationaire fase bestaat uit silicapartikels met daarop hydroxylgroepen terwijl een niet-polaire fase voornamelijk alkyl- en nitrilgroepen draagt. [36]

De samenstelling van de mobiele fase kan tijdens het proces wijzigen. Deze verandering in solventsterke wordt toegepast bij stalen die componenten bevatten met sterk uiteenlopende polariteit. Deze techniek is gekend onder de naam gradiëntelutie. Bij isocratische elutie wijzigt de samenstelling van de mobiele fase niet. [37] 1.3.2. Tandem massaspectrometrie: MS/MS

Massaspectrometrie is een analytische methode die ons toelaat zowel kwalitatieve als kwantitatieve informatie te verkrijgen over moleculen. [38] Deze techniek staat gekend voor zijn hoge selectiviteit, nauwkeurigheid en snelheid. Een ander voordeel is de kleine hoeveelheid monster die nodig is om goede resultaten te bekomen. [39]

De moleculen worden eerst door middel van een ionisatiebron omgezet tot ionen met een positieve of negatieve lading. [38] Deze ionen worden dan gescheiden op basis van hun massa over lading verhouding (m/z) en gedetecteerd. Het signaal afkomstig van de detector wordt gebruikt bij het opstellen van een massaspectrum, waarbij het signaal wordt uitgezet in functie van de m/z waarde. Een massaspectrometer bestaat uit een ionisatiebron, een massa analysator en een detector. [40]

14

1.3.2.1. ESI

De elektrospray ionisatie (ESI) is een techniek waarbij ionen gecreëerd worden onder atmosferische druk. Het staal dat zich in de vloeistoffase bevindt, wordt doorheen een capillair gepompt. Het uiteinde van het capillair draagt een voltage tussen de 2000 en 4000 V. [41] Door dit elektrisch veld ontstaat een druppel met een kegelachtige structuur, de zogenaamde Taylor-Cone. Wanneer de elektrostatische repulsie ter hoogte van het geladen oppervlak van de Taylor Cone de oppervlaktespanning overschrijdt, wordt de Rayleigh limiet bereikt. [42] De vloeistof valt uiteen en er ontstaan geladen druppels die zich voortbewegen in de richting van een tegenelektrode. [44] Bij het verdampen van het solvent uit de druppels neemt de diameter af en vergroten de Coulomb krachten tussen de ladingen. [44] Wanneer de Rayleigh limiet opnieuw wordt bereikt, vallen de druppels uiteen. Dit proces blijft zich herhalen tot er enkelvoudige ionen in de gasfase ontstaan. [43] Dit proces wordt weergegeven in figuur 1.8.

Figuur 1.8: Schematische voorstelling van het elektrospray ionisatie proces [42] 1.3.2.2. Massa-analysator

De ionen worden door middel van een quadrupool gescheiden en naar de detector geleid. Een quadrupool bestaat uit vier parallelle staven die zich op een gelijke afstand van elkaar bevinden. Tussen deze staven wordt er een gelijk- (DC) en een radiofrequentiespanning (RF) aangelegd. Dit elektrisch veld zorgt ervoor dat ionen zich met een oscillerende beweging richting de detector verplaatsen. De amplitude van de oscillatie staat nauw in verband met de m/z waarde en bepaalt of de molecule de detector zal bereiken. Zoals weergegeven in figuur 15

1.9 kunnen de DC en RF spanning zodanig gecontroleerd worden dat de amplitude van de oscillatie van de gewenste molecule een bepaalde grootte aanneemt zodat die de detector bereikt zonder met de quadrupool te botsen. [38]

Figuur 1.9: Het principe van een quadrupool massa-analysator [45]

1.3.2.3. Tandem Quadrupool detector (TQD)

Dit principe maakt gebruik van een combinatie van drie quadrupolen, waarvan de eerste en de derde fungeren als massa-analysatoren. Daartussen bevindt zich een botsingscel waar de ionen fragmentatie ondergaan. Deze cel is qua design vergelijkbaar met de twee andere quadrupolen, maar deze quadrupool staat enkel onder invloed van RF spanning aangezien hier geen massaselectie gebeurt. De ionen gaan hier botsen met een neutraal gas en vormen fragment- of dochterionen. Dit proces wordt botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) genoemd.

Er bestaan verschillende MS/MS modes. In deze masterproef wordt Multiple reaction monitoring (MRM) toegepast. Zoals weergegeven in figuur 1.10 wordt een specifiek moederion geselecteerd door de eerste quadrupool en selecteert de laatste quadrupool twee fragmentionen die kenmerkend zijn voor de component. Deze toepassing zorgt voor de hoge selectiviteit. [38,41]

16

Figuur 1.10: Het principe van MRM [46]

1.3.2.4. Elektron-multiplier

Voor de detectie worden de ionen afkomstig van de m/z analysator eerst vermenigvuldigd via het principe van secundaire elektronen emissie. De elektron multiplier bestaat uit verschillende dynodes die gerangschikt zijn volgens stijgend potentiaal. De ionen worden gefocusseerd op de eerste dynode waarna secundaire elektronen worden uitgezonden. Deze elektronen worden versneld en gaan terug botsen met de volgende dynode. Opnieuw worden hier secundaire elektronen uitgezonden. Dit proces wordt nog enkele malen herhaald. Er wordt hier gesproken van een cascadesysteem. Dit resulteert in een meetbaar elektrisch signaal dat evenredig is met het aantal invallende ionen. [38,44]

17

2. ONDERZOEKSOBJECTIEVEN Het doel van dit onderzoek is de ontwikkeling van een methode voor de simultane kwantificatie van antipsychotica in plasma bedoeld voor routine analyses in het kader van de forensische toxicologie. Hierbij ligt de nadruk op de kwantificatie van zoveel mogelijk componenten in een zo klein mogelijk volume. Aangezien antipsychotica worden toegediend in lage dosissen is een grote gevoeligheid vereist. Het betreft hier volgende antipsychotica en actieve metabolieten: amisulpride, aripiprazol, bromperidol, clozapine, desmethylclozapine, droperidol, flupentixol, haloperidol, levomepromazine, olanzapine, desmethylolanzapine, pimpamperon, prothipendyl, quetiapine, 7-OH-quetiapine, risperidon, 9-OH-risperidon, sertindol, sulpiride, tiapride en zuclopentixol.

Een eerste doelstelling van deze masterproef is de selectie van een optimale staalvoorbereiding en UHPLC-MS/MS parameters. Een geschikte staalvoorbereiding (eiwitprecipitatie, vloeistof-vloeistof extractie of vaste fase extractie) wordt bepaald door de extractie efficiëntie en het matrix effect te vergelijken.

De tweede doelstelling is de validatie van de methode volgens internationaal aanvaardbare richtlijnen. De selectiviteit wordt geëvalueerd door de aanwezigheid van storende pieken te analyseren in blanco en zero stalen. Het geschikte kalibratiemodel wordt bepaald en er wordt beslist of het toekennen van een wegingsfactor noodzakelijk is. De kwantificatielimiet wordt ingesteld. De accuraatheid wordt samen met de binnen-dag en tussen-dag precisie geëvalueerd. Onderzoek naar de extractie efficiëntie en het matrix effect wordt eveneens uitgevoerd. Tenslotte worden het carry-over effect en de stabiliteit bij bewaring na 24, 48 en 62 uur onder autosampler condities geanalyseerd. Deze validatieparameters worden onderzocht in natriumfluoride- en citraatplasma, aangezien deze matrices de meest voorkomende zijn bij routine analyses in het laboratorium voor toxicologie in het NICC.

18

3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. REAGENTIA EN SOLVENTEN De antipsychotica amisulpride, aripiprazol, bromperidol, clozapine, desmethylclozapine, droperidol, flupentixol, haloperidol, olanzapine, desmethylolanzapine, paliperidon (= 9-OHrisperidon), pimpamperon, prothipendyl, quetiapine, 7-OH-quetiapine, risperidon, sertindol, sulpiride, tiapride en zuclopentixol zijn allen aangekocht bij Promochem (Molsheim, Frankrijk). Als interne standaard (IS) wordt gebruik gemaakt van aripiprazol-d8, clozapine-d4, haloperidol-d4, desmethylolanzapine-d8, paliperidon-d4 (= 9-OH-risperidon-d4), quetiapine-d8 en risperidon-d4. Deze reagentia zijn eveneens geleverd door Promochem. De externe controlestalen (Mass Check® Neuroleptics 1 en 2, level I en II) werden bezorgd door Chromsystems (Gräfelfing, Duitsland). De inhoud van deze controlestalen is terug te vinden in tabel 3.5.

Water (H2O) (Biosolve Chimie SARM, Dieuze, Frankrijk), acetonitril (Merck, Darmstadt, Duitsland) en methanol (MeOH) (Merck, Darmstadt, Duitsland) zijn van HPLC-kwaliteit. Chloorbutaan, azijnzuur, mierenzuur 0,1 % in water, 0,1 N zoutzuur (HCl), ammoniakoplossing 32 %, MeOH van ULC-MS kwaliteit en chloroform werden geleverd door Merck. Natriumhydroxide 1,0 M (NaOH), ammonium formaat (≥ 99,995 %) en mierenzuur (98 %) werden bezorgd door Sigma-aldrich (St-Louis, VS). 3.2. STOCKOPLOSSING

De antipsychotica en de gedeutereerde analogen onder de vorm van een poeder worden opgelost in MeOH zodat een concentratie wordt verkregen van 1 mg/mL. Deze primaire stockoplossingen worden bewaard bij -20°C. 3.3. WERKOPLOSSINGEN

Voor de optimalisatie van de MS/MS parameters worden werkoplossingen (WSMS) bereid van alle antipsychotica afzonderlijk door 100 µL van de primaire stockoplossingen op te lossen in 25 mL MeOH. De bewaring gebeurt bij 7 °C. De werkoplossing (WStest) gebruikt tijdens de optimalisatie van de staalvoorbereiding wordt aangemaakt door 100 µL van alle primaire stockoplossingen samen te voegen en aan te lengen met MeOH tot 25 mL. Zo wordt een oplossing verkregen waarin alle antipsychotica aanwezig zijn in een concentratie van 4 19

µg/mL. De validatie maakt gebruik van een werkoplossing (WSV) waarbij de antipsychotica worden onderverdeeld in drie groepen naargelang hun therapeutische concentraties. Een overzicht hiervan wordt weergegeven in tabel 3.1.

Tabel 3.1: Indeling op basis van therapeutische concentratie [9] A 0,100-1,000 µg/ml Amisulpride Aripiprazol Clozapine Desmethylclozapine Pimpamperon Tiapride

B 0,010-0,075 µg/ml Desmethylolanzapine Droperidol Levomepromazine Olanzapine Prothipendyl Quetiapine 7-OH-quetiapine 9-OH-risperidon Sulpiride

C 0,001-0,005 µg/ml Bromperidol Flupentixol Haloperidol Risperidon Sertindol Zuclopentixol

Voor de bereiding van WSV wordt 100 µL van de primaire stockoplossingen van de antipsychotica uit groep C 10 keer verdund met MeOH. Van deze verdunning wordt 40 µL genomen samen met 200 µL van de primaire standaardoplossingen van de antipsychotica in groep A en 40 µL van de antipsychotica in groep B. Dit wordt samengevoegd en aangelengd met MeOH tot 25 mL zodat de antipsychotica in het mengsel respectievelijk een concentratie hebben van 8 µg/mL, 1,6 µg/mL en 0,16 µg/mL. De werkoplossing (WSIS) bestaande uit alle gedeutereerde analogen wordt op dezelfde manier aangemaakt. Opnieuw wordt er een onderverdeling gemaakt op basis van hun therapeutische concentratie. De oplossingen worden bewaard in de koelkast bij een temperatuur van 7 °C.

3.4. OPLOSSINGEN VOOR STAALVOORBEREIDING EN UHPLC-ANALYSE

De acetaatbuffer gebruikt bij SPE wordt bereid door 5,7 mL azijnzuur toe te voegen aan 800 mL water. De pH wordt op 4 gebracht door het toevoegen van 1,0 M NaOH. Daarna wordt het geheel aangelengd met water tot 1L. De elutieoplossing wordt aangemaakt door het samenvoegen van 47,5 mL MeOH van HPLC-kwaliteit en 2,5 mL ammoniak-oplossing van 32 %. De ammonium formaat buffer 5 mM voor de reconstitutie wordt bereid door het samenvoegen van 0,31 g ammonium formaat en 0,5 mL mierenzuur (98 %). Het geheel wordt vervolgens aangelengd tot 1 L met water. 20

3.5. PLASMA

Het bloed is afkomstig van het laboratorium voor medische analyse in Gent en het militair hospitaal te Brussel. Als anticoagulans wordt zowel gebruik gemaakt van citraat als van natriumfluoride. Plasma wordt verkregen na het centrifugeren van het bloed gedurende 10 minuten bij 3.500 rpm (rotaties per minuut). De plasmastalen worden bewaard bij een temperatuur van -20 °C. 3.6. APPARATUUR 3.6.1. Weegschaal, vortex, centrifuge, vacuümkamer, verdampingstoestel, vacuümcentrifuge, filter

Een weegschaal (Sartonius Mechatronics Belgium N.V., Vilvoorde, België) wordt gebruikt bij het exact afwegen van diverse vaste stoffen. Het homogeniseren van de stalen gebeurt door middel van een IKA® vortex Genius 3 (IKA®-Werke GmbH & Co KG, Staufen, Duitsland). Het type centrifuge gebruikt tijdens de eiwitprecipitatie is een Eppendorf centrifuge 5417 R (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Tijdens de LLE wordt daarentegen gebruik gemaakt van een gekoelde BR4i centrifuge (Thermo elektron corporation, Massachusetts, VS). Een Vac-Elut SPE (Waters, Milford, Massachusetts, USA) wordt aangewend tijdens de SPE procedure, het droogdampen wordt uitgevoerd met een Vapostat III evaporator (Barkey, Leopoldshöhe, Duitsland). Tijdens de validatie worden de stalen drooggedampt met een vacuümcentrifuge (Christ, Osterode am Harz, Duitsland). Na de reconstitutie worden de stalen gefiltreerd met een Millex® Syringe filter (4/13/25 mm). 3.6.2. Uhplc-ms/ms De UHPLC wordt uitgevoerd met behulp van een Acquity UPLC® systeem (Waters corporation, Milford, VS). Dit toestel, bestaande uit een binaire solvent manager, een staalmanager en een kolomverwarmer, wordt in deze masterproef gebruikt in combinatie met een MS/MS. De scheiding gebeurt ter hoogte van een Acquity UPLC® Bridged Ethylene Hybrid (BEH) kolom (1,7 µm 2,1 mm x 100 mm). De polaire mobiele fase bestaat uit een mengsel van 0,1 % mierenzuur (Oplossing A) en MeOH (oplossing B). Er wordt gewerkt met gradiëntelutie, zoals weergegeven in tabel 3.2. De wasstappen worden toegepast om de levensduur van de apparatuur te verlengen. De strong wash bestaat uit 100 % MeOH (ULCMS kwaliteit), de weak en seal wash uit 90 % water (HPLC kwaliteit) en 10 % MeOH (ULC21

MS kwaliteit). De kolomtemperatuur bedraagt 55 °C, het injectievolume staat ingesteld op 10 µL en er wordt gewerkt met een debiet van 0,450 mL/min.

Tabel 3.2: Gebruikte UHPLC gradiënt Tijd (min) 0,00 0,30 6,00 6,10 7,00 7,10 9,00

Oplossing A (%) 90 90 30 0 0 90 90

Oplossing B (%) 10 10 70 100 100 10 10

Voor de detectie wordt gebruik gemaakt van een Xevo TQ massaspectrometer (Waters Corporation, Milford, USA). Dit toestel is voorzien van een ESI en een TQD. Tabel 3.3 geeft de belangrijkste parameters weer van de massaspectrometer.

Tabel 3.3: Parameters MS ESI modus Spanning capillair Temperatuur ionenbron Temperatuur desolvatiegas Debiet desolvatiegas Debiet botsingsgas

ESI+ 2,00 kV 150 °C 650 °C 1000 L/u 0,35 mL/min

3.7. METHODEONTWIKKELING 3.7.1. Optimalisatie MS/MS parameters

De eerste vereiste is de bepaling van de transities van elk molecule. De WSMS van alle antipsychotica afzonderlijk beschreven in § 3.3. worden 10 x verdund met MeOH en rechtstreeks geïnfuseerd in de massaspectrometer.

Er wordt gestart met de bepaling van de m/z waarde van het moederion in SCAN-modus. Enkel de eerste quadrupool (zie § 1.3.2.) wordt hierbij gebruikt. Het moederion wordt geïoniseerd, maar niet gefragmenteerd. Een ideale ionisatie wordt verkregen door de optimalisatie van de cone voltage. In een volgende fase wordt dit moederion ter hoogte van de 22

botsingscel gefragmenteerd. De twee meest abundante fragmentionen worden gekozen voor de identificatie en de kwantificatie van het antipsychoticum. De botsingsenergie wordt voor elk fragmention afzonderlijk geoptimaliseerd om de gevoeligheid te maximaliseren. Via de injectie van WStest wordt het tijdsvenster, waarbinnen de massaspectrometer de fragmentionen moet detecteren, ingesteld. 3.8. STAALVOORBEREIDING

Verschillende manieren van staalvoorbereiding worden vergeleken op basis van hun extractie efficiëntie en matrix effect. Voor de evaluatie werd gebruik gemaakt van de Matuszewski-methode. [47] De toegepaste formules worden hieronder weergegeven (3.1).

(3.1) A = blanco matrix belast met analiet voor de extractie en met IS na de extractie B = blanco matrix belast met analiet en IS na de extractie C = analiet en IS in puur injectiesolvent

Beide experimenten worden samen uitgevoerd. Met behulp van WStest, beschreven in § 3.3., worden de controlestalen bij lage (12 ng/mL) en hoge (240 ng/mL) concentratie op die manier aangemaakt dat de reële matrix zo goed mogelijk wordt benaderd. Bij de evaluatie van de extractie efficiëntie wordt een blanco matrix vóór (n=5) en na de extractie (n=5) belast met analiet, de IS (25 µL WSIS) wordt pas na de extractie toegevoegd. Het absoluut matrix effect wordt bepaald door de hoeveelheid analiet in de blanco matrix, belast na extractie, te vergelijken met de hoeveelheid analiet die wordt geverifieerd in puur injectiesolvent. Bij het 23

relatief matrix effect wordt de aanwezigheid van een mogelijks matrix effect gecorrigeerd door de IS, indien zowel het analiet als de IS op dezelfde manier reageren. 3.8.1. Eiwitprecipitatie

Er wordt 1 mL acetonitril aan 100 µL plasma toegevoegd (n = 20). Na het vortexen wordt dit mengsel gecentrifugeerd gedurende 15 minuten bij 14.000 rpm. Na het collecteren van het supernatans wordt de extractie drooggedampt met behulp van stikstof bij 37 °C. De reconstitutie gebeurt door 500 µL ammonium formaat toe te voegen. Dit volume wordt vervolgens na filtratie overgebracht in vials. 3.8.2. LLE

Aan 100 µL plasma wordt 50 µL water toegevoegd (n = 20). De pH wordt verhoogd door het toevoegen van 50 µL NH4OH. Na het vortexen wordt 1 mL chloorbutaan toegevoegd. Vervolgens wordt gecentrifugeerd gedurende 15 minuten bij 14.000 rpm. De bovenstaande organische fase wordt naar een proefbuis overgebracht en ondergaat evaporatie onder stikstof bij 37 °C. Reconstitutie gebeurt met 500 µL ammonium formaat. Na filtratie wordt dit volume overgebracht in vials. 3.8.3. SPE

De stalen worden opgezuiverd door een SPE met een Oasis MCX kolom (3 cc Vac Cartridge, 60 mg Sorbent, 30 µm partikels). Acetaat buffer 2,5 mL wordt toegevoegd aan de stalen (n=20). De solventen die worden gebruikt bij het conditioneren, wassen en elueren worden weergegeven in tabel 3.4. Na het elueren wordt drooggedampt onder stikstof bij een temperatuur van 37 °C. Vervolgens vindt de reconstitutie plaats, 500 µL ammonium formaat wordt toegevoegd aan de proefbuizen. Na filtratie wordt het volume overgebracht in vials.

Tabel 3.4: Overzicht van de verschillende SPE-stappen Conditioneren

Wassen Elueren

Oasis MCX 1 mL MeOH 1 mL H2O 1 mL acetaatbuffer 1 mL 0,1 N HCl 1 mL MeOH 1 mL elutie-oplossing

24

3.9. VALIDATIE

Het protocol voor de validatie van UHPLC-MS/MS methoden is gebaseerd op de richtlijnen die werden opgesteld door de US FDA, het European Medicines Agency (EMA) en de werkgroep Quality Assurance van de Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (GTFCh) en op de richtlijnen die worden vermeld in de literatuur. [48-50] 3.9.1. Selectiviteit

Zes blanco stalen (zonder IS) van verschillende oorsprong worden gecontroleerd op mogelijke interferenties afkomstig van co-eluerende componenten. De aanwezigheid van cross-fragmentatie met de gedeutereerde IS wordt geëvalueerd met behulp van zero stalen (met IS). Finaal worden blanco stalen, belast met elk antipsychoticum afzonderlijk, gecontroleerd op de aanwezigheid van storende pieken. 3.9.2. Lineariteit van de kalibratiecurve

Bij het nagaan van de lineariteit wordt een ijklijn opgesteld, waarbij de relatieve respons wordt uitgezet in functie van de concentratie. De 8 kalibratoren (zie tabel 3.5.) overkoepelen het gewenste concentratiebereik gebaseerd op de therapeutische concentraties van de antipsychotica. Een volume van 250 µL plasma wordt belast met een bepaalde hoeveelheid van de WSV en 100 µL van de WSIS. De concentraties van de verschillende kalibratoren samen met de interne en externe controlestalen worden weergegeven in tabel 3.5. De stalen ondergaan SPE zoals beschreven in § 3.8.3. Na droogdampen onder vacuüm wordt 200 µL buffer toegediend bestaande uit 90 % ammonium formaat en 10 % MeOH. Na filtratie worden de stalen in stijgende volgorde geanalyseerd via UHPLC-MS/MS. Dit experiment wordt acht keer uitgevoerd.

25

Tabel 3.5: Concentratie van de kalibratoren, de interne en externe controlestalen Kalibratoren (ng/mL)

Interne controlestalen

Externe controlestalen

KAL 1

KAL 2

KAL 3

KAL 4

KAL 5

KAL 6

KAL 7

KAL 8

QC LOW

QC HIGH

1

2

Amisulpride

25,0

50,0

100,0

200,0

400,0

800,0

1280,0

1600,0

30,0

960,0

87,1

395,0

Aripiprazol

25,0

50,0

100,0

200,0

400,0

800,0

1280,0

1600,0

30,0

960,0

160,0

291,0

Bromperidol

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

16,3

25,6

32,0

0,6

19,5

-

-

Clozapine

25,0

50,0

100,0

200,0

400,0

800,0

1280,0

1600,0

30,0

960,0

315,0

520,0

Droperidol

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

-

-

Flupentixol

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

16,3

25,6

32,0

0,6

19,5

-

-

Desmethylclozapine

25,0

50,0

100,0

200,0

400,0

800,0

1280,0

1600,0

30,0

960,0

165,0

230,0

Desmethylolanzapine

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

39,8

73,0

Haloperidol

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

16,3

25,6

32,0

0,6

19,5

10,1

15,2

Prothipendyl

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

-

-

Levomepromazine

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

18,8

71,0

7-OH-quetiapine

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

-

-

9-OH-risperidon

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

30,9

56,6

Olanzapine

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

35,1

64,3

Pimpamperon

25,0

50,0

100,0

200,0

400,0

800,0

1280,0

1600,0

30,0

960,0

55,1

344,0

Quetiapine

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

166,0

284,0

Risperidon

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

16,3

25,6

32,0

0,6

19,5

9,1

14,3

Sertindol

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

16,3

25,6

32,0

0,6

19,5

-

-

Sulpiride

5,0

10,0

20,0

40,0

80,0

160,0

256,0

320,0

6,0

192,0

-

-

Tiapride

25,0

50,0

100,0

200,0

400,0

800,0

1280,0

1600,0

30,0

960,0

-

-

Zuclopentixol

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

16,3

25,6

32,0

0,6

19,5

-

-

De best fit van de kalibratiecurves wordt bepaald aan de hand van een visuele inspectie van de ijklijn, de lack-of-fit test, de F-test en het percentage relatieve fout (% RE). Zowel visueel als met behulp van de lack-of-fit test wordt een onderscheid gemaakt tussen het lineaire en het kwadratische regressiemodel. Gewogen regressie wordt toegepast wanneer de data heteroscedastisch zijn. Dit wordt geëvalueerd aan de hand van een residuplot en kan bekrachtigd worden met een F-test (α = 5 %). Het gekozen model wordt bevestigd met het % RE. Dit wordt berekend met formule 3.2. Er wordt steeds geopteerd voor het eenvoudigste model dat resulteert in een aanvaarbare accuraatheid en precisie.

(3.2) 3.9.3. Accuraatheid en Precisie

De accuraatheid en precisie worden gemeten in interne en externe controlestalen op verschillende concentratieniveaus (zie tabel 3.5). De interne controlestalen bij lage en hoge concentratie worden bereid door aan 250 µL blanco plasma (zowel citraat- als natriumfluorideplasma) een bepaalde hoeveelheid van WSV toe te voegen. De externe

26

controlestalen, aangekocht onder de vorm van een poeder, worden gereconstitueerd met exact 1,0 mL H2O. De accuraatheid en de precisie worden geëvalueerd door de analyse van de controlestalen in tweevoud op 8 verschillende dagen. De accuraatheid, uitgedrukt onder de vorm van een bias, vergelijkt de gemeten concentratie met de theoretische concentratie. De precisie kan worden onderverdeeld in de binnen-dag precisie (RSDr) en de tussen-dag precisie (RSDt) en wordt bepaald met behulp van een single-factor ANOVA test (α = 5 %). Onderstaande formules worden hierbij toegepast (3.3).

(

( )

( )

)

√

√

(3.3) 3.9.4. LOQ

De LOQ ook wel de kwantificatielimiet genoemd wordt beschouwd als de laagste standaard van de kalibratiecurve. Deze parameter wordt gedurende 8 dagen in tweevoud bepaald met een LOQ staal dat los staat van de kalibratiecurve. De accuraatheid en de precisie worden berekend met bovenvermelde formules (3.3). Bij de evaluatie van de precisie wordt terug gebruik gemaakt van een single-factor ANOVA test. 3.9.5. De extractie efficiëntie

De extractie efficiëntie wordt geëvalueerd in zesvoud bij 2 verschillende concentraties, QC low en QC high (zie tabel 3.5). De stalen ondergaan de SPE procedure zoals beschreven in § 3.8.3. De extractie efficiëntie wordt bepaald door de stalen, die vóór en na de extractie zijn belast, te vergelijken. (zie § 3.8.) Dit experiment wordt zowel in natriumfluoride- als citraatplasma uitgevoerd. 27

3.9.6. Het matrix effect Zes controlestalen bij lage en hoge concentratie, waarbij het analiet en de IS pas na extractie zijn toegevoegd aan de blanco matrix, worden samen geanalyseerd met 6 controlestalen waarbij het analiet zich bevindt in niet-geëxtraheerd injectiesolvent. Het relatief en absoluut matrix effect worden berekend zoals is weergegeven in § 3.8. Dit experiment wordt opnieuw in tweevoud uitgevoerd, zowel in natriumfluoride- als citraatplasma. 3.9.7. Het carry-over effect

De eventuele overdracht tussen de stalen wordt nagegaan door een blanco staal te belasten met een concentratie die 10 maal hoger ligt dan die van de hoogste kwantificatielimiet (zie tabel 3.6). Dit staal wordt onmiddellijk gevolgd door een blanco staal belast met 100 µL WSIS. 3.9.8. Stabiliteit

Er wordt nagegaan of de componenten tijdens de analyse stabiel blijven. De stabiliteit in de autosampler wordt bepaald in vijfvoud bij lage, medium en hoge concentratie, aangemaakt met WSV. De controlestalen worden onmiddellijk geïnjecteerd. De overige stabiliteitsstalen, bewaard in de autosampler bij een temperatuur van 5 °C, worden geïnjecteerd na 24, 48 en 62 uur. De oppervlakte van het analiet gemeten in de stabiliteitsstalen wordt vergeleken met de resultaten verkregen uit de controlestalen die onmiddellijk na de bereiding werden geïnjecteerd.

28

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1. METHODEONTWIKKELING 4.1.1. UHPLC parameters

De parameters beschreven in § 3.6.2. werden reeds eerder geoptimaliseerd. Het chromatogram in figuur 4.1 toont de scheiding van alle antipsychotica die wordt bekomen met deze parameters gedurende een looptijd van 9 minuten. De meeste antipsychotica zijn basislijn gescheiden. Enkel haloperidol en prothipendyl hebben dezelfde retentietijd.

6

2

8

9 + 10 14

1

18 15 + 16

7 3+4 5

11 +12

13

21

23 + 24

17 19 + 20 22

25

26

27

28

Figuur 4.1: Voorbeeld van een chromatogram van kalibrator 5 met daarin alle antipsychotica Sulpiride (1), tiapride (2), desmethylolanzapine-d8 (3), desmethylolanzapine (4), olanzapine (5), amisulpride (6), 7-OH-quetiapine (7), pimpamperon (8), 9-OH-risperidon-d4 (9), 9-OH-risperidon (10), risperidon-d4 (11), risperidon (12), droperidol (13), desmethylclozapine (14), clozapine (15), clozapine-d4 (16), quetiapine-d8 (17), quetiapine (18), haloperidol-d4 (19), haloperidol (20), prothipendyl (21), bromperidol (22), aripiprazol-d8 (23), aripiprazol (24), levomepromazine (25), sertindol (26), zuclopentixol (27) en flupentixol (28)

29

4.1.2. Optimalisatie MS/MS parameters

De MS/MS parameters zijn weergegeven in tabel 4.1. Om de selectiviteit te garanderen wordt door Sauvage et al. [51] aanbevolen om minstens 2 MRM transities (qualifier en quantifier) te kiezen die specifiek zijn voor de component. De meest gevoelige transities werden bepaald door de afzonderlijke infusie van de antipsychotica. De cone voltage en de botsingsenergie werden geoptimaliseerd om de meest abundante transities te bekomen, zo wordt de gevoeligheid verhoogd.

Tabel 4.1: Overzicht moederionen, fragmentionen en MS/MS parameters Component

Moederion (m/z)

Cone Voltage (V)

Amisulpride

370,2

30

Fragmention (m/z) 149,0

*

214,0 Aripiprazol

448,2

30

98,1

*

60

4,52

4,20 - 4,70

4,07

3,80 - 4,30

420,1

35

123,0

*

165,1 84,0

30 *

40 30

4,03

3,80 - 4,30

40

3,91

3,70 - 4,10

1,67

1,50 - 1,93

333,2

30

88,1

Desmethylclozapine

313,2

30

227,0

*

270,1 213,0

30 *

30 50

1,67

1,50 - 1,85

34

3,72

3,50 - 3,93

6,10

5,90 - 6,30

4,39

4,20 - 4,60

307,2

40

198,1

Droperidol

280,1

24

164,9

*

193,9 435,1

42

264,9

24 *

304,9 Haloperidol

376,1

34

122,9

42 *

40

4,38

4,20 - 4,60

44

5,05

4,80 - 5,60

1,77

1,60 - 2,10

2,57

2,40 - 2,90

4,41

4,20 - 4,60

4,36

4,15 - 4,55

35

169,2

Levomepromazine

329,0

24

209,9

*

241,9 30

213,0

30 *

256,1 Pimpamperon

376,1

35

164,9

286,1

26

213,0

*

384,2

38

221,0

*

24 *

40

4,33

4,20 - 4,55

35

2,34

2,15 - 2,55

3,52

3,35 - 3,75

30

258,1

7-OH-quetiapine

400,2

40

269,1

*

295,1 35

110,1

60 70

3,51

3,35 - 3,75

60

3,31

3,20 - 3,60

3,30

3,20 - 3,50

40

114,1

9-OH-risperidon

427,2

40

110,0

40

*

40

415,3

431,3

35

191,2 Risperidon-d4

9-OH-risperidon-d4

52 30

392,2

411,3

38

253,0 Quetiapine-d8

Risperidon

35 24

241,0 Quetiapine

40 30

291,0 Prothipendyl

54 36

380,2

313,2

52

164,9 Haloperidol-d4

Olanzapine

40

256,1 Desmethylolanzapine-d8

Flupentixol

30

192,0 Clozapine-d4

40

4,80 - 5,20 4,75 - 5,20

Bromperidol

299,2

4,94

50

4,92

293,1

Desmethylolanzapine

1,90 - 2,40

50

45

35

50

Tijdsinterval (min)

2,04

40

456,2

327,1

Retentietijd (min)

50

285,1 Aripiprazol-d8

Clozapine

Botsingsenergie (eV)

*

207,1

40

114,1

60

30

Component Sertindol

Moederion (m/z)

Cone Voltage (V)

441,2

40

Fragmention (m/z) 71,0

*

113,0 Sulpiride

342,2

40

112,1

329,1

30

132,9

*

401,1

40

169,1 231,0

Tijdsinterval (min)

5,65

5,30 - 6,00

1,04

0,80 - 1,30

1,38

1,15 - 1,60

5,83

5,60 - 6,10

30 40

*

177,0 Zuclopentixol

Retentietijd (min)

60 40

214,1 Tiapride

Botsingsenergie (eV)

50 50

*

40 50

* transitie voor kwantificatie van de component

Tijdens de optimalisatie bleken een aantal componenten hetzelfde moederion te hebben (desmethylclozapine en olanzapine, haloperidol en pimpamperon). Haloperidol en pimpamperon beschikken naast het moederion ook over éénzelfde fragmention. Dit vormt echter geen probleem, aangezien ze chromatografisch worden gescheiden en dus elueren op een verschillend tijdstip. Daarnaast is de identificatie zowel afhankelijk van de 2 MRM transities als van de ratio qualifier op quantifier. De ratio van deze transities moet binnen een interval van ± 20 % liggen rond de vastgestelde ratio bij kalibrator 5, zoals bepaald volgens de regels van de ‘EU commision decision 2002/657’.

4.2. STAALVOORBEREIDING

Voor de optimalisatie van de staalvoorbereiding werden drie verschillende methoden vergeleken op basis van de extractie efficiëntie en het matrix effect. Het doel is de ontwikkeling van een methode die aanvaardbare resultaten geeft voor alle antipsychotica. 4.2.1. Extractie efficiëntie en matrix effect

De extractie efficiëntie geeft de fractie van de antipsychotica weer die zich hebben getransfereerd vanuit de matrix naar het primair extract. Een extractie efficiëntie boven de 50 % is aanvaardbaar, maar de resultaten moeten reproduceerbaar zijn (RSD < 20 %) en concentratie onafhankelijk. De extractie efficiëntie wordt grafisch weergegeven in figuur 4.2.

31

Figuur 4.2: De gemiddelde waarde van de extractie efficiëntie bij lage en hoge concentratie, de foutenbalken geven de RSD (%) weer

De eiwitprecipitatie resulteert in een goed extractierendement. De resultaten zijn voor de meeste componenten herhaalbaar (RSD < 20 %), uitgezonderd voor clozapine en flupentixol. De LLE, waarbij de antipsychotica zich vanuit de matrix naar de organische fase verplaatsen omwille van hun lipofiele eigenschappen en zuurtegraad (pKa), geeft onaanvaardbare resultaten voor 7-OH-quetiapine en sulpiride. Deze bedragen respectievelijk tussen 4 en 6 % voor 7-OH-quetiapine en tussen 3 en 13 % voor sulpiride. De lage extractie efficiëntie van 7OH-quetiapine kan verklaard worden door de aanwezigheid van een fenol groep, die bij de basische pH van de LLE een lading draagt. Dit is ook het geval bij sulpiride door de aanwezigheid van de zure groep in R4 (zie tabel 1.2). Deze ladingen verhogen de affiniteit voor de waterige fase en verlagen zo het extractierendement. De SPE resulteert in aanvaardbare resultaten met een extractie efficiëntie tussen 64,3 en 100,8 % en een gemiddelde RSD tussen 3,0 en 17,9 % met uitzondering van olanzapine (RSD = ± 29 %).

32

Het matrix effect zegt ons iets over de eventuele aanwezigheid van co-eluerende matrixcomponenten, die een invloed kunnen hebben op de intensiteit van het signaal en dus op de finale kwantificatie. Dit verschijnsel komt voor bij LC-MS en is afhankelijk van de staalvoorbereiding, het type ionisatiebron en de gebruikte matrix. Het relatief matrix effect voor de toegepaste staalvoorbereidingsstappen wordt aangetoond in figuur 4.3. 100 % duidt geen matrix effect aan. Ionsuppressie wordt waargenomen bij een matrix effect < 100 % en ionversterking bij een matrix effect > 100 %. Eveneens wordt een RSD verwacht lager dan 20 %.

Figuur 4.3: De gemiddelde waarde van het matrix effect bij lage en hoge concentratie, de foutenbalken geven de RSD (%) weer

LLE werd reeds uitgesloten omwille van de lage extractie efficiëntie bij 7-OH-quetiapine en sulpiride. Een groot verschil tussen de eiwitprecipitatie en de SPE, zowel bij de extractie efficiëntie als het matrix effect, wordt niet waargenomen. Toch gaat de voorkeur uit naar SPE omwille van onderhoudsredenen. De eiwitprecipitatie zorgt er immers voor dat de kolom en de ionisatiebron snel worden vervuild, wat een enorme impact kan hebben bij routine analyses van grote reeksen stalen. 33

4.3. VALIDATIE

Het uitvoeren van een methodevalidatie is noodzakelijk zodat de kwaliteit en de objectieve vergelijking van de analyses verzekerd kan worden. De resultaten bekomen tijdens de validatie vormen de basis voor een betrouwbare interpretatie. De volgende parameters worden onderzocht: de selectiviteit, de lineariteit van de kalibratiecurve, de accuraatheid, de precisie, de LOQ, de extractie efficiëntie, het matrix effect, het carry-over effect en de stabiliteit. Tijdens de validatie van deze parameters moet er rekening worden gehouden met het feit dat niet alle gedeutereerde analogen van de componenten ter beschikking waren om dienst te doen als IS. De IS quetiapine-d8 werd gebruikt voor amisulpride, prothipendyl, quetiapine, 7-OH-quetiapine en sulpiride. Aripiprazol-d8 werd toegepast als IS bij aripiprazol, levomepromazine en zuclopentixol. Haloperidol-d4 werd aangewend bij bromperidol, droperidol, haloperidol, pimpamperon en tiapride. Clozapine-d4 werd gebruikt bij clozapine en desmethylclozapine, desmethylolanzapine-d8 bij desmethylolanzapine en olanzapine. Risperidon-d4 werd toegepast bij flupentixol, risperidon en sertindol. 9-OH-risperidon-d4 werd gebruikt als IS bij 9-OH-risperidon. De keuze werd gemaakt op basis van structuuranalogie en retentietijd. 4.3.1. Selectiviteit

Deze parameter beschrijft het vermogen van een methode om componenten te identificeren en te meten op ondubbelzinnige wijze in de aanwezigheid van onzuiverheden, matrixcomponenten en metabolieten. Blanco stalen, zero stalen en stalen belast met elk antipsychoticum afzonderlijk werden gecontroleerd op de aanwezigheid van storende pieken, die de identificatie en kwantificatie kunnen bemoeilijken. Aangezien een kwantitatieve methode wordt ontwikkeld, is een interferentie toegestaan wanneer het oppervlak van deze storende piek kleiner is dan 20 % van de piekoppervlakte van de LOQ. De resultaten van de blanco en zero stalen worden weergegeven in tabel 4.2. De laatste kolommen in de tabel geven de procentuele verhouding weer van de piekoppervlakte van de interferentie in de blanco/zero stalen op de piekoppervlakte van de LOQ. Deze verhouding moet lager zijn dan 20 %. Zowel visueel als met behulp van onderstaande tabel kunnen geen noemenswaardige interferenties aangetoond worden. Hetzelfde geldt voor de stalen belast met elk antipsychoticum afzonderlijk. Er kan geconstateerd worden dat de methode selectief is voor alle componenten. 34

Tabel 4.2: Overzicht van de resultaten voor de selectiviteit Component Area Blanco Amisulpride 31 Aripiprazol 70 Bromperidol 41 Clozapine 79 Droperidol 35 Flupentixol 37 Desmethylclozapine 39 Desmethylolanzapine 17 Haloperidol 27 Prothipendyl 30 Levomepromazine 22 7-OH-quetiapine 25 9-OH-risperidon 33 Olanzapine 19 Pimpamperon 84 Quetiapine 30 Risperidon 67 Sertindol 17 Sulpiride 9 Tiapride 60 Zuclopentixol 45

Area Zero 32 826 583 115 194 32 134 22 39 134 52 20 126 26 204 642 137 109 2388 781 66

Selectiviteit Area LOQ Area blanco/area LOQ (%) 39678 0,08 27956 0,25 21370 0,19 24710 0,32 17940 0,19 572 6,47 51151 0,08 2121 0,78 1010 2,64 9776 0,31 2073 1,06 3607 0,69 31933 0,10 5391 0,35 88533 0,10 11570 0,26 3432 1,95 2556 0,67 14270 0,06 55125 0,11 807 5,59

Area zero/area LOQ (%) 0,08 2,96 2,73 0,47 1,08 5,62 0,26 1,05 3,86 1,37 2,51 0,56 0,39 0,48 0,23 5,55 3,98 4,26 16,74 1,42 8,19

4.3.2. Lineariteit van de kalibratiecurve

Voor de bepaling van het kalibratiemodel wordt de relatieve respons uitgezet in functie van de concentratie. Een onderscheid maken tussen het lineaire en het kwadratische regressiemodel kan zowel visueel als met behulp van een lack-of-fit test. Deze F-test meet de variantie binnen één meetserie en gaat die vergelijken met de variantie rond het voorspelde regressiemodel. Bij een p-waarde > 0,05 kan de nulhypothese (H0 = geen afwijking voor lineariteit) aanvaard worden op 95 % significantieniveau en kan er besloten worden dat er geen significante afwijking is voor de lineariteit. Lineariteit wordt steeds verkozen boven het kwadratische regressiemodel omwille van de complexiteitsgraad.

De resultaten van de lack-of-fit test worden weergegeven in tabel 4.3. Er werd voor sommige componenten (amisulpride, bromperidol, olanzapine en desmethylolanzapine) toch geopteerd voor het kwadratische regressiemodel, hoewel een p-waarde > 0,05 werd bekomen. Deze keuze werd gemaakt op basis van de accuraatheid in combinatie met een visuele inspectie van de ijklijn. We observeren eveneens in de F-test dat, hoewel een p-waarde hoger dan 0,05 werd bekomen, de significantie ten opzichte van lineariteit duidelijk verlaagt. In figuur 4.4 worden voorbeelden gegeven van een lineaire en twee kwadratische curves met een verschillende afbuiging. 35

Tabel 4.3: Resultaten van de F-test voor risperidon, amisulpride en bromperidol

Risperidon

Amisulpride

Bromperidol

Risperidon

y = 0,2122x + 0,007053

36

Amisulpride

y = -1,14445E-06x² + 0,00359x + 0,04159

Bromperidol

y = 6,04790E-03x² + 0,22508x + 0,42718

Figuur 4.4: Voorbeelden van een kalibratiecurve voor risperidon, amisulpride en bromperidol

Risperidon kent duidelijk een lineair verband volgens de F-test en de visuele inspectie van de ijklijn. Dit is ook het geval bij aripiprazol, clozapine, desmethylclozapine, droperidol, flupentixol, haloperidol, levomepromazine, pimpamperon, prothipendyl, quetiapine, 7-OHquetiapine, 9-OH-risperidon, sertindol, sulpiride, tiapride en zuclopentixol. Er werd gekozen voor het kwadratische regressiemodel bij amisulpride, bromperidol, desmethylolanzapine en olanzapine. Amisulpride kent duidelijk een lineair verband bij lage concentraties, maar er kan een afbuiging worden waargenomen bij hoge concentraties. Dit kan verklaard worden door een verzadiging van de ionisatiebron. Bij bromperidol wordt een probleem waargenomen ter hoogte van de lage concentraties en dit kan mogelijks door matrix effecten veroorzaakt worden. Uit vorige paragraaf (§ 4.3.1.) kan reeds besloten worden dat er geen interferentie aanwezig is en dit niet de oorzaak is.

37

Na het bepalen van het regressiemodel wordt nagegaan of de data heteroscedastisch zijn via een F-test (α = 5 %). Deze test vergelijkt de varianties van de laagste en hoogste kalibratoren. Dit wordt eveneens grafisch weergegeven via een residuplot in figuur 4.5.

Risperidon - ongewogen

Risperidon - 1/x

Amisulpride - ongewogen

Amisulpride – 1/x

Bromperidol - ongewogen

Bromperidol – 1/x

Figuur 4.5: Residuplot van risperidon, amisulpride en bromperidol voor en na de weging

Wanneer geen gewogen regressie wordt toegepast is er duidelijk een buiging te zien in het residuplot van amisulpride. Bij het toekennen van een wegingsfactor verdwijnt de buiging. Dit is ook het geval bij risperidon, hoewel hier slechts sprake is van een lichte buiging. Een groot verschil tussen beide residuplots wordt niet waargenomen bij bromperidol. Een gewicht wordt hier toch overwogen wanneer rekening wordt gehouden met de accuraatheid en het % RE. Het residuplot van amisulpride en bromperidol toont ons ook aan dat er duidelijk een probleem is ter hoogte van de lage concentraties en dit een belangrijke invloed kan hebben op de keuze van het kalibratiemodel. Dit wordt in § 4.3.4. verder onderzocht.

38

Nadat het kalibratiemodel is bepaald, wordt de goodness of fit getest via het % RE. Dit geeft het verschil weer tussen de gemeten concentratie en de theoretische concentratie. In tabel 4.4 wordt de som van het kwadraat van het % RE van alle kalibratoren (n = 8) weergegeven, samen met het regressiemodel dat werd gekozen. Bij deze keuze werd rekening gehouden met de lack-of-fit test, visuele waarnemingen, het residuplot, het % RE en de accuraatheid.

Tabel 4.4: Goodness of fit: % RE De gearceerde zones duiden het gekozen regressiemodel aan Som van het kwadraat % RE Lineair

Lineair, 1/x

Amisulpride

1014704

118968

Lineair, 1/x² Kwadratisch 30041

127073

Kwadratisch, 1/x Kwadratisch, 1/x² 27620

20734

Aripiprazol

8645

2137

648

7086

1453

1265

Bromperidol

521094

43998

28597

29592

8961

5075

Clozapine

103089

25269

10725

699313

16028

11092

Droperidol

358482

25925

14175

29615

2796

2077

Flupentixol

96894

20007

11518

68451

28224

11802

Desmethylclozapine

311157

23536

11265

208223

143889

119097

Desmethylolanzapine

348581

26624

14659

28799

2471

1197

Haloperidol

88709

4726

2747

592905

6181

2455

Prothipendyl

31298

2993

1735

19392

2537

2305

Levomepromazine

134665

30763

8626

73133

23499

22027

7-O H-quetiapine

148774

6617

2889

4422

1598

927

9-O H-risperidon

17877

627

322

11634

1435

509

O lanzapine

180678

14223

8535

7967

4843

3845

Pimpamperon

119892

30769

9968

322908

28170

18944

Q uetiapine

33966

2413

18776

24398

2036

7122

Risperidon

2731

785

378

6477

1034

638

Sertindol

106609

35236

12779

155953

31719

31553

Sulpiride

158229

23106

2690

305296

17366

14767

Tiapride

310775

67887

13389

182275

40752

35991

Zuclopentixol

93072

8687

4974

19727

4914

3818

39

Tabel 4.5 toont het gemiddelde en het betrouwbaarheidsinterval (CI 95 %) van de coëfficiënten uit de acht ijklijnen.

Tabel 4.5: Samenvatting van de gegevens uit de acht ijklijnen Lineaire curve 1/x

Richtingscoëfficiënt

y-intercept

Best fit

95 % CI

Best fit

95 % CI

Aripiprazol

0,001328

0,001185 - 0,001466

0,002734

0,000842 - 0,006292

Haloperidol

0,042064

0,031896 - 0,052254

-0,002145

-0,005980 - 0,001652

Prothipendyl

0,005557

0,004107 - 0,006993

-0,000055

-0,002920 - 0,002792

Q uetiapine

0,006093

0,005050 - 0,007125

-0,001930

-0,011131 - 0,007256

7-O H-Q uetiapine

0,010861

0,010310 - 0,011415

0,007119

-0,002795 - 0,101745

Risperidon

0,212229

0,201323 - 0,223127

0,007053

0,003331 - 0,010794

9-O H-risperidon

0,014958

0,014320 - 0,015605

-0,000130

-0,005110 - 0,004835

Sulpiride

0,007411

0,006262 - 0,008588

0,006172

-0,006670 - 0,019021

Zuclopentixol

0,005515

0,004399 - 0,006626

-0,000984

-0,001390 - 0,000580

Lineaire curve 1/x²

Richtingscoëfficiënt

y-intercept

Best fit

95 % CI

Best fit

95 % CI

Clozapine

0,002021

0,001810 - 0,002233

0,023460

0,01190 - 0,03506

Desmethylclozapine

0,003546

0,002940 - 0,004135

-0,013056

-0,0212 - -0,004945

Droperidol

0,095031

0,073517 - 0,116558

-0,146204

-0,17425 - 0,011817

Flupentixol

0,039061

0,019785 - 0,058340

0,002339

-0,00067 - 0,005345

Levomepromazine

0,001367

0,000916 - 0,001809

-0,001409

-0,001809 - -0,00091

Pimpamperon

0,055782

0,050312 - 0,061238

0,581932

0,47249 - 0,691060

Sertindol

0,142501

0,108537 - 0,176438

0,016390

0,004136 - 0,028639

Tiapride

0,030084

0,025357 - 0,034818

0,506867

0,025357 - 0,034818

Kwadratische curve 1/x

Kwadratische term best fit

Amisulpride

Lineaire term

y-intercept

95 % CI

best fit

95 % fit

best fit

95 % fit

-1,14445E-06 -0,0000014 - -0,0000009

0,003586

0,003056 - 0,004157

0,04159

0,033070 - 0,050128

Bromperidol

6,04790E-03

0,004756 - 0,007340

0,225076

0,225076 - 0,150941

0,42718

0,225076 - 0,031352

O lanzapine

1,20012E-05

0,000009 - 0,000015

0,009467

0,007039 - 0,011861

-0,00841

-0,014364 - -0,001889

Desmethylolanzapine

7,82668E-06

0,000005 - 0,000011

0,004057

0,002916 - 0,005234

-0,00712

-0,011676 - -0,002549

4.3.3. Accuraatheid en Precisie

De accuraatheid, de binnen-dag precisie (RSDr) en de tussen-dag precisie (RSDt) voor de interne en externe controlestalen worden weergegeven in tabel 4.6. De accuraatheid wordt uitgedrukt door middel van de bias. Dit geeft de afstand weer van de gemeten waarde tot de theoretische waarde en moet binnen een interval van ± 15 % liggen. De precisie geeft ons meer informatie over de spreiding van de kalibratoren en wordt uitgedrukt door de relatieve standaarddeviatie (RSD). Bij een waarde < 15 % wordt voldaan aan de specificaties.

40

Tabel 4.6: De accuraatheid en precisie Component Amisulpride

Aripiprazol

Bromperidol

Clozapine

Desmethylclozapine

Droperidol

Flupentixol

Haloperidol

Levomepromazine

Olanzapine

Desmethylolanzapine

Pimpamperon

Theoretische waarde QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern

30,0 960,0 30,0 960,0 87,1 395,0 30,0 960,0 30,0 960,0 160,0 291,0 0,6 19,5 0,6 19,5 / / 30,0 960,0 30,0 960,0 315,0 520,0 30,0 960,0 30,0 960,0 165,0 230,0 6,0 192,0 6,0 192,0 / / 0,6 19,5 0,6 19,5 / / 0,6 19,5 0,6 19,5 10,1 15,2 6,0 192,0 6,0 192,0 18,8 71,0 6,0 192,0 6,0 192,0 35,1 64,3 6,0 192,0 6,0 192,0 39,8 73,0 30,0 960,0 30,0 960,0 55,1 344,0

Gemiddelde (n=16) 29,6 993,1 21,1 810,7 107,0 397,3 27,8 961,1 33,0 1011,3 473,3 847,6 0,9 19,7 0,5 13,9 / / 29,8 901,0 25,5 846,2 303,2 486,6 28,6 911,6 27,9 845,6 168,0 238,2 6,4 205,6 6,0 152,5 / / 0,6 21,1 0,5 17,0 / / 0,6 17,7 0,6 19,3 10,4 16,0 6,1 200,5 1,5 59,6 16,4 62,9 6,2 190,4 5,7 128,1 39,0 69,7 6,6 188,4 7,1 148,2 32,9 57,5 30,8 830,5 29,9 553,9 51,2 267,8

RSDr (%) (n=2) 12,2 10,4 7,8 17,1 5,3 10,1 3,8 2,9 3,1 6,0 4,3 5,7 13,8 4,6 27,7 7,4 / / 8,8 2,3 4,5 2,5 3,1 3,6 10,1 5,8 3,1 7,2 11,9 7,4 7,1 4,8 2,2 5,3 / / 13,4 10,6 14,9 15,8 / / 7,2 5,6 6,6 3,5 5,3 4,6 8,0 10,0 46,1 62,0 12,5 10,1 4,1 2,7 7,7 5,9 10,3 8,5 4,3 3,2 11,5 5,7 10,7 7,8 17,9 24,3 35,7 10,6 8,9 8,6

RSDt (%) (n=8) 11,6 9,4 31,1 28,3 7,9 15,5 7,6 3,8 14,9 12,4 6,9 6,1 42,4 10,4 64,9 13,3 / / 8,8 4,5 10,9 4,4 7,3 6,3 15,2 6,4 25,2 16,6 10,8 7,1 8,8 4,5 10,9 4,4 / / 19,2 17,9 69,9 45,3 / / 11,5 8,2 14,4 10,1 9,3 11,2 11,5 17,7 46,2 67,1 28,0 17,5 14,6 4,2 13,0 11,0 15,4 15,2 15,9 4,5 14,1 9,8 16,2 13,9 18,5 25,0 42,5 20,0 15,1 15,3

Bias (%) (n=16) -1,4 3,5 -29,8 -15,6 22,8 0,6 -7,4 0,1 10,0 5,3 195,8 191,3 44,8 1,2 -21,9 -28,6 / / -0,6 -6,1 -14,9 -11,9 -3,8 -6,4 -4,7 -5,0 -6,9 -11,9 1,8 3,5 5,9 7,1 0,2 -20,6 / / 3,1 7,9 -20,8 -13,0 / / 1,4 -9,2 -0,7 -0,9 2,9 5,1 2,0 4,4 -74,4 -69,0 -12,7 -11,4 2,5 -0,8 -5,4 -33,3 11,0 8,4 10,3 -1,9 17,6 -22,8 -17,4 -21,2 2,6 -13,5 -0,4 -42,3 -7,0 -22,2

41

Component Prothipendyl

Quetiapine

7-OH-quetiapine

Risperidon

9-OH-risperidon

Sertindol

Sulpiride

Tiapride

Zuclopentixol

Theoretische waarde QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern QC low citraat QC high citraat QC low NaF QC high NaF QC extern QC extern

6,0 192,0 6,0 192,0 / / 6,0 192,0 6,0 192,0 166,0 284,0 6,0 192,0 6,0 192,0 / / 0,6 19,5 0,6 19,5 9,1 14,3 6,0 192,0 6,0 192,0 30,9 56,6 0,6 19,5 0,6 19,5 / / 6,0 192,0 6,0 192,0 / / 30,0 960,0 30,0 960,0 / / 0,6 19,5 0,6 19,5 / /

Gemiddelde (n=16) 5,6 178,3 0,6 42,2 / / 5,9 176,3 6,1 186,0 163,8 285,8 6,2 193,7 1,9 57,6 / / 0,6 19,7 0,6 19,5 9,8 15,0 6,0 194,1 6,0 189,4 30,8 56,7 0,5 21,2 0,6 19,4 / / 5,6 202,9 35,4 192,7 / / 31,6 958,4 23,7 618,9 / / 0,7 20,9 0,6 18,4 / /

RSDr (%) (n=2) 5,6 4,4 47,4 20,7 / / 2,3 3,2 3,0 3,9 5,4 5,6 6,7 3,3 27,1 11,1 / / 5,5 2,8 3,9 3,7 3,7 3,5 2,3 3,0 1,2 2,0 4,3 3,9 27,0 14,4 18,9 8,5 / / 7,3 12,4 6,1 4,0 / / 23,3 11,4 13,0 12,1 / / 14,4 4,1 8,3 6,4 / /

RSDt (%) (n=8) 9,1 6,8 100,3 65,6 / / 11,7 5,6 10,7 8,9 6,6 6,6 9,4 4,6 40,0 77,6 / / 11,6 4,1 11,7 4,4 4,1 3,5 3,6 3,1 3,7 2,7 3,7 3,4 26,3 28,5 38,8 34,2 / / 23,0 10,6 54,8 16,2 / / 21,8 10,4 46,3 29,3 / / 16,0 9,4 23,5 19,3 / /

Bias (%) (n=16) -6,5 -7,1 -90,2 -78,0 / / -2,3 -8,2 2,2 -3,1 -1,3 0,6 3,9 0,9 -67,6 -70,0 / / 6,2 0,8 7,3 0,2 8,1 4,7 0,2 1,1 -0,8 -1,3 -12,1 -11,8 -11,5 8,7 -6,3 -0,5 / / -6,1 5,7 489,6 0,4 / / 5,4 -0,2 -21,0 -35,5 / / 8,3 7,3 0,0 -5,8 / /

Uit bovenstaande tabel kan geconcludeerd worden dat de accuraatheid en precisie bij het gebruik van natriumfluorideplasma niet aan de specificaties voldoet voor amisulpride, bromperidol, droperidol, desmethylclozapine, flupentixol, prothipendyl, levomepromazine, 7OH-quetiapine, olanzapine, desmethylolanzapine, pimpamperon, sertindol, sulpiride, tiapride en zuclopentixol. Dit kan verklaard worden door het matrix effect waar dieper wordt op ingegaan in § 4.3.6. Wanneer geen rekening wordt gehouden met de resultaten voor het natriumfluorideplasma, wordt er voldaan aan de eisen bij clozapine, droperidol, desmethylclozapine, haloperidol, prothipendyl, quetiapine, 7-OH-quetiapine, olanzapine, risperidon en 9-OH-risperidon. 42

Amisulpride, aripiprazol en desmethylolanzapine voldoen aan de eisen voor de interne controlestalen, maar niet voor de externe controlestalen. Dit is opvallend bij aripiprazol (bias = ± 196 %). De werkoplossing werd reeds opnieuw aangemaakt, zodat een foutieve concentratie kon worden uitgesloten. Er is ook een IS beschikbaar, maar die lijkt het matrix effect niet te compenseren (§ 4.3.6.). Waarschijnlijk moet de oorzaak daar worden gezocht, aangezien de matrix van de externe controlestalen verschilt met de matrix die wordt gebruikt bij het opstellen van de ijklijn.

De antipsychotica flupentixol, levomepromazine, pimpamperon, sertindol, sulpiride, tiapride en zuclopentixol kennen voornamelijk problemen met de precisie. Een variatie in de co-eluerende componenten per matrix en dus het matrix effect kan een mogelijke oorzaak zijn, aangezien geen van deze componenten beschikt over een gedeutereerd analoog als IS. (zie § 4.3.6.) De oorzaak voor de imprecisie kan ook gezocht worden bij de extractie efficiëntie (zie § 4.3.5.) en het gebrek aan stabiliteit (zie § 4.3.8.). Wanneer de resultaten voor de extractie efficiëntie niet reproduceerbaar zijn (RSD > 20 %) of de componenten niet stabiel blijven gedurende de analyse, kan dit eveneens leiden tot imprecisie.

De maximale onnauwkeurigheid (bias = 44,8 %) en imprecisie (RSD = 42,4 %) worden teruggevonden bij bromperidol. Een probleem werd reeds geobserveerd bij het vaststellen van het kalibratiemodel (zie § 4.3.2.). 4.3.4. LOQ

De resultaten voor de accuraatheid en precisie van de LOQ in citraatplasma worden getoond in tabel 4.7. De bias moet binnen een interval van ± 20 % liggen, de RSDr en RSDt worden aanvaard wanneer een waarde < 20 % wordt verkregen.

43

Tabel 4.7: Accuraatheid en precisie van de LOQ Component Amisulpride Aripiprazol Bromperidol Clozapine Droperidol Flupentixol Desmethylclozapine Desmethylolanzapine Haloperidol Prothipendyl Levomepromazine 7-OH-quetiapine 9-OH-risperidon Olanzapine Pimpamperon Quetiapine Risperidon Sertindol Sulpiride Tiapride Zuclopentixol

Theoretische concentratie (ng/mL)

Gemiddelde (ng/mL) (n=16)

RSDr (%) (n=2)

RSDt (%) (n=8)

Bias (%) (n=16)

25 (50) 25 0,5 (1) 25 5 0,5 25 5 0,5 5 (10) 5 (10) 5 5 5 25 5 0,5 0,5 (1) 5 (10) 25 (50) 0,5

17,6 (57,6) 23,7 0,6 (1,3) 24,3 5,4 0,5 (1,0) 24,1 5,5 0,5 4,3 (9,2) 5,3 (10,2) 5,1 4,9 5,1 20,1 4,8 0,5 0,5 (0,96) 4,2 (8,59) 20,9 (56,11) 0,5

11,7 (5,9) 2,7 21,0 (9,30) 5,7 3,4 24,7 (21,04) 2,7 5,6 10,3 9,7 (4,0) 12,5 (7,1) 5,5 2,9 3,8 6,7 2,1 8,2 19,2 (12,1) 9,5 (6,32) 55,8 (9,44) 9,3

38,03 (7,2) 16,8 52,3 (11,39) 11,0 11,0 41,4 (25,77) 12,7 16,2 15,0 31,1 (4,9) 53,5 (8,6) 9,2 5,6 16,4 8,7 13,5 15,3 35,1 (14,8) 38,9 (7,74) 72,3 (11,57) 19,6

-29,5 (15,1) -5,2 23,8 (28,6) -2,9 7,6 1,25 (0,0) -3,8 10,5 -2,5 -13,1(-7,8) 6,5 (1,5) 1,3 -1,4 2,5 -19,6 -4,8 6,3 -2,5 (-3,6) -16,1 (-14,1) -16,5 (12,2) 7,5

Een bias buiten het interval van ± 20 % wordt bekomen voor amisulpride en bromperidol. Dit bevestigt onze waarnemingen in § 4.3.2., waar het residuplot reeds aantoonde dat er een probleem is ter hoogte van de lage concentraties. Een precisie hoger dan 20 % wordt waargenomen bij amisulpride, bromperidol, flupentixol, prothipendyl, levomepromazine, sertindol, sulpiride en tiapride. Deze imprecisie kan veroorzaakt worden door problemen die reeds werden aangehaald in § 4.3.3.

Er moet geconcludeerd worden dat deze methode niet kan worden toegepast bij deze lage concentratie. Voor bovenvermelde componenten wordt op dezelfde manier de accuraatheid en de precisie bepaald bij de op één na laagste kalibrator, deze resultaten worden in de tabel 4.7 weergegeven tussen haakjes. Betere resultaten werden verkregen, uitgezonderd voor bromperidol. Verder onderzoek is hier vereist. Daarbij lijkt een herevaluatie van het kwadratische kalibratiemodel voor amisulpride en bromperidol noodzakelijk. 4.3.5. De extractie efficiëntie

De resultaten voor de extractie efficiëntie in natriumfluoride- en citraatplasma worden weergegeven in tabel 4.8. Een extractie efficiëntie boven de 50 % en een RSD < 20 % is aanvaardbaar. Wanneer citraat wordt toegepast als anticoagulans kan geconcludeerd worden dat de extractieprocedure voldoende efficiënt is. De extractie efficiëntie is over het algemeen reproduceerbaar uitgezonderd voor amisulpride, clozapine, flupentixol, sulpiride en tiapride. Dit kan een mogelijke verklaring zijn voor de imprecisie, waargenomen in § 4.3.3. en § 4.3.4., bij amisulpride, flupentixol, sulpiride en tiapride. Bij het gebruik van natriumfluoride als

44

anticoagulans worden meer problemen gedetecteerd. Een lage extractie efficiëntie wordt teruggevonden bij prothipendyl (47,3-63,4 %) en levomepromazine (43,0-44,8 %).

Tabel 4.8: Extractie efficiëntie Extractie efficiëntie (%) Component Amisulpride Aripiprazol Bromperidol Clozapine Droperidol Flupentixol Desmethylclozapine Desmethylolanzapine Haloperidol Prothipendyl Levomepromazine 7-OH-Quetiapine 9-OH-risperidon Olanzapine Pimpamperon Quetiapine Risperidon Sertindol Sulpiride Tiapride Zuclopentixol

Citraat Low 98,8 87,3 103,2 90,6 97,2 108,4 85,6 92,8 65,0 81,1 59,7 98,5 96,8 106,4 94,8 96,9 97,3 75,0 114,8 126,0 120,6

RSD % 7,3 7,2 5,0 20,5 15,0 9,3 8,6 10,8 5,4 7,4 8,8 9,4 7,4 13,2 10,7 8,4 10,0 14,7 9,1 14,3 5,0

NaF High 98,9 96,5 99,9 104,9 107,2 107,2 97,2 102,7 104,4 92,9 66,6 101,8 104,0 104,3 101,1 103,0 100,8 100,6 100,4 103,2 101,9

RSD % 22,3 4,3 11,9 21,4 19,8 21,3 10,2 5,3 7,3 6,1 11,1 6,1 6,2 5,3 19,8 5,0 6,4 15,6 20,6 36,3 5,9

Low 99,3 84,2 94,1 89,0 88,9 97,4 82,3 52,1 111,2 47,3 44,8 81,4 99,4 69,0 94,3 100,9 97,4 79,9 113,6 113,6 80,7

RSD % 8,1 8,5 4,5 20,2 12,2 18,7 21,7 78,6 12,5 214,8 126,3 31,1 9,0 58,1 9,0 9,4 11,2 7,2 9,8 11,3 13,6

High 93,3 94,8 81,5 94,1 86,8 91,9 90,2 91,9 106,9 63,4 43,0 59,3 100,7 86,7 87,8 105,3 98,1 92,9 96,7 85,5 94,8

RSD % 6,7 4,9 12,0 11,9 15,3 20,2 8,3 34,2 7,9 28,7 30,4 28,0 5,1 37,9 8,4 7,7 5,7 20,5 9,2 13,4 9,3

4.3.6. Het matrix effect

Tabel 4.9 en 4.10 tonen de resultaten van de validatie van het absolute en relatieve matrix effect. Hierbij is het belangrijk dat de resultaten reproduceerbaar zijn, een RSD < 20 % voor het relatieve matrix effect is aanvaardbaar. De antipsychotica worden onderverdeeld in twee groepen op basis van de beschikbaarheid van een gedeutereerd analoog als IS. De ratio analiet/IS compenseert dan de suppressie of de versterking van het analietsignaal, aangezien de ionisatie van het gedeutereerd analoog op dezelfde manier wordt beïnvloed als het overeenkomstig analiet wanneer deze co-elueren.

Tabel 4.9: Het relatief en absoluut matrix effect van antipsychotica met gedeutereerd analoog als IS Component Aripiprazol Clozapine Desmethylolanzapine Haloperidol 9-OH-risperidon Quetiapine Risperidon

Low 211,4 103,1 56,6 84,6 94,7 143,9 180,3

Absoluut matrix effect (%) Citraat NaF RSD % High RSD % Low RSD % High 37,0 87,8 36,6 250,9 46,3 105,1 26,2 66,5 14,5 81,4 29,0 68,4 11,9 58,6 18,8 11,8 55,3 11,7 4,3 83,8 25,8 96,3 50,1 118,6 16,6 89,1 13,9 127,8 36,1 105,2 14,8 104,9 21,2 188,8 36,4 120,8 27,8 109,9 28,7 271,0 45,6 139,2

RSD % 34,6 15,3 43,0 25,2 23,0 23,0 16,7

Low 192,6 101,5 96,0 62,8 100,6 90,1 99,1

Relatief matrix effect (%) Citraat NaF RSD % High RSD % Low RSD % High 7,0 130,0 13,8 44,2 19,4 64,8 23,1 75,4 10,2 95,8 24,5 83,3 12,3 87,0 6,4 96,6 12,2 66,9 11,8 87,1 7,2 62,1 15,7 85,4 3,0 94,6 6,2 94,1 9,3 97,5 2,9 88,4 5,8 87,4 15,4 87,6 11,4 94,0 5,4 100,7 18,7 101,9

RSD % 12,4 10,9 13,0 5,0 6,7 11,5 7,9

45

Tabel 4.10: Het relatief en absoluut matrix effect van de antipsychotica zonder gedeutereerd analoog als IS Component Amisulpride Bromperidol Droperidol Flupentixol Desmethylclozapine Prothipendyl Levomepromazine 7-OH-Quetiapine Olanzapine Pimpamperon Sertindol Sulpiride Tiapride Zuclopentixol

Low 86,3 47,6 119,3 159,4 99,8 129,0 218,4 101,7 70,6 98,2 717,0 110,8 98,1 179,9

Absoluut matrix effect (%) Citraat NaF RSD % High RSD % Low RSD % High 7,5 92,1 4,0 89,8 10,6 96,5 15,4 43,7 23,7 46,6 8,6 44,1 8,8 77,3 17,3 169,9 18,5 113,1 32,0 54,5 59,3 187,7 20,0 63,2 10,4 72,5 22,6 102,3 42,3 71,3 11,4 103,1 24,1 15,9 86,1 44,2 11,3 104,1 20,0 43,7 74,1 57,2 13,5 77,4 16,2 23,8 77,8 48,9 14,0 70,8 17,4 13,7 49,8 13,6 16,8 79,4 12,9 131,4 31,2 90,4 52,0 159,2 90,2 1242,8 57,8 256,7 4,7 93,4 4,0 122,8 13,6 99,2 3,4 92,2 3,1 99,5 14,8 94,9 61,9 79,8 54,4 187,6 35,5 72,4

RSD % 5,5 9,8 12,6 59,3 11,0 35,6 42,3 32,2 45,1 10,4 89,9 6,4 4,5 47,6

Low 53,9 33,0 83,6 102,1 107,7 82,4 212,9 63,8 118,0 69,1 411,1 69,4 69,4 231,3

Relatief matrix effect (%) Citraat NaF RSD % High RSD % Low RSD % High 8,4 79,5 19,7 43,8 17,4 71,5 13,4 45,4 12,2 24,4 22,0 33,4 11,2 81,1 18,2 87,3 19,0 84,9 20,6 44,1 46,0 82,2 28,8 45,8 6,2 81,5 8,7 119,0 35,9 87,5 11,4 87,3 5,6 9,8 70,2 33,5 17,9 161,7 7,3 45,0 83,9 93,1 8,2 65,8 5,4 11,7 84,2 36,7 9,2 105,8 6,7 115,0 9,1 77,2 9,1 83,9 18,4 65,8 16,5 67,5 29,5 123,8 66,7 455,2 23,4 182,5 10,6 80,5 22,3 59,7 17,5 73,4 7,5 99,2 32,0 51,3 16,5 71,4 38,0 111,6 31,4 183,0 41,8 104,5

RSD % 13,2 25,6 24,5 55,6 12,3 44,7 58,8 40,0 14,7 20,0 87,6 12,8 22,6 19,6

Zowel tabel 4.9 als 4.10 tonen aan dat het matrix effect een groter probleem vormt bij natriumfluorideplasma dan bij citraatplasma. Dit bevestigt onze eerdere vermoedens tijdens de evaluatie van de accuraatheid en de precisie (§ 4.3.3.).

Het absoluut matrix effect voor de componenten in tabel 4.9 bedraagt minimaal 11,7 % en maximaal 211,4 %. Het effect wordt echter grotendeels en voor de meeste componenten gecompenseerd door de IS. Dit kan worden afgeleid uit het relatief matrix effect (62,1-101,9 %). Het effect is ook reproduceerbaar en dus onafhankelijk van de gebruikte matrix. Een uitzondering is aripiprazol. Dit antipsychoticum kent een hoog relatief matrix effect. De IS aripiprazol-d8 zorgt niet voor de nodige compensatie. Dit zou een mogelijke verklaring kunnen zijn voor de problemen die worden gedetecteerd bij de accuraatheid van de externe controlestalen (tabel 4.6).

De componenten in tabel 4.10 ondervinden duidelijk meer hinder van het matrix effect. Dit is voornamelijk het geval bij bromperidol, flupentixol, levomepromazine, sertindol en zuclopentixol wanneer gekeken wordt naar het relatief matrix effect. Een RSD > 20 % wordt waargenomen bij flupentixol, sertindol, sulpiride, tiapride en zuclopentixol. Het effect lijkt dus afhankelijk van het gebruikte plasma. Dit kan ook de imprecisie verklaren die bij deze componenten werd gedetecteerd ter hoogte van de controlestalen en de LOQ (zie § 4.3.3. en §4.3.4.).

Een mogelijke oplossing voor dit probleem is het gebruik van een geschikte IS zodat het matrix effect kan worden gecompenseerd. De ionsuppressie of ionversterking kan ook worden 46

veroorzaakt door co-eluerende analieten aangezien een mix wordt gebruikt tijdens de validatie. [52] Dit is hier echter niet het geval aangezien de antipsychotica chromatografisch optimaal gescheiden zijn (zie figuur 4.1). Een andere mogelijke oorzaak is de aanwezigheid van co-eluerende matrixcomponenten. Om de invloed van deze componenten te reduceren, kan de staalvoorbereiding worden aangepast. Wanneer deze optimalisatie het matrix effect niet onder controle krijgt, moeten de chromatografische parameters, zoals kolomtype en mobiele fase, in de toekomst herbekeken worden. In dat geval kan een andere chromatografische

scheiding

soelaas

brengen

door

ongedetecteerde

co-eluerende

matrixcomponenten te gaan scheiden van de antipsychotica.

Figuur 4.6 toont een blanco staal in SCAN modus. Deze kan de eventuele aanwezigheid van co-eluerende componenten aantonen. Er worden geen opvallende pieken waargenomen vóór het tijdstip waar het laatste antipsychoticum elueert (zie tabel 4.1). Wel is het signaal van het blanco staal relatief hoog. Het signaal op het einde van de run is afkomstig van componenten die de kolom verlaten tijdens de wasstappen.

Figuur 4.6: Blanco staal in SCAN modus 4.3.7. Het carry-over effect

Het carry-over effect wordt veroorzaakt door contaminatie afkomstig van een staal met een hogere concentratie dat eerder in de analytische reeks de kolom doorlopen heeft. Het is mogelijk dat bij de volgende stalen verkeerdelijk een hoeveelheid afkomstig van het vorige staal wordt waargenomen. Het is logisch dat dit een grote invloed kan hebben op de accuraatheid en de precisie van de analyse. De concentratie die wordt gemeten in het blanco staal mag hoogstens 20 % van de LOQ bedragen. Dit geldt enkel wanneer de methode bedoeld is voor kwantitatieve doeleinden. Bij een kwalitatieve bepaling is geen carry-over effect toegelaten. De resultaten voor het carry-over effect zijn terug te vinden in tabel 4.11. 47

Tabel 4.11: Weergave van de resultaten voor het carry-over effect

Component Amisulpride Aripiprazol Bromperidol Clozapine Droperidol Flupentixol Desmethylclozapine Desmethylolanzapine Haloperidol Prothipendyl Levomepromazine 7-OH-quetiapine 9-OH-Risperidon Olanzapine Pimpamperon Quetiapine Risperidon Sertindol Sulpiride Tiapride Zuclopentixol

Area blanco 110,9 4932 41 225 599 739 293 0 3 0 0 38 23 40 372 305 132 0 4 30 0,0

Area blanco/ Area LOQ area LOQ (%) 39678 0,28 27956 17,64 21370 0,19 24710 0,91 17940 3,34 572 129,23 51151 0,57 2121 0,00 1010 0,27 9776 0,00 2073 0,00 3607 1,07 31933 0,07 5391 0,74 88533 0,42 11570 2,63 3432 3,85 2556 0,00 14270 0,03 55125 0,06 807 0,00

Een overdracht tussen de 2 stalen met een signaal groter dan 20 % van de LOQ wordt gedetecteerd bij flupentixol. Dit zou ook moeten terug te zien zijn bij de accuraatheid van de LOQ, maar dit is niet het geval. Een verklaring kan hier niet direct gevonden worden. De wasstappen zullen moeten aangepast worden om deze carry-over te vermijden. Indien dit niet kan verwezenlijkt worden zal een blanco tussen de stalen moeten geïnjecteerd worden om contaminatie te vermijden. 4.3.8. Stabiliteit

De stabiliteit onder autosampler condities werd bepaald op 3 verschillende tijdstippen bij 3 verschillende concentraties. Een analiet wordt aanzien als stabiel wanneer er wordt voldaan aan 2 voorwaarden: de ratio van de gemiddelde piekoppervlakte in de stabiliteitsstalen op de controlestalen moet binnen een interval van 90 % - 110 % liggen en het 90 % confidentie interval van de stabiliteitsstalen moet binnen het 80 % - 120 % interval van de controlestalen liggen.

De stabiliteit na 24 uur wordt weergegeven in tabel 4.12. Tabel 4.13 toont de resultaten van de stabiliteitstesten van de IS. Zowel bij lage, medium als hoge concentraties worden stabiliteitsproblemen gedetecteerd bij flupentixol, sertindol en zuclopentixol. Dit kan de 48

imprecisie bij de controlestalen verklaren die bij deze componenten wordt waargenomen in tabel 4.6. De duur van de routine analyses moet dus binnen een tijdsinterval van 24 uur liggen. Bijkomend onderzoek is hier noodzakelijk. Zo zou de stabiliteit na 12 uur kunnen bepaald worden. Het verlies dat bij de andere componenten wordt gedetecteerd, wordt meestal gecompenseerd door de IS. De resulaten van de stabiliteit bij bewaring na 48 en 62 uur geven een verlies aan voor bijna alle componenten.

Tabel 4.12: Evaluatie stabiliteit na 24 u Stabiliteit na 24 u IV %

Low 90% CI

Amisulpride

97

56029-58093

46980-70470

91

177826-202362

166817-250225

Aripiprazol

97

14971-16357

12983-19475

81

68643-80050

100

104664-112488

86493-129740

91

Clozapine

91

14134-17226

13715-20572

Droperidol

100

31221-32178

Component

Bromperidol

Flupentixol

High 90% CI

QC 80% - 120%

99

803484-854379

672343-1008514

73687-110531

96

577645-723315

540682-811023

137500-174972

136668-205003

98

554331-606660

475329-712993

65

54695-84895

85700-128551

99

527565-604709

458758-688137

25329-37993

79

126862-152336

140574-210861

95

1125247-1217379

984623-1476935

QC 80% - 120% IV %

Medium 90% CI QC 80% - 120% IV %

81

855-1223

1022-1533

71

5068-8173

7418-11127

91

38689-82458

53502-80253

Desmethylclozapine

106

33847-35535

26232-39348

91

146107-171531

139520-209281

98

1492934-1634590

1276981-1915472

Desmethylolanzapine

107

2820-2918

2152-3228

90

15099-19002

15235-22852

99

210284-228967

176910-265365

97

496-1143

677-1015

92

3894-4507

3658-5486

101

29187-31640

24155-36233

Prothipendyl

108

8459-9042

6480-9721

91

39265-47627

38045-57067

103

423154-462273

344953-517430

Levomepromazine

105

2270-2433

1791-2686

86

11043-13356

11320-16980

98

158051-169655

133943-200914

7-OH-quetiapine

102

28046-29282

22466-33699

87

130283-159831

133319-199978

100

1108299-1177327

917867-1376800

9-OH-risperidon

102

40553-42562

32436-48655

89

172962-203396

170014-255022

100

1494609-1616019

1239690-1859536

Olanzapine

106

5707-6081

4457-6686

90

29516-36377

29149-43723

101

397112-426460

324699-487048

Pimpamperon

101

150734-160406

123804-185706

92

560007-632624

517540-776310

97

2450212-2580395

2066677-3100015

Quetiapine

105

8905-9263

6922-10383

89

37603-43876

36480-54720

101

424925-469577

355115-532673

Risperidon

106

3522-3742

2729-4094

89

14701-17323

14471-21707

102

173899-189361

142064-213097

Sertindol

79

957-1295

1144-1716

73

6272-10258

9061-13591

93

74279-139545

91509-137264

Sulpiride

108

11476-12194

8756-13135

94

53479-63935

50145-75218

102

603793-649277

489991-734987

Tiapride

100

71312-74137

57954-86932

92

237740-263603

217229-325844

98

979959-1033857

818002-1227003

94

500-708

517-775

80

3027-4306

3657-5486

100

18593-37870

22689-34033

Medium 90% CI QC 80% - 120% IV %

High 90% CI

QC 80% - 120%

Haloperidol

Zuclopentixol

Tabel 4.13: Evaluatie stabiliteit IS na 24u IV %

Low 90% CI

94

648482-698116

574210-861314

84

688115-759529

688490-1032735

96

606967-730913

557894-836842

99

189280-202004

158025-237038

89

201278-236125

197112-295667

98

185963-197126

156402-234603

83

38400-41276

38592-57888

69

38584-48846

50542-75813

99

53944-58453

45306-67960

102

358002-377125

288405-432607

88

355445-421431

354394-531592

98

385318-409862

323664-485496 340202-510302

Component Aripiprazol-d8 Desmethylolanzapine-d8 Haloperidol-d4 Quetiapine-d8 Clozapine-d4 Risperidon-d4 9-OH-risperidon-d4

QC 80% - 120% IV %

98

508703-525254

421050-631574

91

474290-529022

442324-663486

98

404639-426459

104

31155-32864

24521-36782

89

32111-38376

31750-47625

102

45758-49888

37516-56274

103

551565-571171

435664-653496

89

545593-633875

532010-798015

100

544172-578888

450421-675632

49

5. CONCLUSIE EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN Een UHPLC-MS/MS methode werd ontwikkeld voor de simultane bepaling van antipsychotica

en

enkele

actieve

metabolieten.

Hierbij

werd

een

SPE

met

kationuitwisselingsmechanisme gebruikt.

Een

kwantitatieve

methode

werd

met

succes

ontwikkeld

voor

droperidol,

desmethylclozapine, haloperidol, quetiapine, 7-OH-quetiapine, olanzapine, risperidon en 9OH-risperidon. Deze methode is enkel bruikbaar wanneer wordt gewerkt met citraatplasma, aangezien een hoog matrix effect werd waargenomen bij natriumfluorideplasma.

De resultaten van de methodevalidatie geven aan dat verder onderzoek noodzakelijk is voor de overige antipsychotica. Zo wordt een gebrek aan accuraatheid (bias > 15 %, voor LOQ

>

20

%)

waargenomen

bij

amisulpride,

aripiprazol,

bromperidol

en

desmethylolanzapine. Dit kan worden veroorzaakt door het matrix effect. Mogelijke opties om het matrix effect onder controle te krijgen zijn de aanpassing van de staalvoorbereiding, het gebruik van een meer geschikte interne standaard en de herevalutie van de chromatografische parameters. Imprecisie (RSD > 15 %, voor LOQ > 20 %) werd gedetecteerd bij amisulpride, bromperidol, flupentixol, levomepromazine, pimpamperon, prothipendyl, sertindol, sulpiride, tiapride en zuclopentixol. Deze imprecisie kan veroorzaakt worden door een gebrek aan reproduceerbaarheid van zowel de extractie efficiëntie als het matrix effect (RSD > 20 %) en door de stabiliteitsproblemen die werden waargenomen bij bewaring na 24 uur onder autosampler condities. Het is hierbij aan te raden om ook de stabiliteit te evalueren na 12 uur onder autosampler condities. Daarnaast werden ook problemen met de gevoeligheid waargenomen bij amisulpride en bromperidol. Een herevaluatie van het lineair bereik lijkt hier noodzakelijk. Hierdoor zal het kalibratiemodel, de accuraatheid en de precisie ook moeten geherevalueerd worden. Een carry-over effect werd waargenomen bij flupentixol. Een aanpassing van de wasstappen is dus vereist.

50

6. LITERATUURLIJST [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8]

[9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]

[16] [17] [18] [19] [20]

[21] [22]

[23] [24] [25]

Tanghe A, de Keyser H. Schizofrenie en andere psychosen. vol 9. Apeldoorn. Garant Uitgevers nv. 2000. Kabela M. Psychosen en schizofrenie: theorie en behandeling. Swets & Zeitlinger. 2003. http://www.who.int/mental_health/management/schizophrenia/en/ (02-03-2014) Sweetman S C. Martindale The Complete Drug Reference. Thirty-sixth edition. Pharmaceutical Press. 2009. Denys D, de Haan L. 25 Years Antipsychotics: Back To the Future. Tijdschr. Psychiatr. 2008, vol. 50: pp. 105–109. Morrissette D A, Stahl M S. Treatment of schizophrenia Affective symptoms in schizophrenia. Drug Discov. Today Ther. Strateg. 2011, vol. 8 (1–2): pp. 3–9. Kahn R S, Westenberg H G M. Dopamine en serotonine bij schizofrenie. Tijdschrift voor psychiatrie 1994, no. 10. Patteer L, Morrens M, Maudens K E, Niemegeers P, Sabbe B, Neels H. Therapeutic drug monitoring of common antipsychotics. Lippincott Williams & Wilkins 2012, vol. 34 (6): pp. 629–51. http://www.tiaft.org/node/36. (14-02-2014). http://www.farmamozaiek.be/farmamozaiek/. (03-03-2014) https://www.ebi.ac.uk/chembl/drugstore. (17-03-2014) http://www.drugbank.ca/drugs. (17-03-2014) Su Hyun J, So Young L. Response of i(kr) and HERG currents to the antipsychotics tiapride and sulpiride. Korean J. Physiol. Pharmacol 2010, vol. 14 (5): pp. 305–310. Davis C. Droperidol. Elsevier Inc 2007, no. 1: pp. 1-6. Weiner I, Gaisler I, Schiller D, Green A, Zuckerman L, Joel D. Screening of antipsychotic drugs in animal models. Drug Dev. Res. 2000, vol. 50 ( 3–4): pp. 235– 249. Akam E, Strange P G. Inverse agonist properties of atypical antipsychotic drugs. Biochem. Pharmacol 2004, vol. 67 (11): pp. 2039–2045. http://www.bcfi.be/GGR/MPG/MPG_JB.cfm. (05-04-2014) Minss A B, Clark R F. Toxicology and overdose of atypical antipsychotics. J. Emerg. Med 2012, vol. 43 (5): pp. 906–913. Van den Bosch R J, Louwerens J W, Slooff C J. Behandelingsstrategieën bij schizofrenie. Bohn Stafleu Van Loghum. 1999. pp. 20-98. Miyamoto S, Duncan G E, Marx C E, Lieberman J a.Treatments for schizophrenia: a critical review of pharmacology and mechanisms of action of antipsychotic drugs. Mol. Psychiatry 2005, vol. 10 (1): pp. 79–104. Hjerde E, Dahl S G, Sylte I. Atypical and typical antipsychotic drug interactions with the dopamine D2 receptor. Eur. J. Med. Chem. 2005, vol. 40 (2): pp. 185–194. Angelo H R, Petersen A. Therapeutic drug monitoring of haloperidol, perphenazine, and zuclopenthixol in serum by a fully automated sequential solid phase extraction followed by high-performance liquid chromatography. Ther. Drug Monit. 2001, vol. 23 (2): pp. 157–162. Dhal M L. Cytochrome p450 phenotyping/genotyping in patients receiving antipsychotics: useful aid to prescribing? Clin Pharmacokinet 2002; 41 (7): 453-470. Saar E, Beyer J, Gerostamoulos D, Drummer O H. The analysis of antipsychotic drugs in human matrices using LC-MS(/MS). Drug Test. Anal. 2012, vol. 4 (6): pp. 376–394. Wille S M R, Lambert W E E. Recent developments in extraction procedures relevant to analytical toxicology. Anal. Bioanal. Chem. 2007, vol. 388 (7): pp. 1381–1391. 51

[26] Spark holland.SPE WORKBOOK: the basics of sample preparation efficiency. pp. 5– 31. [27] Polson C, Sarkar P, Incledon B, Raguvaran V, Grant R. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003, vol. 785 (2): pp. 263–275. [28] Souverain S, Rudaz S. Veuthey J-L. Protein precipitation for the analysis of a drug cocktail in plasma by LC-ESI-MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, vol. 35 (4): pp. 913– 920. [29] Zhang G, Jr A V T, Barlett M G. Bioanalytical methods for the determination of antipsychotic drugs. Biomed. Chromatogr 2008, vol. 687, pp. 671–687 [30] Kole P L, Venkatesh G, Kotecha J, Sheslala R. Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods. Biomed. Chromatogr. 2011, vol. 25 (1– 2): pp. 199–217. [31] Mcdowall R D. Review sample preparation for biomedical. Journal of Chromatography 1989, vol 492: pp. 3-58. [32] Biziuk M. Solid Phase Extraction Technique – Trends , Opportunities and Applications. Polish J. of Environ. Stud. 2006, Vol. 15 (5): pp. 677-690. [33] http://www.abacus-lab.com/analitycal-chemistry/extraction/solid-phase-extraction(spe)/. (12-03-2014) [34] Swartz M E. Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC): An Introduction. Waters Corporation 2005, pp. 8–14. [35] http://www.waters.com/waters/en_NL/Solvents-and-Caveats-for-LC MS/nav.htm?cid=10091173&locale=en_NL (22-03-2014) [36] Snyder L R, Kirkland J J, Dolan J W. Introduction to Modern Liquid Chromatography Introduction to Modern Liquid Chromatography. Third Edition. John wiley and sons. 2010. [37] Joseph P D, Arsenault C, McDonald P D. Wiley: Beginners Guide to Liquid Chromatography. Waters Corporation. 2009. [38] Ho C S, Lam C W K, Chan M H M, Cheung R C K, Law L K, Lit L C W, Ng K F, Suen M W M, Tai H L. Electrospray ionisation mass spectrometry: principles and clinical applications. Clin. Biochem. Rev. 2003, vol. 24 (1): pp. 3–12. [39] Chen H-W, Hu B, Zhang X. Principle and Application of Ambient Mass Spectrometry for Direct Analysis of Complex Samples. Chinese J. Anal. Chem. 2010, vol. 38 (8): pp. 1069–1088. [40] Gross J H. Mass Spectrometry: A Textbook. 1st ed. Springer. 2004. chapter 1. [41] Balogh M P. The Mass Spectrometry Primer. Waters Corporation. 2009. [42] Cech N B, Enke C G. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals. Wiley Periodicals, Inc. 2002, 20: pp. 362–387 [43] Gaskell S J. Special feature: Electrospray : Principles and Practice. Journal of mass spectrometry 1997, vol. 32 (April): pp. 677–688. [44] Watson J T, Sparkman O D. Introduction to Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation. John Wiley & Sons. 2007. [45] http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=kwbgcDsHqnOxmOlIEcCpBgFlFyB &subNav=oibelDsHqnOxmOlIEcCvBG. (20-03-2014). [46] http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcms8030/8030-8.html. (20-03-2014). [47] Matuszewski B K, Constanzer M L, Chavez-Eng C M. Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MS. Analystical chemistry 2003, 75 (13):3019-3030

52

[48] Peter F T, Maurer H H. Bioanalytical method validation and its implications for forensic and clinical toxicology - A review. Accredit. Qual. Assur. 2002, vol. 7 (11): pp. 441–449. [49] Peters F T, Drummer O H, Musshoff F. Validation of new methods. Forensic Sci. Int. 2007, vol. 165 (2–3): pp. 216–224. [50] Wille S M R, Peters F T, Fazio V, Samyn N. Practical aspects concerning validation and quality control for forensic and clinical bioanalytical quantitative methods. Accredit. Qual. Assur. 2011, vol 16 (6): pp.279-292. [51] Sauvage F -L, Gaulier J -M, Lachâtre G, Marquet P. Pitfalls and prevention strategies for liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the selected reactionmonitoring mode for drug analysis. Clin. Chem.2008, vol. 54 (9): pp. 1519–1527. [52] Remane D. Meyer M R, Wissenbach D K, Maurer H H. Ion suppression and enhancement effects of co-eluting analytes in multi-analyte approaches: systematic investigation using ultra-high-performance liquid chromatography/mass spectrometry with atmospheric-pressure chemical ionization or electrospray ionizat. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2010, vol. 24 (21): pp. 3103–3108.

53

BIJLAGE FRANCQUI LECTURES 2014 PAST, PRESENT AND FUTURE OF THE PHARMACEUTICAL SCIENCES PROF. DR. DAAN J. A. CROMMELIN IMPACT OF THE PHARMACEUTICAL SCIENCES OVER THE PAST 50 YEARS AND … QUA VADIS? Met deze eerste lezing wou professor D. Crommelin aantonen wat er de afgelopen 50 jaar is veranderd. Daarnaast wou hij de bijdrage van de farmaceutische wetenschappers en de impact op de gezondheidszorg benadrukken. Er kan besloten worden dat er veel is veranderd, voornamelijk in de jaren 70 en 80. Zo konden we 50 jaar geleden nog niet spreken van bloeddrukverlagende geneesmiddelen, antidepressiva, geneesmiddelen voor de behandeling van parkinson,…

Een groep van wetenschappers werd aangesteld om een rapport te schrijven over deze evolutie. De evaluatie werd onderverdeeld in 6 domeinen. Elk onderdeel droeg zijn steentje bij tot de evolutie die de geneesmiddelen hebben ondergaan. Professor D. Crommelin gaat met ons wat dieper in op de formulatie van de geneesmiddelen. Hij begon zijn betoog met “Patients don’t take drugs, they take dosage forms containing them”. Gedurende jaren zijn veel nieuwe toepassingen ontstaan, zoals de droge poeder inhalator en de insuline pomp. Daarnaast beschikt men ook over meer informatie. Men had vroeger geen idee over de mate waarin geneesmiddelen werden opgenomen, dit is nu ondenkbaar. Op het einde van de lezing wees hij ons ook op het verschil in ontwikkelingsduur. Er werd een mooie vergelijking gemaakt met een ladder. Vooraleer iets op de markt wordt gebracht, moet worden aangetoond dat het veilig is. Dit houdt de innovatie tegen, geneesmiddelen zullen nooit volledig veilig zijn. Een ladder zou dezer dagen nooit worden goedgekeurd. Dit zou ook het geval zijn met aspirine.

BIOTECH TAKES OVER AND WE BETTER BE PREPARED. GENERIC PARADIGM REVISITED: BIOSIMILARS AND NON-BIOLOGICAL-COMPLEX DRUGS In deze lezing wordt de toenemende populariteit van de biologicals besproken. Zo zijn 7 van de 10 best verkopende geneesmiddelen biologicals. Deze geneesmiddelen beschikken over veel voordelen, maar in deze lezing wordt voornamelijk gesproken over de nadelen. Naast de hoge kostprijs en de lage stabiliteit behoort ook de volledige karakterisatie van de proteïnen tot de vele nadelen. Het grootste probleem is waarschijnlijk de immunogeniciteit.

Biosimilars worden geïnjecteerd. Dit zorgt ook voor de nodige problemen, maar er zijn reeds alternatieve methodes op de markt. Zo behoort de toediening via pulmonaire weg tot de mogelijke opties. Dit werd uitgetest met insuline, maar dit bleek geen succes (lage biologische beschikbaarheid = ± 10 %). Andere mogelijkheden zijn de toediening via Jet penetratie of subcutane toediening. Ook hier werden weer veel nadelen waargenomen wanneer een vergelijking werd gemaakt met de klassieke injectie. Een ander punt dat werd aangekaart is de rol van proefdieren. Biologicals zijn species specifiek. Vandaar dat het vaak voorkomt dat dierenproeven mooie resultaten beloven, terwijl dit niet het geval is bij mensen. Het gebruik van proefdieren moet hier zeker opnieuw geëvalueerd worden.

SCENARIOS FOR THE FUTURE OF THE PHARMACEUTICAL SCIENCES AND IMPLICATIONS

INNOVATION

STRATEGIES

AND

PUBLIC

PRIVATE

PARTNERSHIPS (PPPs). THE CHANGING ROLE OF THE PHARMACIST IN AN INTERNATIONAL PERSPECTIVE (FIP)

In deze derde lezing werd gesproken over de farmaceutische industrie en hoe de toekomst er zal uit zien. Zo moeten de farmaceutische bedrijven er rekening mee houden dat er constant nood is aan verandering. Hiervoor is veel geld nodig, maar ook een goede samenwerking tussen de overheid en private ondernemingen is cruciaal (PPPs).

De rol van de apotheek zal in de toekomst meer de nadruk leggen op zorgverlening, het business element wordt kleiner. Andere goede ideeën voor de toekomst zijn de aanmaak van een databank, dit kan misbruik van geneesmiddelen tegengaan. Ook moeten de mensen meer bewust worden gemaakt over het feit dat geneesmiddelen toxisch zijn en dus verstandig moeten gebruikt worden. Een zekerheid voor de toekomst is de personalisatie van de therapie. Geneesmiddelen zullen meer op kleine schaal worden aangemaakt, gericht op een specifieke groep van patiënten.