MS

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bio-Analyse Academiejaar 2008-2009

METHODEONTWIKKELING VOOR DE BEPALING VAN LSD IN URINE MET BEHULP VAN LC-MS/MS

EXPERIMENTEEL ONDERZOEK

Ruben DE WAELE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor Prof. Dr. Apr. W. Lambert

Commissarissen Dr. Apr. J. Cordonnier Dr. Apr. C. Stove

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bio-Analyse Academiejaar 2008-2009

METHODEONTWIKKELING VOOR DE BEPALING VAN LSD IN URINE MET BEHULP VAN LC-MS/MS

EXPERIMENTEEL ONDERZOEK

Ruben DE WAELE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor Prof. Dr. Apr. W. Lambert

Commissarissen Dr. Apr. J. Cordonnier Dr. Apr. C. Stove

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor het persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

2 juni 2009

De promotor

De auteur

Prof. Dr. Apr. W. Lambert

Ruben De Waele

Allereerst wil ik Prof. Dr. Apr. W. Lambert en Dr. Apr. J. Cordonnier bedanken om mij de kans te bieden deze thesis uit te voeren in het laboratorium Chemiphar te Brugge.

Dr. Apr. J. Cordonnier, directeur van Chemiphar, wens ik hierbij nog eens te bedanken voor het opvolgen en regelmatig nalezen van het uitgevoerde werk.

Een speciaal woord van dank voor Apr. V. Coopman, voor het uitstekend begeleiden van het onderzoek en het helpen verwerken van de resultaten.

Verder wil ik ook Ir. S. Van Quekelberghe bedanken voor de technische hulp bij het gebruik van de LC-MS/MS, alsook het verwerken van de resultaten.

Tenslotte wens ik Dr. Apr. C. Stove te bedanken, voor het nalezen van de thesis en het aanbrengen van opmerkingen.

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING ......................................................................................................................1 1.1. LSD .............................................................................................................................1 1.1.1. De ontdekking van LSD ......................................................................................1 1.1.2. Het werkingsmechanisme en de metabolisatie van LSD....................................2 1.1.3. Het effectenpatroon van LSD .............................................................................4 1.1.4. Medische toepassingen voor LSD .......................................................................5 1.1.5. De toxiciteit, afhankelijkheid en tolerantie bij LSD gebruik.............................5 1.1.6. De gebruiksvormen .............................................................................................6 1.2. DE SCREENING VAN LSD IN URINE .....................................................................7 1.2.1. Historiek ..............................................................................................................7 1.2.2. Competitieve Enzyme linked immunosorbent assay..........................................8 1.3. BEVESTIGINGSTECHNIEKEN ................................................................................9 1.3.1. Historiek ..............................................................................................................9 1.3.2. Beknopte beschrijving van de werking van een LC-MS/MS.............................9 2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................12 3. REAGENTIA EN MATERIALEN ................................................................................14 3.1. STANDAARDEN EN REAGENTIA ........................................................................14 3.2. ANALYTISCHE KOLOMMEN EN APPARATUUR ...............................................14 4. METHODEONTWIKKELING EN VALIDATIE........................................................15 4.1. LC-MS/MS TOESTEL ..............................................................................................15 4.1.1. Algemene instellingen........................................................................................15 4.1.2. Kiezen van transities LSD, LSD-D3 en 2-oxo-3-OH-LSD ................................15 4.1.2.1. Werkwijze ....................................................................................................15 4.1.2.2. Resultaten.....................................................................................................16 4.1.3. Keuze van de kolom, mobiele fase en gradiënt.................................................17 4.1.3.1. Eerste chromatografische methode ...............................................................17 4.1.3.2. Tweede chromatografische methode.............................................................19 4.2. VALIDATIE VAN EERSTE CHROMATOGRAFISCHE METHODE .....................22 4.2.1. Lineariteit ..........................................................................................................22 4.2.1.1. Werkwijze ....................................................................................................22 4.2.1.2. Resultaten.....................................................................................................22

4.2.2. Uittesten verschillende extracties......................................................................23 4.2.2.1. De uitgevoerde extractieprocedures ..............................................................23 4.2.2.2. Werkwijze ....................................................................................................24 4.2.2.3. Resultaten.....................................................................................................24 4.2.3. Nagaan van de ionsuppressie bij de verschillende extracties ..........................26 4.2.3.1. Werkwijze ....................................................................................................26 4.2.3.2. Resultaten.....................................................................................................27 4.3. VALIDATIE VAN TWEEDE CHROMATOGRAFISCHE METHODE ...................31 4.3.1. Lineariteit ..........................................................................................................31 4.3.1.1. Werkwijze ....................................................................................................31 4.3.1.2. Resultaten.....................................................................................................31 4.3.2. Controle van de ionsuppressie ..........................................................................32 4.3.2.1. Werkwijze ....................................................................................................32 4.3.2.2. Resultaten.....................................................................................................32 4.3.3. Onderzoeken van de lineariteit van de ijklijn in blanco-urine ........................34 4.3.3.1. Werkwijze ....................................................................................................34 4.3.3.2. Resultaten.....................................................................................................34 4.3.4. Herhaalbaarheid en intermediaire precisie van het extractierendement........35 4.3.4.1. Werkwijze ....................................................................................................36 4.3.4.2. Resultaten herhaalbaarheid extractierendement.............................................36 4.3.4.3. Resultaten intermediaire precisie extractierendement....................................36 4.3.5. Selectiviteit van de ontwikkelde methode.........................................................38 4.3.5.1. Werkwijze ....................................................................................................39 4.3.5.2. Resultaten.....................................................................................................39 4.3.6. Herhaalbaarheid en accuraatheid voor LSD ...................................................40 4.3.6.1. Werkwijze ....................................................................................................41 4.3.6.2. Resultaten.....................................................................................................41 4.3.7. Intermediaire precisie en accuraatheid voor LSD + opstellen Shewart kaart 42 4.3.7.1. Werkwijze ....................................................................................................42 4.3.7.2. Resultaten.....................................................................................................42 4.3.7.3. Opstellen Shewart controlekaart ...................................................................43 4.3.7.4. Meetonzekerheid op de bekomen resultaten..................................................43 4.3.8. Berekening CCα, CCβ, detectielimiet (LoD) en kwantificatielimiet (LoQ)......45 4.3.8.1. Werkwijze ....................................................................................................45

4.3.8.2. Resultaten.....................................................................................................46 5. TOEPASSING VAN DE METHODE OP RINGTESTEN ...........................................47 5.1. PROCEDURE ...........................................................................................................47 5.2. RESULTATEN VAN DE ANALYSE .......................................................................48 6. BESLUIT ........................................................................................................................50 7. LITERATUURLIJST.....................................................................................................52

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN LSD: N,N-diethyl-lysergzuuramide 5-HT: 5-hydroxy-tryptamine; serotonine LAE: N-ethyl-lysergzuuramide LEO: N-(2-hydroxyethyl)-N-ethyl-lysergzuuramide 2-oxo-LSD: 2-oxo-N,N-diethyl-lysergzuuramide 2-oxo-3-OH-LSD: 2-oxo-3-hydroxy-N,N-diethyl-lysergzuuramide ASC: Altered states of consciousness RIA: Radioimmunoassay CEDIA: Cloned enzyme donor immunoassay EMIT: Enzyme-multiplied immunoassay ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay TMB: Tetramethylbenzidine GC-MS: Gaschromatografie-massaspectrometrie LC-MS/MS: Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie HPLC: Hogedrukvloeistofchromatografie RP: Reversed phase API: Atmospheric pressure ionisatie ESI: Electrospray ionisatie m/z waarde: massa/lading verhouding CID: Collision-induced dissociation MRM: Multiple reaction monitoring IS: Interne standaard Mr: Relatieve molecuulmassa LoD: Detectielimiet LoQ: Kwantificatielimiet

1. INLEIDING 1.1. LSD 1.1.1. De ontdekking van LSD

Alles begon toen Sandoz AG Pharmaceutical Company (Bazel, Zwitserland) in 1917 startte met het onderzoeken van de ergotalkaloïden. Deze stoffen komen voor in ergot of moederkoren. Ergot is het sclerotium van de Claviceps purpurea, een schimmel die behoort tot de Zakjeszwammen (Ascomyceten) en die parasiteert op rogge en andere graangewassen (figuur 1.1). Consumptie van dit geïnfecteerde graan kan leiden tot ergotisme of antoniusvuur, wat gepaard gaat met convulsies en/of gangreen (vaak met dodelijke afloop). Dit is te wijten aan het feit dat er in ergot naast farmaceutisch nuttige componenten ook mycotoxines voorkomen (Röst, 1992).

FIGUUR 1.1.: ERGOT OF MOEDERKOREN OP ROGGE (http://www.ipm.uiuc.edu/bulletin/photos/barley_ergot.jpg) Het eerste ergotalkaloïde, dat in 1918 geïsoleerd werd uit moederkoren, was ergotamine (figuur 1.2A). Onmiddellijk vond het zijn farmaceutisch nut als middel bij postpartum bloedingen en migraine. Vanaf dan was het wachten tot W. A. Jacobs en L. C. Craig erin slaagden om de gemeenschappelijke kern van alle ergotalkaloïden te karakteriseren. Deze kern kreeg de naam lysergzuur (figuur 1.2B), wat een nogal onstabiele component bleek te zijn. Naar analogie met ergometrine, een minder complex ergotalkaloïde waarbij de amidebinding gevormd is tussen lysergzuur en 2-aminopropanol, slaagde Albert Hofmann (1906-2008) erin lysergzuuramides te synthetiseren met gebruik van eenvoudige amines. Met behulp van 2-aminobutanol verkreeg hij methylergometrine, een oxytocicum, en met diethylamine in 1938 het N,N-diethyl-lysergzuuramide (LSD) (figuur 1.2C).

1/57

(A)

(B)

(C)

FIGUUR 1.2.: (A) STRUCTUUR ERGOTAMINE (B) STRUCTUUR LYSERGZUUR (C) STRUCTUUR LSD http://www.medicinescomplete.com/mc/martindale/2007/images/CLK0643C001.gif http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/80/Lysergic_acid_chemical_structure.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/af/LSD-2D,_3D.png Het oorspronkelijke doel van Hofmann was het synthetiseren van een analepticum, maar gedurende de farmacologische testen bleek LSD op de proefdieren weinig interessante effecten uit te oefenen. Verdere testen werden daarom stopgezet en het duurde tot 16 april 1943 alvorens de psychische effecten voor het eerst werden waargenomen. Dit gebeurde toen Hofmann LSD uitkristalliseerde onder vorm van een tartraat en onbewust LSD innam (Hofmann, 1980). Het zijn deze effecten die van LSD hedendaags een drug maken, tot grote spijt van Hofmann (Fusar-Poli & Borgwardt, 2008).

1.1.2. Het werkingsmechanisme en de metabolisatie van LSD

LSD werd ongeveer tegelijkertijd ontdekt met de neurotransmitter serotonine (5-HT). Aangezien de 2 structuren een indolring gemeenschappelijk hebben (figuur 1.3) vermoedde men dat het psychisch effect van LSD te maken had met 5-HT in de hersenen (Barondes, 1996). Vandaag de dag wordt aangenomen dat LSD zijn belangrijkste psychische effecten uitoefent door op te treden als een agonist van de 5-HT2A receptoren in de frontale cortex van de hersenen (Ebersole et al., 2003; Aghajanian & Marek, 1999).

FIGUUR 1.3.: STRUCTUUR SEROTONINE (http://www.pathofysiologie.nl/images/010.JPG)

2/57

In het menselijk lichaam wordt LSD zeer sterk gemetaboliseerd. Slechts ongeveer 1 % komt onveranderd in de urine terecht. Gezien de korte plasmahalfwaardetijd (3 uur), gebeurt de metabolisatie en excretie ook heel vlug (Upshall & Wailling, 1972). Dit alles heeft tot gevolg dat na orale inname van een normale dosis LSD (30-300 µg), de urineconcentratie na enkele uren lager is dan 1 ng/ml, wat natuurlijk niet bevorderlijk is voor de detectie en kwantificatie van LSD (Van Bocxlaer et al., 2000).

FIGUUR 1.4.: DE METABOLIETEN VAN LSD (Canezin et al., 2001)

De metabolieten die kunnen aangetroffen worden in de urine zijn nor-LSD, N-ethyllysergzuuramide

(LAE),

2-oxo-N,-N-diethyl-lysergzuuramide

(2-oxo-LSD),

N-(2-

hydroxyethyl)-N-ethyl-lysergzuuramide (LEO), 13-of 14-hydroxy-LSD onder de vorm van glucuroniden en 2-oxo-3-hydroxy-N,N-diethyl-lysergzuuramide (2-oxo-3-OH-LSD) (Canezin et al., 2001) (zie figuur 1.4.). Deze laatste metaboliet, die niet gedetecteerd kan worden in plasma, is de belangrijkste en komt in de urine voor in een 16 tot 43 maal hogere concentratie dan LSD (Klette et al., 2000). Bovendien kan 2-oxo-3-OH-LSD ook langer gedetecteerd worden dan LSD, wat dan weer een voordeel is bij de analyse (Reuschel et al., 1999a).

3/57

1.1.3. Het effectenpatroon van LSD

LSD behoort samen met ecstacy (methyleendioxymethamfetamine of MDMA) en cannabis tot de meest gebruikte hallucinogenen. Deze klasse van drugs noemt men naast hallucinogenen ook wel psychedelica, psychotomimetica of phantastica (Lewin, 1964). Dergelijke namen geven al een goede indicatie van de te verwachten effecten.

Het effect van hallucinogenen zoals LSD is in tegenstelling tot andere centraal werkende drugs sterk afhankelijk van de verwachtingen van de gebruiker (“set”) alsook van de omgeving (“setting”) (Nichols, 2004). Dr. Stanislov Grof formuleerde het als volgt: “I consider LSD to be a powerful unspecific amplifier or catalyst of biochemical and physiological processes in the brain”(Grof, 1975). Het is deze onvoorspelbaarheid in effect die klinisch onderzoek naar LSD zo moeilijk maakt.

Na inname van een typische dosis LSD (30-300 µg) treden er snel effecten op die te wijten zijn aan de verstoring van het evenwicht tussen de ortho- en parasympathische systemen (pupilverwijding, tachycardie, misselijkheid,…). De psychische effecten treden reeds op na 30 tot 60 minuten, en leiden tot hallucinaties die ongeveer 6 tot 12 uur aanhouden (Dierick et al., 2003). Nadien zijn er geen blijvende negatieve effecten beschreven (Strassman, 1984; Halpern & Pope, 1999).

Naast deze “gewenste” effecten, kunnen er ook enkele minder aangename ervaringen plaatsvinden. De eerste mogelijkheid is het optreden van flashbacks, waarbij bepaalde effecten van de drug in een “nuchtere” toestand worden herbeleefd. Dit werd onderzocht door Halpern & Pope (2003a) en zij kwamen tot de conclusie dat de incidentie hiervoor laag is, maar dat er geen behandeling voor bestaat. Een dergelijke flashback kan tot maanden na inname van LSD optreden en staat totaal niet in relatie met de frequentie van gebruik.

Een tweede mogelijkheid is het optreden van een bad trip. Hierbij krijgt de gebruiker angstaanvallen en wordt hij extreem paranoïde. Veelal ligt de oorzaak bij de ongunstige “set” of “setting” waarin de persoon LSD nam. Een dergelijke intoxicatie kan men behandelen met benzodiazepines of antipsychotica (Shiloh et al., 1999). Het is echter belangrijk om het slachtoffer gerust te stellen en te ondersteunen, aangezien de angstaanvallen zouden kunnen leiden tot zelfmoordpogingen. 4/57

1.1.4. Medische toepassingen voor LSD

Na de ontdekking van deze psychische effecten, werden door Sandoz onmiddellijk verschillende studies opgezet bij dieren en mensen. Dit leidde tot de ontwikkeling van het geneesmiddel Delysid, dat gebruikt werd bij neurologisch onderzoek en in de psychiatrie (Passie, 1997). Ondanks het feit dat het gebruik van LSD in deze domeinen van de geneeskunde zeer veilig en succesvol bleek, werd er sinds 1970 geen legaal onderzoek meer uitgevoerd naar de effecten van LSD (Passie, 2008). Dit kent zijn oorzaak in de opkomst van LSD als drug sinds de jaren ‘60, waardoor LSD in de illegaliteit belandde. Een belangrijke trendsetter voor dit recreationele LSD gebruik was Dr. Timothy Leary van de Harvard universiteit (Hofmann, 1980).

Vandaag de dag groeit opnieuw de interesse om LSD te gaan gebruiken als medisch hulpmiddel. Een mogelijke toepassing is de behandeling van clusterhoofdpijn (Sewell et al., 2006). De dosissen die men hiervoor zou gebruiken zijn natuurlijk subpsychedelisch. De effectiviteit van LSD is niet onlogisch aangezien bij de huidige behandeling van migraine ergotamine gebruikt wordt (bijvoorbeeld Cafergot®). Naast clusterhoofdpijn zou LSD kunnen aangewend worden bij de psychotherapeutische behandeling van terminale patiënten (Kurland, 1985; Winkelman & Roberts, 2007), bij alcohol- en drugsverslaving (Halpern, 2003b) en bij dwangstoornis (obsessive-compulsive disorder) (Brandrup

& Vanggaard,

1977). Vooraleer men LSD hiervoor zal kunnen aanwenden, moet er natuurlijk nog uitvoerig onderzoek plaatsvinden.

1.1.5. De toxiciteit, afhankelijkheid en tolerantie bij LSD gebruik

Intoxicaties zijn mogelijk vanaf een plasmaconcentratie die hoger is dan 1 µg/l (Moffat et al., 2004), wat dan onder meer kan leiden tot echte psychosen. Maar de veranderingen in het bewustzijn, die ook wel altered states of consciousness (ASC) genoemd worden, gaan niet gepaard met levensbedreigende veranderingen in de cardiovasculaire, renale of hepatische functies. Daardoor is LSD nog nooit de directe doodsoorzaak geweest bij een overlijden (Cohen, 1967; Jaffe, 1985). Dat neemt niet weg dat er geen (fatale) ongelukken kunnen gebeuren na inname van LSD. Bijvoorbeeld te lang in de zon staren met als gevolg irreversibele oogschade of uit een raam springen doordat men denkt te kunnen vliegen (Fuller, 1976; Reynolds & Jindrich, 1985). 5/57

Aangezien LSD de dopaminerge neurotransmissie in de hersenen niet beïnvloedt, brengt het geen fysieke afhankelijkheid met zich mee. Het is immers dopamine dat het euforisch effect veroorzaakt dat kenmerkend is voor de zeer verslavende drugs zoals bijvoorbeeld opiaten en cocaïne (O’Brien, 2001). Doordat het gebruik van LSD een zeer intensieve ervaring is, is het ook weinig waarschijnlijk dat men psychisch verslaafd zal geraken. Als gevolg hiervan treden er geen sterke abstinentieverschijnselen op.

Bij herhaaldelijk gebruik van LSD, ontwikkelt zich een snelle tolerantie voor de psychische effecten. Na ongeveer een week van abstinentie is deze echter opnieuw volledig verdwenen (Dierick et al., 2003). De oorzaak voor deze tolerantie is te vinden bij de desensitisatie en downregulatie van de 5-HT2A receptoren in de hersenen (Leysen et al., 1989).

1.1.6. De gebruiksvormen

Illegale LSD komt voor onder een aantal vormen, waarvan het blotter papier het meest gekend is (figuur 1.5.). Hierbij dompel je absorberend papier, onderverdeeld in vierkanten, onder in een oplossing van LSD. Het resultaat is dat elk vierkantje een dosis van de drug zal bevatten (meestal 30-150 µg).

FIGUUR 1.5.: BLOTTER PAPIER

Er bestaat een heel eenvoudige manier om na te gaan of er LSD aanwezig is op deze blotters. Hierbij maakt men gebruik van de fluorescerende eigenschappen van LSD. Een methanolextract van de blotter wordt op een filtreerpapier gebracht. Onder UV licht (360nm) treedt een blauwe fluorescentie op bij een positief resultaat. (Cole, 2003) (figuur 1.6.).

FIGUUR1.6.: FILTREERPAPIER MET METHANOL (LINKS) EN METHANOLEXTRACT VAN BLOTTERPAPIER (RECHTS) ONDER UV LICHT

6/57

1.2. DE SCREENING VAN LSD IN URINE

Voor de screening van LSD in urine wordt gebruik gemaakt van immunoassays. Dit zijn immunologische bepalingstechnieken die gebaseerd zijn op de interactie tussen een antigen en een antilichaam. Zij hebben als voordeel dat ze snel en relatief goedkoop zijn, maar bezitten niet de kwantitatieve mogelijkheden en de specificiteit van vloeistofchromatografiemassaspectrometrie (LC-MS) (Wu et al., 1997). Er bestaat bovendien een kans op valspositieve resultaten door het optreden van kruisreactiviteit (crossreactiviteit). Hierbij gaat het antilichaam een aspecifieke interactie aan (bijvoorbeeld met clenbuterol in geval van LSD) (Cody & Valtier, 1997).

1.2.1. Historiek

Tot voor enkele jaren werd voor deze screening de Radioimmunoassay (RIA) gebruikt. Deze wordt beschouwd als de meest gevoelige en specifieke van alle immunoassays. Het principe van deze bepaling is de competitie tussen het antigen (LSD), dat al dan niet aanwezig is in de urine, en zijn radioactief gemerkt equivalent (LSD-I125) voor binding aan een specifiek antilichaam. Na een incubatieperiode wordt de ongebonden fractie weggewassen en de radioactiviteit gemeten met behulp van een scintillatieteller. Het bekomen signaal is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid LSD in de urine.

Omwille van de negatieve elementen die verbonden zijn aan radioactiviteit (transport, radioactief afval, gevaar bij zwangere vrouwen,…) wordt deze techniek liever niet meer gebruikt. Deze kan vervangen worden door een Enzyme-multiplied immunoassay (EMIT) of door een Cloned enzyme donor immunoassay (CEDIA). Uit onderzoek is gebleken dat CEDIA betere precisie, accuraatheid en minder kruisreactiviteit vertoont dan EMIT (Wiegand et al., 2002). Naast EMIT en CEDIA bestaat er ook de Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Hiervan bestaan er 2 grote types: de sandwich ELISA en de competitieve ELISA. Het is deze laatste techniek die gebruikt wordt als screeningsmethode in het labo Chemiphar.

7/57

1.2.2. Competitieve Enzyme linked immunosorbent assay

Deze methode is gebaseerd op de competitie tussen LSD (de belangrijkste metaboliet heeft een lage crossreactiviteit) in het staal en het LSD-horseradish peroxidase conjugaat voor een beperkt aantal antilichamen. Hierbij vertrekken we van microtiterkuipjes die bedekt zijn met het geïmmobiliseerd antilichaam. In deze kuipjes wordt achtereenvolgens staal/controle en drug-enzym conjugaat toegevoegd. Dit mengsel wordt gedurende 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. Na deze incubatieperiode worden de kuipjes gewassen om ongebonden componenten te verwijderen. De aanwezigheid van het conjugaat kan vervolgens aangetoond worden door toevoeging van tetramethylbenzidine (TMB), een substraat voor het enzym. Na 30 minuten incuberen wordt de omzettingsreactie stopgezet door toevoeging van zuur. De resulterende kleur kan visueel worden waargenomen. Deze kleurintensiteit is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid LSD (of metaboliet) in het staal (zie figuur 1.7.).

(A)

(B)

(D)

(E)

(C)

(F)

FIGUUR 1.7.:COMPETITIEVE ELISA (A)MICROTITERKUIPJES BEDEKT MET ANTILICHAMEN (B)TOEVOEGEN STAAL/CONTROLE EN DRUG-ENZYM CONJUGAAT VERVOLGENS INCUBEREN BIJ KAMERTEMPERATUUR (C)WEGWASSEN ONGEBONDEN COMPONENTEN (D)DRUG/DRUG-ENZYMCONJUGAAT GEBONDEN OP ANTILICHAAM (E)TOEVOEGEN TMB SUBSTRAAT EN INCUBEREN (F)ABSORPTIE METEN BIJ 450NM (VISUEEL IS KLEURLOOS POSITIEF EN BLAUW NEGATIEF) (http://www.neogen.com/LifeSciences/images/ELISA_Generic.jpg) Elk urinestaal dat hierbij (zwak) positief test op de aanwezigheid van LSD (cut-off bedraagt 5 ng/ml), moet verder geanalyseerd worden door een techniek met een grotere specificiteit en gevoeligheid.

8/57

1.3. BEVESTIGINGSTECHNIEKEN 1.3.1. Historiek

Het grootste probleem bij de analyse van LSD in urine, is de lage concentratie en de beperkte tijdspanne waarin het opspoorbaar is. Om dit te kunnen oplossen zijn er 2 mogelijkheden: enerzijds een metaboliet identificeren die gedurende een langere tijd in een hogere concentratie wordt geëxcreteerd in de urine, anderzijds een analytische methode ontwikkelen die LSD kan detecteren en kwantificeren bij veel lagere concentraties. 2-oxo-3OH-LSD komt meestal in aanmerking als geschikte metaboliet (Reuschel et al., 1999b; Poch, 1999). De laatste decennia is er op beide vlakken grote vooruitgang geboekt (Reuschel et al., 1999a).

De analytische methoden waren tot voor een aantal jaar voornamelijk gebaseerd op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) (Paul et al., 1990; Nelson & Foltz, 1992). Deze techniek brengt echter een aantal problemen met zich mee aangezien LSD thermolabiel is (bij de GC temperaturen), weinig vluchtig is (zonder derivatisatie) en bovendien irreversibel adsorbeert aan de GC kolom (Van Bocxlaer et al., 2000). Om die redenen maakt men meer en meer gebruik van vloeistofchromatografie-(tandem) massaspectrometrie (LCMS(/MS)) (Sklerov et al., 2000; Canezin et al., 2001; Johansen & Jensen, 2005; Favretto et al., 2007).

1.3.2. Beknopte beschrijving van de werking van een LC-MS/MS

Bij deze analysetechniek is een staalvoorbereiding (vloeistof-vloeistof of solid-phase extractie van de urine nodig). Het verkregen extract wordt vervolgens geïnjecteerd op de HPLC-kolom. De chromatografische scheiding is gesteund op de interactie van de componenten met twee verschillende fasen (in dit geval een stationaire en een mobiele). Voor LSD wordt een reversed phase (RP) kolom gebruikt, waardoor de scheiding gebeurt door verschillen in interactie met de apolaire groepen op de kolom. Het gevolg is dat de meest polaire component altijd als eerste zal elueren. Bijgevolg zal 2-oxo-3-OH-LSD een kortere retentietijd hebben dan LSD.

9/57

Na elutie van de kolom, worden de componenten naar de massaspectrometer geleid. Hierbij moeten er eerst 2 zaken gebeuren: er moet overgegaan worden van de vloeibare fase naar hoogvacuüm én de componenten moeten geïoniseerd worden. Deze beide doelstellingen worden gerealiseerd door de zogenaamde atmospheric pressure ionisatie (API) technieken. Tot deze technieken behoort onder andere de hier gebruikte electrospray ionisatie (ESI) (figuur1.8.). Bij ESI wordt de vloeibare fase doorheen een metalen capillair gestuurd, waarbij aan de tip een spanning van 3-5 kV wordt aangelegd. Hierdoor wordt de vloeistof aan de tip omgezet tot een aërosol van sterk geladen druppeltjes. Rond het capillair wordt er een vernevelingsgas (meestal N2) aangebracht dat dit proces versterkt, maar dat voornamelijk tot doel heeft de spray te richten naar de massaspectrometer. Vervolgens worden deze druppeltjes verdampt dankzij droge en warme N2, waardoor de lading op de component terechtkomt. De aldus gevormde ionen treden de massaspectrometer binnen via de cone. Aangezien ESI een “zachte” ionisatietechniek is, treedt er weinig fragmentatie op en worden er voornamelijk moederionen gevormd. Door het aanleggen van een spanning op de cone, kan men reeds bij de interface een fragmentatie uitvoeren, wat nuttig is om structurele info te verkrijgen.

FIGUUR 1.8.: PRINCIPE VAN ELECTROSPRAY IONISATIE (http://www.astbury.leeds.ac.u k/facil/MStut/mstutorial.htm)

De gevormde ionen moeten vervolgens gescheiden worden op basis van hun massa/lading verhouding (m/z waarde). Hiervoor bestaan er heel wat massafilters, maar degene die meestal wordt gebruikt in de tandem MS is de triple-quadrupool (figuur 1.9.).

FIGUUR 1.9.: BASISOPBOUW VAN EEN TRIPLE-QUADRUPOOL (user’s guide Micromass)

10/57

Hierbij zijn MS1 en MS2 quadrupolen die bestaan uit een set van 4 parallelle en tegenover elkaar staande metalen staven. Op een dergelijke quadrupool worden 2 elektrische velden aangelegd (1 constant en 1 variërend) waardoor elke m/z waarde zijn bepaalde combinatie heeft om deze massafilter te passeren. Een quadrupool kan in een Single Ion Monitoring (SIM) mode gebruikt worden, waarbij de m/z waarde constant blijft in functie van de tijd; of in een scan mode, waarbij de m/z waarde varieert. Tussen de 2 quadrupolen bevindt zich de collision cel. Hier kan men de ionen laten botsen met atomen van een edelgas (meestal argon). Dit proces noemt men collision-induced dissociation (CID). Het resultaat van dergelijke CID is dat er een tweede fragmentatie van de ionen plaatsgrijpt.

Deze triple-quadrupool kan in een aantal vormen gebruikt worden: een dochterion scan (SIM-scan), een moederion scan (scan-SIM), een “neutral loss” scan (scan-scan met een vast verschil) en een multiple reaction monitoring (MRM). Het is in de MRM modus dat er hier zal gewerkt worden. Bij MRM worden de beide quadrupolen gelijktijdig gewijzigd in hun m/z waarde, waardoor er moeder/dochter transities worden bekomen.

De uiteindelijke detectie van de ionen gebeurt via een elektronen multiplier (figuur 1.10.). Wanneer de positieve (bij electrospray +) ionen de triple-quadrupool passeren, slaan ze in op een metalen oppervlak waarbij elektronen worden vrijgemaakt. Deze elektronen slaan op hun beurt terug in, waardoor het signaal telkens opnieuw wordt versterkt. Door het signaal te linken aan de spanning die er over de quadrupool staat, kan men het ion identificeren (Van Bocxlaer et al., 2000; Watson et al., 2008; Pitt, 2009).

FIGUUR 1.10.: PRINCIPE ELEKTRONEN MULTIPLIER (http://www.cee.vt.edu/ewr/environmental/teach/smprimer/icpms/horn.gif)

11/57

2. OBJECTIEVEN

Wanneer men wil achterhalen of een bepaald individu LSD heeft genomen, wordt door het laboratorium Chemiphar een screening uitgevoerd op urine via ELISA. Hierbij bestaat echter de kans op een vals positief of een vals negatief resultaat. Een vals positief resultaat kan men bekomen doordat de ELISA techniek een crossreactiviteit bezit tegenover een aantal componenten die mogelijks in de urine voorkomen, maar die weinig met LSD te maken hebben. Een voorbeeld hiervan is de screening van geputrefieerde lijken, waarbij de ELISA testen een positief resultaat kunnen geven. Een vals negatief resultaat is echter ook mogelijk. De gebruikte ELISA test heeft namelijk wel een crossreactiviteit voor enkele metabolieten van LSD (bijvoorbeeld 36 % voor nor-LSD), maar voor de belangrijkste metaboliet (2-oxo-3OH-LSD) is deze zeer laag (slechts 2.1 %). Het gevolg hiervan is dat LSD gebruik slechts een beperkte tijd na inname detecteerbaar zal zijn via deze screening. Bovendien is de ELISA screeningstest gevoelig voor een aantal vervalsingen zoals het verdunnen van de urine door gebruik van diuretica, of het toevoegen van adulteranten zoals zouten (natriumchloride, natriumhypochloriet) aan de urine. Als gevolg van deze vervalsingen testen de urinestalen negatief. Beide vervalsingen kan men echter makkelijk opsporen door bijvoorbeeld respectievelijk de creatinine waarde en de osmolariteit van de urine te controleren.

Omwille van de onzekerheid die gepaard gaat met een ELISA screening, is het wenselijk dat er een techniek wordt ontwikkeld op basis van LC-MS/MS die een grotere selectiviteit én gevoeligheid bezit. De doelstellingen die worden vooropgesteld zijn de volgende:  De nieuwe methode moet in staat zijn om het LSD gebruik te kunnen bevestigen en te kwantificeren na een positieve screening via ELISA op urine.  De methode moet een oplossing bieden voor de geputrefieerde lijken, waarbij ELISA testen vaak geen zin hebben.  LSD-gebruik moet ook kunnen aangetoond worden wanneer ELISA een vals negatief resultaat geeft. Dit kan door het opsporen van 2-oxo-3-OH-LSD die in een hogere concentratie voorkomt en een langere excretieduur heeft in de urine.

12/57

Om tot een dergelijke methode te komen, richten we ons op de 2 belangrijkste componenten: LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Als interne standaard (IS) kiezen we voor LSD-D3, een gedeutereerde vorm van LSD. Dit heeft als voordeel dat de 2 componenten zich identiek zullen gedragen (extractierendement, chromatografisch gedrag,…) en enkel te onderscheiden zijn op basis van hun massaspectrum. Hierdoor zal de techniek toelaten LSD niet alleen te identificeren, maar ook te kwantificeren. Aangezien 2-oxo-3-OH-LSD verschilt in polariteit t.o.v. LSD, zal het een ander extractierendement en retentietijd bezitten. Daardoor zal LSD-D3 vermoedelijk geen geschikte IS zijn voor kwantificatie van 2-oxo-3-OH-LSD. We stellen ons echter tot doel om een zo hoog mogelijk extractierendement te verkrijgen voor LSD. Doordat 2-oxo-3-OH-LSD in veel hogere concentratie aanwezig is in de urine, zal het vermoedelijk toch mogelijk zijn om deze component simultaan te identificeren, ondanks een minder gunstig extractierendement.

Bij dergelijke methodeontwikkeling zullen de volgende stappen doorlopen worden:  Infuseren van LSD, LSD-D3 en 2-oxo-3-OH-LSD in de massaspectrometer om de transities te selecteren en de instellingen (cone-voltage en collision-energie) te optimaliseren.  Ontwikkeling van een hogedrukvloeistofchromatografie (keuze van de kolom, mobiele fase, gradiënt …) voor de scheiding van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD.  Keuze van de optimale ionsuppressie.  Bepaling van het extractierendement bij gebruik van verschillende extractievloeistoffen.  Validatie van de ontwikkelde methode: lineariteit, selectiviteit, herhaalbaarheid, accuraatheid, detectielimiet, kwantificatielimiet, meetonzekerheid.  Testen van de bruikbaarheid voor de bepaling van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD in urine aan de hand van monsters die vooraf via ELISA gescreend werden.

13/57

3. REAGENTIA EN MATERIALEN 3.1. STANDAARDEN EN REAGENTIA LSD-stockoplossing 25 µg/ml (Cerilliant, Round Rock, TX, VS) lotnummer 35068-05D LSD-D3 25 µg/ml (Cerilliant, Round Rock, TX, VS) lotnummer FC021104 2-oxo-3-OH-LSD-stockoplossing 100 µg/ml (Cerilliant, Round Rock, TX, VS) lotnummer FN101305 Ammoniumhydroxideoplossing 25 % p.a. (VWR International, Leuven, België) lotnummer 05E130008 n-Hexaan p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer 90386 Ethylacetaat p.a. (Merck, Darmstadt, Duitsland) lotnummer I432568 Chloroform p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer 87435 Isopropanol p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer 84890 Ultrapure H2O geproduceerd door Arium® 611 UV (Sartorius, Leuven, België) Methanol p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer 94625 Ammoniumformiaat (Sigma-Aldrich, St-Louis, VS) lotnummer 55006212 Acetonitrile p.a. (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Barcelona, Spanje) lotnummer 95184 Mierenzuur 98-100 % (Merck, Darmstadt, Duitsland) lotnummer 36232163F1 Werkstandaarden (1 µg/ml) van LSD, LSD-d3 en 2-oxo-3-OH-LSD werden bereid door verdunnen van de respectievelijke stockoplossingen met acetonitrile. De stockoplossingen worden bewaard bij -20°C en afgeschermd van licht.

3.2. ANALYTISCHE KOLOMMEN EN APPARATUUR XTerra® RP18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm)

(Waters, Milford, Massachusetts, VS)

XTerra® MS C18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm) XTerra® MS C18 (10 x 2,1 mm, 3,5 µm)

(Waters, Milford, Massachusetts, VS) (Waters, Milford, Ierland) (prekolom)

Centrifuge (Jouan type B4i, St-Herblain, Frankrijk) Turbo Vap LV Evaporator (Zymark, Hopkinton, Massachusetts, VS) Vortexmixer: Top-mix 11118 (Fisher Bioblock Scientific, Doornik, België) HPLC Waters 2695 Separations Module (Waters, Milford, Massachusetts, VS) Massaspectrometer Micromass Quattro (Waters, Milford, Massachusetts, VS) Stikstofgenerator NM30L (Peak scientific, Billerica, Massachusetts, VS) Softwarepakket bij LC-MSMS: MassLynx v.3.5 14/57

4. METHODEONTWIKKELING EN VALIDATIE 4.1. LC-MS/MS TOESTEL 4.1.1. Algemene instellingen

De temperatuur in de autosampler bedraagt 20 °C (± 2 °C). De stalen worden hier op hun juiste positie ingebracht, waarna er 40 µl wordt geïnjecteerd op de HPLC-kolom. De kolomoven wordt ingesteld op 35 °C (± 5 °C) en de flow van de mobiele fase bedraagt 0,2 ml/min. Na scheiding op de kolom wordt het eluaat naar de MS geleid, waar de spanning aan de tip van het capillair +3,5 kV bedraagt (electrospray positief). De temperatuur in de bron en bij verdamping wordt ingesteld op respectievelijk 120 en 350 °C. De flow van N2 gas naar de cone en voor de verdamping bedraagt respectievelijk 50 en 500 liter per uur.

4.1.2. Kiezen van transities LSD, LSD-D3 en 2-oxo-3-OH-LSD 4.1.2.1. Werkwijze

Van de werkstandaarden (1 µg/ml) wordt een 1 op 10 verdunning gemaakt door 100 µl te mengen met 450 µl acetonitrile en 450 µl ultrapuur water. Deze verdunningen worden vervolgens afzonderlijk rechtstreeks geïnfuseerd in de MS. Dankzij de ESI ontstaan er positief geladen moederionen. In eerste instantie werken we enkel op basis van de eerste quadrupool zonder collision gas. Dit stelt ons in staat om de exacte m/z waarde van het moederion te bepalen en de cone-voltage te optimaliseren. Wanneer er een te hoog voltage wordt aangelegd, wordt het moederion sterk gefragmenteerd. Bij een te laag voltage zal het moederion onvoldoende worden binnengetrokken in de massaspectrometer.

Eens de m/z waarden en de cone-voltages voor de moederionen bepaald zijn, leggen we het collision gas aan. Hierdoor ontstaat er een CID, wat ons in staat stelt om een scan van de dochterionen te analyseren. Wanneer we de componenten willen identificeren en kwantificeren hebben we nood aan 2 transities. Hierbij moeten we niet enkel oog hebben voor de abundantie van de dochterionen, maar ook opletten dat we geen dochterionen kiezen die voorkomen bij de verschillende componenten. Voor 2-oxo-3-OH-LSD zou dit geen probleem geven, maar wel voor LSD en LSD-D3 aangezien ze op hetzelfde tijdstip elueren. Eenmaal de exacte m/z waarden van de dochterionen gekend zijn, is het de bedoeling om voor elk ion de collision energie te optimaliseren. Dit heeft tot doel de abundantie van het dochterion tot haar maximum te brengen, wat resulteert in een optimale gevoeligheid. 15/57

4.1.2.2. Resultaten

Onderstaande figuur geeft de scans weer van de dochterionen van respectievelijk LSDD3, LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Hieruit blijkt dat het ion met m/z waarde 281 geen goede keuze zou zijn (ondanks de hoge abundantie), aangezien het zowel voorkomt bij LSD als LSD- D3 (figuur 4.1.).

FIGUUR 4.1.: SCANS VAN DOCHTERIONEN VAN LSD-D3, LSD EN 2-OXO-3-OHLSD. DE MOEDERIONEN ZIJN BLAUW OMCIRKELD EN DE GEBRUIKTE DOCHTERIONEN ROOD. De transities die werden gekozen, worden samen met de cone-voltages en collision energie weergegeven in onderstaande tabel (tabel 4.1.). Deze transities zullen niet meer gewijzigd worden. Wat wel nog moet ingesteld worden, is het tijdsinterval waarbij de MS de transities moet opvolgen. Dit kunnen we slechts bepalen wanneer we de retentietijden kennen van de componenten. Deze hangen af van de HPLC-kolom, de mobiele fase en de gradiënt.

16/57

TABEL 4.1.: OVERZICHT TRANSITIES EN BIJHORENDE INSTELLINGEN

Component

m/z waarde en conevoltage van het moederion

m/z waarde en collision energie van het dochterion [fragment]

LSD (Mr: 323g/mol)

324.1 (27V)

223.1 (20eV)a [MH-C4H11NCO]+ 251.1 (17eV)b [MH-C4H11N]+

LSD- D3 (Mr: 326g/mol)

327.1 (27V)

226.1 (22eV)a [MH-C4H11NCO]+ 254.1 (17eV)b [MH-C4H11N]+

356.1 (25V)

237.1 (20eV)a [MH-H2O-C4H11NCO]+ 313.1 (18eV)b methode1 [MH-RNCH2]+ 338.1 (10eV)b methode2 [MH-H2O]+

2-oxo-3-OH-LSD (Mr: 355g/mol) a b

ion gebruikt voor kwantificatie ion nodig voor identificatie

4.1.3. Keuze van de kolom, mobiele fase en gradiënt 4.1.3.1. Eerste chromatografische methode Als HPLC-kolom wordt gebruik gemaakt van de XTerra®RP18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm). Bij deze kolom is de silica chemisch gemodificeerd door binding met C18 ketens, waardoor de stationaire fase apolair wordt (omgekeerde fase of “reversed phase”). Bij de keuze hebben we ons laten leiden door de literatuur, maar ook door de voordelen die verbonden zijn aan RP chromatografie. Eén van deze voordelen is dat alle actieve plaatsen gelijk zijn in adsorptiesterkte, wat resulteert in een betere pieksymmetrie en resolutie. Bovendien heeft LSD een log P waarde van 2.9, wat betekent dat het veeleer een apolaire molecule is. Hierdoor zal LSD meer affiniteit vertonen voor een RP-kolom dan voor een “normal phase”-kolom. Dit heeft tot gevolg dat een RP-kolom beter in staat is om LSD te scheiden van andere apolaire componenten.

Aangezien de stationaire fase apolair is, moet de mobiele fase polair zijn. Voor deze mobiele fase hebben we ons gebaseerd op de literatuur (Favretto et al., 2007). Oplossing A bestaat uit een mengsel van 1,0 ml mierenzuur en 0,1261 g ammoniumformiaat, opgelost in 999 ml ultrapuur water (pH 3). Als oplossing B gebruiken we een mengsel van 1,0 ml mierenzuur en 0,1261 g ammoniumformiaat, opgelost in 999 ml methanol. Het verschil met de literatuur is dat we methanol gebruiken in plaats van acetonitrile. Dit doen we omwille van de hoge kostprijs van acetonitrile. Oplossing B heeft hierbij de grootste eluotrope sterkte. Wanneer we deze niet zouden gebruiken, bestaat het gevaar voor irreversibele adsorptie van

17/57

sterk apolaire substanties. Mierenzuur en ammoniumformiaat worden toegevoegd om de pH van de mobiele fase op de gewenste waarde (pH 3) in te stellen, zodanig dat de 3 componenten (LSD, LSD-D3 en 2-oxo-3-OH-LSD) reeds in de geprotoneerde vorm voorkomen. Bovendien begunstigt mierenzuur eveneens de werking van de ESI (electrospray positief).

Na het kiezen van de kolom en de mobiele fase, worden een hele reeks van gradiënten uitgetest. De doelstelling is het vinden van de gradiënt die de beste scheiding geeft tussen LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Hiervoor wordt in een vial 250 µl van de LSD, LSD-D3 en 2-oxo3-OH-LSD werkstandaarden (1 µg/ml) onder N2 drooggedampt en na toevoegen van 1,0 ml mobiele fase (beginsamenstelling van de gradiënt) grondig gemengd met een vortexmixer. De chromatogrammen die de beste scheiding vertonen, worden weergegeven in onderstaande figuur (figuur 4.2.). De bijhorende gradiënt is weergegeven in tabel 4.2.

FIGUUR 4.2.: CHROMATOGRAMMEN BEKOMEN VIA METHODE 1 VOOR DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN LSD, LSD-D3 EN 2-OXO-3-OH-LSD ( IDENTIFICATIE 2-OXO-3-OH-LSD VIA 356,10 > 313,10 )

18/57

TABEL 4.2.: DE GEBRUIKTE GRADIËNT BIJ METHODE 1 interval (min) 0-5 5-10 10-15

% oplossing A 60 10 60

% oplossing B 40 90 40

curve constant constant constant

Onder deze voorwaarden bedragen de retentietijden van 2-oxo-3-OH-LSD, LSD en LSD-D3 respectievelijk 1,87; 2,84 en 2,84 minuten. De analyseduur van 1 run bedraagt 15 minuten. Met behulp van deze retentietijden en transities, kunnen we de MS optimaliseren. Het werken met twee “windows”, waarbij de MS van 0,5 tot 2,22 minuten enkel de transities registreert van 2-oxo-3-OH-LSD en van 2,22 tot 5 minuten de transities van LSD en LSD-D3, werd uitgetest. Deze techniek heeft tot voordeel dat de “dwell” voor elke transitie nu groter is, wat de gevoeligheid ten goede komt. We stelden echter vast dat dergelijke methode niet bruikbaar was op geëxtraheerde urinestalen, doordat de retentietijden dichter bij elkaar kwamen te liggen. Daarom stellen we de MS in om van 0,5 tot 5 minuten alle transities op te volgen met een dwell van 0,3 seconden per transitie.

4.1.3.2. Tweede chromatografische methode

Bij de tweede methode wordt opnieuw gebruik gemaakt van een RP-kolom, meer bepaald een XTerra® MS C18 (100 x 2,1 mm, 3,5 µm). Vóór deze kolom wordt een XTerra® MS C18 (10 x 2,1 mm, 3,5µm) prekolom geplaatst. Deze prekolom heeft exact dezelfde samenstelling als de HPLC-kolom, maar heeft tot doel storende bestanddelen te weerhouden die de analytische kolom zouden kunnen verontreinigen. Op deze manier kan men de levensduur van de HPLC-kolom vergroten.

Als mobiele fase maken we gebruik van een mengsel van oplossing A (0,15 % mierenzuur in ultrapuur water) en oplossing B (0,15 % mierenzuur in acetonitrile). In vergelijking met de eerste methode is methanol vervangen door acetonitrile. Dit heeft twee grote voordelen: de HPLC-kolom heeft een kortere conditioneringstijd nodig voor acetonitrile in vergelijking met methanol én acetonitrile is bovendien minder vervuilend voor de MS.

19/57

Nadat de kolom en mobiele fase gekozen zijn, gaan we opnieuw op zoek naar de gradiënt die de beste scheiding garandeert. Dit doen we op dezelfde manier als beschreven bij methode 1 (zie boven). De beste scheiding wordt bekomen door middel van onderstaande gradiënt (tabel 4.3.). Het chromatogram dat via deze gradiënt wordt verkregen, wordt weergegeven in onderstaande figuur (figuur 4.3.).

TABEL 4.3.: DE GEBRUIKTE GRADIËNT BIJ METHODE 2 interval (min) 0-2 2-8 8-13 13-16 16-18 18-20 20-30

% oplossing % oplossing A B 95 5 95 → 50 5 → 50 50 50 50 → 20 50 → 80 20 80 20 → 95 80 → 5 95 5

curve constant lineair constant lineair constant lineair constant

FIGUUR 4.3.: CHROMATOGRAMMEN BEKOMEN VIA METHODE 2 VOOR DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN LSD, LSD-D3 EN 2-OXO-3-OH-LSD ( IDENTIFICATIE 2-OXO-3-OH-LSD VIA 356,10 > 338,10 )

20/57

De retentietijden bij deze methode bedragen voor 2-oxo-3-OH-LSD, LSD en LSD-D3 respectievelijk 9,40; 10,91 en 10,91 minuten. Doordat 1 run 30 minuten duurt, maken we gebruik van een divert valve. Hiermee zullen we enkel de componenten die elueren tussen 8 en 13 minuten naar de MS leiden. Het overige deel wordt rechtstreeks afgevoerd naar de waste. Dit heeft tot voordeel dat de MS niet onnodig wordt vervuild.

Zoals te zien is op de chromatogrammen, maken we hier gebruik van 2 windows. Tussen de 8 en 10,2 minuten laten we de MS enkel de 2 transities van 2-oxo-3-OH-LSD opvolgen. De 4 transities van LSD en LSD-D3 worden enkel onderzocht tussen 10,2 en 13 minuten. Op die manier kunnen we de dwell vergroten tot 0,5 seconden per transitie.

21/57

4.2. VALIDATIE VAN EERSTE CHROMATOGRAFISCHE METHODE 4.2.1. Lineariteit 4.2.1.1. Werkwijze

Voor de controle van de lineariteit van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD werden de standaardcurven telkens in duplo opgesteld met als eindconcentraties 0, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150 en 200 ng/ml. Hiervoor maken we gebruik van de werkstandaarden en een 1 op 10 verdunning in acetonitrile. De gewenste hoeveelheden worden toegevoegd aan een vial met behulp van een Hamilton spuit. De IS (LSD-D3) wordt aan elke vial in een concentratie van 50 ng/ml toegevoegd. Na droogdampen onder N2 wordt 200 µl mobiele fase toegevoegd (60 % oplossing A en 40 % oplossing B ) en wordt gedurende 1 minuut gevortext. Eens het LCMS/MS toestel geconditioneerd is, worden deze stalen geanalyseerd.

4.2.1.2. Resultaten

Figuur 4.4 geeft de grafiek weer waarbij de gemiddelde relatieve respons van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD is uitgezet ten opzichte van de concentratie. Als relatieve respons nemen we de verhouding van de area van LSD of 2-oxo-3-OH-LSD ten opzichte van de area van LSD-D3, waarna we vervolgens vermenigvuldigen met factor vijftig. Op deze manier wordt gecorrigeerd voor de mogelijke variatie op het injectievolume. 300,000 y = 1,272x - 2,3382 2 R = 0,9995

LSD

relatieve respons

250,000

2-oxo-3-OH-LSD

200,000 150,000 y = 0,3285x + 0,4237

100,000

2

R = 0,9995 50,000 0,000 0

50

100

150

200

concentratie (ng/ml in vial)

FIGUUR 4.4.: RELATIEVE STANDAARDCURVEN LSD EN 2-OXO-3-OH-LSD IN MOBIELE FASE

22/57

De best passende rechte wordt gevonden via gewogen lineaire regressie. Deze is gebaseerd op de methode van de kleinste kwadraten, rekening houdend met de concentratie. Naarmate de concentratie groter wordt, neemt de standaarddeviatie op het meetresultaat toe. Wanneer we hiervoor niet zouden corrigeren, dan zou de afwijking op een hoge concentratie zwaarder doorwegen dan die op een lage concentratie (Klaessens, 2008). De regressielijnen die aldus bekomen worden, hebben een determinatiecoëfficiënt van telkens 0,9995 (≥0,995). Aangezien de residuele waarden een normale verdeling hebben rond nul, kan men besluiten dat er een lineair verband bestaat.

4.2.2. Uittesten verschillende extracties 4.2.2.1. De uitgevoerde extractieprocedures

Breng in een polyethyleentereftalaat (pet) tube 2,0 ml blanco-urine. Voeg hieraan IS en eventueel LSD / 2-oxo-3-OH-LSD toe, gevolgd door 1,0 ml 1M ammoniumhydroxide. Op deze manier alkaliniseren we de urine, waardoor de ons interesserende componenten als ongeladen moleculen voorkomen. Vervolgens worden er 3 verschillende vloeistof/vloeistof extractiemethoden uitgetest. We voegen daarvoor 6 ml chloroform/isopropanol in een verhouding 80/20 (Favretto et al., 2007) óf 6 ml hexaan/ethylacetaat in een verhouding 70/30 toe. Hierna wordt er gedurende 1 minuut gemengd met een vortexmixer en centrifugeren we de tubes 5 minuten bij 700 g. De organische fase wordt vervolgens met een pasteurpipet overgebracht in een glazen proefbuis, die we via de evaporator droogdampen. Aan deze drooggedampte proefbuizen wordt 200µl mobiele fase toegevoegd (60 % oplossing A en 40 % oplossing B ), waarna er gemengd wordt met een vortexmixer. De vloeistof wordt vervolgens overgebracht in een vial met insert.

Als derde extractiemethode wordt een combinatie uitgetest van hierboven vermelde extractievloeistoffen. De urine wordt eerst geëxtraheerd door middel van 6 ml hexaan/ ethylacetaat en vervolgens met 6 ml chloroform/isopropanol. Na extractie worden de twee organische solventen drooggedampt in dezelfde proefbuis. Het verdere verloop is identiek als hierboven beschreven. We passen deze combinatie toe, aangezien (rekening houdend met het verschil in polariteit tussen LSD en 2-oxo-3-OH-LSD) verwacht wordt dat hexaan/ ethylacetaat een hoger rendement zal halen voor LSD en chloroform/isopropanol voor 2-oxo3-OH-LSD (Favretto et al., 2007). Op deze manier zouden we het rendement van beide componenten vergroten, maar een nadeel is dat ook de matrixeffecten kunnen toenemen 23/57

4.2.2.2. Werkwijze

Het is de bedoeling na te gaan welke extractieprocedure het beste resultaat (extractierendement en matrixeffecten) oplevert. Daarom voeren we het hierna beschreven experiment in duplo uit. Aan 2,0 ml blanco-urine wordt 10 µl van de LSD-D3, LSD en 2-oxo3-OH-LSD werkstandaarden (1 µg/ml) toegevoegd, waarna de urine geëxtraheerd wordt. Voor elk van de 3 extractiemethoden doen we dit 6 keer. Hiernaast maken we ook 6 stalen aan, waarbij we rechtstreeks de 10 µl van elke werkstandaard aan een vial toevoegen, droogdampen en oplossen in 200µl mobiele fase. Deze laatste stalen gelden als referentie voor wat overeenkomt met 100% extractierendement, zonder matrixeffecten.

Na analyse van deze stalen, berekenen we voor elke methode het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt op de absolute respons van de drie componenten. De bekomen waarden worden vervolgens vergeleken met deze van de referentiestalen. We moeten hier gebruik maken van de absolute respons, zodanig dat we de componenten rechtstreeks met elkaar kunnen vergelijken.

4.2.2.3. Resultaten

Onderstaande tabel 4.4 geeft de bekomen resultaten weer van de twee experimenten. Wanneer we kijken naar de variatiecoëfficiënt op de absolute respons, wordt het nog maar eens onderstreept hoe belangrijk het is om gebruik te maken van een IS. Deze gedraagt zich immers gelijkaardig als LSD, waardoor de relatieve respons een veel kleinere variatiecoëfficiënt bezit.

TABEL 4.4: ABSOLUTE RESPONS BIJ REFERENTIE EN VERSCHILLENDE EXTRACTIES

n 1 2 3 4 5 6 gemiddelde RSD

referentie 461048,3 451356,8 462316,2 533249,6 525709,6 504150,3 489638,5 7,3%

LSD-D3 (1) hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol 200491,6 28935,3 188322,8 50792,1 145867,0 30852,4 170591,8 41183,8 215146,1 34441,1 195684,5 37861,7 186017,3 37344,4 13,2% 21,3%

combinatie 72373,3 44437,7 43004,5 85297,5 77043,1 88897,9 68509,0 29,3%

24/57

n 1 2 3 4 5 6 gemiddelde RSD

referentie 134342,4 153924,8 140858,6 144820,7 140489,8 132979,1 141235,9 5,4%

n 1 2 3 4 5 6 gemiddelde RSD

referentie 372406,2 425076,5 413008,0 451896,8 426782,2 409453,2 416437,5 18,6%

n 1 2 3 4 5 6 gemiddelde RSD

referentie 134221,9 142134,3 127796,0 132103,0 127661,4 141281,0 134199,6 4,5%

n 1 2 3 4 5 6 gemiddelde RSD

referentie 105522,6 115190,1 124394,4 118874,6 117118,0 119518,4 116769,7 5,4%

n 1 2 3 4 5 6 gemiddelde RSD

Referentie 31511,6 31452,4 33631,6 29736,4 30173,8 31100,2 31267,7 4,2%

LSD-D3 (2) hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie 41064,6 15621,5 20617,9 36225,2 14390,5 10942,1 46274,1 20105,2 14427,6 54737,5 12646,1 28442,5 49813,7 11193,5 26465,8 46438,6 18731,3 17515,2 45759,0 15447,5 19735,2 14,2% 22,3% 34,5% LSD (1) hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie 168808,3 26370,9 61950,0 158579,0 44688,1 39131,0 135247,7 32727,2 36571,6 147275,0 34291,0 73244,6 184317,1 27559,2 70757,8 173482,2 31189,4 74642,1 161284,9 32804,3 59382,9 11,2% 20,0% 29,1% LSD (2) hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie 39205,7 13696,9 20181,9 37693,5 13436,4 11046,6 44308,8 20233,6 14388,4 53959,7 12823,9 27352,2 47831,9 13574,4 27519,6 46428,7 17169,5 17849,7 44904,7 15155,8 19723,1 13,3% 19,3% 34,1% 2-oxo-3-OH-LSD (1) hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie 181,2 4883,7 5969,9 147,7 9005,4 3412,1 45,7 6076,6 3198,0 87,5 7673,0 5405,5 104,7 5798,3 7222,7 172,5 6876,4 5677,5 123,2 6718,9 5147,6 43,0% 21,9% 30,3% 2-oxo-3-OH-LSD (2) hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie 32,6 1388,9 1068,4 41,2 1608,5 574,3 45,4 2325,2 790,3 32,6 1228,0 1113,0 44,9 1675,6 2721,1 75,4 1760,9 687,6 45,4 1664,5 1159,1 34,8% 22,7% 68,5%

25/57

Wanneer we bij elke extractiemethode voor de drie componenten de verhouding berekenen van de gemiddelde absolute respons ten opzichte van die bij de referentie, levert ons dat de resultaten op die worden weergegeven in tabel 4.5.

TABEL 4.5.: PROCENTUELE VERHOUDING VAN DE GEMIDDELDE ABSOLUTE RESPONS EXTRACTIE TEN OPZICHTE VAN REFERENTIE hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol 1 2 1 2 LSD-D3 LSD 2-oxo-3-OH-LSD

37,9% 38,7% 0,1%

32,4% 33,5% 0,1%

7,6% 7,9% 5,8%

10,9% 11,3% 5,3%

combinatie 1 2 13,9% 14,3% 4,4%

13,9% 14,7% 3,7%

Met dergelijke lage percentages kunnen we niet verder werken, aangezien de gevoeligheid van de methode niet groot zal zijn. De oorzaak van dit probleem ligt ofwel bij een laag extractierendement ofwel bij een grote ionsuppressie.

Uit de bovenstaande resultaten, kunnen we enkel afleiden dat hexaan/ethylacetaat inderdaad het beste resultaat oplevert voor LSD en chloroform/isopropanol voor 2-oxo-3-OHLSD. De combinatie van beide extracties geeft echter niet het verwachte resultaat, waarschijnlijk doordat de invloed van de ionsuppressie groter is dan de som van de extractierendementen.

4.2.3. Nagaan van de ionsuppressie bij de verschillende extracties 4.2.3.1. Werkwijze

Het is nu de bedoeling na te gaan of de oorzaak van de ongunstige resultaten moet gezocht worden bij de ionsuppressie. Breng, voor het opmaken van 4 standaardreeksen, respectievelijk 0, 2, 4, 10, 20, 40 µl van de 1 op 10 verdunning van de LSD en 2-oxo-3-OHLSD werkstandaarden (= 0; 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 en 4,0 ng) over in een vial. Voeg aan elke vial 4 µl toe van een 1 op 10 verdunning van de LSD-D3 werkstandaard (= 0,4 ng). Verdamp het oplosmiddel met de evaporator. Op deze manier bekomen we 4 standaardreeksen van telkens 6 vials.

Tegelijkertijd extraheren we voor elk van de drie extractiemethoden acht keer 2,0 ml blanco-urine. Aan elke drooggedampte proefbuis wordt zoals gewoonlijk 200 µl mobiele fase

26/57

toegevoegd, waarna gevortext wordt. De bekomen matrices van dezelfde extractiemethode worden samengebracht in 1 proefbuis, waarna opnieuw wordt gevortext. Op deze manier krijgen we voor elke extractieprocedure een homogene matrix.

Deze matrices zullen we toevoegen aan de 4 drooggedampte standaardreeksen. Aan een eerste reeks voegen we 200 µl mobiele fase toe; bij een tweede reeks 200 µl hexaan/ ethylacetaat matrix; aan een derde 200 µl chloroform/isopropanol matrix; en aan de laatste reeks 200 µl matrix van de gemengde extractie. Dit levert ons 4 reeksen op van 0, 1, 2, 5, 10 en 20 ng/ml LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. De concentratie van de IS bedraagt hierbij telkens 2 ng/ml. Na conditioneren van het LC-MS/MS toestel, worden deze stalen geanalyseerd. 4.2.3.2. Resultaten In tabel 4.6 wordt de gemiddelde respons en variatiecoëfficiënt voor LSD-D3 weergegeven die we bekomen voor elk van de 4 standaardreeksen. De absolute en relatieve responsen van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD worden in onderstaande grafieken uitgezet ten opzichte van de concentratie (figuur 4.5; 4.6; 4.7 en 4.8). TABEL 4.6.: GEMIDDELDE RESPONS EN RSD VOOR LSD-D3 BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN mobiele fase hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie gemiddelde respons 4384,9 1616,3 544,7 510,4 RSD 30,5% 49,4% 39,2% 36,4%

65000

absolute respons

55000 45000

y = 2855,5x - 2169,2 R2 = 0,9948 mobiele fase

y = 344,16x - 331,44 R2 = 0,977

hexaanethylacetaat 35000

y = 350,93x - 245,14 R2 = 0,9944

y = 1278,9x - 1307 R2 = 0,9879

chloroform isopropanol combinatie

25000 15000 5000 -5000 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

conc (ng/ml)

FIGUUR 4.5.: ABSOLUTE STANDAARDCURVE LSD BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN 27/57

600

y = 26,051x - 15,002 2 R = 0,9964

relatieve respons

500

y = 22,965x - 0,841 2 R = 0,9971

y = 24,835x - 12,243 2 R = 0,9962

mobiele fase hexaan ethylacetaat chloroform isopropanol combinatie

400 300 200

y = 20,333x - 4,4884 2 R = 0,9971

100 0 0

5

10

15

20

-100 conc (ng/ml)

FIGUUR 4.6.: RELATIEVE STANDAARDCURVE LSD BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN

24000 y = 1031,4x + 343,23 R2 = 0,9929

absolute respons

19000

y = 137,72x - 85,06 R2 = 0,9912

y = 61,563x + 9,955 R2 = 0,9962

mobiele fase hexaan ethylacetaat chloroform isopropanol combinatie

14000

y = 66,647x - 19,985 R2 = 0,9979

9000

4000

-1000

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

conc (ng/ml)

FIGUUR 4.7.: ABSOLUTE STANDAARDCURVE 2-OXO-3-OH-LSD BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN

28/57

250 y = 9,3426x + 6,5937 R2 = 0,9831

relatieve respons

200

mobiele fase

y = 3,7496x + 2,023 R2 = 0,9975

y = 4,3407x + 5,5337 R2 = 0,9846

hexaan ethylacetaat

150

y = 2,3926x + 2,4557 R2 = 0,9866

chloroform isopropanol combinatie

100

50

0 0

2

4

6

8

10 12 conc (ng/ml)

14

16

18

20

FIGUUR 4.8.: RELATIEVE STANDAARDCURVE 2-OXO-3-OH-LSD BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN Om uit te drukken wat de invloed is van de ionsuppressie op de respons van LSD-D3, nemen we voor elke matrix de verhouding van de gemiddelde absolute respons ten opzichte van die in mobiele fase. Dit levert ons de volgende percentages op: 36,9 % bij hexaan/ ethylacetaat, 12,4 % bij chloroform/isopropanol en voor de combinatie 11,6 %. Wanneer we ditzelfde willen nagaan voor LSD en 2-oxo-3-OH-LSD, moeten we voor elke matrix de verhouding berekenen van de richtingscoëfficiënt bij de absolute standaardcurve ten opzichte van die in mobiele fase. De bekomen percentages worden weergegeven in tabel 4.7.

TABEL 4.7.: PROCENTUELE VERHOUDING RICHTINGSCOËFFICIËNTEN ABSOLUTE STANDAARDCURVE MATRIX / MOBIELE FASE hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie LSD 44,8 % 12,3 % 12,1 % 2-oxo-3-OH-LSD 13,4 % 6,5 % 6,0 %

Door de bovenstaande percentages te vergelijken met die uit het vorige experiment, kunnen we onder meer besluiten dat het extractierendement van hexaan/ethylacetaat voor 2oxo-3-OH-LSD zeer laag is. Het belangrijkste besluit is echter dat de oorzaak van het probleem gezocht moet worden bij de ionsuppressie en niet bij het extractierendement. Dit valt te verklaren doordat de componenten een kleine retentietijd bezitten. Hierdoor elueren ze gelijktijdig met heel wat (mogelijk) interfererende bestanddelen. Dit heeft tot gevolg dat het ionisatieproces van de ons interesserende stoffen wordt onderdrukt. De enige oplossing voor

29/57

dit probleem is overschakelen op een andere methode, waardoor we een betere scheiding verkrijgen tussen de te bepalen componenten en de interfererende bestanddelen.

Door de relatieve standaardcurven van LSD te vergelijken met die van 2-oxo-3-OHLSD, kunnen we tenslotte vaststellen dat LSD (in tegenstelling tot 2-oxo-3-OH-LSD) dezelfde ionsuppressie kent als LSD-D3. Dit mag niet verrassen, aangezien LSD en LSD-D3 dezelfde retentietijd bezitten.

30/57

4.3. VALIDATIE VAN TWEEDE CHROMATOGRAFISCHE METHODE 4.3.1. Lineariteit 4.3.1.1. Werkwijze

Voor de controle van de lineariteit van de tweede chromatografische methode voor de bepaling van LSD werd een standaardcurve in duplo opgesteld met als concentraties 0; 0,5; 1; 2; 5; 7,5; 10 en 20 ng/ml mobiele fase. Hetzelfde gebeurde voor 2-oxo-3-OH-LSD, doch in een tienmaal hogere concentratie, aangezien deze metaboliet in een aanzienlijk hogere concentratie voorkomt in de urine. Aan elke vial wordt LSD-D3 toegevoegd in een concentratie van 5 ng/ml. Dezelfde procedure wordt gevolgd zoals beschreven voor methode 1.

4.3.1.2. Resultaten

Figuur 4.9 geeft de grafiek weer waarbij de (gemiddelde) relatieve respons van LSD is uitgezet ten opzichte van de concentratie. 180 y = 8,2389x - 2,1982 R2 = 0,9996

160

relatieve respons

140 120

LSD

100 80 60 40 20 0 -20

0

2

4

6

8 10 12 conc (ng/ml in vial)

14

16

18

20

FIGUUR 4.9.: RELATIEVE STANDAARDCURVE LSD IN MOBIELE FASE

Via gewogen lineaire regressie wordt de best passende rechte getekend en de lineariteit wordt bevestigd (determinatiecoëfficiënt gelijk aan 0,9996), alsook een normale verdeling van de residuele waarden rond nul. Voor 2-oxo-3-OH-LSD wordt een lineair verband gevonden met voorschrift y = 1.8059x – 5.2922 en determinatiecoëfficiënt 0.9979.

31/57

4.3.2. Controle van de ionsuppressie 4.3.2.1. Werkwijze

Hiervoor gaan we op exact dezelfde manier te werk als beschreven bij methode 1. Het enige verschil is dat er nu 4 standaardreeksen zullen worden aangemaakt van telkens 0; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 35; 50 ng/ml LSD en 0; 5; 10; 20; 50; 100; 200; 350; 500 ng/ml 2-oxo-3-OHLSD. Elke vial zal een concentratie bezitten van 5 ng/ml LSD-D3. Dit betekent dat we voor elke extractiemethode twaalf keer 2 ml urine zullen extraheren, om op die manier voldoende matrix te bekomen.

4.3.2.2. Resultaten

In tabel 4.8 wordt de gemiddelde respons en variatiecoëfficiënt voor LSD-D3 weergegeven die we bekomen voor elk van de 4 standaardreeksen. De absolute responsen van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD worden in onderstaande grafieken uitgezet ten opzichte van de concentratie (figuur 4.10 en 4.11). TABEL 4.8.: GEMIDDELDE RESPONS EN RSD VOOR LSD-D3 BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN mobiele fase hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie gemiddelde respons 10576,1 7856,1 5099,5 4534,3 RSD 35,5% 35,9% 15,1% 10,4%

140000

y = 2631,8x - 436,77 y = 1771x - 820,86 y = 991,16x - 743,81 R2 = 0,9989 R2 = 0,9969 R2 = 0,9993

absolute respons

120000 100000

y = 860,65x - 690,15 R2 = 0,9994

mobiele fase hexaan ethylacetaat

80000

chloroform isopropanol combinatie

60000 40000 20000 0 -20000

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

conc (ng/ml)

FIGUUR 4.10.: ABSOLUTE STANDAARDCURVE LSD BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN

32/57

300000

absolute respons

250000

y = 537,61x - 267,51 y = 338,08x - 1758 y = 330,31x - 1601,2 R2 = 0,9993 R2 = 0,9997 R2 = 0,9991 mobiele fase

200000

hexaan ethylacetaat

y = 293,1x - 1896,4 R2 = 0,997

chloroform isopropanol combinatie

150000 100000 50000 0 0

50

100

150

200 250 300 conc (ng/ml)

350

400

450

500

FIGUUR 4.11.: ABSOLUTE STANDAARDCURVE 2-OXO-3-OH-LSD BIJ DE VERSCHILLENDE STANDAARDREEKSEN

Om uit te drukken wat de invloed is van de ionsuppressie op de respons van LSD-D3, LSD en 2-oxo-3-OH-LSD, verwerken we de resultaten op dezelfde manier als bij methode 1. De alzo verkregen percentages worden samenvattend weergegeven in tabel 4.9. TABEL 4.9.: SAMENVATTENDE RESULTATEN IONSUPPRESSIE LSD-D3 LSD 2-oxo-3-OH-LSD

hexaan/ethylacetaat chloroform/isopropanol combinatie 74,3% 48,2% 42,9% 67,3% 37,7% 32,7% 62,9% 61,4% 54,5%

Uit deze percentages blijkt dat de ionsuppressie inderdaad minder uitgesproken is door over te schakelen naar deze tweede methode. Het blijft echter wel noodzakelijk om een ijklijn op te stellen in urine, wanneer we kwantitatieve resultaten nastreven. Doordat de extractie met hexaan/ethylacetaat het minst ionsuppressie kent voor LSD én het beste rendement oplevert, wordt beslist om enkel verder te werken met deze extractiemethode.

33/57

4.3.3. Onderzoeken van de lineariteit van de ijklijn in blanco-urine 4.3.3.1. Werkwijze

Aangezien de ionsuppressie ons verplicht een ijklijn op te stellen in urine, gaan we na of er (net zoals in mobiele fase) een lineair verband bestaat tussen respons en concentratie. Een standaardcurve wordt in duplo opgesteld in urine met als ijkpunten 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3,5 en 5 ng/ml LSD. Dergelijke range wordt gekozen op basis van 2 positieve gevallen die beschreven worden in de literatuur (Canezin et al., 2001). Bij de ene persoon werd in de urine 1.3 ng/ml LSD gevonden en bij de andere 240 pg/ml.

Van 2-oxo-3-OH-LSD wordt terug een tienmaal hogere concentratie gebruikt, omwille van de reeds hoger vermelde reden. Daarnaast wordt er aan de 2,0 ml urine ook LSD-D3 toegevoegd, tot een concentratie van 0,5 ng/ml. Na additie van de componenten wordt de urine geëxtraheerd met hexaan/ethylacetaat volgens de hoger beschreven procedure en vervolgens geanalyseerd.

4.3.3.2. Resultaten In onderstaande grafieken (figuur 4.12 en 4.13) wordt de relatieve respons van respectievelijk LSD en 2-oxo-3-OH-LSD uitgezet ten opzichte van de concentratie. Via gewogen lineaire regressie wordt de best passende rechte gevonden en de voorwaarden voor lineariteit worden onderzocht (r2 en verdeling van de residuele waarden). 450

relatieve respons

400 350

LSD: ijklijn 1

300

LSD: ijklijn 2

y = 76,798x + 0,0315 2 R = 0,9991

250 y = 76,478x - 1,1784 2 R = 0,9994

200 150 100 50 0 0

0,5

1

1,5

2 2,5 3 conc (ng/ml in urine)

3,5

4

4,5

5

FIGUUR 4.12.: RELATIEVE STANDAARDCURVE LSD IN URINE 34/57

7 y = 0,1208x + 0,0537 2 R = 0,8961

2-oxo-3-OH-LSD: ijklijn 1

6 relatieve respons

2-oxo-3-OH-LSD: ijklijn 2

5 4 3 y = 0,0915x - 0,167 2 R = 0,893

2 1 0 -1

0

10

20

30

40

50

conc (ng/ml in urine)

FIGUUR 4.13.: RELATIEVE STANDAARDCURVE 2-OXO-3-OH-LSD IN URINE

Op basis van de bekomen resultaten kunnen we stellen dat aan de eisen voor lineariteit meer dan voldaan wordt in het geval van LSD (binnen de onderzochte range). Door het corrigeren voor alle variërende omstandigheden (extractierendement, ionsuppressie, injectievolume,…), zorgt de IS er voor dat de relatieve standaardcurven van LSD steeds mooi samenvallen. Dit is echter niet het geval voor 2-oxo-3-OH-LSD. Een verklaring hiervoor is dat LSD-D3 geen goede interne standaard is, aangezien de metaboliet een ander (en veel kleiner) extractierendement bezit bij gebruik van hexaan/ethylacetaat (zie volgend experiment). We kunnen daarom nu reeds besluiten dat het onmogelijk zal zijn om via deze IS de metaboliet kwantitatief te bepalen.

Ondanks het lage extractierendement moet identificatie van 2-oxo-3-OH-LSD mogelijk zijn vanaf 1 à 2 ng/ml. Dergelijke waarden komen voor in de urine doordat de metaboliet in een 16 tot 43 keer hogere concentratie aanwezig is dan LSD.

4.3.4. Herhaalbaarheid en intermediaire precisie van het extractierendement

Het extractierendement zal op drie concentratieniveaus worden bepaald: low (200 pg/ml LSD en 2 ng/ml 2-oxo-3-OH-LSD in urine), medium (1 ng/ml LSD en 10 ng/ml 2-oxo3-OH-LSD in urine) en high (3 ng/ml LSD en 30 ng/ml 2-oxo-3-OH-LSD in urine).

35/57

4.3.4.1. Werkwijze

Voor elk concentratieniveau wordt 6 keer (n = 6) de gewenste hoeveelheid van elke component toegevoegd aan 2,0 ml blanco-urine. In het geval van herhaalbaarheid doen we dit op dezelfde dag; voor de intermediaire precisie is dat verspreid over 6 dagen. De hoeveelheid IS die nodig is om een concentratie te bekomen van 500 pg/ml in urine, wordt telkens pas toegevoegd na extractie en droogdampen. Op deze manier is de respons van de IS, in tegenstelling tot die van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD, enkel afhankelijk van de matrixeffecten en niet van het extractierendement.

Tegelijkertijd zullen we voor elk concentratieniveau 6 keer (herhaalbaarheid: zelfde dag / intermediaire precisie: verschillende dagen) dezelfde hoeveelheden van LSD, 2-oxo-3OH-LSD en IS nu rechtstreeks toevoegen aan een vial en droogdampen. Het gemiddelde van de bekomen relatieve responsen van LSD en 2-oxo-3-OH-LSD wordt vergeleken met dat van de extracties. Wanneer het extractierendement van de 2 componenten 100% zou bedragen, dan zou de gemiddelde relatieve respons gelijk moeten zijn. Hiervoor baseren we ons op het feit dat de ionsuppressie voor LSD en LSD-D3 gelijk is, aangezien ze op hetzelfde tijdstip elueren. Voor 2-oxo-3-OH-LSD is de retentietijd verschillend, maar de ionsuppressie blijkt niet veel te verschillen (tabel 4.9). De bekomen waarden zullen daardoor toch een goede maat zijn voor het extractierendement van de metaboliet.

4.3.4.2. Resultaten herhaalbaarheid extractierendement

Tabellen 4.10 en 4.11 geven de relatieve responsen weer voor LSD en 2-oxo-3-OHLSD bij de verschillende concentraties onder omstandigheden van herhaalbaarheid. Daarnaast wordt ook het gemiddelde, de variatiecoëfficiënt en het extractierendement vermeld (deze laatste wordt in het groen aangeduid).

4.3.4.3. Resultaten intermediaire precisie extractierendement

Hetzelfde wordt gedaan voor de relatieve responsen bekomen onder omstandigheden van intermediaire precisie (tabel 4.12 en 4.13).

36/57

TABEL 4.10.: HERHAALBAARHEID EXTRACTIERENDEMENT LSD n

1 2 3 4 5 6 gemiddelde respons RSD (%) extractierendement (%) * mobiele fase

0,2 (low) * MF extractie 12,7 9,7 11,9 11,5 14,9 11,4 13,9 13,4 11,0 11,2 12,9 11,1 12,9 11,39 10,9 % 10,5 % 88,5 %

concentraties (ng/ml) 1 (medium) MF extractie 78,5 42,7 77,7 39,9 74,3 40,6 76,5 45,1 74,8 39,1 80,4 44,7 77,0 42,0 3,0 % 6,0 % 54,5 %

3 (high) MF extractie 236,1 145,5 226,4 146,8 241,5 138,5 239,1 139,1 236,5 135,5 241,1 160,3 236,8 144,3 2,3 % 6,2 % 60,9 %

TABEL 4.11.: HERHAALBAARHEID EXTRACTIERENDEMENT 2-OXO-3-OH-LSD n 2 (low) MF extractie 1 63,2 0,29 2 66,1 0,22 3 63,6 0,32 4 61,0 0,12 5 57,1 0,31 6 67,6 0,51 gemiddelde 63,1 0,30 RSD (%) 6,0 % 44,1% extractierendement (%) 0,47%

concentraties (ng/ml) 10 (medium) 30 (high) MF extractie MF extractie 360,8 0,98 1201,2 3,08 370,5 1,40 1225,9 10,40 345,2 1,64 1378,0 4,49 368,9 0,81 1268,7 6,05 377,1 1,97 1364,0 4,53 461,9 1,15 1569,2 3,64 380,7 1,32 1334,5 5,37 10,8 % 32,7 % 10,2 % 49,7 % 0,35% 0,40%

TABEL 4.11.: INTERMEDIAIRE PRECISIE EXTRACTIERENDEMENT LSD n

1 2 3 4 5 6 gemiddelde RSD (%) extractierendement (%)

concentraties (ng/ml) 0,2 (low) 1 (medium) MF extractie MF extractie 12,9 11,4 77,0 42,0 16,0 15,3 81,9 48,3 12,3 12,6 83,9 49,8 15,3 12,6 78,0 51,3 11,6 9,0 78,2 58,7 13,9 12,9 80,6 57,6 13,7 12,3 79,9 51,3 12,7 % 16,7 % 3,3 % 12,1 % 89,7 % 64,2 %

3 (high) MF extractie 236,8 144,3 240,9 127,1 237,4 161,3 228,0 141,2 226,4 146,4 247,6 126,7 236,2 141,2 3,4 % 9,2 % 59,8 %

37/57

TABEL 4.12.: INTERMEDIAIRE PRECISIE EXTRACTIERENDEMENT 2-OXO-3-OH-LSD n

concentraties (ng/ml) 2 (low) 10 (medium) 30 (high) MF extractie MF extractie MF extractie 1 63,1 0,30 380,7 1,32 446,4 1,88 2 22,2 0,20 119,5 0,47 428,3 1,03 3 20,8 0,20 158,7 1,64 703,2 2,48 4 30,1 0,18 236,5 0,87 919,0 5,37 5 91,1 0,13 376,4 0,53 786,4 1,95 6 53,3 0,10 147,5 0,41 520,3 1,58 gemiddelde 46,8 0,18 236,5 0,87 633,9 2,38 RSD (%) 59,2 % 37,2 % 49,3 % 58,0 % 31,5 % 64,6% extractierendement (%) 0,40% 0,37% 0,38%

De bovenstaande resultaten bevestigen dat het extractierendement van LSD zich situeert tussen 54 en 64 %. Op basis van de variatiecoëfficiënten kunnen we besluiten dat de herhaalbaarheid en de intermediaire precisie van de extractie aanvaardbaar zijn. Bovendien zal de IS corrigeren indien er een afwijking mocht optreden. Het percentage dat wordt bekomen op het niveau van 200 pg/ml ligt hoger en is te wijten aan het feit dat extractie van blanco-urine een signaal veroorzaakt bij de onderzochte transitie van LSD (zie experiment selectiviteit). Dit signaal heeft relatief gezien een grotere invloed wanneer er slechts een lage concentratie LSD aanwezig is, vandaar het “verhoogde” extractierendement.

In het geval van 2-oxo-3-OH-LSD kunnen we stellen dat het extractierendement zeer laag is. Een bijkomend gegeven is dat de variatiecoëfficiënten veel groter zijn in vergelijking met LSD. Dit heeft 2 mogelijke verklaringen: ofwel is de variatie op de extractie van 2-oxo-3OH-LSD groter, ofwel blijft de verhouding van de ionsuppressie voor de metaboliet en LSDD3 niet constant. Bij verdere analysen zal de IS niet kunnen corrigeren voor deze variatie aangezien het extractierendement verschillend is.

4.3.5. Selectiviteit van de ontwikkelde methode Bij dit onderzoek hebben we ons beperkt tot de controle van de selectiviteit van de methode voor LSD en 2-oxo-3-OH-LSD ten opzichte van endogene componenten aanwezig in de urine van verschillende personen. Wanneer men verder geïnteresseerd zou zijn in de specificiteit ten opzichte van mogelijke interfererende stoffen die kunnen voorkomen in de urine, dan kan men als vertrekpunt de publicatie van Klette et al. (2002) gebruiken. 38/57

4.3.5.1. Werkwijze

Aan 2,0 ml blanco-urine van 6 verschillende personen wordt LSD-D3 toegevoegd in een concentratie van 0,5 ng/ml. De urine wordt vervolgens geëxtraheerd, waarna we de bekomen stalen analyseren via de LC-MS/MS. Door een IS toe te voegen kunnen we nagaan of de extractie en de injectie goed verlopen is.

4.3.5.2. Resultaten

Onderstaande figuur 4.14 geeft het chromatogram weer van een blanco-urinestaal waaraan interne standaard werd toegevoegd. De chromatogrammen van de vijf andere urinestalen waren gelijkaardig.

FIGUUR 4.14.: CHROMATOGRAMMEN VOOR DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN RESPECTIEVELIJK LSD, LSD-D3 EN 2-OXO-3-OH-LSD NA ADDITIE VAN IS AAN BLANCO URINE Uit het chromatogram en de tabel 4.13 blijkt dat een signaal wordt waargenomen bij de transitie 324 > 223,1. Dit is de transitie waarop de kwantificatie van LSD zal gebeuren.

39/57

TABEL 4.13.: RETENTIETIJD, AREA EN ION RATIO TRANSITIE 324 > 223,1 BIJ BLANCO-URINE n 1 2 3 4 5 6

RT 10,84 10,77 10,80 10,80 10,77 10,77

area 32,6 20,2 20,2 15,3 16,2 33,8

ion ratio 1,03 1,48 0,64 0,53 0,95 1,24

Om echter geïdentificeerd te worden als LSD, mogen de retentietijd en de ion ratio niet meer dan respectievelijk 2% (Rivier, 2003) en 30% (SOFT / AAFS, 2006) afwijken van de gemiddelde waarden bekomen uit een standaardcurve van LSD in urine. Deze curve wordt gelijktijdig met de stalen geanalyseerd en levert als gemiddelde retentietijd en ion ratio respectievelijk 10,69 minuten en 17,182. Rekening houdend met de vooropgestelde eisen, kan geen enkel signaal in de blanco-urine worden bevestigd als zijnde LSD.

Op basis van deze resultaten kunnen we stellen dat de ontwikkelde methode een goede selectiviteit bezit voor LSD en 2-oxo-3-OH-LSD. Het waargenomen signaal bij de transitie van LSD zal natuurlijk wel bijdragen tot een verhoogd signaal wanneer LSD effectief aanwezig is in de urine. Kwantitatieve resultaten zijn echter perfect mogelijk doordat we werken met een ijklijn in urine en een kwantificatielimiet (LoQ) (die onder meer bepaald wordt door de blanco signalen).

4.3.6. Herhaalbaarheid en accuraatheid voor LSD

De herhaalbaarheid en accuraatheid bij de bepaling van LSD in urine zal opnieuw op drie concentratieniveaus worden onderzocht: low (200 pg/ml LSD), medium (1 ng/ml LSD) en high (3 ng/ml LSD). Voor 2-oxo-3-OH-LSD worden deze parameters niet gecontroleerd, aangezien hiervoor geen kwantitatieve resultaten worden nagestreefd.

Om aan de eisen van de Food and Drug Administration voor de accuraatheid te voldoen, mag de gemiddelde waargenomen concentratie op elk niveau maximaal 15 % afwijken van de werkelijke concentratie. Wanneer de variatiecoëfficiënt op de meetresultaten minder is dan 15 % dan kan men volgens dezelfde eisen spreken van een aanvaardbare herhaalbaarheid (FDA, 2001).

40/57

4.3.6.1. Werkwijze

Voor elk concentratieniveau voegen we aan 2,0 ml blanco-urine de gewenste hoeveelheid LSD en LSD-D3 (eindconcentratie 0,5 ng/ml) toe. Na extractie met hexaan/ethylacetaat worden de monsters geanalyseerd. Voor elke concentratie aan LSD wordt de bepaling zes maal uitgevoerd (n = 6). De uiteindelijke concentraties worden bepaald op basis van een gelijktijdig opgestelde ijklijn in blanco-urine.

4.3.6.2. Resultaten

De

bekomen

concentraties

worden

samen

met

de

standaarddeviatie,

de

variatiecoëfficiënt en de accuraatheid weergegeven in de onderstaande tabel 4.14.

TABEL 4.14.: HERHAALBAARHEID EN ACCURAATHEID n 1 2 3 4 5 6 gemiddeld (ng/ml) SD (ng/ml) RSD (%) accuraatheid (%)

concentraties (ng/ml) 0,2 (low) 1 (medium) 3 (high) 0,177 1,015 3,044 0,199 1,006 3,092 0,188 1,024 3,082 0,197 1,004 2,949 0,193 0,993 3,054 0,192 0,993 3,011 0,191 1,006 3,039 0,008 0,012 0,053 4,1 % 1,2 % 1,7% 95,5 % 100,6 % 101,3 %

De accuraatheid (in het groen) bij de bepaling van LSD blijkt te variëren van 95,5 tot 101,3 % en bevindt zich met andere woorden binnen de vooropgestelde grenswaarden (85115 %). Alle variatiecoëfficiënten variëren tussen de 1,2 en 4,1 % en zijn bijgevolg steeds lager dan 15 %. Hieruit kunnen we concluderen dat de kwantificatie van LSD herhaalbaar en accuraat verloopt binnen het onderzochte interval.

41/57

4.3.7. Intermediaire precisie en accuraatheid voor LSD + opstellen Shewart kaart

Bij de bepaling van de intermediaire precisie en accuraatheid bij het kwantificeren van LSD, zullen we ons enkel baseren op 1 concentratieniveau. Deze concentratie wordt gekozen op basis van de Amerikaanse wetgeving, die stelt dat in een urinestaal meer dan 200 pg/ml LSD moet gedetecteerd worden alvorens men mag rapporteren dat de urine positief werd getest op LSD (Reuschel et al., 1999). De hierboven vermelde eisen voor precisie en accuraatheid blijven gelden.

4.3.7.1. Werkwijze

Gedurende 10 dagen wordt elke dag aan 2,0 ml urine LSD en LSD-D3 toegevoegd om concentraties te bekomen van respectievelijk 200 en 500 pg/ml. Na extractie worden de stalen geanalyseerd via de LC-MS/MS en de concentratie van LSD wordt bepaald op basis van een ijkcurve in blanco-urine. Deze ijklijn moet elke dag opnieuw worden opgesteld en meegenomen in de analyse.

4.3.7.2. Resultaten

De alzo verkregen concentraties worden samen met de standaarddeviatie, de variatiecoëfficiënt en de accuraatheid weergegeven in de onderstaande tabel 4.15.

TABEL 4.15.: INTERMEDIAIRE PRECISIE EN ACCURAATHEID n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 gemiddelde (ng/ml) SD (ng/ml) RSD (%) accuraatheid (%)

0,2 ng/ml (low) 0,196 0,197 0,227 0,215 0,185 0,203 0,234 0,236 0,197 0,300 0,210 0,018 8,4 % 105,0 %

42/57

Op basis van de bekomen resultaten kunnen we besluiten dat voldaan wordt aan de eisen van intermediaire precisie en accuraatheid op het niveau van 200 pg/ml.

4.3.7.3. Opstellen Shewart controlekaart (ISO 8258:1991)

Door gebruik te maken van bovenstaand gemiddelde en standaarddeviatie, kan men een Shewart controlekaart opstellen op het niveau van 200 pg/ml LSD (zie volgende bladzijde). Het principe van een Shewart kaart is gebaseerd op de veronderstelling dat (door de toevallige fouten) de meetresultaten een Gaussiaanse verdeling hebben rond het gemiddelde. Hierdoor kan men stellen dat voor een concentratie van 200 pg/ml LSD, 95 % van de bekomen meetresultaten tussen de groene lijnen zal komen te liggen (gemiddelde ± 2 SD). De rode lijnen geven het interval weer waarvoor verwacht wordt dat het 99,7 % van de meetresultaten zal omvatten (gemiddelde ± 3 SD).

Wanneer we in het vervolg reële urinestalen zullen onderzoeken op LSD, nemen we naast een ijklijn ook steeds een controlestandaard van 0,2 ng/ml LSD mee. De gemeten concentratie voor deze standaard moet aan een aantal eisen voldoen om te mogen besluiten dat de kwantificatie van de reële stalen op een correcte manier zal verlopen. Zo mag de controlestandaard nooit buiten de rode lijnen komen te liggen en mag er zich slechts 2 keer een resultaat tussen de groene en rode lijnen bevinden. Wanneer niet aan deze voorwaarden voldaan is, moet er opnieuw gekalibreerd worden om het probleem trachten op te lossen. Hetzelfde geldt wanneer het resultaat 11 keer na elkaar aan dezelfde zijde van het gemiddelde ligt. Dit is een teken dat er een veranderende trend is die onderzocht moet worden.

4.3.7.4. Meetonzekerheid op de bekomen resultaten

Wanneer een reëel urinestaal wordt geanalyseerd, dan zit er altijd een bepaalde onzekerheid op de bekomen concentratie. Om dit uit te drukken maken we opnieuw gebruik van de hierboven vermelde resultaten bij 200 pg/ml LSD. Doordat de accuraatheid 104.95 % bedraagt, kunnen we stellen dat er een bias is van 4,95 %. Naast deze bias moeten we voor de meetonzekerheid ook rekening houden met de relatieve standaarddeviatie van 8.42 %. Dit maakt dat het interval [meetresultaat – 21,79 %; meetresultaat + 21,79 %] met 95 % zekerheid

43/57

44/57

de werkelijke waarde van het urinestaal omvat. Deze 21,79% wordt berekend op basis van onderstaande formule: ‫׀‬bias‫ ׀‬+ 2 RSD We kiezen ervoor om alles uit te drukken op basis van variatiecoëfficiënten. Zij hebben als kenmerk constant te blijven bij grote concentraties en toe te nemen naarmate de concentratie kleiner wordt (in tegenstelling tot de standaarddeviatie) (Klaessens, 2008). Aangezien we de meetonzekerheid bepalen bij 200 pg/ml (wat ongeveer overeenkomt met de LoQ, zie volgend experiment), kunnen we stellen dat deze op dit niveau zijn maximum benadert.

4.3.8. Berekening CCα, CCβ, detectielimiet (LoD) en kwantificatielimiet (LoQ) CCα geeft de concentratie weer van LSD in de urine waarvoor er 5 % kans bestaat om een hogere concentratie als vals positief te rapporteren. CCβ vertegenwoordigt de concentratie waarvoor er 5 % kans bestaat om een lagere concentratie als vals negatief te rapporteren. Deze 2 parameters zijn voornamelijk van belang wanneer er geen wettelijke grens voor LSD in de urine is vastgelegd. Ze dienen als beslissingsgrenzen met een bepaalde kans op een vals positief/negatief resultaat. Voor verdere informatie wordt verwezen naar de onlangs verschenen publicatie van Boqué & Vanden Heyden (2009). Onder de detectielimiet verstaan we de laagste concentratie, verkregen na analyse van een staal mét LSD, die we kunnen onderscheiden van de concentratie bekomen na analyse van een blancostaal. De kwantificatielimiet is de laagste concentratie van LSD in de urine, die met een voldoende precisie en accuraatheid kan worden bepaald.

4.3.8.1. Werkwijze

Voor de berekening van CCα, CCβ, LoD en LoQ was het nodig om op 7 verschillende dagen een standaardcurve op te stellen. Deze werden vervolgens verwerkt in twee verschillende werkbladen (één voor CCα, CCβ en één voor LoD, LoQ), die reeds waren aangemaakt door het laboratorium Chemiphar.

45/57

4.3.8.2. Resultaten

De bekomen waarden voor CCα en CCβ bedragen respectievelijk 25 en 58 pg/ml LSD. De waarden voor LoD en LoQ bedragen respectievelijk 94 en 188 pg/ml. Rekening houdend met de mogelijke variatie op deze meetresultaten, kunnen we stellen dat LSD in de urine zeker te kwantificeren is vanaf 200 pg/ml.

Onderstaande figuur 4.15 geeft het chromatogram weer van een urinestaal waaraan LSD en LSD-D3 werden toegevoegd aan een concentratie van respectievelijk 200 en 500 pg/ml.

FIGUUR 4.15.: CHROMATOGRAMMEN VOOR DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN RESPECTIEVELIJK LSD, LSD-D3 EN 2-OXO-3-OH-LSD NA ADDITIE VAN LSD EN LSD-D3 IN EEN CONCENTRATIE VAN 200 EN 500 PG/ML AAN BLANCO URINE

46/57

5. TOEPASSING VAN DE METHODE OP RINGTESTEN 5.1. PROCEDURE

De ringtesten worden in eerste instantie gescreend via de beschreven ELISA test. Enkel de positieve en zwak positieve stalen worden verder geanalyseerd via LC-MS/MS. Dergelijke beslissing gebeurt steeds visueel, met name door de kleur van het staal te vergelijken met dat van de positieve en negatieve controle (figuur 5.1).

FIGUUR 5.1.: FOTO ELISA TEST VAN POSITIEVE EN NEGATIEVE CONTROLE + 2 NEGATIEVE STALEN

47/57

5.2. RESULTATEN VAN DE ANALYSE

De bekomen resultaten worden voor elke ringtest weergeven in onderstaande tabel 5.1. Hieruit kunnen we concluderen dat er een probleem ontstaat bij een situatie zoals 028908FA238. Figuur 5.2 geeft het chromatogram weer van de desbetreffende ringtest. Deze ringtest zouden we kunnen vergelijken met urine van een persoon die LSD genomen heeft, maar waarbij er enkel nog 2-oxo-3-OH-LSD terug te vinden is. Aangezien de ELISA test een lage cross-reactiviteit bezit tegenover deze belangrijkste metaboliet, zal de screening een negatief resultaat opleveren. In de praktijk zal de analyse van het staal niet verder gezet worden, waardoor het 2-oxo-3-OH-LSD niet gedetecteerd wordt. De oplossing voor dit probleem ligt bij een ELISA kit die een hogere cross-reactiviteit bezit voor de metaboliet. TABEL 5.1.: SAMENVATTENDE TABEL VAN DE RESULTATEN BIJ DE RINGTESTEN LSD (ng/ml)

metaboliet (ng/ml)

nummer ringtest datum ELISA aanwezig analyse aanwezig analyse ? ? F027808A250 april '09 negatief / / ? ? F027808B251 april '09 positief 3,5 / ? ? F027808C252 april '09 positief 7,0 / 004609FA247 feb '09 negatief / / / / 004609FC249 feb '09 negatief / / / / 004609FB248 feb '09 negatief / / / / 044608FC243 aug '08 negatief / / / / 044608FB242 aug '08 positief 6,6 7,2 / / 240 mei '08 negatief / / / / 028908FA238 mei '08 negatief / / 16 detectie 234 nov '07 negatief / / / / 233 nov '07 negatief / / / / 65407C231 aug '07 positief 3 3,3 / / 36107226 mei '07 negatief / / / / 008207F225 feb '07 negatief / / / / 94106A220 nov '06 positief 2 2,0 / / 94106B221 nov '06 positief / / / / 94106C222 nov '06 positief 7,6 7,9 / / 63806A217 aug '06 negatief / / / / 63806B218 aug '06 positief 2 2,1 / / 38506C216 mei '06 negatief / / / / 38506B215 mei '06 positief 10 6,7 / / 38506FA214 mei '06 positief 10 11,9 / / 211 feb '06 negatief / / / / 213 feb '06 negatief / / / / 212 feb '06 negatief / / / / 087205F209 nov '05 negatief / / / / Metaboliet = 2-oxo-3-OH-LSD ?: de resultaten van de ringtesten zijn op dit moment nog niet bekend Er was aan dit staal geen LSD of 2-oxo-3-OH-LSD toegevoegd, maar het staal was wel verdund

48/57

Wanneer we kwantitatieve uitspraken doen voor LSD, moeten we opletten dat de waargenomen concentratie zich bevindt in het gebied waarvoor lineariteit bewezen is. Indien dat niet het geval blijkt te zijn, is het nodig de stalen te verdunnen. Het is immers niet toegestaan om via extrapolatie de concentratie te berekenen.

FIGUUR 5.2.: CHROMATOGRAMMEN VOOR DE VERSCHILLENDE TRANSITIES VAN RESPECTIEVELIJK LSD, LSD-D3 EN 2-OXO-3-OH-LSD BIJ DE RINGTEST 028908FA238

49/57

6. BESLUIT De doelstelling van dit onderzoek was een methode ontwikkelen op basis van LCMS/MS om via urine het gebruik van LSD te kunnen opsporen. Hiervoor hebben we ons gericht op LSD en zijn belangrijkste metaboliet 2-oxo-3-OH-LSD, die in een hogere concentratie voorkomt én bovendien langer opspoorbaar is in de urine. Als interne standaard maken we gebruik van LSD-D3, een gedeutereerde vorm van LSD. Tot op vandaag wordt door het laboratorium Chemiphar de urine enkel gescreend via een ELISA test voor LSD. Deze kit bezit echter een lage crossreactiviteit voor 2-oxo-3-OH-LSD, waardoor er een kans bestaat op een vals negatief resultaat. Dit zou in de toekomst vermeden kunnen worden door gebruik te maken van de nieuw ontwikkelde methode.

Hierbij wordt aan de urine LSD-D3 toegevoegd, waarna een vloeistof/vloeistof extractie volgt op basis van hexaan/ethylacetaat (70/30). Het bekomen staal analyseren we via een XTerra® MS C18 kolom met een gradiënt bestaande uit oplossing A (0,15 % mierenzuur in ultrapuur water) en oplossing B (0,15 % mierenzuur in acetonitrile). De retentietijden van 2-oxo-3-OH-LSD en LSD/ LSD-D3 bedragen hierbij respectievelijk 9,3 en 10,7 minuten. De ionisatie in de massaspectrometer gebeurt via een positieve electrospray en er wordt gebruik gemaakt van 2 windows. Het eerste window onderzoekt enkel de gekozen transities van 2oxo-3-OH-LSD (356 > 237,1 en 356 > 338) en het tweede die van LSD en LSD-D3 (324 > 223,1 en 324 > 251,1 // 327 > 226,1 en 327 > 254,1). Naast de retentietijd moet voor de identificatie ook de ion ratio binnen grenzen van 30 % liggen van de waarden 17,182 (LSD) en 7,464 (2-oxo-3-OH-LSD).

LSD en 2-oxo-3-OH-LSD hebben een extractierendement van respectievelijk ongeveer 60 % en 0,40 %, met een voor LSD aanvaardbare herhaalbaarheid en intermediaire precisie. De ionsuppressie werd onderzocht en deze bedraagt voor LSD en 2-oxo-3-OH-LSD respectievelijk 32,7 % en 37,1 %. Hierdoor moeten de standaardcurven steeds opgesteld worden in urine. Lineariteit werd daarbij nagegaan en bevestigd binnen een range van 0 tot 5 ng/ml LSD. Voor 2-oxo-3-OH-LSD kunnen we geen lineariteit bekomen aangezien LSD-D3 geen goede interne standaard is. Daarom zijn exacte kwantitatieve resultaten voor 2-oxo-3OH-LSD uitgesloten, maar detectie en identificatie moet mogelijk zijn omwille van de hogere concentratie (ondanks het lage extractierendement).

50/57

De detectielimiet en kwantificatielimiet worden respectievelijk vastgelegd op 94 pg/ml en 188 pg/ml. De methode heeft een goede selectiviteit ten opzichte van blanco matrix, maar er kan nog verder onderzoek uitgevoerd worden naar de specificiteit. Er wordt bij de kwantificatie van LSD in urine voldaan aan de eisen voor accuraatheid, herhaalbaarheid en intermediaire precisie. Bij het rapporteren van een kwantitatief resultaat kunnen we met 95 % zekerheid stellen dat de werkelijke waarde maximaal 21,8 % zal afwijken van het bekomen resultaat.

51/57

7. LITERATUURLIJST

Aghajanian,

G.K.;

Marek,

G.J.

(1999).

Serotonin

and

hallucinogens.

Neuropsychopharmacology, 21, 16S-23S.

Barondes, S.H. (1996). Geestesziekten en moleculen. Nederlandse uitgave: Natuur en techniek.

Boqué, R.; Vanden Heyden, Y. (2009). The limit of detection. LCGC Europe, 22, issue 2.

Brandrup, E.; Vanggaard, T. (1977). LSD treatment in a severe case of compulsive neurosis. Acta Psychiatrica Scandinavica, 55, 127-141.

Canezin, J.; Cailleux, A.; Turcant, A.; Le Bouil, A. ; Harry, P. ; Allain, P. (2001). Determination of LSD and its metabolites in human biological fluids by high-performance liquid chromatography with electrospray tandem

mass spectrometry. Journal

of

Chromatography. B, Biomedical sciences and applications, 765, 15-27.

Cody, J.T.; Valtier, S. (1997). Immunoassay analysis of lysergic acid diethylamide. Journal of Analytical Toxicology, 21, 459-464.

Cohen, S. (1967). Psychotomimetic agents. Annual Review of Pharmacology, 7, 301-318

Cole, M.D. (2003). The Analysis of Controlled Substances. John Wiley & Sons, Ltd.

Dierick, M.; Ansseau, M.; D’Haenen, H.; Peuskens, J.; Linkowski, P. (2003). Handboek Psychofarmacotherapie. Academia Press Wetenschappelijke Uitgeverij.

Ebersole, B.J.; Visiers, I.; Weinstein, H.; Sealfon, S.C. (2003). Molecular basis of partial agonism: orientation of indoleamine ligands in the binding pocket of the human serotonin 5HT2A receptor determines relative efficacy. Molecular Pharmacology, 63, 36-43.

52/57

Favretto, D.; Frison, G.; Maietti, S.; Ferrara, S.D. (2007). LC-ESI-MS/MS on an ion trap for the determination of LSD, iso-LSD, nor-LSD and 2-oxo-3-hydroxy-LSD in blood, urine and vitreous humor. International Journal of Legal Medicine, 121, 259-265.

[FDA] Food and Drug Administration: Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, 2001.

Fuller, D.G. (1976). Severe solar maculopathy associated with the use of lysergic acid diethylamide (LSD). American Journal of Ophthalmology, 81, 413-416.

Fusar-Poli, P.; Borgwardt, S. (2008). Albert Hofmann, the father of LSD (1906-2008). Neuropsychobiology, 58, 53-54.

Grof, S. (1975). Realms of the human unconscious. Observations from LSD Research. New York, Viking Press.

Halpern, J.H.; Pope, H.G. (1999). Do hallucinogens cause residual neuropsychological toxicity? Drug and Alcohol Dependence, 53, 247-256.

Halpern, J.H.; Pope, H.G. (2003a). Hallucinogen persisting perception disorder: what do we know after 50 years? Drug and Alcohol Dependence, 69, 109-119.

Halpern, J.H. (2003b). Hallucinogens: an update. Current psychiatry reports, 5, 347-354.

Hofmann, A. (1980). LSD: My Problem Child. New York, McGraw-Hill.

http://www.ipm.uiuc.edu/bulletin/photos/barley_ergot.jpg (30/03/09) http://www.medicinescomplete.com/mc/martindale/2007/images/CLK0643C001.gif (30/3/09) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/80/Lysergic_acid_chemical_structure.png (30/03/09) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/af/LSD-2D,_3D.png (30/03/09) http://www.pathofysiologie.nl/images/010.JPG (02/04/09) http://www.neogen.com/LifeSciences/images/ELISA_Generic.jpg (30/3/09) http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm (02/04/09) 53/57

ISO 8258:1991 Shewart control charts.

Jaffe, J.H. (1990). Drug addiction and drug abuse. In: Goodman and Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman A.G., Rall T.W., Nies A.S., Taylor P. (Eds.), New York, Mc Graw-Hill, 532-581.

Johansen, S.S.; Jensen, J.L. (2005). Liquid chromatography-tandem mass spectrometry determination of LSD, iso-LSD, and the main metabolite 2-oxo-3-hydroxy-LSD in forensic samples and application in a forensic case. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 825, 21-28.

Klaessens, J.W.A. (2008). Statistiek, validatie en meetonzekerheid voor het laboratorium. Arnhem, Syntax Media.

Klette, K.L.; Anderson, C.J.; Poch, G.K.; Nimrod, A.C.; Elsohly, M.A. (2000). Metabolism of lysergic acid diethylamide (LSD) to 2-oxo-3-hydroxy LSD (O-H-LSD) in human liver microsomes and cryopreserved human hepatocytes. Journal of Analytical Toxicology, 24, 550-556.

Klette, K.L.; Horn, C.K.; Stout, P.R. (2002). LC-MS analysis of human urine specimens for 2-oxo-3-OH-LSD: method validation for potential interferants and stability study of 2-oxo-3OH-LSD under various storage conditions. Journal of Analytical Toxicology, 26, 193-200.

Kurland, A.A. (1985). LSD in the supportive care of the terminally ill cancer patient. Journal of Psychoactive Drugs, 17, 279-290.

Lewin, L. (1964). Phantastica, Narcotic, and Stimulating Drugs. Their Use and Abuse. London: Routledge and Kegan Paul.

Leysen, J.E.; Janssen, P.F.; Niemegeers, C.J. (1989). Rapid desensitization and downregulation of 5-HT2 receptors by DOM treatment. European Journal of Pharmacology, 163, 145-149.

54/57

Moffat, A.C.; Osselton, M.D.; Widdop, B. (2004). Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons in pharmaceuticals, body fluids and post-mortem material (Third edition). Pharmaceutical Press. London, UK. Lysergide: 1194-1196. Nelson, C.C.; Foltz, R.L. (1992). Determination of lysergic acid diethylamide (LSD), isoLSD, and N-demethyl-LSD in body fluids by gas chromatography/tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry, 64, 1578-1585.

Nichols, D.E. (2004). Hallucinogens. Pharmacology & Therapeutics, 101, 131-181.

O’Brien, C.P. (2001). Drug addiction and drug abuse. In: Goodman and Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics. Hardman, J.G.; Limbird, L.E.; Molinoff, P.B.; Ruddon, R.W.; Gilman, A.G. (Eds.), New York, Mc Graw-Hill, 574-639.

Passie, T. (1997). Psycholytic and psychedelic therapy research: A complete international bibliography. Laurentius Publishers. Hannover, Germany. 1931-1995.

Passie, T. (2008). The Pharmacology of Lysergic Acid Diethylamide: A Review. CNS Neuroscience & Therapeutics, 14, 295-314.

Paul, B.D.; Mitchell, J.M.; Burbage, R.; Moy, M.; Sroka, R. (1990). Gas chromatographicelectron-impact mass fragmentometric determination of lysergic acid diethylamide in urine. Journal of Chromatography, 529, 103-112.

Pitt, J.J. (2009). Principles and Applications of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Clinical Biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews, 30, 19-34.

Poch, G.K.; Klette, K.L.; Hallare, D.A.; Mangliemot, M.G.; Czarny, R.J.; McWhorter, L.K.; Anderson, C.J. (1999). Detection of metabolites of lysergic acid diethylamide (LSD) in human urine specimens: 2-oxo-3-hydroxy-LSD, a prevalent metabolite of LSD. Journal of Chromatography. B, Biomedical sciences and applications, 724, 23-33.

55/57

Reuschel, S.A.; Eades, D.; Foltz, R.L. (1999a). Recent advances in chromatographic and mass spectrometric methods for determination of LSD and its metabolites in physiological specimens. Journal of Chromatography. B, Biomedical sciences and applications, 733, 145159.

Reuschel, S.A.; Percey, S.E.; Liu, S.; Eades, D.; Foltz, R.L. (1999b). Quantitative determination of LSD and a major metabolite, 2-oxo-3-OH-LSD, in human urine by solidphase extraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology, 23, 306-312.

Reynolds, P.C.; Jindrich, E.J. (1985). A mescaline associated fatality. Journal of Analytical Toxicology, 9, 183-184.

Rivier, L. (2003). Criteria for the identification of compounds by liquid chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-multiple mass spectrometry in forensic toxicology and doping analysis. Analytica Chimica Acta, 492, 69-82.

Röst, L.C.M. (1992). De Grote Winkler Prins Encyclopedie. Elsevier, Amsterdam, Deel 16: moederkoren , 214-215.

Sewell, R.A.; Halpern, J.H.; Pope, H.G. Jr. (2006). Response of cluster headache to psilocybin and LSD. Neurology, 66, 1920-1922.

Shiloh, R.; Nutt, D.; Weizman, A. (1999). Atlas of psychiatric pharmacotherapy. Martin Dunitz Ltd., London, UK.

Sklerov, J.H.; Magluilo, J.Jr.; Shannon, K.K.; Smith, M.L. (2000). Liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry for the detection of lysergide and a major metabolite, 2-oxo-3-hydroxy-LSD, in urine and blood. Journal of Analytical Toxicology, 24, 543-549.

[SOFT / AAFS] Society of Forensic Toxicologist and American Academy of Forensic Sciences: Forensic toxicology laboratory guidelines (2006).

56/57

Strassman, R.J. (1984). Adverse reactions to psychedelic drugs. A review of the literature. The Journal of Nervous and Mental Disease, 172, 577-595.

Upshall, D.G.; Wailling, D.G. (1972). The determination of LSD in human plasma following oral administration. Clinica Chimica Acta, 36, 67-73. Van Bocxlaer, J.F.; Clauwaert, K.M.; Lambert, W.E.; Deforce, D.L.; Van Den Eeckhout, E.G.; De Leenheer, A.P. (2000). Liquid chromatography-mass spectrometry in forensic toxicology. Mass Spectrometry Reviews, 19, Chapter 21, 165-214.

Watson, D.; Jickells, S.; Negrusz, A. (2008). Clarke’s Analytical Forensic Toxicology. Jickells, S.; Negrusz, A. (Eds). Pharmaceutical Press, London,UK, 557-585.

Wiegand, R.F.; Klette, K.L.; Stout, P.R.; Gehlhausen, J.M. (2002). Comparison of EMIT II, CEDIA, and DPC RIA assays for the detection of lysergic acid diethylamide in forensic urine samples. Journal of Analytical Toxicology, 26, 519-523.

Winkelman, M.J.; Roberts, T.B. (2007). Psychedelic medicine: New evidence for hallucinogenic substances as treatments. Greenwood, Westport, CT.

Wu, A.H.B.; Feng, Y.J.; Pajor, A.; Gornet, T.G.; Wong, S.S.; Forte, E.; Brown, J. (1997). Detection and interpretation of lysergic acid diethylamide results by immunoassay screening of urine in various testing groups. Journal of Analytical Toxicology, 21, 181-184.

57/57