HPLC‐MS és HPLC‐MS/MS
Bobály Balázs, Fekete Jenő
Készülék felépítése (melyik „a műszer”?) MS
LC
Patm
ionforrás
tömeganalizátor
detektor
10-3 torr
10-6 torr
1 ml mozgófázisból keletkező gáz atm nyomáson mozgófázis
víz
gáztérfogat (ml)
1700
acetonitril metanol 554
685
THF
n‐C7
kloroform
341
208
342
Ionkromatogram, tömegspektrum: I(m/z)
HPLC
UHPLC
Atmoszférikus nyomású ionizáció (API) APPI: atmoszférikus nyomású fotoionizáció – 2% APCI: atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció ‐ 5% ESI: elektroporlasztásos ionizáció ‐ 93% MALDI: mátrix‐segített lézerdeszorpciós ionizáció Polaritás kérdése: +/‐ mód?
Lágy ionizációs technikák: ‐ Ionizáció során ritkán van fragmentáció, ehhez ütközőcella/ioncsapda kell ‐ A spektrumban főként kvázimolekulaion és adduktok jelennek meg [M‐H]‐, [M+NH4]+, stb.. ‐Az MS/MS spektrum sem gazdag fragmensekben (ált. max 4‐5 csúcs) ‐Az spektrum jellege (megjelenő ionok és intenzitásuk) készülékfüggő: nincs univerzális spektrumkönyvtár, csak „házi”
LC‐MS
Elektroporlasztásos ionizáció (ESI) Atmoszférikus nyomás
10‐3 torr, első 10‐6 torr, második vákuumlépcső vákuumlépcső ellenáramú N2 szárítógáz
töltött folyadék
mozgófázis az LC‐ről
fűtött N2 szárítás
porlasztó N2 Taylor‐ aeroszol kónusz nyaláb
mintázó kónusz
gázfázisú ionképződés
fűtött kapilláris, 3‐5 kV
deszolvatáció, ionképződés
tömeganalizátor ionoptika
Elektroporlasztásos ionizáció (ESI) Kismolekula
Makromolekula
fragmens ion
17 kDa
Intenzitás (%)
[M+H]+
myoglobin
[M+Na]+
[M+K]+
izotópcsúcsok
m/z
Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (APCI) H2O-e-→H2O+ H2O++H2O→H3O++OHH3O++M→H2O+[MH]+
fűtött tömb porlasztó gáz LC
fűtött N2 szárítás
1. Oldószermolekulák ionizációja
köpeny gáz oldószer molekula mintakomponens
ellenáramú N2 szárítógáz
korona kisülési tű ~5 µA
2. Kvázi molekulaionok, adduktok képződése
ellenáramú N2 szárítógáz
Atmoszférikus nyomású fotoionizáció (APPI) Direkt ionizáció: M+hν→M.++eM.++H.→[MH]+
Indirekt ionizáció: dopant (pl. toluol) poszt-kolonna adagolása a mozgófázishoz LC
T‐csatlakozó
MS
make‐up, dopant (ld. APPI)
Me-O2-C20H30, apoláris molekula, APCI/APPI ionizáció működik jobban
Felbontás M/ΔM
Milyen tömegről beszélünk?
Mennyiségi meghatározás ‐ Ionizációs hatásfok mátrixfüggő, az érzékenység 20‐40%‐ot is változhat! ‐Kötelező a belső std, vagy addíciós módszer! ‐Legjobb belső std‐ek: C13 izotópjelzett, vagy deuterált analógok (D cserélődhet H‐ra)
Pufferek kiválasztása
Illékony puffer lehet (nem illékony csak nagyon rövid ideig). Szerves aminok, mint additívek használatát kerülni kell!!!
Analizátorok‐kvadrupól tömeganalizátor (Q) detektálás kvadrupól rudak
kilépő nyílás (detektor felé)
ionok stabil pályájú ion
belépő nyílás (forrás felől)
instabil pályájú ion egyen‐ és váltófeszültség
Analizátorok‐kvadrupól tömeganalizátor (Q) 1.
2.
‐
+
+
+
‐
y
‐
+ ‐
+
+
kvadrupól rudak
z x
3.
4.
‐
pozitív ion
+ +
+
+
+
‐
‐
‐ +
Adott m/z stabilis pályáját a DC mértéke, valamint az AC frekvenciája együttesen határozza meg. ‐Egységnyi felbontás ‐Robusztus ☺ ‐Olcsó ☺ ‐m/z 50‐3000 tartomány ‐Tömeginformációt nyújt, plusz szelektivitás
Analizátorok‐kvadrupól tömeganalizátor (Q) SIM‐mód
SCAN‐mód
‐Adott m/z követése, nagyobb érzékenységgel
‐Adott tömegtartomány pásztázása kisebb érzékenységgel
‐AC/DC beállítások nem változnak a mérés során ‐Kvantira alkalmas
‐AC/DC beállítások változnak a mérés során. Az analizátor egyszerre csak adott m/z‐t ereszt át, majd vált a következő m/z‐re
Analizátorok ‐ repülési idő tömeganalizátor (ToF)
ionáram
merőleges kigyorsítás (impulzus szerű)
ToF gyorsító elektród
%
ionoptika, koherens ionnyaláb
Kisebb m/z ionok jobban felgyorsulnak, repülési idejük rövidebb. Nagyobb m/z ionok repülési ideje hosszabb.
detektor m/z
Azonos m/z ionok, a gyorsító elektródtól való eltérő távolság miatt eltérő Ekin‐re tesznek szert.
%
belépő nyílás
reflektron ToF
m/z ionok pályája repülési cső reflektron gyűrű alakú elektródok, (iontükör)
‐10‐20000 felbontás ☺ ‐Kevésbé robusztus, kalibráció ‐Drágább ‐Egész tömegtartomány gyors pásztázása ☺ ‐m/z 50‐10000 (rToF) ‐m/z 50‐106 (ToF, kisebb felbontás) ‐Tömeginformációt nyújt, plusz szelektivitás ‐Inkább kvalira alkalmas, pontos tömeg mérése (1‐10 ppm)
Analizátorok – ioncsapda típusú analizátorok, itt: Orbitrap szigetelés
ionpálya
belépő nyílás
külső elektród
Különböző m/z ionok eltérő frekvenciával oszcillálnak a csapdában, az eredő frekvencia függvényt felbontva és FT‐va számítható a tömegspektrum (FT‐IR, FT‐NMR)
belső elektród
oszcilláció
Akár 300000 felbontás ☺ Méregdrága Szerkezetfelderítés nagyágyúja az NMR mellett, pontos tömeg mérése
detektor elektród 2 Fourier‐ transzformáció erősítés
frekvencia jel
%
detektor elektród 1
m/z
prekurzor ion
+
semleges fragmentum
mobilitás
+
aktiváció, fragmentáció
mobilitás
Tandem tömegspektrometria: mennyiségi meghatározás szelektív átmenetek
MS/MS
termék (fragmens) ion
Leggyakoribb: ütközéses aktiváció (Collision Induced Dissociation)
Tandem tömegspektrometria: hármas kvadrupól (QqQ) Q1 1) Termékion pásztázás
Ar
q2
Q3
Q1 SIM
q2 CID
Q3 SCAN
Q1 SIM
q2 CID
Q3 SIM
Q1 SCAN
q2 CID
Q3 SIM
Q1 SCAN
q2 CID
Q3 SCAN (Δ m/z)
2) Kiválasztott átmenet detektálása 3) Prekurzor ion pásztázás 4) Semleges vesztés pásztázása
SIM/SRM/MRM/sMRM
SRM
SIM
Tandem tömegspektrometria: mennyiségi meghatározás sMRM mennyiségi meghatározásra UHPLC módszerrel
intenzitás
6 perc mérési idő 2,2 ml/min 256 komponens monitorozása ~5 másodperc széles csúcsok
intenzitás
intenzitás
intenzitás
Idő (perc)
A komponensek termékion (product ion scan) spektrumai
Hibrid készülékek: IM‐QToF tömegkalibráció ion‐ ion‐ optika optikai KVADRUPÓL mozgófázis LC‐ről
IONMOBILITÁS MS ETD
IM
CID
ION‐ FORRÁS
elővákuum
nagyvákuum
ion‐ ion‐ csapda mobilitás csapda cella (CID) (ETD)
KETTŐS REFLEKTRON TOF
gyorsító elektród
detektor
IM‐MS (izomerek‐izobárok elválasztása) Vd=KE
t1
1 t2
t3
2
3
Orbitrap Fusion Orbitrap tömeganalizátor
Lineáris ioncsapda detektorok
Ionoptika
Kvadrupól tömeganalizátor
Alacsony nyomású Magas cella nyomású cella Ionoptika C‐ioncsapda
S‐lencsék (ionoptika) Ionforrás
Felső tömeghatár (m/z)
Q
LIT
ToF
ToF reflektron
Orbitrap
4000
6000
>106
10000
50000
4000
5000
20000
100000
100
200
10
<5
pulzus
pulzus
pulzus
pulzus
Felbontás (m/z 2000 (egységnyi) 1000‐nél) Tömegpontosság 100 (ppm) Iondetektálás folyamatos módja Alkalmazott vákuum (torr)
10‐5
10‐3
10‐6
10‐6
10‐10
Tandem MS
MS/MS
MSn
‐
MS/MS (QToF)
MS/MS (Fusion)
Alkalmazás Ár
kvanti (szerkezet) szerkezet (kvanti) szerkezet (kvanti) szerkezet (kvanti) szerkezet (kvanti) +
+
++
++
++++
Melyik „a műszer”? MS ‐Szelektív és érzékeny… …ha az anyag hajlandó ionizálódni ‐$$$ ‐Nem univerzális, nem old meg minden problémát ‐Izobárokat továbbra is el kell választani ‐Bonyolult mátrixokhoz, nyomelemzéshez (≥ppt/ppq), szerkezeti információ
LC (optikai detektorok) ‐ kevésbé érzékeny (kiv. FL) ‐ kevésbé szelektív ‐ Sokkal olcsóbb ‐Nem univerzális, kromofór, vagy egyéb mérhető fiz. tul. ‐Az árat a módszerfejlesztéssel kell megfizetni ‐Egyszerűbb mátrixok, minor komponensek elemzése (≥ppb)
