Monitorování hladin etoposidu a topotekanu pomocí kapalinové chromatografie při periokulární a intravitreální aplikaci v terapii retinoblastomu Klapková E1., Petrušková D2., Pochop P2., Průša R1. 1) Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2) Oční klinika dětí a dospělých 2. LF UK a FN Motol
24.9.2012
Retinoblastom • primární zhoubný nádor sítnice, který
vychází z embryonálních nediferencovaných i diferencovaných retinoblastů
• 70 % jednostranné nádory, většinou na podkladě
nedědičné somatické mutace
• charakteristika: rychlý růst, záhy vyplňuje sklivcovou
dutinu, po úplném postižení bulbu prorůstá do orbity, optického nervu a do CNS
• projevy: strabismus, leukokorie (Beerův příznak)
zornice - světlá, šedobílá či nažloutlá, ztuhlá amauroticky
• metastázy: kostní dřeň, kosti, plíce,
CNS
• možnosti léčby: laserová terapie
chirurgická léčba radioterapie chemoterapie
aplikace cytostatik přímo do nádoru
Současná terapie pokročilých forem retinoblastomu •
Pokročilá forma retinoblastomu = skupina C a D podle International Intraocular Retinoblastoma
Classification (IRC, ABC klasifikace) – Murphree, 2005 = skupina IV a V podle Reese-Ellsworth • CHEMOREDUKCE + LOKÁLNÍ OČNÍ TERAPIE: úspěch v 85 % (IRC A,B) x v 47 % (IRC C,D)*
zvýšení úspěšnosti záchranné terapie: Intenzifikace chemoterapie Lokální aplikace chemoterapie
Etopozid
Topotekan
derivát kamptotecinu
derivát podofylotoxinu s glykosidicky navázanými substituenty
Aplikace
Aplikace
nádory plic, pleury, mediastina,
karcinom plic, ovárií,
trávicí trubice, gynekologické nádory,
retinoblastom
retinoblastom
Vedlejší účinky
Vedlejší účinky
nausea, zvracení,
nausea, zvracení, průjem, obstipace, mukozitida
hematotoxicita (leukopenie,
hematotoxicita (leukopenie,
trombopenie)
trombopenie, neutropenie, anémie)
? účinné, netoxické, snesitelné koncentrace
Cíl stanovení koncentrací – sklivec, periferní krev výpočet AUC
(Cílová AUC ve sklivci pro etoposid2: 276 – 492 μg/ml.h Cílová AUC ve sklivci pro topotekan3: 0,12 – 0,18 μg/ml.h)
sledování toxicity etopozidu a topotekanu najít ideální techniku a způsob aplikace cytostatik na modelu králičího bulbu 2
Lowis SP, Price L et al. (1998). A study of the feasibility and accuracy of pharmacokinetically guided etoposide dosing in children. Br J Cancer 77:2318-2323. 3 Stewart CF, Iacono LC et.al. (2004). Results of a phase II upfront window of pharmacokinetically guided topotecan in high-risk medulloblastoma and supratentorial primitive neuroectodermal tumor. J Clin Oncol 22:3357-3365.
Metody "In vivo" experiment byl schválen etickou komisí pro ochranu zvířat podle vyhlášky č.207/2004 s.11 Ministerstva zemědělství České Republiky 24 zdravých, dospělých Novozélandských bílých králíků Samci o váze 2,59 ± 0.38 kg Levé bulby byly u všech králíků ponechány bez aplikace jako bulby kontrolní
Metody Aplikace etopozidu 2,5 mg ET periokulárně 0,5 mg ET intravitreálně
Periokulární aplikace
Aplikace topotekanu 1 μg topotekanu intravitreálně 2 μg topotekanu intravitreálně Odběr vzorků (sklivec, plazma) 1., 2., 6. hodině 1., 2., 7., 14. den 3. týden
Intravitreální aplikace
Kapalinový chromatograf Agilent 1200
degasser kvartérní pumpa autosampler termostat kolon DAD detektor
HPLC - Etopozid příprava vzorku 200 μl vzorku + 20 μl I.S. (difenylhydantoin) protřepat přidat 5 ml dichlormetanu 5 min třepat centrifugace (5 min, 3000 ot/min) odpipetovat 4 ml org. vrstvy sušení při 37 °C rozpuštění odparku ve 100 μl MF
Chromatografické podmínky DAD detektor, 229 nm MF: ACN:metanol:voda (45:20:35) průtok MF: 1,0 ml/min kolona: kolona Supelcosil LC-18, 15 cm x 4,6 mm x 5µm t: laboratorní
Záznam analýzy
etopozid
I.S.
Kato Y. et al., Journal of Chromatography 57, 21-24, 2003
Koncentrace etopozidu ve sklivci při intravitreální aplikaci
Koncentrace etopozidu v plazmě
HPLC - Topotekan příprava vzorku 100 μl vzorku + 200 μl metanolu 10 s třepat centrifugace (5 min, 14 000 ot/min, 4 °C) 50 μl nástřik
Chromatografické podmínky DAD detektor, 267 nm MF: ACN:0,01 M KH2PO4 (85:35) průtok MF: 1,5 ml/min kolona: Inertsil ODS 3V, 15 cm x 4,6 mm x 5µm t: 25 °C
Záznam analýzy
topotekan
Koncentrace topotekanu ve sklivci při intravitreální aplikaci
Koncentrace topotekanu v plazmě při intravitreální aplikaci
Koncentrace topotekanu v levém oku při intravitreální aplikaci 2 μg 0,16 0,14
koncentrace (ug/ml)
0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1
2
3
králíci
4
5
6
VÝSLEDKY Etopozid
Periokulárně Sklivec: nulová koncentrace Plazma: 1,9 – 7,7 μg/ml AUC: 374,7 μg/ml.h Intravitreálně Sklivec: 87 – 251 μg/ml Plazma: 1,9 – 3,2 μg/ml AUCsklivec: 928,7 μg/ml.h AUCplazma: 233,1 μg/ml.h
Topotekan
Intravitreálně 1 μg Sklivec: 0,24 – 0,46 μg/ml Plazma: 0 – 0,36 μg/ml AUCsklivec: 2,155 μg/ml.h AUCplazma: 1,067 μg/ml.h Intravitreálně 2 μg Sklivec: 0,66 – 1,35 μg/ml Plazma: 0,25 – 0,81 μg/ml AUCsklivec: 5,338 μg/ml.h AUCplazma: 3,136 μg/ml.h
ZÁVĚR • peribulbární aplikací nelze docílit terapeutických hladin cytostatik ve sklivci králíka • stabilní terapeutické hladiny byly dosaženy intravitreální aplikací •transkorneální intravitrealní aplikace se ukázala nejvhodnějším způsobem aplikace cytostatik do sklivcového prostoru králičího bulbu pro snížení rizika diseminace tumoru •přímá aplikace cytostatik do sklivce by mohla být u vybraných případů zavedena do praxe
Práce byla podpořena granty IGA MZd ČR NR/9532-3/2007 a GAUK 63008
Děkuji Vám za pozornost
