Molekulární genetika II
Ústav biologie a lékařské genetiky 1.LF UK a VFN, Praha
Polymorfismy lidské DNA vyu ívané ve vazebné analýze, p ímé a nep ímé diagnostice Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) STR…short tandem repeats, SSR…simple sequence repeats
TAGCCATCGGTACACACACACACACACAGTGCTTCAGTAGC TAGCCATCGGTACACACACACACAGTGCTTCAGTAGCGTAG Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude tento polymorfismus ve vazbě s mutovanou alelou a ve většině případů bude současně s ní předáván z rodičů na potomky (kosegregace) a bude možné jej využít jako marker i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění.
Úkol č. 2, str. 81 – Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I Aa
II
1
1
aa
2
2
3
A B C D a) Riziko postižení pro II/3 i II/4 je 50%.
4
Úkol č. 2, str. 81 – Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I Aa
II
1
aa
1
A B C D
A
2
2
3
A
a a
a a
a a
a) Riziko postižení pro II/3 i II/4 je 50%. b) Riziko postižení pro II/3 je 95%. b) Riziko postižení pro II/4 je 5%.
4
Nondisjunkce u Downova syndromu
Tři rodokmeny rodin s dětmi postiženými Downovým syndromem (prostá trisomie). Výsledek analýzy DNA – tetranukleotidového polymorfismu na chromozómu 21 - je znázorněn pod rodokmeny. Od kterého z rodičů zdědilo dítě třetí kopii chromozómu 21? V kterém meiotickém dělení došlo k nondisjunkci?
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Meióza I u matky
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Meióza I u matky
Meióza II u matky
Úkol č. 1, str. 95, PKU I Aa
1
Aa
2
II 1
2
3
aa A
a
A
AA
aA
a
Aa
aa
2/3 Aa, 1/3 AA
Nemá PKU
A
a
A
AA
aA
a
Aa
aa
1/2 Aa, 1/4 AA, 1/4 aa
Prenatální dg. v té době nebyla možná. Riziko 25% umožňovalo rodičům požádat o ukončení těhotenství ze zdravotních (genetických) důvodů. Screening po narození dítěte by odhalil onemocnění, dietní opatření by umožnila relativně příznivý vývoj
Úkol č. 2a, str. 95, PKU (incidence 1/10000) I
1
2
Aa
3
Aa
4
II 1
2
1/50 Aa
2/3 Aa
1/2
a
a
3
aa
4
2/3 Aa
1/2
1/50 x ½ x 2/3 x ½ = 2/600 = 1/300 q2 = 1/10000 q = 1/100 2pq = 2 x 99/100 x 1/100 = 1/50
Riziko postižení nízké, zátěžové testy v případě PKU málo přesné, lze doporučit DNA analýzu. Je nutné mít dostatek času na provedení vyšetření DNA v obou rodinách !! Jinak není možné přistoupit k prenatální dg.
Úkol č. 2b-1, str. 95, PKU (incidence 1/10000)
I
1
2
Aa
3
Aa
4
II 2
1
1/50 Aa
1/2
aa a
a
1
1/50 x ½ x 1 = 1/100 q2 = 1/10000 q = 1/100 2pq = 2 x 99/100 x 1/100 = 1/50
3
4
2/3 Aa
2/3 Aa
Úkol č. 2b-2, str. 95, PKU (incidence 1/10000)
I
1
2
Aa
3
Aa
4
II 1
2
1/50 Aa
2/3 Aa
1/2
a
a
3
aa
1/2
1/50 x ½ x 2/3 x ½ = 2/600 = 1/300 q2 = 1/10000 q = 1/100 2pq = 2 x 99/100 x 1/100 = 1/50
4
2/3 Aa
Úkol č. 3, str. 96, PKU
I Aa
1
Aa
2
II 1
1 2
aa
A
A
a
a
2
3
A aa
AA
a
a) ANO, rodina je informativní z hlediska genotypu dětí. b) Intragenová sonda, dcera tedy JE heterozygotní. c) Intragenová sonda, syn tedy JE dominantní homozygot. d) Jedná se o nepřímou diagnostiku, NELZE využít mimo kontext dané rodiny. 5
Úkol č. 4, str. 96 R408W (Sty I)
*
Mutovaná alela R408W
Normální alela +
108 bp
137 bp
245 bp
Úkol č. 4a, str. 96-97 I
1
3
2
4
II 3
2
1
4
?
245 137 108
+/+
R408W / +
R408W / +
+/+
+/+
R408W / +
Úkol č. 5, str. 97-98 – výsledky SSCP pro EXON č. 6 I
1
3
2
4
II 3
2
1
4
? GENOTYP +/ +
R408W / +
+/+
Mutace v 6. exonu (6mut)
+/ +
+/+
6mut / + R408W / +
6mut / +
R408W / +
+/+
+/ +
R408W / +
6mut / +
6mut / +
9
Úkol č. 4c,d, str. 97 I
1
3
2
4
II Aa R408W / +
3
2
1
4
Aa ?
mut / + A
A
a
a
A aa
AA
a
c) Bylo by lepší znát druhou mutaci v rodině snoubenky, kterou musí mít II/3 a nejspíše i I/3. Spojením s nepřímou diagnostikou bychom mohli stanovit genotyp nenarozeného potomka snoubenců. Klinický genetik rozhodne, zda v této fázi prenatální vyšetření nabídnout snoubencům. d) Pátrání po druhé mutaci v rodině snoubenky (ETIKA - poučený souhlas !)
Úkol č. 5, str. 97-98 – výsledky SSCP pro EXON č. 6 I
1
3
2
4
II 3
2
1
4
? GENOTYP +/ +
R408W / +
+/+
Mutace v 6. exonu (6mut)
+/ +
+/+
6mut / + R408W / +
6mut / +
R408W / +
+/+
+/ +
R408W / +
6mut / +
6mut / +
Úkol č. 5, str. 97-98
b) Biopsie trofoblastu (odběr 10.-12. týden gravidity), amniocyty po 15.-16. týdnu gravidity MOŽNÉ POSTUPY • nepřímá DNA analýza (RFLP), po doplnění vyšetření v rodině snoubence, pokud bude informativní • přímá DNA analýza R408W, SSCP 6.exonu • kombinace obou předchozích • bude-li v době gravidity určena 6mut – přímá analýza • sekvenování
Metodu volí specialista v laboratoři.
Úkol č. 5, str. 97-98
Poznámka: Dle současných platných právních a etických norem: c) Odběr tkáně za účelem izolace a vyšetření DNA je vázán na poučený souhlas „pacienta“. U nezletilých o vyšetření rozhodují zákonní zástupci. d) Od okamžiku, kdy je známo, že snoubenci jsou heterozygotní, je možno na žádost ženy indikovat ukončení gravidity ze zdravotních (genetických) příčin pro 25% (vysoké) riziko závažné vady či choroby plodu. Teoreticky až do 24. týdne gravidity.
