Molekuláris Orvostudományok (Multidiszciplináris Orvostudományok) Doktori Iskola
DIABETOLÓGIAI ALAP- ÉS KLINIKAI KUTATÁSOK: A SZIGETSEJT MŰKÖDÉS, VALAMINT A DIABETESES RETINOPATHIA PATHOGENEZISÉNEK TANULMÁNYOZÁSA
Doktori (Ph.D.) értekezés
Dr. Dura Eszter
Témavezető: Dr. Romics László, akadémikus, egyetemi tanár Szigorlati bizottság: Dr. Somogyi János, egyetemi tanár Dr. Gerő László, egyetemi tanár Dr. Halmos Tamás, osztályvezető főorvos Hivatalos bírálók: Dr. Gerő László, egyetemi tanár Dr. Wittmann István, egyetemi docens
Semmelweis Egyetem Budapest 2002
TARTALOMJEGYZÉK 1.
BEVEZETÉS .....................................................................................................................................6
2.
IRODALMI HÁTTÉR......................................................................................................................7 2.1
AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ FIZIOLÓGIÁJA .............................................................................................7
2.1.1
A pancreas Langerhans-szigetek szöveti felépítése ..............................................................7
2.1.2
Az insulin szekréciót befolyásoló tényezők ...........................................................................7
2.1.3
Glukózzal indukált insulin szekréció.....................................................................................8
2.1.3.1
A D-glukóz metabolizmus szerepe az insulin szekrécióban. A glukóz-szenzor funkció .............. 10
2.1.3.2
Iontranszport folyamatok.............................................................................................................. 11
2.1.3.3
Mechanikai folyamatok ................................................................................................................ 11
2.1.3.4
Sejtek közötti kölcsönhatások, a sejtek heterogenitásának szerepe .............................................. 12
2.1.4
Nem-glukóz insulinotróp hatások .......................................................................................12
2.1.4.1
2.1.4.1.1
Az aminosavak tápanyag szerepe az insulin szekrécióban................................................. 13
2.1.4.1.2
Bázikus aminosavak hatása a pancreas B-sejtek insulin szekréciójára .............................. 13
2.1.4.2
Dikarbonsavak metil-észterei ....................................................................................................... 13
2.1.4.3
Hormonok és neurotranszmitterek szabályozó szerepe ................................................................ 14
2.1.5 2.2
AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ ZAVARA ....................................................................................................15 A "G-kvintett" .....................................................................Hiba! A könyvjelző nem létezik.
2.2.2
Glukotoxicitás.....................................................................................................................17
2.2.2.1
Glukóz-deszenzitizáció és glukotoxicitás a B-sejtekben .............................................................. 17
2.2.2.2
A glukotoxicitás és következményei az extrapancreatikus szövetekben ...................................... 16
A DIABETES MIKROVASZKULÁRIS SZÖVŐDMÉNYEI........................................................................18
2.3.1
A diabeteses retinopathia epidemiológiája.........................................................................18
2.3.2
A diabeteses retinopathia rizikótényezői ............................................................................18
2.3.3
A diabeteses retinopathia pathogenezise............................................................................20
2.4
4.
Az insulin szekréció hosszú távú szabályozása ...................................................................14
2.2.1
2.3
3.
Az aminosavak insulinotróp hatása .............................................................................................. 12
A MULTIFUNKCIONÁLIS MOLEKULA: A SZEMIKARBAZID-SZENZITÍV AMINOXIDÁZ ENZIM .............21
CÉLKITŰZÉSEK ...........................................................................................................................23 3.1
IN VITRO KÍSÉRLETEK ....................................................................................................................23
3.2
VIZSGÁLATOK DIABETESES RETINOPATHIÁBAN .............................................................................25
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .....................................................................................................26 4.1
IN VITRO KÍSÉRLETEKBEN HASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...................................................26
4.1.1
Kísérleti állatok ..................................................................................................................26
4.1.2
Anyagok ..............................................................................................................................26
4.1.3
Az aminosav keverék összetétele és elkészítése...................................................................26
4.1.4
Módszerek...........................................................................................................................27
4.1.4.1
Pancreas szigetek izolálása ........................................................................................................... 27
4.1.4.2
Pancreas szigetek inkubálása........................................................................................................ 29
4.1.4.3
Pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása ............................................................. 30
4.1.4.4
A szigetek insulin tartalmának mérése ......................................................................................... 31
2
4.1.4.5
Izolált pancreas szigetek 45Ca felvételének mérése ...................................................................... 31
4.1.4.6
Diszperz pancreas szigetsejt szuszpenzió izolálása ...................................................................... 32
4.1.4.7
Tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított pancreas non-B-szigetsejtek nyerése..................... 33
4.1.4.8
D-glukóz metabolizmus vizsgálata............................................................................................... 34
4.1.4.8.1
Az extracelluláris és intracelluláris megoszlási terek meghatározása pancreas szigetekben.
A 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz transzportja .............................................................................................. 34 4.1.4.8.2
D-[5-3H]glukóz felhasználás vizsgálata. D-[5-3H]glukóz átalakítása 3HOH-vá................. 35
4.1.4.8.3
A D-[U-14C]glukóz oxidáció vizsgálata. D-[U-14C]glukóz átalakítása 14CO2-vé ............... 36
4.1.4.8.4
D-[U-14C]glukóz átalakítása 14C-jelzett savas metabolitokká ............................................ 37
4.1.4.8.5
D-[U-14C]glukóz átalakítása 14C-jelzett aminosavakká...................................................... 37
4.1.5 4.2
5.
Statisztikai feldolgozás .......................................................................................................37
KLINIKAI VIZSGÁLATOKBAN ALKALMAZOTT MÓDSZEREK.............................................................38
4.2.1
Beteg kiválasztás.................................................................................................................38
4.2.2
Anamnézis, belgyógyászati vizsgálat ..................................................................................38
4.2.3
Szemészeti vizsgálat............................................................................................................39
4.2.4
Laboratóriumi vizsgálatok..................................................................................................43
4.2.5
SSAO meghatározás ...........................................................................................................43
4.2.6
Statisztikai elemzés .............................................................................................................44
EREDMÉNYEK ..............................................................................................................................45 5.1
INSULIN SZEKRÉCIÓS VIZSGÁLATOK IZOLÁLT PANCREAS SZIGETEKBEN ........................................45
5.1.1
Fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék hatása az izolált szigetek insulin
szekréciójára .....................................................................................................................................45 5.1.1.1
Izolált patkány pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása D-glukóz jelenlétében. 45
5.1.1.2
Fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék hatása a különböző D-glukóz koncentrációk által
kiváltott insulin szekréciós válaszra .............................................................................................................. 45 5.1.1.3
A szigetek insulin tartalma ........................................................................................................... 46
5.1.1.4
Az insulin szekréció arányának időfüggése .................................................................................. 47
5.1.2
Az aminosav keverék összetétel változtatásának hatása a pancreas szigetek insulin
szekréciójára .....................................................................................................................................48 5.1.2.1
Taurin szerepe aminosav keverékben ........................................................................................... 48
5.1.2.2
Bázikus aminosavak szerepe az aminosav keverékben ................................................................ 48
5.1.2.3
Az L-glutamin szerepe az aminosav keverékben.......................................................................... 50
5.1.2.4
Az elágazó szénláncú aminosavak szerepe az aminosav keverékben ........................................... 50
5.1.2.5
Az L-alanin szerepe az aminosav keverékben .............................................................................. 50
5.1.3
Insulinotróp anyagok hatása a 8.3 mM D-glukózzal kiváltott inzulin szekrécióra az
aminosav keverék jelenlétében ..........................................................................................................52 5.1.3.1
A glibenclamid és a forskolin hatása ............................................................................................ 52
5.1.3.2
A forskolin és a teofillin hatása .................................................................................................... 53
5.1.3.3
A teofillin és a cytochalasin B hatása ........................................................................................... 54
5.1.4
Az aminosav keverék hatása pancreas szigetek 45Ca nettó felvételre .................................55
5.1.5
A cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek insulin szekréciójára...............56
5.1.5.1
Izolált patkány pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása D-glukóz jelenlétében. 56
5.1.5.2
Cytochalasin B és cytochalasin D koncentrációk kiválasztása az izolált pancreas szigetek insulin
szekréciójának vizsgálatához ........................................................................................................................ 56
3
5.2
5.1.5.3
A cytochalasin B és D hatása a D-glukózzal előidézett insulin szekrécióra ................................. 58
5.1.5.4
A cytochalasin B és D hatása a nem-glukóz tápanyagokkal kiváltott insulin szekrécióra ............ 60
A GLUKÓZ METABOLIZMUS VIZSGÁLATA IZOLÁLT PANCREAS SZIGETEKBEN ÉS TISZTÍTOTT
PANCREAS SZIGETSEJTEKBEN .................................................................................................................61
5.2.1
Izolált pancreas szigetek D-glukóz metabolizmusának vizsgálata......................................61
5.2.1.1
A glukóz transzport és megoszlási terek vizsgálata. Cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas
szigetek 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz felvételére ........................................................................................... 61 5.2.1.2
A cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek D-glukóz metabolizmusára................ 63
5.2.1.3
Az aminosav keverék hatása pancreas szigetekben a D-glukóz anyagcserére .............................. 64
5.2.2
Tisztított pancreas szigetsejtek D-glukóz metabolizmusának vizsgálata ............................65
5.2.2.1
Cytochalasin B hatása a pancreas diszperz szigetsejt szuszpenzió D-glukóz metabolizmusára ... 65
5.2.2.2
A D-[5-3H]glukóz metabolizmusa tisztított pancreas B-sejtekben és tisztított non-B-sejtekben .. 66
5.2.2.3
Tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított non-B-szigetsejtek D-[U-14C]glukóz oxidációja ... 68
5.2.2.4
D-[U-14C]glukóz átalakulás 14C-jelzett aminosavvá és 14C-jelzett savas metabolitokká, tisztított B-
szigetsejtekben és tisztított non-B-szigetsejtekben........................................................................................ 69
5.3
6.
VIZSGÁLATOK DIABETES RETINOPATHIÁBAN ................................................................................72
5.3.1
SSAO aktivitás értékek a retinopathia különböző stádiumaiban ........................................72
5.3.2
Vizelet albumin ürítés .........................................................................................................72
5.3.3
A diabetes időtartama.........................................................................................................75
5.3.4
A diabetes mellitust jellemző paraméterek .........................................................................75
MEGBESZÉLÉS .............................................................................................................................76 6.1
IN VITRO KÍSÉRLETEK EREDMÉNYEINEK ÉRTÉKELÉSE ....................................................................76
6.1.1
Insulin szekréciós vizsgálatok izolált pancreas szigetekben ...............................................76
6.1.2
A cytochalasin B és D hatása az insulin szekrécióra..........................................................79
6.1.3
A glukóz metabolizmus vizsgálata izolált pancreas szigetekben és tisztított pancreas
szigetsejtekben ...................................................................................................................................80 6.2 7.
KLINIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK MEGBESZÉLÉSE ................................................................82
KÖVETKEZTETÉSEK..................................................................................................................87 7.1
AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ ZAVARAINAK FARMAKOLÓGIAI ÉS TERÁPIÁS VONATKOZÁSAI ..................87
7.2
A DIABETES MIKROVASZKULÁRIS SZÖVŐDMÉNYEINEK TERÁPIÁS LEHETŐSÉGEI ...........................89
8.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.........................................................................................................91
9.
IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................................92
10.
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK...........................................................................................................106
10.1
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ..............................................106
10.2
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁN KÍVÜL MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ........................................107
10.3
TUDOMÁNYOS ELŐADÁSOK, POSZTEREK, TOVÁBBKÉPZŐ ELŐADÁSOK....................................108
10.3.1
Az értekezés témájában.....................................................................................................108
10.3.2
Az értekezés témáján kívül ................................................................................................110
11.
ÖSSZEFOGLALÓ........................................................................................................................112
12.
SUMMARY ...................................................................................................................................113
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
AGE ALT ATP BB BMI BSA cAMP DCCT DM DMSO DNS DR EGTA ETDRS FAD FLAG FSK GGT GLP-1 GLUT HbA1c HEPES HGF ICAM-1 IFNg IGT IL LDL MAO NK NOD NPDR PDR RAO SSAO TGFb TNFa UKPDS VAP-1 VCAM-1 VEGF vW
késői glikációs végtermékek (advanced glycation end products) szérum alanin-aminotranszferáz adenozin trifoszfát biotenyésztés (bio breeding) testtömeg index (body mass index) bovin szérum albumin ciklikus adenozin monofoszfát Diabetes Control and Complication Trial diabetes mellitus dimetilszulfoxid dezoxiribonukleinsav diabeteses retinopathia etilénglikol-bi-(2-amino etiléter)N,N-tetra ecetsav Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group flavin adenin dinukleotid fluoreszcein angiográfia forskolin szérum gamma-glutamil-transzpeptidáz glukagon-szerű peptid-1 glukóztranszporter glikált hemoglobin 4(hidroxietil)-1-piperazin etán szulfonsav hepatocita növekedési faktor intercelluláris sejtadhéziós molekula-1 interferon gamma csökkent glukóztolerancia (impaired glucose tolerance) interleukin low density lipoprotein monoaminoxidáz természetes ölősejtek (natural killer cells) non-obez diabeteses (non-obese diabetic) non-proliferatív diabeteses retinopathia proliferatív diabeteses retinopathia retina specifikus aminoxidáz szérum szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz transzformáló növekedési faktor b (transforming growth factor b) tumor nekrózis faktor a United Kingdom Prospective Diabetes Study vaszkuláris adhéziós protein-1 vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (vascular endothelial growth factor) von Willebrand faktor
5
1. BEVEZETÉS A diabetes mellitus (DM) komplex anyagcsere zavar, amelyet krónikus hiperglikémia, valamint a szénhidrát-, zsír-, és fehérje-anyagcsere egyéb rendellenességei jellemeznek, s amelyet gyakran kísérnek specifikus mikrovaszkuláris (retinopathia, nephropathia, neuropathia) és makrovaszkuláris szövődmények (atherosclerosis, stroke, coronariabetegség, perifériás artériák betegsége). Az egyre rohamosabban növekvő számú beteg miatt, az új terápiás lehetőségek kutatása rendkívül időszerű. Az elkövetkezendő évtizedekben a diabetes betegek számának további jelentős növekedése várható. A WHO előrejelzése szerint 2025-re, a Föld 20 év feletti lakosságában a cukorbetegek száma a jelenlegi 140 millióról várhatóan 300 millióra nő [48]. Hazánkban ma kb. 500.000 személy tud diabeteséről, ugyanennyien nincsenek tudatában betegségüknek, így magyarországi előfordulása feltehetően eléri a 10%-ot. Ezért különleges fontosságú, hogy a DM kialakulását és a lehetséges szövődmények arányát minél inkább visszaszorítsuk. A diabetes mellitus pathogenezisében jelenleg a B-sejt glukóz-szenzor funkciójának, valamint insulin szekréciójának elsődleges hibáját és/vagy a perifériás szövetek insulin rezisztenciáját tartjuk a betegség megjelenéséért felelős állapotnak. A kialakult kóros anyagcsere viszonyokat jellemzően visszafordíthatatlan morfológiai eltérések kísérik, melyek az érintett személyek életminőségét és életkilátásait rontják. A kutatások ezért a betegség kialakulásának és lefolyásának minél alaposabb megismerését célozzák. Ezen ismeretek birtokában nyílhat mód a folyamat minél korábbi fázisában történő megállítására, a szövődmények kialakulásának megelőzésére, illetve súlyosságának mérséklésére, az életminőség javítására, a mortalitás csökkentésére. Jelen értekezésben a multidiszciplinális téma megközelítése a betegség okait felderítő alapkutatások felől,
valamint
a diabetes
szövődményeivel
találkozó
klinikus
szemszögéből történik. In vitro kísérleteinkben insulin szekréciós és metabolikus vizsgálatokat
végeztünk
patkány
pancreasból
izolált
szigetekben,
valamint
szigetsejtekben. Az értekezés klinikai részében, a szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz (SSAO) enzim szerepét vizsgáltuk a diabeteses retinopathia pathogenezisében, 2-es típusú cukorbetegségben. 6
2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1
AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ FIZIOLÓGIÁJA
2.1.1 A pancreas Langerhans-szigetek szöveti felépítése A pancreas exokrin állományától jól elkülönülő sejtcsoportok létezését 1869-ben írta le Paul Langerhans. Az ovális alakú, pancreas-szerte előforduló, 76x175 µm nagyságú sejtcsoportok sűrűbben találhatók meg a farokrészben, mint a fejben és a testben. A szigetek az átlagosan 70-80 g tömegű pancreasnak mindössze 1-3 %-át alkotják. Felnőtt emberben a számuk kb. 1-2 millió. Bőséges a vérellátásuk, vénás vérük a V. portae rendszerébe kerül. A Langerhans-szigetek sejtjeit festődésük és morfológiájuk alapján csoportosíthatjuk. Emberben legalább négy különböző alapvető sejttípus fordul elő: A-(α), B-(β), D-(δ), és F-(PP) sejtek melyek legalább négy, hormonális aktivitással rendelkező peptidet termelnek: glukagont, insulint, szomatosztatint és pancreas-polipeptidet. Az insulint termelő B-sejtek, amelyek a leggyakoribbak, rendszerint az egyes szigetek centrumában helyezkednek el, non-B-sejtekkel (A-, D- és F-sejtekkel) koszorúszerűen körülvéve.
2.1.2 Az insulin szekréciót befolyásoló tényezők A pancreas B-sejtek insulin szekréciója nélkülözhetetlen a szervezet energia homeosztázisának fenntartásában. Az insulin szekréció fiziológiás körülmények között állandó, folyamatos ellenőrzés alatt áll [88]. Az insulin szekrécióját azonnali hatással, direkt módon befolyásolhatják tápanyagok, hormonok, neurotranszmitterek, valamint hosszú távú szabályozással számos ontogén, táplálkozási és endokrin faktor [88]. Az insulin a B-sejtek endoplazmatikus retikulumában szintetizálódik. Innen a Golgiapparátusba kerül, ahol membránhoz kötött granulumokba épül be. Megfelelő szekréciós inger hatására, ezek a granulumok a mikrotubuláris rendszer részvételével jutnak a sejthártyához, amivel aztán membránjuk fuzionál, és az insulin exocitózissal a külső térbe kerül. Átjut a B-sejtek és a szomszédos kapillárisok bazálmembránján, majd a kapillárisok fenesztrált endotheliumán keresztül a véráramba kerül.
7
2.1.3 Glukózzal indukált insulin szekréció A keringésben lévő D-glukóz kulcsszerepet tölt be az insulin szekréció szabályozásában. A D-glukóz az egyetlen tápanyag, amely fiziológiás koncentrációban, más exogén tápanyag nélkül is képes in vitro az insulin szekréció stimulálására. A D-glukóz szinte azonnali insulin szekréciót kiváltó hatása a pancreas B-sejtek számos metabolikus, iontranszport és mechanikai folyamatának eredménye (ld. I. táblázat és 1. ábra). I. táblázat. A D-glukózzal indukált insulin szekréció lépései a pancreas B-sejtekben [88]. 1. ·
Metabolikus események GLUT2 transzporter részvétele a D-glukóz koncentráció gyors kiegyenlítődésében, a B-sejt membránon át
·
Glukokináz enzim foszforilálja a D-glukózt
·
A glikolízis felgyorsul
·
Az oxidatív foszforiláció preferenciális fokozódása a mitokondriumban: ATP képződés
2. Iontranszport folyamatok ·
Az ATP stimulálja a K+ csatornák záródását
·
Ennek megfelelően a plazmamembrán depolarizálódik
·
Ennek eredményeképpen kinyílnak a feszültség-függő Ca2+ csatornák
·
A Ca2+ beáramlik a sejtbe és a citoplazma Ca2+ koncentrációja emelkedik
3. Mechanikai folyamatok ·
A mikrotubuláris rendszer részvétele a szekréciós granulumok oda-vissza mozgásában
·
A mikrofilamentáris rendszer közreműködésével a szekréciós granulumok elérik az exocitózis helyét
·
Membrán fúzió és leválás az exocitózis helyén
·
Exocitózis és endocitózis (membrán recirkuláció)
8
Insulin
D-glukóz
Glukokináz GLUT-2
Glukóz-6-P
Glikolízis
Ca2+
Citrát kör ATP
~ K+-ATP csatorna
Ca2+
szulfonilurea
K+
1. ábra. A pancreas B-sejtek insulin szekréciója. (A szaggatott vonal gátló hatást jelez. ~: membrán depolarizáció.) A D-glukóz tápanyag szerepét az insulin szekréció D-glukóz koncentráció és időfüggése is bizonyítja. Egyensúlyi állapotban az insulin szekréció arány szigmoid jellegű módon kapcsolt az extracelluláris glukóz koncentrációhoz. A küszöbérték 5.0 mM-hoz közel, a maximális válasz fele 10.0 mM-nál, a maximális insulin szekréció pedig 20.0 mM D-glukóz koncentráció körül alakul ki. Váratlan D-glukóz koncentráció emelkedésnél az insulin szekréció fokozódás bifázisos jellegű. Az első gyors szekréciós fázis után, mely 1-2 percen belül eléri csúcsértékét, kb. 5 perc elteltével jelenik meg a lassabban emelkedő, elhúzódó jellegű insulin szekréció fokozódás második fázisa. Ugyanis a D-glukóz és más tápanyag-jellegű szekréció fokozó anyagok, nemcsak a preformált insulin szekrécióját fokozzák, amelyet a belső raktárakból felszabaduló Ca2+ vált ki, hanem a proinsulin bioszintézisét is. Ez a B-sejtben az insulin prekurzor peptidek preferált szintézisével kapcsolatos [88].
9
2.1.3.1 A D-glukóz metabolizmus szerepe az insulin szekrécióban. A glukóz-szenzor funkció A D-glukóz transzportja, foszforilációja és katabolizmusa a pancreas B-sejtekben az extracelluláris D-glukóz szintnek megfelelően vezet az intracelluláris ATP-szint emelkedéséhez. A D-glukóz metabolizmusában részt vevő és azt szabályozó B-sejt specifikus folyamatok összessége a B-sejt optimális működését eredményezik. A B-sejt glukóz-szenzor funkciója ezeken a különleges folyamatokon keresztül valósul meg, és látja el feladatát [85]: 1. A B-sejtekben a GLUT2 transzporter részvételével válik lehetővé a D-glukóz transzport,
vagyis
a
D-glukóz
koncentráció
azonnali
kiegyenlítődése
az
extracelluláris és intracelluláris tér között. 2. Az insulin termelő B-sejtekben a D-glukóz foszforilálását az alacsony Km-mel (0.050.1 mM) rendelkező hexokináz enzim mellett, a magas Km-ű (10 mM) glukokináz enzim is katalizálja, így vezetve a D-glukóz foszforiláció arányának emeléséhez fiziológiás mértékű vércukor szint növekedés esetén. 3. A pancreas B-sejtekben mind a hexokináz, mind a glukokináz mitokondriális porin fehérjékhez kötött. Ez a kötődés teszi lehetővé a mitokondriális ATPfelhasználódását a D-glukóz foszforilációhoz, valamint összeköti a hexózok foszforilációját és a mitokondriális légzési folyamatokat [87]. 4. A pancreas B-sejtekben jelen levő glukokináz regulátor fehérje, - mely a glukokinázhoz kapcsolódik, ha fruktóz-6-P kötődik hozzá - a glukokináz enzim aktivitását csökkenti. Fruktóz-1-P kötődése a regulátor fehérjéhez azonban disszociálja a regulátor fehérjét a glukokináz enzimről, és az aktív marad [73]. 5. A D-glukóz fiziológiás koncentráció tartományában fokozódnak a foszforilált Dglukóz szint arányában a mitokondriális oxidatív lebontó folyamatok. A főbb mitokondriális dehidrogenázok Ca2+ függő módon aktiválódnak. (Mint pl. a dihidroxiacetonfoszfát-glicerofoszfát shunt FAD-koenzimmel működő kulcsenzime, a glicerofoszfát dehidrogenáz enzim). Így tehát magasabb D-glukóz koncentráció esetében, a piruvát termelés jobban fokozódik, mint a laktát termelés, vagyis az ATP javarésze a piruvát mitokondriális oxidációjából, illetve a D-glukózból ered [85]. Preferáltan stimulált mitokondriális ATP termelés következik be: a citoplazmában levő ATP mennyiségének folyamatos szabályozása az extracelluláris D-glukóz szint emelkedésével egy időben, szimultán történik [87].
10
6. D-glukóz anomér specificitás. Az a-D-glukóz (glikolízisbeli) metabolizmusa hatékonyabb, és insulinotróp hatása is kifejezettebb, mint a b-D-glukózé [78].
2.1.3.2 Iontranszport folyamatok A glukóz metabolizmus a glikolízis következtében ill. a preferáltan stimulált mitokondriális ATP termeléssel, nemcsak energetikai jelentőségű folyamat, hanem az ion koncentrációt is befolyásolja, a plazmamembránon át történő K+ vagy Ca2+ transzporton keresztül [91]. A magas citoplazmatikus ATP szint összekötő kapocs a Dglukóz metabolizmus helyétől "távolabb" folytatódó iontranszport folyamatokkal [91]. Az insulin szekrécióban központi szerepet játszik a plazmamembrán K+ csatorna zárása ATP által (ld. 1 ábra). Ennek következtében az intracelluláris kálium szint nő, vagyis a sejten belüli pozitív töltés mennyisége növekszik, a plazmamembrán depolarizálódik és a Ca2+ feszültség-függő csatornák megnyílnak. A Ca2+ beáramlása emeli a citoplazma szabad Ca2+ koncentrációját és aktiválja a mikrotubuláris-mikrofilamentáris rendszert, amely elősegíti a szekréciós granulumok megfelelő irányú transzlokációját és exocitózissal történő szekrécióját. A kationok és sejtmozgások részvételét az insulin szekréció folyamatában radioizotópos, elektrofiziológiai, ultrastrukturális és sejtkinetikai vizsgálatok is bizonyították [94].
2.1.3.3 Mechanikai folyamatok A sejtváz-citoszkeleton (mikrotubuláris-mikrofilamentáris) rendszer aktívan képes módosítani az insulin szekréciót [86]. A sejt felszínével párhuzamosan rendeződő sejtváz, a nem stimulált pancreas B-sejtekben, a plazmamembrántól távol tartja az insulin granulumokat. Megfelelő inger hatására azonban, a granulumok lefűződnek és a mikrotubuláris-mikrofilamentáris rendszer mentén a sejtmembránhoz jutnak, majd exocitózisra kerülnek. Ismert, hogy a mikrofilamentáris hálózat gátlószereivel (pl. cytochalasin B) insulin szekréció idézhető elő [68, 102, 139]. A mechanikai folyamatokat biokémiai események kísérik. A mikrofilamentáris rendszer mozgását a kalcium citoplazmatikus koncentrációjának növekedése váltja ki, a kalciumkalmodulin függő protein kináz és protein kináz A, valamint miozin könnyű lánc kináz (MLCK) együttes foszforiláló hatásán keresztül [51].
11
2.1.3.4 Sejtek közötti kölcsönhatások, a sejtek heterogenitásának szerepe A Langerhans-szigetekben a B-sejtek és a non-B-sejtek parakrin módon befolyásolják a szomszédos sejtek szekretoros működését [107]. A szigeten belüli mikrocirkuláció, valamint a sejtek közötti rés-kapcsolat (gap junction) és a bioelektromos intercelluláris kölcsönhatások is potenciális szabályozó szerepet tölthetnek be [103]. Kimutatható, hogy még egy szigeten belül is, a B-sejtek különféle metabolikus, szintetikus és szekréciós
aktivitás-szintűek
lehetnek.
A
D-glukóz
koncentráció
emelkedése
szinkronizálhatja a sejteket, ami magyarázhatja az insulin szekréció oszcilláló működését [75].
2.1.4 Nem-glukóz insulinotróp hatások A D-glukózon kívül, számos más vegyület is képes a B-sejtek insulin szekrécióját előidézni. Ezek egy része lényegében utánozza a tápanyag D-glukóz insulin szekrécióra gyakorolt hatását így pl. egyéb monoszacharidok, bizonyos aminosavak. A tápanyagként hasznosuló nem-glukóz insulinotróp anyagok hatására akkor is létrejön insulin szekréció, ha a GLUT2 transzporter, ill. a glukóz-szenzor funkció bármely komponense nem működik, vagyis amikor a hiperglikémia már nem vált ki insulin elválasztást. Az insulinotróp anyagok más része a glukóz hatását potenciálva, csak glukóz jelenlétében fejti ki hatását. Ilyenek pl. a β-adrenerg receptor agonisták, a peptidhormonok (gasztrointestinális hormonok, glukagon, kortikotropin), vagy a foszfodieszteráz gátlók (pl. a teofillin). Közös ezekben a vegyületekben, hogy a B-sejtek cAMP tartalmát növelik. cAMP hatására a sejtszervekből, a cAMP-kalmodulin [136] rendszeren keresztül stimuláló hatású Ca2+ szabadul fel, így az intracelluláris Ca2+ koncentráció emelésével serkentik az insulin szekréciót.
2.1.4.1 Az aminosavak insulinotróp hatása Az aminosavak pancreas szigetek insulin szekréciójára gyakorolt hatása kettős [83]. Egyes aminosavak (pl. az L-glutamin, L-leucin) oly módon stimulálják a szigetek insulin szekrécióját, hogy tápanyagként hasznosulnak a sejtekben [69, 76]. Más aminosavak, pl. az L-arginin pozitív töltésük következtében akkumulálódnak az insulint termelő sejtek belsejében és ez eredményezi az insulin szekréciós választ [12].
12
2.1.4.1.1 Az aminosavak tápanyag szerepe az insulin szekrécióban Elsőként az L-leucinról vált ismertté, hogy (10 mM koncentrációban) D-glukóz nélkül is insulinotróp hatású. Régebben úgy gondolták, hogy hatását sztereospecifikus receptorhoz kötődve fejti ki [79, 143]. Később kiderült, hogy a transzportálódó, nem metabolizálódó leucin-analóg, a 2-aminobiciklo[2,2,1]heptán-2-karbonsav (BCH) ugyancsak stimulálja az insulin szekréciót azáltal, hogy aktiválja a glutamát dehidrogenázt és stimulálja a szigetekben az endogén aminosavak katabolizmusát. Ezzel párhuzamosan fokozódott a szigetek O2 felvétele és csökkent a K+ konduktancia, vagyis záródtak a K+ csatornák, fokozódott a proinsulin szintézis és az insulin szekréció [121]. Az L-leucin dezaminált analógja a 2-ketoizokapronsav L-aszparaginnal vagy Lglutaminnal együtt alkalmazva, a citoplazmatikus NADPH+H szint emelésével [74], ill. transzaminálódva fokozzák az insulin szekréciót [79, 143]. Hasonló a kevéssé metabolizálódó ketosav, a 3-fenilpiruvát insulinotróp hatása is. Az aminosavak transzaminálódásában való részvételével fokozza a szigetekben az endogén aminosavak lebontását [80].
2.1.4.1.2 Bázikus aminosavak hatása a pancreas B-sejtek insulin szekréciójára Az L-arginin insulinotróp hatását elsősorban a B-sejtben való akkumulációja okozza, mely arginin-transzporter függő folyamat. A pozitív töltésű aminosavak, az L-arginin, Lornitin és a nem metabolizálódó L-homoarginin depolarizálják a plazmamembránt, megnyitva a Ca2+ feszültség-függő ioncsatornákat [12]. A D-glukóz insulinotróp hatásával összehasonlítva, nincsen foszfát csapda, és nem az ATP képzéstől függ az insulin szekréció. Ismert, hogy az L-ornitin a poliamin szintézisben, és azon felül az Larginin az NO képzésben, az urea ciklusban és a kreatin szintézisben vesz részt.
2.1.4.2 Dikarbonsavak metil-észterei A glutamát, a szukcinát és a piruvát metil-észtereik formájában könnyebben penetrálnak a pancreas B-sejtekbe, és kiváló insulinotróppá válnak [70]. Alkalmazásuk a diabetes terápiájában a jövő ígéretes lehetőségnek tűnik (ld. 7.1 fejezet).
13
2.1.4.3 Hormonok és neurotranszmitterek szabályozó szerepe A katekolaminok kettős hatást fejtenek ki az insulin szekrécióra, α-adrenerg receptorokon keresztül gátolják, β-adrenerg receptorokon keresztül serkentik. Az adrenalin és noradrenalin nettó hatása általában a gátlás. Az adrenalin a2-receptoron keresztül hatva gátolja a tápanyag-kiváltott insulin szekréciót pl. stressz, vagy izommunka során [88]. Ugyanakkor pl. izommunka során az insulin szekretálódik vércukor szint emelkedés nélkül is, amely arra utal, hogy a (tápanyag) D-glukózon kívül számos más faktor is szabályozhatja az insulin szekréciót [88]. Ezzel ellentétben a gasztrointesztinális hormonok, mint a glukagon-szerű peptid-1 (glucagon-like peptide-1; GLP-1), a gasztrin, vagy a szekretin potenciálják a tápanyagkiváltott insulin szekréciót, az adenilátcikláz enzim aktiválásán keresztül. Ez a magyarázata annak a tapasztalatnak, hogy a D-glukóz szájon át adva fokozottabb arányú insulin szekréciót idéz elő, mint ugyanakkora mértékű hiperglikémiát okozó intravénás D-glukóz injekció [88]. Az insulin szekréció kolinerg szabályozása a foszfolipáz C ® diacilglicerol ® inozitol1,4,5-triszfoszfát ® protein kináz C ® intracelluláris Ca2+ mobilizáción keresztül valósul meg. A N. vagus ezen az úton közvetíti az insulin szekréció kefalikus fázisát [88].
2.1.5 Az insulin szekréció hosszú távú szabályozása Az insulin szekréció hosszú távú szabályozásában ontogén faktorok is résztvesznek. Ez magyarázza a pancreas eltérő szekréciós működését a különböző életszakaszokban (fötális, neonatális, felnőtt kor). A táplálkozási faktorok szerepét bizonyítja, hogy éhezésben a D-glukózra adott insulin szekréciós válasz zavart szenved, mely a glukokináz enzim csökkent expressziójával hozható összefüggésbe [36]. Ezzel ellentétben elhízás esetében, a D-glukózra adott insulin szekréciós válasz jelentős fokozódását tapasztaljuk. Számos hormon képes a pancreas B-sejtek működését befolyásolni. Megváltozott endokrin állapotokban (pl. pajzsmirigy betegségek, akromegália, terhesség, laktáció) számítani lehet az insulin szekrécióban bekövetkező változásokra is [88]. 14
2.2
AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ ZAVARA
A diabetes mellitus multifaktoriális etiológiájú betegség, melyet elsősorban krónikus hiperglikémia
jellemez.
1-es
típusú
cukorbetegségben
a
B-sejtek
pusztulása
következtében abszolút insulin hiány alakul ki. 2-es típusú cukorbetegségben a pancreas B-sejtek öröklött vagy szerzett insulin szekréció zavara és/vagy extrapancreatikus insulin rezisztencia alakul ki [91]. A B-sejt diszfunkció az insulin szekréció valamennyi speciális fázisát érintheti (ld. II. táblázat). II. táblázat. A B-sejt diszfunkció lehetséges okai 2-es típusú diabetes mellitusban [88]. 1. A proinsulin-insulin átalakulás öröklött zavara 2. A D-glukóz metabolizmus elsődleges zavara ·
A glukokináz gén mutációja (csökkent működés)
·
A glukóz-6-foszfatáz enzim túlműködése
·
A mitokondriális, FAD-dal működő glicerofoszfát dehidrogenáz enzim csökkent aktivitása (energetikai zavar)
3. D-glukóz metabolizmus másodlagos zavara ·
GLUT2 gén expresszió csökkenése (underexpression)
·
Glikogén akkumulálódás (glukotoxicitás)
4. Mitokondriális ATP generálás zavara ·
tRNSLeu(UUR) pontmutáció
5. A mikrotubuláris-mikrofilamentáris rendszer zavart működése az insulin szekrécióban A II. táblázatban összefoglalt B-sejt diszfunkciók közül, a proinsulin átalakulás és a Cpeptid kihasadás zavarát 2-es típusú DM néhány esetében, familiáris betegségként írták le. Különböző mitokondriális génmutációk (DNS ill. RNS pontmutációk, pl. tRNSLeu(UUR) pontmutáció) is szerepet játszhatnak a 2-es típusú DM pathogenezisében, zavart okozva a mitokondriális ATP generálásában [34]. A szekréciós folyamat utolsó fázisát érintő, speciálisan a B-sejtek mikrotubuláris rendszerének zavarát is leírták már, kísérletes 2-es típusú diabeteses állat-modell esetében, hiperglikémiás egerekben (Acomys cahirinus) [95]. 15
2.2.1 A "G-kvintett" A legtöbb 2-es típusú diabetes esetében, elsősorban a D-glukózra adott szekréciós válasz szenved zavart, más tápanyag illetve nem-glukóz insulinotróp anyag hatásával összehasonlítva [91]. Feltételezhetően tehát, a pancreas B-sejtek D-glukóz szenzor funkciójának zavara alakul ki először, mely meghatározó jelentőségű a 2-es típusú DM pathogenezisében [91]. A D-glukóz metabolizmusában kialakuló lehetséges működészavarokat, - találó módon - a "G-kvintett"-ként foglalhatjuk össze [84] (ld. III. táblázat). III. táblázat. A pancreas B-sejt D-glukóz metabolizmusának lehetséges működészavarai 2-es típusú diabetes mellitusban: a "G-kvintett" [84]. 1. GLUT2 gén expresszió zavara 2. Glukokináz gén mutáció 3. Glukóz-6-foszfatáz túlműködése 4. Glicerofoszfát dehidrogenáz hiánya 5. Glikogén akkumuláció 1. A GLUT2 csökkent expressziója. Hosszantartó hiperglikémia esetében a GLUT2 pozitív sejtek száma, az insulin pozitív sejtek számának arányához képest csökken [101]. Ez a funkcionális defektus a glukóz metabolizmus zavarához vezet és új értelmezést nyer a B-sejtek heterogenitásának ismeretében (ld. 2.1.3.4 fejezet). 2. A glukokináz gén non-sense mutáció számos MODY (maturity-onset diabetes of the young) beteg esetében kimutatható (ez a 2-es típusú cukorbetegek kb. 1%-át jelenti) [141]. A legtöbb 2-es típusú diabetesben szenvedő betegben azonban ilyen eltérés nem található. 3. A glukóz-6-foszfatáz túlműködése jelentős funkció zavart eredményezhet 2-es típusú diabetesben, ugyanis a (glukóz-6-P ® glukóz+Pi) futil ciklus (foszfát csapda) kialakításával ATP deplécióhoz vezet [91]. 4. A FAD-dal aktivált mitokondriális glicerofoszfát dehidrogenáznak, a dihidroxiacetonfoszfát-glicerofoszfát
út
(shunt)
kulcsenzimének
felnőttkori
csökkent
működése kapcsolatba hozható az élet korai szakaszában történt fehérjehiányos táplálkozással [110]. Hasonló zavart találtak öröklődő, 2-es típusú DM-ban szenvedő rágcsálókban (Goto-Kakizaki patkányok, db/db egerek és fa/fa patkányok) is. 16
Ilyen károsodás azonban, nem volt ki mutatható az 1-es típusú diabeteses állatmodellekben (spontán diabeteses BB patkányokban ill. NOD egerekben) [88]. 5. Glikogén akkumuláció. A normoglikémiás szigetek nem tartalmaznak kimutatható mennyiségű glikogént, viszont akár csak egy napig tartó, extrém magas glukóz expozíció után, a glikogén akkumulálódik a szigetsejtekben, mind in vivo, mind in vitro [88].
2.2.2 Glukotoxicitás A relatív vagy abszolút insulin hiány következménye a krónikus hiperglikémia, amely önmagát felgyorsító folyamatban a cukorbetegség kialakulásához és annak számos szövődményéhez vezet a szervezetben.
2.2.2.1 Glukóz-deszenzitizáció és glukotoxicitás a B-sejtekben A krónikus hiperglikémia másodlagos B-sejt funkció-zavart eredményezhet, melynek reverzibilis fázisában glukóz-deszenzitizáció következik be. Ekkor a pancreas B-sejtek kevéssé érzékenyek a D-glukóz insulinotróp hatására. Ez a fázis időleges és visszafordítható [52]. A glukotoxicitás azonban már a B-sejt irreverzibilis károsodását jelenti [91]. Vagyis lényegében először maga a B-sejt válik diabetesessé. A glukotoxicitás okai és/következményei a B-sejtekben [91]: 1. Szorbitol akkumuláció a B-sejtekben. 2. A B-sejt proteinek nem-enzimatikus glikációja (beleértve a citoszolban található fehérjéket is). 3. A szekréciós túlműködés miatt bekövetkező B-sejt kimerülés. 4. Glikogén akkumuláció a B-sejtekben. 5. Hiperglikémiás
pszeudohipoxia:
a
hiperglikémia
során
a
megnövekedett
glukózoxidáció a NADPH felszaporodásához vezet, mely fokozott szabadgyök termeléssel jár. A glukotoxicitás speciális jelei: 1. Paradox módon, D-glukóz koncentráció emelkedése után, átmeneti insulin szekréció gátlás, majd csökkentő D-glukóz koncentrációnál, insulin szekréció fokozódás következik be. 2. Intravénás D-glukóz adására 2-es típusú DM betegek az anomer specificitás zavarát mutatják. Az a-D-glukóz anomerre adott insulin szekréciós válasz preferenciája gátlódik, sőt megfordul [90]. 17
2.2.2.2 A glukotoxicitás és következményei az extrapancreatikus szövetekben A hiperglikémia a biokémiai folyamatok egyensúlyzavarait váltja ki (nem-enzimatikus glikáció, protein kináz C aktiváció, hexózamin anyagcsere út, aldóz reduktáz enzim aktivitás növekedés), melyek sejt-szintű működési zavart eredményeznek (vazoaktív anyagok termelődése, kóros fibrinolitikus és antithrombin aktivitás, oxidatív stressz) [18, 131]. Ezen tényezők következtében jellegzetes anatómiai és funkcionális elváltozások keletkeznek a szervezet számos szövetében, mely állapotok részletes ismertetése meghaladja az értekezés kereteit. Ezért a továbbiakban a diabetes specifikus krónikus érszövődmények közül, az értekezés klinikai vizsgálataihoz kapcsolódó diabeteses retinopathiával foglalkozunk.
2.3
A DIABETES MIKROVASZKULÁRIS SZÖVŐDMÉNYEI
2.3.1 A diabeteses retinopathia epidemiológiája A diabeteses retinopathia (DR) a cukorbetegségben kialakuló krónikus, specifikus kisérkárosodások közül az egyik leggyakoribb, az életminőséget jelentősen befolyásoló szövődmény. Megfelelő kezelés nélkül, a magára hagyott betegség - az esetek nagy részében a non-proliferatív, majd proliferatív stádiumon át - teljes vaksághoz vezet. Jelenleg a diabeteses retinopathia, az iparilag fejlett ill. közepesen fejlett társadalmakban a 20-55 év közötti, munkaképes korú korosztályban a megelőzhető vakság fő oka. A nemzetközi ajánlásoknak megfelelően (Saint Vincent Deklaráció, Diabetes 2000SM) hazánkban is hangsúlyt kell fektetni a cukorbetegség következtében látáskárosodott betegek számának csökkentésére [5, 53].
2.3.2 A diabeteses retinopathia rizikótényezői Nagyszámú
beteganyagon
végzett
prospektív
tanulmányok
(DCCT,
UKPDS)
tapasztalatai szerint a DM időtartama és a hiperglikémia mind 1-es, mind 2-es típusú diabetesben a mikroangiopathiás szövődmények, így a retinopathia legfontosabb rizikótényezői [134, 135]. 2-es típusú cukorbetegekben 15 év betegségtartam után, közel 78%-ban alakul ki valamilyen fokú diabeteses retinopathia [49]. Ugyanakkor a fokozatos és gyakran tünetmentes kezdet miatt, az újonnan felfedezett 2-es típusú cukorbetegekben (az általában non-proliferatív stádiumú) DR az esetek 18-39%-ában is jelen lehet [51]. Előfordulhat, hogy látásromlás, vagy más okból végzett vizsgálat kapcsán, a szemfenéki kép alapján a szemorvos diagnosztizálja a cukorbetegséget [105].
18
A nem-megfelelő szénhidrát anyagcsere viszonyok mellett számos egyéb, potenciálisan befolyásolható rizikófaktor is szerepet játszhat a DR kialakulásában és progressziójában: többek között a magasabb szisztolés és diasztolés vérnyomás, valamint az emelkedett plazma triglicerid szint [25, 49, 51]. A diabeteses angiopathiára, így a retinopathiára való fogékonyság kialakulásában genetikai faktorok is szerepet játszhatnak [9]. A felsorolt tényezők azonban a DR számos és sokszínű klinikai megjelenési formájának csak egy részét magyarázzák.
2.3.3 A diabeteses retinopathia pathogenezise Bár a szemfenéki elváltozások jól ismertek, a vaszkuláris endothel károsodás pathomechanizmusa nem tisztázott még teljes mértékben. A tartósan magasabb vércukorszint biokémiai folyamatok egyensúlyzavarait váltja ki, mely a retina érhálózatában is jellegzetes anatómiai és funkcionális elváltozásokhoz vezet (ld. IV. táblázat). IV. táblázat. A diabeteses retinopathia kórlefolyása során kialakuló anatómiai és funkcionális elváltozások [50].
Anatómiai elváltozások
Funkcionális elváltozások
bazálmembrán károsodás (vastagodás)
károsodott véráramlás, viszkozitás ñ
pericita veszteség az érfalban (apoptózis) endothel proliferáció mikroaneurizmák képződése
↔
hipoxia, ischaemia kapilláris permeabilitás ñ vér-retina gát károsodás
kapillárisok elzáródása
elektrofiziológiai eltérések (ERG)
neovaszkularizáció
Az érdeklődés középpontjában jelenleg a krónikus hiperglikémiára visszavezethető számos pathomechanizmus mellett, a retinopathia kialakulásának molekuláris alapjai, a növekedési faktorok pl. hepatocita növekedési faktor (HGF), transzformáló növekedési faktor b (TGFb), vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF), ill. jelátviteli rendszereik állnak [1, 20, 104, 145].
19
2.4
A
MULTIFUNKCIONÁLIS
MOLEKULA:
A
SZEMIKARBAZID-SZENZITÍV
AMINOXIDÁZ ENZIM
A szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim elnevezés - (SSAO; EC 1.4.3.6) [amine:oxygen oxidoreductase (deaminating)(copper-containing)] - több homológ enzimet jelöl az aminoxidáz enzimek családján belül. Az enzimcsoport közös vonása, hogy kofaktorként FAD helyett rezet tartalmaznak, érzékenyek a szemikarbaziddal és egyéb ún. karbonil reagensekkel való gátlásra, de rezisztensek a monoaminoxidáz enzimek (MAO-A és MAO-B) inhibitoraival szemben, mint pl. a clorgilin és a pargilin [10, 16, 149]. Az értekezésben az enzimcsaládot összefoglalóan, SSAO néven említjük. Az enzim az emlős állatok és az emberi szervezet számos szövetében megtalálható, elsősorban az érfal simaizomsejtjei és több más sejt-típus (pl. zsírsejt, retina ganglionsejt) plazmamembránja tartalmazza [44, 63, 153]. Szolubilis SSAO aktivitás a szérumban is kimutatható [147]. A szérum SSAO enzim génszekvenciáját (a 17. kromoszóma q21-es régióján) és glikoprotein struktúráját (két azonos alegység, melyben egy kezdeti rövid N terminális citoplazmatikus domén után egy transzmembrán szakasz következik, majd egy nagyobb extracelluláris domén, mely tartalmazza a katalitikus helyet, valamint egy réz iont) egymástól függetlenül végzett kutatások azonosnak találták a vaszkuláris adhéziós protein-1 (VAP-1) szerkezetével [124, 152]. A VAP-1 szelektint nem igénylő multifunkcionális adhéziós molekula, mely a leukociták (elsősorban CD8+ limfociták és NK sejtek) endothelhez való kitapadását és a szervezeten belüli közlekedését segíti. Az SSAO fiziológiai és pathofiziológiai szerepe még nem ismert minden részletében. Az SSAO enzim által katalizált oxidatív deamináció során monoamin vegyületekből (pl. metilaminból, aminoacetonból) aldehidek, valamint hidrogén-peroxid és ammónia keletkeznek (ld. 2. ábra) [63, 150]. Endothel sejttenyészetben, egyidejű metilamin és SSAO
expozíció
után
jellegzetes
morfológiai
változások
pszeudopódiumok eltűnése, vakuolizáció és sejt zsugorodás [150].
20
észlelhetők:
a
SSAO a.)
CH3 NH2 + O2 + H2O → metilamin
HCHO + H2O2 + NH3
formaldehid
hidrogén-peroxid
ammónia
SSAO b.)
CH3OCH2NH2 + O2 + H2O
→
aminoaceton
CH3COCHO + H2O2 + NH3
metilglioxál
hidrogén-peroxid
ammónia
2. ábra. Az SSAO enzim által katalizált oxidatív deamináció a.) metilamin, ill. b.) aminoaceton szubsztrát jelenlétében. A reakció során toxikus hatású aldehid, hidrogén-peroxid és ammónia keletkezik. Emelkedett szérum SSAO aktivitást mutattak ki diabeteses kísérleti állatokban [28, 42], 1-es és 2-es típusú cukorbetegekben [13, 14, 98], valamint krónikus pangásos szívelégtelenségben [15] és krónikus májbetegségben [54]. Feltételezések szerint a fokozott
SSAO
enzim
aktivitás
során
keletkező
toxikus
reakciótermékek
endothelkárosító hatása szerepet játszhat a krónikus érszövődmények kialakulásában [148]. Diabeteses retinopathiában szenvedő 1-es és 2-es típusú cukorbetegekben is magasabb SSAO szintek mérhetők [13, 35, 39]. Az azonban nem tisztázott egyértelműen, hogy vajon a szérum SSAO aktivitás különböző-e a DR különböző súlyossági stádiumaiban, van-e direkt összefüggés a retinopathia súlyossága és az enzim aktivitás között.
21
3. CÉLKITŰZÉSEK 3.1
IN VITRO KÍSÉRLETEK
Az aminosavak szerepét az insulin szekréciós válaszban és a szekréció szabályozásában számos tanulmány vizsgálta már [11, 12, 64, 69, 76, 115, 116, 119]. Ezekben a kísérletekben azonban az aminosavakat a fiziológiás koncentrációt sokszorosan meghaladó dózisban (mM) alkalmazták, ill. csak néhány aminosav kombinációjának insulinotróp hatását vizsgálták. Célul tűztük ki ezért, hogy az aminosavak insulin szekrécióban betöltött kettős hatásmódját fiziológiás körülmények között is igazoljuk. Kísérleteinkben patkányból izolált pancreas szigetek működését vizsgáltuk, a táplálékfelvételt követő állapotok modellezése során. A pancreas szigeteket a plazma éhhomi, normál posztprandiális ill. hiperglikémiát jellemző vércukorszintjének megfelelő D-glukóz oldatban, valamint 20 aminosavat és citrullint, ornitint, taurint fiziológiás koncentrációban tartalmazó aminosav keverékben inkubáltunk. A szigetek insulin szekréciójában,
45
Ca felvételében, valamint D-glukóz metabolizmusában
bekövetkező működésbeli változásokat regisztráltuk. A cytochalasin B-ről (mely a Helminthosporium dematioideum gomba által termelt sejtpermeabilis toxin, a sejtosztódást és a kontraktilis mikrofilamentumok kialakulását gátolja) ismert, hogy izolált pancreas szigetekben és izolált perfundált pancreasban egyaránt fokozza a tápanyag és nem-tápanyag-jellegű szekréciót serkentő szerek által kiváltott insulin elválasztást [68, 102, 139]. A cytochalasin B-re adott szekréciós válasz időbeli lefutását, valamint az insulin termelő B-sejtek ultrastrukturális szerkezetére és motilis aktivitására gyakorolt hatását több tanulmány is vizsgálta. A kutatások során bizonyossá vált, hogy az insulin kibocsátást növelő hatás nagyrészt a B-sejt mikrofilamentáris sejtvázával való kölcsönhatásnak köszönhető [62, 68, 102, 125, 138, 139]. A cytochalasin B, a D-glukózra adott insulin szekréciós válasz fokozása mellett azonban, gátolja a D-glukóz felvételét és további katabolizmusát izolált pancreas szigetekben és egyéb sejt-típusban is [62]. Korábban az insulin szekréció fokozása és a plazmamembránon keresztüli D-glukóz transzport gátlása között nem feltételeztek direkt okozati összefüggést és hatásbeli kapcsolatot [62].
22
Vizsgálataink alapjául az a tény szolgált, hogy több sejt-típusban a cytochalasin D (Zygosporium mansonii gomba termeli, sejtpermeabilis gomba toxin), a cytochalasin Bhez hasonló hatást fejt ki a mikrofilamentáris rendszerre (aktin filamentumok gátlása, gátolja
a
sejtosztódást
a
kontraktilis
mikrofilamentumok
dezorganizálásával),
ugyanakkor nem befolyásolja a D-glukóz transzportját. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz ill. nem-glukóz tápanyagok által indukált insulin szekréció folyamatát, cytochalasin B és cytochalasin D jelenlétében tanulmányoztuk. Ezt követően a cytochalasin B anyagcsere hatásának további vizsgálatát végeztük alacsonyabb (2.8 mM) és magasabb (16.7 mM) koncentrációjú Dglukóz jelenlétében inkubált, tisztított pancreas B-szigetsejtekben ill. tisztított non-Bszigetsejtekben. In vitro kísérleteinkben a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. Milyen szerepet töltenek be a fiziológiás koncentrációjú aminosavak az insulin szekréció normál szabályozásában? 2. A fiziológiás koncentrációjú 20 aminosav és citrullin, ornitin, valamint taurin keveréke együttesen hogyan befolyásolják a táplálkozás után preparált pancreas szigetekben az insulin szekréciót, a patkány plazmában poszprandiálisan kialakuló értéknek megfelelő koncentrációjú D-glukóz (8.3 mM) jelenlétében? 3. A fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék összetételének változtatásával igazolható-e az aminosavak tápanyag- és direkt hatásának kettős szerepe az insulin szekréció fiziológiás szabályozásában? 4. Az aminosavakra adott szekréciós válaszban mely intracelluláris metabolikus, iontranszport ill. mechanikai folyamatok vesznek részt? 5. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz ill. nem-glukóz tápanyagok által indukált insulin szekréció fokozásában kimutatható-e eltérés a két penész gomba anyagcsere termék, a cytochalasin B és a cytochalasin D hatása között? 6. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz metabolizmus befolyásolásában van-e különbség a cytochalasin B és a cytochalasin D között? 7. Mutat-e különbséget a D-glukóz metabolizmusa cytochalasin B jelenlétében, hipoglikémiát (2.8 mM) ill. hiperglikémiát (16.7 mM) modellező állapotokban patkány pancreasból izolált tisztított B-szigetsejtekben ill. tisztított non-Bszigetsejtekben? 23
3.2
VIZSGÁLATOK DIABETESES RETINOPATHIÁBAN
Kutatómunkánk kiindulópontja az a feltételezés volt, mely szerint a szérum szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim emelkedett aktivitása közvetlen szerepet játszhat a diabeteses retinopathia kialakulásában. Vizsgálatunk célja a szérum SSAO enzim
aktivitás
meghatározása
volt
különböző
súlyossági
fokú
diabeteses
retinopathiában szenvedő 2-es típusú cukorbetegekben, valamint egészséges kontroll személyekben, hogy az emelkedett SSAO aktivitás és a diabeteses retinopathia kialakulása közötti feltételezett összefüggést humán klinikai adatok nyerésével támasszuk alá. Az értékezés klinikai vizsgálatának kérdés felvetései: 1. Kimutatható-e különbség a szérum SSAO aktivitás értékek között a különböző diabeteses retinopathia stádiumokban, 2-es típusú cukorbetegekben? 2. Tapasztalható-e összefüggés a retinopathia súlyossága és az SSAO enzim szérum szintje között? 3. Befolyásolja-e az enzim aktivitást a DM fennállásának ideje, a hipertónia vagy az obesitas (BMI)? 4. Összefügg-e az enzim aktivitás a diabetesben rendszeresen mért laboratóriumi paraméterekkel (HbA1c, éhgyomri glukóz, ALT, GGT, húgysav, kreatinin koncentrációk, mikroalbuminuria)? 5. Szerepet játszhat-e a szérum SSAO aktivitás emelkedése a DR kialakulásában?
24
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1
IN VITRO KÍSÉRLETEKBEN HASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4.1.1 Kísérleti állatok Kísérleteinkhez kb. 200 g testsúlyú, nőstény, Wistar patkányokat (Proefdierencentrum, Haverlee, Belgium) használtunk. A kísérleti állatok táplálékhoz és ivóvízhez korlátlanul juthattak. Tartási körülményeik az Európai Unió idevonatkozó előírásainak megfeleltek.
4.1.2 Anyagok A cytochalasin B és D, valamint a forskolin és a teofillin a Sigma (St. Louis, MO, USA) terméke. A cytochalasinok oldására alkalmazott DMSO-t (dimetilszulfoxid) a Merck-től (Darmstadt, Németország) szereztük be. A 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz (specifikus aktivitás: 0.30 Ci/mmol), a 3HOH, a [U-14C]szacharóz (specifikus aktivitás: 0.55 Ci/mmol), a D-[5-3H]glukóz (specifikus aktivitás: 15.7 Ci/mmol) és a D-[U-14C]glukóz (specifikus aktivitás: 0.34 Ci/mmol) a New England Nuclear-tól (Boston, MA, USA) származott.
4.1.3 Az aminosav keverék összetétele és elkészítése A patkány plazmában posztprandiálisan mérhető aminosav koncentrációkat modellező aminosav keveréket irodalmi adatok alapján állítottuk össze. Az inkubációs médium végső aminosav koncentrációit az V. táblázatban tüntettük fel. A 4-szeres vagy 8-szoros koncentrációjú aminosav keveréket tartalmazó oldatot (pH=7.4) valamennyi kísérlethez egyszerre készítettük el, majd 15 ml-es adagokban, -80°C-on tároltuk. Közvetlenül felhasználás előtt, szobahőmérsékleten olvasztottuk ki az aminosav keveréket tartalmazó oldatot.
Az
inkubációs médiumba a kívánt mennyiségre, négyszeresére ill.
nyolcszorosára hígítottuk. A maradék oldatot nem használtuk fel újra. Az aminosavak közül az L-alanin, L-arginin, L-aszparagin, L-aszpartát, L-cisztein, Lglicin, L-glutamát, L-glutamin, L-izoleucin, L-leucin, L-lizin, L-metionin, L-prolin, Lszerin, L-tirozin, L-treonin, L-triptofán és az L-valin a Merck (Darmstadt, Németország) terméke. Az L-citrullin, L-fenilalanin, L-hisztidin és a taurin a Sigma cégtől (St. Louis, MO, USA) származott. Az L-ornitint az Aldrich-tól (Steinheim, Németország) szereztük be.
25
V. táblázat. A kísérletekben alkalmazott aminosav keverék összetétele. A patkány plazmában posztprandiálisan mérhető aminosav koncentrációk, irodalmi adatok alapján kerültek kiszámításra. A kísérletekben alkalmazott aminosav keverék koncentrációi a patkányban található átlagos plazma koncentrációknak feleltek meg. Az értékeket átlag±SD tüntettük fel, zárójelben az átlag megállapításához felhasznált irodalmak számát tüntettük fel. Aminosav
Plazma koncentráció Sprague-Dawley patkány törzsben (mM/l) [19, 96, 99, 112, 144]
Plazma koncentráció Wistar patkány törzsben (mM/l) [6, 7, 22, 23, 61, 106]
A kísérletekben alkalmazott aminosav keverék összetételea (mM/l)
529±190 (6) 218±63 (6) 81±21 (5) 31±16 (6) 23±7 (3) 90±30 (5) 85±26 (6) 341±70 (6) 142±61 (6) 636±160 (5) 85±16 (6) 105±30 (6) 185±60 (6) 455±102 (6) 58±15 (6) 70±17 (4) 286±56 (2) 285±133 (6) 90±21 (6) 250±84 (6) 95±24 (5) 233±68 (6) 300±152 (5)
591±130 (6) 204±121 (6) 16±6 (2) 36±42 (4) 47±5 (2) 89±18 (2) 74±15 (6) 193±103 (6) 103±84 (3) 599±223 (3) 82±33 (6) 70±29 (3) 136±31 (3) 382±52 (6) 48±25 (4) 52±27 (4) 257±163 (6) 250±106 (6) 97±47 (6) 329±91 (6) 167±42 (6) 190±36 (6) 286±183 (6)
560 210 60 35 30 90 80 270 130 620 85 90 170 420 55 60 265 270 95 290 135 210 290
L-alanin L-arginin L-aszparagin L-aszpartát L-cisztein L-citrullin L-fenilalanin L-glicin L-glutamát L-glutamin L-hisztidin L-izoleucin L-leucin L-lizin L-metionin L-ornitin L-prolin L-szerin L-tirozin L-treonin L-triptofán L-valin Taurin a
Megegyezik a Sprague-Dawley és Wistar patkány törzsek plazmájában mért átlagos aminosav koncentrációk átlag értékeivel
4.1.4 Módszerek 4.1.4.1 Pancreas szigetek izolálása A sziget izolálás célja funkcióképességét megtartott Langerhans-szigetek és szigetsejtek nyerése. Kísérleteinkben a kollagenáz módszert alkalmaztuk [55, 93], mely rágcsáló, malac és humán pancreas sziget izolálására is adaptálható. A továbbiakban patkány pancreas szigetek izolálását írjuk le.
26
A kísérleti állatok dekapitációja, minden esetben reggel 8-9 óra között történt. A hasüreg megnyitása után, műanyag intravénás kanült (átmérője£1.02 mm) illesztettünk egy 10 ml-es fecskendőre és az epevezetékbe vezettük. A kanült közel a májból való kilépéshez körülötte átvezetett fonallal vagy csipesszel rögzítettünk. Az epevezetéket, duodenális belépése előtt koherrel fogtuk le. Kb. 10 ml Hanks oldatot (összetételét ld. VI. táblázat) injektáltunk a kanülbe. Mivel a fő pancreasvezetékek az epevezetékbe nyílnak, az injektált folyadék retrográd úton tölti fel a pancreas vezeték rendszerét és az exokrin állomány mechanikus roncsolását okozza. A felpuffadt pancreast szabaddá tettük gasztrikus, duodenális, lép és ér kapcsolataitól. VI. táblázat. A Hanks oldat összetétele (pH=7.4) [41]. Összetevő
mM
NaCl
137
KCl
5.6
CaCl2
1.26
MgSO4
0.81
Na2HPO4
0.34
KH2PO4
0.44
NaHCO3
4.17
Két vagy három mirigyet helyeztünk egy üvegserlegbe, és pancreas szövetet olló segítségével apró darabokra vágtuk (1-2 mm). A szövetdarabokat (a három pancreas térfogata kb. 4 ml) átöntöttük egy 10 ml-es kémcsőbe, ahol kollagenáz porral (EC 3.4.24.3) kevertük össze (7 mg/pancreas; liofilizált Clostridium histolitycum; specifikus aktivitása kb. 0.15 U/mg; Boehringer, Mannheim, Németország). A szövet-szuszpenziót finoman, folyamatosan gázbuborékokkal kevertük (O2-CO2; 95/5, v/v%) 10 percen keresztül, 37ºC-on. A csövet ekkor gumidugóval lezártuk és erőteljesen, kézzel ráztuk (200-250 rázás/perc) 5 percen át, 37ºC-on. Ekkor a szövet-szuszpenzió már homogén szerkezetet mutat. A felülúszó eltávolítása után a szövet-részt ismét szuszpendáltuk egy üvegtartályban (magassága 4.5 cm, átmérője kb. 7.5 cm) Hanks oldatban, hogy az össztérfogat 150 ml legyen. Amint a szigetek szedimentálódtak a tartály aljára (kb. 1 perc alatt), a felülúszót ismét eltávolítottuk és helyét újabb, azonos térfogatot adó Hanks oldattal pótoltuk. 27
Ezt a folyamatot kb. két-háromszor megismételtük, hogy az exokrin szövetet minél jobban eltávolítsuk, mely sokkal lassabban ülepszik le, mint a szigetek. A mintából 2-3 ml-t helyeztünk petri csészébe, sziget gyűjtés céljából. A szigeteket (4.0 mm átmérőjű) keskenyedő végű üveg pálca és egy műanyag cső segítségével gyűjtöttük, kis felbontású (40-100x nagyítású) mikroszkóp alatt. (Az üveg pálcákat egyik végükön korábban felhevítettük, így kaptuk a keskenyedő véget.) Minden szigetet egyenként helyeztünk az inkubációs médiumba. Három patkány pancreasból kb. 400 db, 0.1 mm átmérőt meghaladó sziget nyerhető.
4.1.4.2 Pancreas szigetek inkubálása 8 pancreas szigetet helyeztünk az 1.0 ml inkubációs médiumot tartalmazó műanyag mikroserlegbe, mely alja lapos (2.3 cm magas, 1.0 cm átmérőjű) [93]. Majd a serleget Packard szcintillációs küvettába tettük és gumikupakkal lezártuk. 90 percig 37ºC-on inkubáltuk, folyamatos enyhe mozgatás mellett. Az első 5 percben 95% O2 - 5% CO2 gázeleggyel buborékoltattuk. A kísérletekben használt alap inkubációs bikarbonát puffer általános összetételét a VII. táblázatban tüntettük fel. Az inkubációs médium bovin szérum albumin tartalma 1% w/v (BSA V. frakció; Sigma, St. Louis, MO, USA), a többi komponenst a kísérlet jellegtől függően adtuk az inkubációs médiumhoz. Kb. 50 mintát inkubáltunk egyszerre, köztük minden esetben 3 pancreas szigetet nem tartalmazó kontrollt is. VII. táblázat. A kísérletekben alkalmazott alap inkubációs (Krebs-Henseleit) bikarbonát puffer összetétele (pH=7.4) [93, 94]. Összetevő NaCl
115 mM
KCl
5.0 mM
CaCl2
1.0 mM
MgCl2
1.0 mM
NaHCO3
24.0 mM
BSA
0.5 mg/ml
Az inkubáció után, a mikroserlegből mikroszkóp alatt, Pasteaur pipettával szívtuk fel az inkubációs médiumot (0.7 ml-t, a szigetek érintése nélkül). A minták insulin tartalmát vagy azonnal mértük meg, vagy a mintákat későbbi meghatározásig -20°C-on tároltuk. 28
4.1.4.3 Pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása A pancreas szigetek insulin szekrécióját radioimmunassay módszerrel, visszatitrálással határoztuk meg. Az eljárás gyorsan elvégezhető: 100 minta esetében kb. 2 órát vesz igénybe [93]. 0.5 ml inkubációs médiumot elegyítettünk tengerimalac insulin antiszérummal, melyet 1 % w/v bovin szérum albumint (BSA) tartalmazó (0.1 M, pH=7.0) foszfát pufferral hígítottunk. Az így kapott 1.0 ml elegyet 30 percig inkubáltunk 37ºC-on, majd szobahőmérsékleten 0.5 ml foszfát/albumin pufferben, jelzetlen és
125
I
jelzett insulint (3000-4000 cpm/ml) adtunk hozzá. Újabb 30 perc elteltével, 1.0 ml (0.1 M, pH=7.0 foszfát pufferben oldott) cellulóz szuszpenzióval elegyítettük (cellulóz por: MN Cellulose Powder 300, Macherey, Nagel and Co. Düren, Németország). 30 perces szobahőmérsékleten végzett folyamatos keverés után (mely a homogenitást biztosította), 10 percig 1000 g-vel centrifugáltuk +4ºC-on (Beckman centrifuga, TJ-6 modell). Majd a felülúszóból 1.0 ml minta radioaktivitását mértük. A pancreas szigetek által szekretált insulin mennyiségét a következő képlet felhasználásával számoltuk [93]:
Szekretált insulin (µU/90 perc/sziget) =
2 (C-S) A 8 (1.09 T-D)
A mintákhoz adandó anti-insulin szérum mennyisége, minden csőben a maximálisan szekretált insulin kétszeres mennyiségének megkötésére alkalmas kell hogy legyen. Az A értéke a mintához adott radioaktívan jelzett és jelzetlen insulin mennyiségét jelenti µU-ban kifejezve, mely legalább 50%-kal szükséges hogy meghaladja az anti-insulin szérum kötőképességét. S értéke, a minta radioaktivitása kisebb, mint a szigetet nem tartalmazó kontroll (C) érték, és a két érték különbsége arányos a szekretált insulin mennyiségével. A minták mérésével párhuzamosan, minden alkalommal meghatároztuk a teljes radioaktivitást (T), valamint a nem abszorbeált radioaktivitást (D) is. 0.5 ml jelzett és jelzetlen insulint 2.0 ml albumin/foszfát pufferrel hígítottunk, melyből 1.0 ml-t vettünk ki a teljes radioaktivitás (T) meghatározásához. 0.5 ml jelzett és jelzetlen insulint 1.0 ml albumin/foszfát pufferrel hígítva és 1.0 ml cellulóz szuszpenziót hozzáadva pedig, a cellulózhoz nem adszorbeált radioaktivitást (D) mértük, melyet denaturált jelzett insulin, vagy más radioaktív kontamináció okozhat. 29
125
I
Mivel az insulin meghatározásához az (1.0 ml) inkubációs médium felét (0.5 ml) használtuk ezért 2-vel szorozzuk és mert 8 sziget szekrécióját mértük csövenként, 8-al osztjuk az eredményt. Az 1.09 korrekció a cellulóz által elfoglalt térfogat beszámítása.
4.1.4.4 A szigetek insulin tartalmának mérése Az insulin szekréció meghatározására felszívott (0.7 ml) inkubációs médium eltávolítása után, a műanyag mikroserlegben az izolált 8 sziget 0.3 ml inkubációs médiumban marad vissza. 1.0 ml foszfát puffert (100 mM, pH=7.0) hozzáadva, mely 1% w/v BSA-t tartalmazott, a mikroserleg tartalmát háromszor 10 másodpercig szonikáltunk (MSE Ultrasonic Disintegrator készülékkel). A minták insulin tartalmát vagy azonnal határoztuk meg, vagy -20°C-on tárolva későbbi időpontban. Az insulin tartalom meghatározásához a fenti albumin/foszfát pufferben való százszoros hígítással, 25 ill. 50 ml minta insulin tartalmát mértük párhuzamosan radioimmunassayel. A szigetek insulin tartalmát pg/sziget ill. mU/sziget értékben fejeztünk ki (1 mg insulin 25 U-nak felel meg).
4.1.4.5 Izolált pancreas szigetek 45Ca felvételének mérése Izolált pancreas szigeteket (100 sziget) 90 percig, 37°C-on inkubáltuk 1.0 ml inkubációs médiumban, mely a következő ionokat tartalmazta: Na+ 139, K+ 5, Ca2+ 2, Mg2+ 2, Cl124, HCO3- 24 milliequivalenst literenként (mEq/l) [94]. Az inkubációs oldat az ionokon kívül 0.5 % w/v BSA-t, 45Ca-ot (specifikus aktivitás: 5-7 mCi/ml, 45CaCl2; New England Nuclear, Boston, MA, USA), továbbá a kísérletben vizsgálandó anyagokat tartalmazta. Az inkubáció első 5 percében a médiumot 95% oxigén és 5% CO2 elegyével ekvilibráltattuk [94]. Inkubálás után a szigeteket négyszer mostuk szobahőmérsékleten (2.0 ml inkubációs médiumban reszuszpendálva, 4 g-vel, 5 percen át centrifugáltuk), hogy az extracelluláris radioaktivitást biztosan eltávolítsuk. Majd az utolsó átmosást követően a szigeteket petri csészébe helyeztük, és mikroszkóp alatt egyenként vittünk át 5-5 szigetet, friss 2.0 ml inkubációs médiumba. Minden cső és pipetta szilikonozott volt, a szigetek adherenciájának megelőzésére.
30
Valamennyi
45
Ca minta radioaktivitásának meghatározásához 5 szigetet és 10 ml
szcintillációs koktélt (Insta-gel, Packard, Downers Grove, IL, USA) alkalmaztunk. A radioaktivitást cpm/sziget értékben fejeztük ki. A szigetek kalcium felvételét a
45
Ca
specifikus aktivitás (cpm/mg) és a radioaktívan nem jelzett kalcium koncentráció arányából számítottuk ki és pmol/sziget értékben fejeztük ki [94].
4.1.4.6 Diszperz pancreas szigetsejt szuszpenzió izolálása A diszperz pancreas szigetsejt szuszpenzió előállításához [109] 800 pancreas szigetet háromszor mostunk át, majd 30 percig, 30ºC-on 0.5 ml Hepes-NaOH (10 mM, pH=7.4) B1 pufferben inkubáltunk, mely összetételét a VIII. táblázat mutatja. VIII. táblázat. A Hepes-NaOH (10 mM, pH=7.4) - B1 puffer összetétele. Összetevő
mM
NaCl
124
KCl
5.4
MgSO4
0.8
NaH2PO4
1.0
NaHCO3
14
EGTA
1.0
D-glukóz
2.8
A pancreas szigeteket ezután 30-szor szuszpendáltuk 400 µl űrtartalmú Eppendorf pipettával, majd a szigetsejtek izolálását 20ºC-on, 1-3 perces inkubálással folytattuk a fenti pufferben, mely 5 mg neutrális proteinázt (EC 3.4.24.4; Bacillus polymyxa) (Dispase II; Boehringer-Mannheim, Németország) is tartalmazott. Ezután 4.0 ml HepesNaOH pufferrel (20 mM, pH=7.4) - B2 kiegészítve [72] a diszperz pancreas sejteket 90 másodpercen át, 20ºC-on 800 g-vel centrifugáltuk. A Hepes-NaOH (20 mM, pH=7.4) B2 puffer összetételét a IX. táblázat tartalmazza. Az üledéket ezzel az oldattal mostuk, és szuszpendáltuk benne 1 szigetsejt/µl hígításban. A sejtszámot hemocitométerben határoztuk meg. A módszerrel szigetenként 1.49±0.19 x 103 sejt nyerhető (n=10) [109]. Az élő sejtek aránya a diszperz szigetsejt-szuszpenzióban tripán kék kizárás alapján meghatározva legalább 95%.
31
IX. táblázat. A Hepes-NaOH (20 mM, pH=7.4) - B2 puffer összetétele [72]. Összetevő NaCl
115 mM
KCl
5 mM
MgCl2
1 mM
CaCl2
1 mM
NaHCO3
5 mM
D-glukóz
8.3 mM
BSA
0.5 mg/ml
4.1.4.7 Tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított pancreas non-B-szigetsejtek nyerése Tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított pancreas non-B-szigetsejtek előállításához a diszperz pancreas szigetsejt szuszpenziót 70 µm pórusméretű nylon szűrőn szűrtük át (Falcon Products, Franklin Lanes, NJ, USA) és 6 ml Hepes-NaOH (20 mM, pH 7.4) B2 pufferrel 1.045 g/cm3 sűrűségű Percoll (Pharmacia, Uppsala, Svédország) oldatra rétegeztük [108]. 15 percig 400 g-vel +4ºC-on centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, majd a sejtüledéket 5.0 ml PBS (phosphate-buffered saline) oldatban (pH=7.2) reszuszpendáltuk, mely 0.5% BSA-t, 2.0 mM EDTA-t és 5.6 mM D-glukózt is tartalmazott. Az izolálás további lépéseit a fenti PBS oldattal végeztük. A sejtszám meghatározása után, a sejteket ismét centrifugáltuk (3 percig, 300 g-vel), majd 0.5 ml PBS-ben oldott (52 µg/ml) R2D6 patkány pancreas B-sejt membrán elleni monoklonális ellenanyaggal 30 percig +4ºC-on (Alejandro és mtsai módszere szerint) inkubáltuk [4]. A sejteket 9.5 ml PBS hozzáadásával mostuk át, majd 3 percig 300 g-vel centrifugáltuk és a felülúszót elöntöttük. A sejt üledéket 80 µl PBS-ben reszuszpendáltuk és 20 µl MACS (magnetic cell separator) patkány antiegér IgM-el borított mikrogyöngyöt adtunk hozzá (Miltényi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Németország; megrendelési szám 473-02). 30 percig +4ºC-on történő inkubálást követően a sejteket 10 ml PBS-ben mostuk át, 3 percig 300 g-vel centrifugáltuk, és a felülúszót eltávolítva 1.0 ml PBS-ben reszuszpendáltuk. Ezt a sejtszuszpenziót MS+ oszlopra rétegeztük (Miltényi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Németország) és Mini MACS szeparátor (Miltényi Biotec GmbH) mágneses terébe helyeztük. 32
A mágneses térben az oszlopról a pancreas non-B-sejtek könnyen eltávolíthatók. Az oszlopot 3x500 ml PBS-sel mostuk le, és a három mosófolyadékot egybeöntöttük. Ez a frakció tartalmazta a tisztított non-B-sejteket. Az oszlopot ezután eltávolítottuk a mágneses térből, és 1.0 ml PBS-sel mostuk át. Így kaptuk a tisztított B-sejt frakciót. Ez után megszámláltuk a két sejtpopuláció sejtszámát. A pancreas B és non-B-sejtpopulációk tisztaságának ellenőrzésére [108] meghatároztuk a sejtek insulin tartalmát, mely B-sejtekben 12.16±1.2 pg/sejt és non-B-sejtekben 3.61±0.56 pg/sejt. A sejtek glukagon tartalma B-sejtek esetében 0.14±0.02 pg/sejt és non-B-sejtekben 1.55±0.14 pg/sejt. Az insulin/glukagon moláris aránya B-sejtekben 58.52±9.32 (n=14) és non-B-sejtekben 1.44±0.24 (n=11).
4.1.4.8 D-glukóz metabolizmus vizsgálata A D-glukóz metabolizmusának vizsgálata magában foglalja a glukóz oxidáció folyamatában, a közti és a végtermékek összességét. A D-[U-14C]glukózból keletkezett 14
CO2, a
14
C-jelzett savas metabolitok (14C-piroszőlősav) és a
14
C-aminosavak
mennyiségét picomol D-glukóz értékben fejeztük ki. A D-[5-3H]glukózból képződött 3
HOH, a glukóz teljes felhasználását mutatja. A D-[5-3H]glukóz felhasználását és a D-
[U-14C]glukóz oxidációját külön-külön, valamint ugyanazon mintákban, szimultán is mérhetjük [81].
4.1.4.8.1 Az extracelluláris és intracelluláris megoszlási terek meghatározása pancreas szigetekben. A 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz transzportja Az extracelluláris megoszlási tér mérésére a sejtekbe be nem jutó [U-14C]szaharóz ill. az intracelluláris tér mérésére a felvételre kerülő, de nem metabolizálódó D-glukóz analóg, a 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz mennyiségét vettük figyelembe. A 3-O-metil-D-[U14
C]glukóz a glukóz transzport vizsgálatára alkalmas: a D-glukóz felvételét gátolja a B-
sejtbe, de nem gátolja a további metabolikus eseményeket [122]. A [U-14C]szaharóz (2.0 mM, 16mCi/ml) megoszlását az extracelluláris térben, valamint a 3
HOH (15 mCi/ml) és a D-[U-14C]glukóz (16 mCi/ml) intracelluláris akkumulációját, és a
3-O-metil-D-[U-14C]glukóz transzportját vizsgálva, 20 pancreas szigetet 5 illetve 15 percig inkubáltunk 37°C-on, 60 ml Hepes-NaOH (20 mM, pH=7.4) - B2 bikarbonát pufferben, a jelzett anyagok jelenlétében [67, 72, 109].
33
Az inkubálás után, a szigeteket tartalmazó médiumot 150 ml szilikon olajra rétegeztük (Versilube F-50; General Electrics, Waterford, NY, USA), és 50 ml CsCl (640 mM) és HCl (50 mM) tartalmú oldaton át centrifugáltuk 1 percen át, 1000 g-vel (Beckman Microfuge, 152-es modell; Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA) [122]. Az üledékhez 200 ml hiamin hidroxidot (Packard Instruments, Downers Grove, IL, USA) adtunk [43]. 30 percig 4°C-on enyhén folyamatosan mozgattuk, majd 10 ml szcintillációs koktélba vittük (Insta-gel, Packard, Downers Grove, IL, USA). Az üledék 3
H és
14
C radioaktivitását a szigeteket nem tartalmazó kontroll radioaktivitásának
figyelembe vételével, nl/sziget értékben fejeztük ki. A 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz (0.3 mCi/mmol) transzportot jelzetlen 3-O-metil-D-glukóz hozzáadásával is meghatároztuk [67].
4.1.4.8.2 D-[5-3H]glukóz felhasználás vizsgálata. D-[5-3H]glukóz átalakítása 3HOHvá 20 szigetet 120 percig inkubáltunk 37°C-on, 40 ml inkubációs médiumban, mely 2.5 mCi/ml D-[5-3H]glukózt tartalmazott (Radiochemical Centre, Amersham, Anglia) [21, 43, 62, 81]. A szigeteket tartalmazó kis csövet (30 mm x 5 mm) 1.5 ml H2O-t tartalmazó (20 ml térfogatú) liquid szcintillációs küvettába helyeztük, melyet gumidugóval zártunk le. Az inkubáció első 5 percében O2/CO2 (95/5%, v/v) gáz keverékkel buborékoltattuk. Az inkubációs idő elteltével, a gumidugón át injektálva, 20 ml citrát-NaOH pufferrel (0.4 M, pH=4.9) leállítottuk az intermedier anyagcserét. Majd szobahőmérsékleten újabb 22 órán keresztül (folyamatosan enyhén mozgatva) inkubáltunk tovább [62, 81]. Az inkubálás után, a szigeteket tartalmazó médiumot 150 ml szilikon olajra rétegeztük (Versilube F-50; General Electrics, Waterford, NY, USA), és 50 ml CsCl (640 mM) és HCl (50 mM) tartalmú oldaton át centrifugáltuk 1 percen át, 1000 g-vel (Beckman Microfuge, 152-es modell; Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA). Az üledékhez 200 ml hiamin hidroxidot (Packard Instruments, Downers Grove, IL, USA) adtunk [43]. 30 percig 4°C-on enyhén folyamatosan mozgattuk, majd a 3HOH mérésére 5 ml szcintillációs koktélban (Lumagel; Lumac, Bázel, Svájc) a b-számláló 3H csatornáján mértük a radioaktivitást. A szigeteket nem tartalmazó háttér értékének kivonása után, a glukóz felhasználást pmol/120 perc/sziget értékben fejeztük ki. A radioaktivitás visszanyerése kb. 75%-os volt.
34
A képződött 3HOH mennyiséget a D-[5-3H]glukóz felhasználás mértékének tekintettük. Különböző specifikus aktivitású D-[5-3H]glukóz hozzáadásával a 2.8-16.7 mM tartományban a glukóz felhasználás ötszörösére fokozható [109].
4.1.4.8.3 A D-[U-14C]glukóz oxidáció vizsgálata. D-[U-14C]glukóz átalakítása 14
CO2-vé
20 szigetet 120 percig inkubáltunk 37°C-on, 40 ml inkubációs médiumban, mely 10 mCi/ml D-[U-14C]glukózt tartalmazott (Radiochemical Centre, Amersham, Anglia) [21, 43, 62, 81]. A szigeteket tartalmazó kis csövet (30 mm x 5 mm) 1.5 ml H2O-t tartalmazó (20 ml térfogatú) liquid szcintillációs küvettába helyeztük, melyet gumidugóval zártunk le. Az inkubáció első 5 percében O2/CO2 (95/5%, v/v) gáz keverékkel buborékoltattuk. Az inkubációs idő elteltével a gumidugón át, 20 ml citrát-NaOH pufferben (0.4 M, pH=4.9) 10 mM antimicin A-t, 10 mM rotenont és 5.0 mM KCN-t injektáltunk az inkubációs médiumba. Ezáltal leállítottuk a sejtlégzést. A szintén a küvettába helyezett nagy csőbe (30 mm x 10 mm) pedig, 500 ml hiamin hidroxidot (Packard Instruments, Downers Grove, IL, USA) juttattunk. 60 perc folyamatos enyhe mozgatás mellett, szobahőmérsékleten történő inkubációt követően a nagy csövet kivettük a küvettából, hogy meghatároztuk a radioaktivitását (vagyis az elnyelődött
14
CO2 mennyiségét) [21,
43, 79]. A keletkezett
14
CO2 mérésére a nagy csövet új szcintillációs küvettába helyeztük és 10
ml szcintillációs koktélt (Lumagel; Lumac, Bázel, Svájc) adtunk hozzá. A b-számláló 14
C csatornáján mértük a radioaktivitást. A szigeteket nem tartalmazó háttér értékének
kivonása és az ugyanolyan körülmények között, de szintén szigetek nélküli NaH14CO3 (3 mCi/ml) visszanyerés korrekcióval, a glukóz oxidáció mértékét pmol/120 perc/sziget értékben fejeztük ki [21, 43].
35
4.1.4.8.4 D-[U-14C]glukóz átalakítása 14C-jelzett savas metabolitokká A D-[U-14C]glukóz (10 mCi/ml) oxidáció során képződött 14C-savas metabolitok és 14Caminosavak (ld. később: 4.1.4.8.5 fejezet) vizsgálatára 20 szigetet (30 mm x 5 mm átmérőjű) kis csőben hasonlóképpen inkubáltunk, mint a 4.1.4.8.3 fejezetben [43, 67]. Az inkubálás végén a szigeteket az inkubációs médiummal együtt 2.0 ml H2O-ban +4°Con, 3x5 másodpercig közepes erősséggel, 3-as amplitúdóval szonikáltuk (MSE Ultrasonic Disintegrator készülékkel) [37, 43, 67]. A D-[U-14C]glukóz oxidációkor keletkezett 14C-jelzett savas metabolitok szeparálására a szonikátumot (10 cm x 5 mm) anioncserélő oszlopra rétegeztük (0.5 ml, Dowex 1-X8, formiát ciklusú forma; Fluka, Buchs, Svájc) [37]. Az oszlopot 3x2.0 ml H2O-val átmostuk, majd 3.0 ml 1.0 M ammónium formiát/0.1 M hangyasav oldattal eluáltuk a 14
C-jelzett savas metabolitokat [37]. Az eluátumot 15 ml szcintillációs koktéllal keverve
(Lumagel; Lumac, Bázel, Svájc) mértük a minta (14C) radioaktivitását [37]. A háttér a pancreas sziget-homogenizátumot nem tartalmazó oszlopra felvitt minta radioaktivitása volt.
4.1.4.8.5 D-[U-14C]glukóz átalakítása 14C-jelzett aminosavakká A D-[U-14C]glukóz oxidációkor keletkezett
14
C-jelzett aminosavak szeparálására a
4.1.3.8.4 pont alatti szonikátumot (10 cm x 5 mm) ioncserélő oszlopra rétegeztük (0.5 ml, Dowex 50, H+ ciklusú forma; Fluka, Buchs, Svájc). Az oszlopot bőségesen (20-30 ml) vízzel mostuk, majd 1.5 ml 1.0 M NH4OH oldattal eluáltuk a
14
C-jelzett
aminosavakat [43]. Az eluátum radioaktivitását 15 ml Lumagel hozzáadása után, liquid szcintilláció mérésével határoztuk meg. Az eluált radioaktivitást felszálló papírkromatográfiával, bután-1-ol:metanol:H2O (2:2:1 térfogatarányú) elegyében vizsgáltuk, és analitikai ioncserélő radiokromatográfiával (Beckman Multichrom B aminosav analizátor) határoztuk meg (mely Packard Tri-Carb flow-monitorhoz kapcsoltan működött; 320 E típus) [43].
4.1.5 Statisztikai feldolgozás Valamennyi eredményt átlag±SEM formában tüntettük fel, együtt az egyedi kísérletek számával (n) vagy szabadság fokával (d.f.). Az átlagok közötti statisztikai szignifikancia szintet Student t-próbával vizsgáltuk. 36
4.2
KLINIKAI VIZSGÁLATOKBAN ALKALMAZOTT MÓDSZEREK
4.2.1 Beteg kiválasztás Prospektív vizsgálatunkba 93, (részben járóbeteg, részben bentfekvő) 2-es típusú diabeteses beteget (46 férfi, 47 nő életkor: 42-85 év, átlagéletkor 66.5±10 év) valamint 42 egészséges személyt vontunk be, a Semmelweis Egyetem II. sz. Szemészeti és III. sz. Belgyógyászati Klinika beteganyagából (1997 szeptember és 1998 december között). Beteg-beválasztási kritériumok: (1) 2-es típusú diabetes mellitus diagnózis, (2) a diabetes kórismézésekor az életkor ³ 20 év. Kizárási kritériumok: (1) csökkent glukóztolerancia (IGT), (2) malignus betegség az anamnézisben, (3) lázzal járó ill. fertőző betegség, (4) krónikus alkohol fogyasztás. A 2-es típusú diabetes kezelése 45 beteg esetében humán insulin készítménnyel (Humulin, Lilly), ill. 48 beteg kezelése orális antidiabetikumokkal - glipizide (Minidiab, Pharmacia & Upjohn), gliclazide (Diaprel, Servier), glibenclamide (Gilemal, Chinoin) -, valamint megfelelő diétával történt. A kontroll csoport 42 egészséges, nem-diabeteses személyből állt (21 férfi, 21 nő, életkor: 24-74, átlagéletkor 50.4±14.7 év). Beválasztási szempontok: (1) 20 év feletti életkor, (2) eltérés nélküli fizikális vizsgálat, (3) a vizsgálatot megelőző 6 hónapban gyógyszeres kezelés hiánya, (4) kizárható IGT vagy diabetes mellitus, (5) egyéb, a retina állapotát érintő betegség hiánya. Előzetes szóbeli és írásbeli tájékoztatás után valamennyi személy írásban beleegyezését adta, hogy részt vesz a vizsgálatban. A klinikai vizsgálati tervet a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Tudományos Kutatásetikai Bizottsága jóváhagyta (TUKEB engedély száma: 123/1997).
4.2.2 Anamnézis, belgyógyászati vizsgálat Az anamnézis felvétel valamennyi esetben az előre meghatározott szempontokat tartalmazó adatlap kitöltésével zajlott. Ezen feltüntettük a páciens nemét, életkorát a vizsgálat időpontjában, valamint a betegség kezdetét, és az ebből számított betegségtartamot.
A
részletes
szövődményeire,
anamnézis
magasvérnyomás
felvétel betegségre,
kitért
a
esetleges
diabetes általános
kórtörténetére, érbetegségek
meglétére, az aktuálisan alkalmazott gyógyszerelésre. A testsúlyt (kg), a testmagasságot (m) és a vérnyomás értékeket (Hgmm) a vizsgálat helyszínén mértük meg.
37
4.2.3 Szemészeti vizsgálat Vizsgálatunk valamennyi résztvevőjénél részletes szemészeti vizsgálat történt. Ennek során felvettük a látásélességet, applanatiós tonometriával mértük a szemnyomást. Az elülső szegmentum réslámpás vizsgálata után maximális pupillatágításban, részletesen vizsgáltuk (+90 D lencsével ill. indirekt binoculáris ophthalmoscoppal) a hátsó szegmentumot. A diabeteses betegek mindkét szeméről - tiszta törőközegek esetén -, 45 fokos színes fundus fényképeket készítettünk (Canon fundus kamera, Japán; szemenként két standard mező, macula temporálisan és papilla N. optici nazálisan). Amennyiben a klinikai kép indokolta, - státus rögzítés céljából - más retina területről is készült fotó. Fluoreszcein angiográfiát (FLAG) a diagnózis szempontjából kérdéses esetekben végeztünk. Az alkalmazott protokoll az EURODIAB IDDM Complications Study ajánlásának felelt meg [3, 123]. Az elkészült diák értékelése és a retinopathia stádiumbeosztása az Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group (ETDRS) beosztása alapján történt [26]. A vizsgált 93 diabeteses betegből 79-ben (84.9%) készült fundusfotó mindkét szemről, 11 esetben (11.8%) csak egy szemről, és 3 esetben (3.2%) érdemi fotó nem volt nyerhető. A törőközegek borússága esetén (pl. katarakta, masszív üvegtesti vérzés) A és B képes ultrahang vizsgálat (Erbe-Sonomed készülék, 8 MHz-es fej) történt. Ezekben az esetekben a megfelelő beteg-csoportba való besorolás a kimutatható kóros elváltozáson alapult. A szemészeti vizsgálat alapján, a következő beteg-csoportokat alakítottuk ki: (0) nincs szemtükörrel kimutatható retinopathia, (1) non-proliferatív retinopathia (enyhe-mérsékelt, mérsékelt-előre haladott, előre haladott, nagyon előre haladott), (2) korai proliferatív retinopathia, (3) nagy-rizikójú proliferatív retinopathia. A besorolás a súlyosabb stádiumú szem állapota alapján történt. A különböző retinopathia stádiumok definíciójára használt terminológiát az X. táblázat tartalmazza. A beteg-csoportok klinikai jellemzőit a XI. táblázatban foglaltuk össze.
38
X. táblázat. Stádiumbeosztás és klasszifikáció az Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group (ETDRS) ajánlásának megfelelően [26].
Jelen tanulmány beteg-csoportja 0. csoport 1. csoport
ETDRS szint
Stádium-beosztás
Definíció
10 20, 35
Nincs retinopathia Enyhe-mérsékelt NPDR
43, 47
Mérsékelt-előre haladott NPDR
53A-D
Előre haladott NPDR
53E
Nagyon előre haladott NPDR
2. csoport
61, 65
Korai PDR
3. csoport
71, 75, 81, 85
Nagy-rizikójú PDR
Nincs szemtükörrel kimutatható retinopathia Mikroaneurizmák Intraretinális vérzések: enyhétől súlyosig, kevesebb mint 4 kvadránsban Kemény exsudátumok Makula ödéma – fokális, diffúz Foveoláris avaszkuláris zóna (FAZ) abnormalitások Puha exsudátumok – Vatta („gyapottépés-szerű") gócok Intraretinális vérzések: enyhétől súlyos fokig, mind a 4 kvadránsban Vénás gyöngyfüzér képződés Intraretinális mikrovaszkuláris abnormalitások / IRMA Bármelyik tényező az alábbiak közül: Súlyos intraretinális vérzések 4 kvadránsban Vénás gyöngyfüzér képződés 2 kvadránsban Mérsékelten súlyos intraretinális mikrovaszkuláris abnormalitások / IRMA 1 kvadránsban Bármely két tényező az alábbiak közül Súlyos intraretinális vérzések 4 kvadránsban Vénás gyöngyfüzér képződés 2 kvadránsban Mérsékelten súlyos intraretinális mikrovaszkuláris abnormalitások / IRMA 1 kvadránsban Érújdonképződés (neovaszkularizáció) a papilla területében / NVD Érújdonképződés (neovaszkularizáció) másutt a retinában / NVE Preretinális vérzés Üvegtesti vérzés Trakciós retina leválás Érújdonképződés az irisben (rubeosis iridis) vagy a csarnokzugban (goniorubeosis), vagy mindkettő Bármely három tényező az alábbiak közül: Újonnan keletkezett erek jelenléte Újonnan képződött erek a papilla területében Újonnan képződött erek súlyossága Ha a NVD kiterjedése ³ 1/4-1/3 papillányi terület vagy mint a 10A standard fényképen Ha az NVE kiterjedése ³ 1/2 papillányi terület Ha mindkettő jelen van, a papilla neovaszkularizáció súlyossága veendő figyelembe Preretinális, vagy üvegtesti vérzés jelenléte
NPDR: non-proliferatív diabeteses retinopathia, PDR: proliferatív diabeteses retinopathia
39
XI. táblázat. A diabeteses beteg-csoportok, valamint egészséges kontroll személyek klinikai paraméterei. Az adatokat átlagérték±SD formában tüntettük fel.
Vizsgált személyek száma Nem (férfi/nő) Jelenlegi életkor (év és szélsőértékek) Diabetes időtartam (év és szélsőértékek) Életkor a DM diagnosztizálásakor (év és szélsőértékek) BMI (kg/m-2) Szisztolés RR (Hgmm) Diasztolés RR (Hgmm)
Összes 2-es típusú diabeteses beteg 93 46/47 66.5±10 (42-85) 13.6±8.5 (0,04-35) 52.8±12.5 (24-81) 27.27±5.86 148±17 82±9
0. csoport
1. csoport
2. csoport
3. csoport
Kontroll
42 19/23 69.1±9.7 (43-85) 9.7±7.7 (0,04-32) 59.2±11.4 (30-81) 27.10±6.00 151±14.5 85±9
16 9/7 64.7±11.3 (42-83) 13.4±7.5 (1-35) 51.1±11.8 (24 –67) 26.48±3.75 152.5±20.2 84.4±7.8
19 8/11 69.2±7.4 (56-82) 19±7.3 (6-35) 50.2±10.3 (28-68) 28.26±4.34 150±15 80.5±10
16 10/6 60.6±9.3 (43-72) 16.2±7.3 (2-32) 44.4±9.6 (27-59) 27.37±9.43 136±18 77±9
42 21/21 50.4±14.7 (24-74) -
BMI: testtömeg index, RR: vérnyomás. 0. csoport: nincs szemtükörrel kimutatható retinopathia, 1. csoport: non-proliferatív retinopathia (enyhe-mérsékelt, mérsékelt-előre haladott, előre haladott, nagyon előre haladott), 2. csoport: korai proliferatív retinopathia, 3. csoport: nagy-rizikójú proliferatív retinopathia.
40
25.08±4.79 137±15 87±6
4.2.4 Laboratóriumi vizsgálatok Valamennyi vizsgálati személytől éhgyomri vérvétel történt. A vérmintából plazma glukóz, szérum GGT és ALT aktivitás, szérum kreatinin, valamint húgysav szint meghatározást végeztünk standard laboratóriumi módszerekkel. A glikált hemoglobin (HbA1c) szint mérése affinitás kromatográfiás módszerrel, Abbot IMx® készülékkel (Abbot IMx® Glycated Hemoglobin assay, IL, USA; referencia érték: 4.4-6.4%) történt. A mikroalbuminuria meghatározását 24 órás vizeletgyűjtés után, radioimmunassay módszerrel (Pharmacia, Svédország) végeztük.
4.2.5 SSAO meghatározás A humán szérum SSAO aktivitást radiometriás módszerrel mértük [149]. A [14C]benzilamin szubsztrátból SSAO enzim jelenlétében képződött [14C]-benzaldehid mennyiségét határoztuk meg. A benzilamin, clorgilin és szemikarbazid a Sigma-Aldrich Ltd.–től (Németország) származott. A [14C]-benzilamin az Amersham International (Egyesült Királyság) terméke (specifikus aktivitás: 2.04 GBq/mmol). Minden más kémiai anyagot analitikai tisztaságban alkalmaztunk. Az éhgyomri reggeli vérvétel során minden vizsgált személytől 10 ml natív vénás vért vettünk (antikoagulálás nélkül, Vacutainer tubusba), majd kb. 1-1.5 órán át +4oC-on tároltuk. A minták szállítása +4oC-on, hűtőtáskában történt a Semmelweis Egyetem Gyógyszerhatástani Intézetébe. Itt a mintákat először 2500 g-vel 10 percig centrifugáltuk. Az SSAO meghatározáshoz szérumot használtunk. A maradék szérumot fagyasztva, -20oC-on tároltuk további laboratóriumi vizsgálatok elvégzéséhez. A szérum 40 ml-ét 0.05 M foszfát pufferben (pH=7.4) clorgilinnel (10-4 M koncentrációban) preinkubáltuk szobahőmérsékleten, 20 percen át, hogy az esetlegesen jelenlevő MAO enzimaktivitást meggátoljuk. Ezután a preparátumot radioaktív [14C]benzilamin (5x10-5 M, 0.1 mCi) szubsztrát jelenlétében inkubáltuk Eppendorf csövekben, 200 ml végső térfogatban 37oC-on 40 percen át. Az enzim reakciót 200 ml 2.0 M citromsav hozzáadásával állítottuk le. A keletkezett oxidált, radioaktív [14C]benzaldehid reakcióterméket 1.0 ml toluol:etilacetát 1:1 arányú elegyének segítségével vontuk ki.
41
A felülúszóból 600 ml-t juttattunk 10 ml Aquasafe folyadékot (Zinsser Analytic, Egyesült Királyság) tartalmazó szcintillációs keverékbe. A minták radioaktivitását folyadékszcintillációs számlálóval mértük (Beckman LS-9000, Irvine, CA, USA). A minták fehérje koncentrációját Bradford szerint határoztuk meg [17]. A szérum SSAO aktivitást pmol oxidált szubsztrát/mg protein/óra egységben fejeztük ki. A radiometriás módszer előnye, hogy szenzitív és specifikus (1.0 mM szemikarbazid jelenlétében nem volt kimutatható enzim aktivitás), valamint hogy több minta egyidejű mérésére alkalmas. A radio-enzimatikus módszer egyedüli hátránya, hogy költségesebb, mint a HPLC (High Pressure Liquid Chromatography, nagy nyomású folyadék kromatográfia) technikával és fluorimetriával [137], vagy az ion-cserélő módszerrel végzett enzim aktivitás meghatározás [150].
4.2.6 Statisztikai elemzés A kontroll személyek és a diabeteses, retinopathia-stádium szerint beosztott betegcsoportok
klinikai
paramétereit
Kruskal-Wallis
variancia
analízis
(ANOVA)
segítségével hasonlítottuk össze. Az értékeket az átlagérték ± SD formájában tüntettük fel. Többváltozós regressziószámítással értékeltük a különböző paraméterek hatását az SSAO aktivitásra. A p<0.05 értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. A statisztikai számításokhoz a Statistica for Windows program 5.0 verziójú (Statsoft Inc.) szoftverét alkalmaztuk.
42
5. EREDMÉNYEK 5.1
INSULIN SZEKRÉCIÓS VIZSGÁLATOK IZOLÁLT PANCREAS SZIGETEKBEN
5.1.1 Fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék hatása az izolált szigetek insulin szekréciójára 5.1.1.1 Izolált patkány pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása Dglukóz jelenlétében Kiindulásként meghatároztuk a szigetek insulin alapszekrécióját, mely értéke: 10.7±1.4 mU/90
perc/sziget
(n=40).
Ugyanabban
a
kísérlet-sorozatban
a
D-glukóz
koncentrációjának növelésekor az 5.6 mM D-glukóz koncentráció váltott ki először kismértékű, de szignifikáns (p<0.001) átlagos insulin szekréció fokozódást az alapszekrécióhoz viszonyítottan. Ekkor további 8.2±1.8 mU/90 perc/sziget (d.f.=72) insulin szekretálódott. Az insulin szekréció mértékét a D-glukóz koncentráció emelésével tovább tudtuk fokozni (ld. 3. ábra). A kísérleteinkben alkalmazott legmagasabb D-glukóz koncentráció (16.7 mM) hatására az insulin szekréció, az alapszekrécióhoz képest, közel tízszeresére emelkedett (116.2±5.7 mU/90 perc/sziget; n=45).
5.1.1.2 Fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék hatása a különböző D-glukóz koncentrációk által kiváltott insulin szekréciós válaszra D-glukóz hiányában, vagy alacsony D-glukóz koncentráció (5.6 és 6.0 mM) alkalmazása során az aminosav keverék nem növelte jelentősen az insulin kibocsátást. Amikor összevontuk a három rész-kísérlet eredményeit (D-glukóz nélkül, 5.6 és 6.0 mM D-glukóz), az ugyanabban a kísérlet-sorozatban mért aminosav keverék nélküli (100.0±5.8%; n=99) szekrécióhoz viszonyítva, az aminosav keverék hatására 125.1±8.2%-os (n=104) szekréció fokozódás következett be. Bár abszolút értékét tekintve az aminosav keverék szignifikánsan fokozta az insulin szekréciót (+3.8±1.5 mU/90 perc/sziget; d.f.=197) (p<0.02), ez arányaiban a D-glukóz koncentráció növelése által előidézett insulin szekréció fokozódástól mégis elmaradt.
43
Magasabb
D-glukóz
koncentrációknál
(7.0-16.7
mM)
az
aminosav
keverék
szignifikánsan emelte az insulin szekréciót (p£0.005). Az insulin szekréció fokozódás nagysága a 7.0 mM D-glukózzal kiváltott szekrécióhoz viszonyítottan +39.9±8.1%; d.f.=78, a 11.1 mM D-glukóz koncentrációnál +34.5±10.6%; d.f.=81, és a 16.7 mM Dglukóz esetében +37.5±8.7%; d.f.=86. Ezen D-glukóz koncentrációk mellett az átlagos emelkedés nagysága 37.3±5.3% (d.f.=245). 8.3 mM D-glukóz jelenlétében az aminosav keverékkel indukált átlagos insulin szekréció fokozódás 50.4±7.4% (d.f.=251), amely magasabb, bár nem szignifikánsan (p>0.1), mint a 7.0, 11.1 illetve a 16.7 mM Dglukózzal végzett vizsgálatok esetében (ld. 3. ábra).
Insulin szekréció (mU/90 perc/sziget)
200
150
100
50
0 0
5
10
15
D-glukóz koncentráció (mM)
3. ábra. Emelkedő D-glukóz koncentráció (0-16.7 mM) hatása az izolált patkány pancreas szigetek insulin szekréciójára aminosavak nélkül (folyamatos vonal), valamint aminosav keverékkel együtt inkubálva (szaggatott vonal). A feltüntetett értékek átlag±SEM szerepelnek.
5.1.1.3 A szigetek insulin tartalma Ezekben a kísérletekben a szigetek insulin tartalma nem különbözött a D-glukóz mentes környezetben (1.20±0.13 mU/sziget; n=26), ill. 8.3 mM D-glukózzal (1.12±0.09 44
mU/sziget; n=26), vagy 16.7 mM D-glukózzal inkubálva (1.13±0.11 mU/sziget; n=26). Hasonlóképpen az aminosavak nélkül, illetve jelenlétükben végzett inkubálás után sem különbözött jelentősen a szigetek insulin tartalma: D-glukóz mentes környezetben (1.16±0.03 vs. 1.09±0.06 mU/sziget), 5.6 mM D-glukóz mellett (1.09±0.06 vs. 1.20±0.07 mU/sziget), és 8.3 mM D-glukóz jelenétében (1.20±0.03 vs. 1.23±0.05 mU/sziget) (minden esetben n=24).
5.1.1.4 Az insulin szekréció arányának időfüggése 8.3 mM D-glukózzal történő inkubálás után, amint az várható volt, az insulin szekréció aránya az inkubálás első 30 perce után kissé magasabb, mint ezt követően. Az insulin szekréció 30 ill. 60 perces inkubálás után átlagosan 44.1±3.4% ill. 72.8±3.1%, a 90 perces inkubálás után mért 100.0±4.0%-hoz viszonyítva (mindegyik esetben n=10). Hasonló helyzetet tapasztaltunk 8.3 mM D-glukóz és az aminosav keverék együttes hatására mért insulin szekréció esetében is. A 30 és 60 perces inkubálás után mért arányok 43.4±1.7% ill. 68.1±3.4%, a 90 perces inkubálást követő 100.0±3.6%-hoz képest (minden esetben n=10). Ezek a százalékban kifejezett értékek nem különböztek szignifikánsan (p³0.3) az aminosavak nélküli kísérletek eredményeitől. Az aminosav keverék hatására bekövetkező átlagos insulin szekréció fokozódás kissé nagyobb volt az inkubáció első 30 percében (+0.27 mU/perc/sziget), mint az időszak utolsó 60 percében (+0.19 mU/perc/sziget). A teljes 90 perces inkubációs periódusra számítva, 0.22±0.06 mU/perc/sziget (d.f.=54, p<0.001) átlagos insulin szekréció fokozódás jött létre az aminosavak jelenlétének következtében.
45
5.1.2 Az aminosav keverék összetétel változtatásának hatása a pancreas szigetek insulin szekréciójára A következő kísérlet-sorozatban az aminosav keverékben lévő taurin és néhány kiválasztott aminosav részvételét tanulmányoztuk a pancreas szigetek 8.3 mM Dglukózzal kiváltott insulin szekréciójának befolyásolásában. Vizsgáltuk, hogyan változik a D-glukózzal stimulált insulin kibocsátás mértéke, ha egyes aminosavakat elhagyunk az aminosav keverékből, ill. ha csak bizonyos aminosavakat adunk a kizárólag D-glukózt tartalmazó inkubációs médiumhoz. Eredményeinket a XII. és XIII. táblázatban, valamint a 4. ábrán foglaltuk össze.
5.1.2.1 Taurin szerepe aminosav keverékben A taurin nélküli aminosav keverék nem változtatta meg jelentősen a 8.3 mM Dglukózzal, az aminosav keverék jelenlétében kiváltott insulin szekréciót. Taurin mentesen az insulin szekréció fokozódás mértéke átlagosan 101.9±4.8%, (n=24), míg a taurinnal kiegészített aminosav keverékkel 100.0±5.6% (n=24). A taurinnal kiegészített aminosav keverék a D-glukózzal kiváltott insulin szekréciót az előző kísérletekkel megegyezően fokozta (p<0.001) (52.7±3.0 mU/90 perc/sziget-ről 77.4±4.9 mU/90 perc/sziget-re; n=23-24), mely a szekréció 45.7±8.8%-os növekedésének felel meg (n=24) (ld. XII. táblázat).
5.1.2.2 Bázikus aminosavak szerepe az aminosav keverékben A bázikus aminosavak (L-arginin, L-citrullin, L-lizin és L-ornitin) úgy tűnik csak kismértékben vesznek részt a (taurinnal kiegészített) aminosav keverékkel kiváltott insulin szekrécióban. Így kihagyásuk az aminosav keverékből nem hatott jelentősen a D-glukózzal kiváltott insulin szekrécióra, az aminosav keverék jelenlétében. Csak a négy bázikus aminosav hatását vizsgálva (más egyéb aminosavak és taurin nélkül), az insulin szekréció mindössze 8.6±3.3%-al (n=22; p<0.02) fokozódott (ld. XII. táblázat).
46
XII. táblázat. Az insulin szekréció fokozódás aránya a fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék (AK) összetételének változtatására. I. a csak 8.3 mM D-glukózzal kiváltott insulin szekréció mértékét tekintve 100%-nak, II. 8.3 mM D-glukózzal, a komplett aminosav keverék jelenlétében kiváltott insulin szekréció mértékét tekintve 100%-nak. A fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék összetétele
Az insulin szekréció fokozódás aránya (%) I. II.
Taurinnal kiegészített komplett AK
145.7±8.8
100.0±5.6
Taurin nélküli AK
148.46±7.5
101.89±4.8
Bázikus aminosavak nélküli AK
144.9±8.1
99.45±4.3
Csak bázikus aminosavak
108.60±3.3
74.53±4.2
L-glutamin nélküli AK
115.97±5.3
79.59±6.0
Csak L-glutamin
90.40±6.8
62.04±3.1
Elágazó szénláncú aminosavak nélküli AK
102.66±4.8
70.45±4.0
Csak elágazó szénláncú aminosavak
136.40±6.0
74.53±3.6
L-glutamin és elágazó szénláncú aminosavak nélküli AK
98.47±3.9
67.58±3.4
Csak L-glutamin és elágazó szénláncú aminosavak
127.32±5.8
87.38±3.9
L-alanin nélküli AK
166.82±7.2
114.5±5.6
Csak L-alanin
104.20±7.8
71.51±4.2
XIII. táblázat. Választott aminosavak insulin szekréció fokozó hatása. A) a választott aminosavat ill. aminosavakat csak 8.3 mM D-glukózzal együtt alkalmazva. B) A fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék (melyből a választott aminosavat ill. aminosavakat kihagytuk) és 8.3 mM D-glukóz jelenlétében. (A 8.3 D-glukózzal kiváltott insulin szekréciót tekintettük 100%-nak.) Insulin szekréció fokozódás (%) Választott aminosav(ak)
8. 3 mM D-glukóz
A/B kísérlet hányadosa (%)
+ A) csak a választott aminosavak 108.60±3.3
+ B) az aminosav keverék (kihagyva belőle a választott aminosavakat) 144.90±6.2
L-glutamin
90.40±6.8
115.97±5.3
77.95
Elágazó szénláncú aminosavak
136.94±6.0
102.66±4.8
133.90
L-glutamin és elágazó szénláncú aminosavak L-alanin
127.32±5.8
98.47±3.9
129.30
104.20±7.8
166.82±7.2
62.46
Bázikus aminosavak
47
74.94
5.1.2.3 Az L-glutamin szerepe az aminosav keverékben Az L-glutamin (620 mM) nem hatott szignifikánsan (p>0.2) a csak D-glukózzal kiváltott insulin szekrécióra. A szekréció mértéke az L-glutaminnal átlagosan 90.4±6.8% (n=53), míg ugyanabban a kísérletben az L-glutamin nélkül mért szekréció 100.0±5.2% (n=54). Azonban az L-glutamin kihagyása az aminosav keverékből (mely taurint tartalmazott) csökkentette (p<0.01) a 8.3 mM D-glukózzal kiváltott insulin szekréciót 79.6±6.0%-ra (n=58), míg a taurint is tartalmazó komplett aminosav keverékkel az insulin szekréció 100.0±5.4% (n=58) (ld. XII. táblázat).
5.1.2.4 Az elágazó szénláncú aminosavak szerepe az aminosav keverékben Az elágazó szénláncú aminosavak (L-izoleucin, L-leucin és L-valin) kihagyása a taurinnal kiegészített aminosav keverékből nem változtatta meg szignifikánsan a Dglukózzal kiváltott insulin szekréciót (p>0.3; d.f.=46). Tulajdonképpen ezen körülmények között, az insulin szekréció szignifikánsan kisebb volt (p<0.025), mint ugyanabban a kísérlet-sorozatban a D-glukóz és csak a három elágazó szénláncú aminosav együttes hatására. Így az utóbbi esetben az insulin szekréció fokozódás 133.4±12.3% (n=23), míg ugyanabban a kísérlet-sorozatban a taurint tartalmazó, de elágazó szénláncú aminosavak nélküli aminosav keverék jelenlétében 100.0±7.3% (n=24) (ld. XIII. táblázat). Ugyancsak ezt eredményezte (p<0.01) az L-glutamin és az elágazó szénláncú aminosavak együttes kihagyása az aminosav keverékből ill. a Dglukózhoz való hozzáadása. Az első esetben kiváltott insulin szekréció 100.0±6.0% (n=23). Az L-glutamin és az elágazó szénláncú aminosavak hozzáadása az egyébként csak D-glukózt (8.3 mM) tartalmazó inkubációs médiumhoz pedig 129.3±8.8% (n=24) insulin szekréció fokozódást eredményezett (ld. XIII. táblázat).
5.1.2.5 Az L-alanin szerepe az aminosav keverékben Az L-alanin kihagyása az aminosav keverékből ezzel szemben, fokozta (p<0.05) a 8.3 mM D-glukózzal kiváltott insulin szekréciót. A taurinnal kiegészített teljes aminosav keverék által kiváltott 100.0±5.4%, (n=34) insulin szekréciót az L-alanin nélküli aminosav keverék 114.5±4.7%-ra emelte (n=32) (ld. XII. táblázat). Azonban csak (8.3 mM) D-glukózzal stimulálva az L-alanin (560 mM) nem befolyásolta szignifikánsan az insulin szekréció mértékét, mely L-alanin nélkül 100.0±5.2% (n=54) ill. L-alaninnal 104.2±7.8% (n=56) volt (ld. XIII. táblázat).
48
49
0%
glukózzal, AK nélkül kiváltott insulin szekréciót tekintettük 100%-nak.) Csak L-alanin
L-alanin nélküli AK
Csak L-glutamin és elágazó szénláncú aminosavak
L-glutamin és elágazó szénláncú aminosavak nélküli AK
Csak elágazó szénláncú aminosavak
Elágazó szénláncú aminosavak nélküli AK
Csak L-glutamin
L-glutamin nélküli AK
Csak bázikus aminosavak
Bázikus aminosavak nélküli AK
Taurin nélküli AK
Taurinnal kiegészített AK
Komplett AK nélkül
Insulin szekréció fokozódás mértéke 180%
160%
140%
120%
100%
80%
60%
40%
20%
4. ábra. A fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék (AK) összetétel
változtatásának hatása a patkány pancreas szigetek 8.3 D-glukózzal előidézett
insulin szekréciójára. Az ábrán az átlagértékeket tüntettük fel. (A csak 8.3 D-
5.1.3 Insulinotróp anyagok hatása a 8.3 mM D-glukózzal kiváltott inzulin szekrécióra az aminosav keverék jelenlétében A következő kísérlet sorozatban négy insulinotróp anyag (glibenclamid, forskolin, teofillin és cytochalasin B) hatását tanulmányoztuk a 8.3 mM D-glukózzal kiváltott inzulin szekrécióra, aminosav keverék hozzáadása nélkül, illetve az aminosav keverék jelenlétében (XIV. táblázat). XIV. táblázat. Glibenclamid (10 mM), forskolin (25 mM), teofillin (1.4 mM) és cytochalasin B (21 mM) hatása a (8.3 mM) D-glukózzal kiváltott insulin szekrécióra (mU/90 perc/sziget) az aminosav keverék nélkül (kontroll) és az aminosav keverékkel együtt. Kísérlet
Vizsgált anyag
Kontroll
Aminosav keverék
79.0±4.9 (20)
118.3±6.2 (20)
Glibenclamid
133.5±16.6 (20)
155.0±13.7 (20)
Forskolin
244.5±14.5 (20)
252.8±13.3 (20)
90.2±8.1 (20)
142.1±8.8 (19)
Forskolin
252.2±20.0 (20)
308.1±24.4 (20)
Teofillin
308.9±22.9 (20)
420.4±35.6 (20)
49.9±6.0 (20)
66.0±5.5 (20)
Teofillin
174.3±14.4 (20)
228.8±12.2 (20)
Cytochalasin B
107.5±6.9 (20)
161.5±18.2 (20)
1. kísérlet -
2. kísérlet -
3. kísérlet -
5.1.3.1 A glibenclamid és a forskolin hatása A glibenclamid az aminosav keverék jelenlétében ill. hiányában egyaránt fokozta (p£0.005) a D-glukózra adott insulin szekréciós választ. Aminosav keverék nélkül 163.6±16.9%-al, illetve az aminosav keverékkel együtt adva 129.5±8.8%-al növelte az insulin szekréciót (mindkét esetben n=20) a megfelelő kontroll értékekhez viszonyítva (100.0±5.7%, ill. 100.0±3.4%; mindkét esetben n=20) (XIV. táblázat, 1. kísérlet). Noha ezek a százalékok nem különböztek egymástól szignifikánsan, az insulin szekréció mégis jobban fokozódott (p<0.02) az aminosav keverék hozzáadásával, az aminosav nélküli kontroll szekréciós értékéhez képest, a glibenclamid nélküli rész-kísérletben (149.0±5.2%; n=20), mint a glibenclamid jelenlétében (122.8±9.0%; n=20). 50
5.1.3.2 A forskolin és a teofillin hatása Ugyanabban a kísérletben (1. kísérlet) a forskolin aminosav keverékkel vagy aminosav keverék nélkül, egyaránt fokozta (p<0.001) a D-glukózzal kiváltott insulin szekréciót. A forskolin insulin szekréciót fokozó hatása jelentősebb (p<0.001) mint a glibenclamidé. A forskolin nélküli minták insulin szekréciós értékéhez viszonyítottan, a forskolin hatására az insulin szekréció fokozódása nagyobb (p<0.001) az aminosavak nélkül (306.6±11.9%; n=20), mint az aminosavakkal együtt (212.9±5.6%; n=20). Összehasonlítva a forskolin (25 mM) és a teofillin (1.4 mM) hatását a 8.3 mM Dglukózzal kiváltott insulin szekrécióra, a forskolin kisebb mértékben fokozta (p£0.06) az insulin szekréciót, mint a teofillin, függetlenül attól, hogy az aminosav keverékkel vagy anélkül alkalmaztuk (XIV. táblázat, 2. kísérlet). A csak 8.3 mM D-glukózt, ill. Dglukózt és aminosavakat tartalmazó rész-kísérletekhez viszonyítva, a forskolin insulin szekréciót fokozó hatása ismét kisebb (p<0.05) az aminosav keverék jelenlétében (220.6±19.0%; n=20), mint az aminosav keverék hozzáadása nélkül (281.3±23.2%; n=20). A teofillin azonban egyaránt fokozta az insulin szekréciót az aminosavak hiányában (347.8±24.2%; n=20), ill. az aminosav keverékkel együtt is (303.8±29.6%; n=20). Ebből következik tehát, hogy a szekréciós válaszban bekövetkező növekedés mértéke, melyet az inkubációs médiumban a D-glukóz mellett jelenlevő aminosav keverék okoz, nem különbözött jelentősen insulinotróp anyag hiányában (átlagosan 157.0±9.5%; n=19) ill. teofillin jelenlétében (136.9±12.4%; n=20). A szekréció fokozódás forskolin jelenlétében azonban, mindössze 122.0±9.3% (n=20) volt, mely tulajdonképpen az aminosav keverék hatására bekövetkező insulinotróp hatás csökkentését jelenti (p<0.02).
51
5.1.3.3 A teofillin és a cytochalasin B hatása A kísérletek következő részében teofillin (1.4 mM) és cytochalasin B (21 mM) egyaránt fokozta (p<0.001) a D-glukózzal kiváltott insulin szekréciót, az aminosav keverékkel együtt vagy anélkül is (XIV. táblázat, 3. kísérlet). A megfelelő cytochalasin B nélküli rész-kísérletekben mért értékekhez képest, a cytochalasin B-vel inkubált esetek insulin szekréció fokozódása hasonló volt (p>0.3) a csak D-glukózzal, aminosavak nélkül (215.4±13.8%; n=20), ill. az aminosav keverékkel együtt inkubált pancreas szigetekben (241.9±26.1%; n=20). Hasonlóképpen teofillin jelenlétében, a cytochalasin B-vel való inkubációk értékeihez képest, az insulin szekréció aránya jelentősen nem különbözött (p>0.4) a csak D-glukózzal, aminosav keverék nélkül (160.6±12.7%; n=20), ill. az aminosav keverékkel együtt inkubált szigetekben (148.2±9.3%; n=20). Ezek az arányok is arra utalnak, hogy a teofillin insulin szekréciót fokozó képessége jelentősebb (p£0.005) a cytochalasin B hatásánál, mind az aminosav keverék nélkül, mind az aminosav keverékkel együtt alkalmazva. Amikor a kísérlet-sorozat teofillin jelenlétében kapott eredményeit összevontuk (XIV. táblázat, 2. és 3. kísérlet), a teofillin nélküli kísérletekhez viszonyítva, a teofillin jelenlétében mért insulin szekréció fokozódás arányai hasonlóak voltak ugyanazokban a kísérletekben: teofillinnel és D-glukózzal együtt átlagosan 286.1±20.2% (n=40), ill. teofillinnel, D-glukózzal és aminosavakkal együttesen inkubálva 324.7±12.7% (n=40). Az a tény, hogy ez a két százalékos arány nem különbözik jelentősen egymástól (p>0.1) megerősíti, hogy a teofillin insulin szekréciót fokozó hatása nem kevésbé jelentős az aminosav keverék jelenlétében, mint az aminosavak nélkül, eltérően attól a helyzettől amit glibenclamid vagy forskolin esetében találtunk.
52
5.1.4 Az aminosav keverék hatása pancreas szigetek 45Ca nettó felvételre Az
aminosav
keverék,
(mely
a
plazmában
levő
aminosavakat
koncentrációban tartalmazta) szignifikánsan fokozta (p<0.001) a
45
fiziológiás
Ca nettó felvételét a
pancreas szigetekbe minden más exogén tápanyag nélkül, de nem fokozta a
45
Ca
felvételt 8.3 mM D-glukózzal inkubálva (XV. táblázat). A 8.3 mM D-glukóz jelenlétében, aminosav keverék nélkül mért értékhez képest (100.0±3.4%; n=31), az aminosav keverék hozzáadásakor, a
45
Ca felvétel alig változott (106.8±2.7%; n=32).
Mind az aminosavakkal együtt, mind az aminosavak nélkül, 8.3 mM D-glukóz jelenlétében, a
45
Ca nettó felvétele a pancreas szigetekben, egyaránt magasabb volt
(p<0.01), mint D-glukóz hiányában. XV. táblázat. Pancreas szigetek
45
Ca nettó felvétele (pmol/sziget) 90 perc, 37°C-on
történő inkubációt követően. D-glukóz
Aminosav keverék
45
Ca nettó felvétel
-
nélkül
3.55±0.14 (32)
-
hozzáadva
4.60±0.17 (32)
8.3 mM
nélkül
7.56±0.26 (31)
8.3 mM
hozzáadva
8.07±0.21 (32)
53
5.1.5 A cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek insulin szekréciójára 5.1.5.1 Izolált patkány pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása Dglukóz jelenlétében Izolált patkány pancreas szigetek insulin szekrécióját 8.3 mM és 16.7 mM D-glukóz jelenlétében végzett inkubáció során mértük. A patkány pancreas szigetek 90 perc alatt 8.3 mM D-glukóz hatására 60.6±2.5 µU/sziget insulint szekretáltak (n=86), míg 16.7 mM D-glukóz jelenlétében a szekréciót jelentősen magasabbnak találtuk (130.4±3.7 µU/sziget; n=105).
5.1.5.2 Cytochalasin B és cytochalasin D koncentrációk kiválasztása az izolált pancreas szigetek insulin szekréciójának vizsgálatához A cytochalasin B és D pancreas szigetek insulin szekréciót befolyásoló hatásának összehasonlításához a kísérletek kezdetén meghatároztuk a későbbiekben alkalmazásra kerülő, legmegfelelőbb cytochalasin B és D koncentrációkat. A 8.3 mM és 16.7 mM Dglukózzal kiváltott insulin szekréciós választ (vagyis a szekréciós válasz fokozódásának mértékét) 5-42 µM cytochalasin B, valamint 5-39 µM cytochalasin D alkalmazásával, 2.5-20 µg/ml koncentráció tartományokban, külön kísérlet-sorozatokban vizsgáltuk (ld. 5. ábra). Az insulin szekréciós vizsgálatok eredményeinek értékelése után, a további összehasonlító vizsgálatokhoz a 21 µM cytochalasin B és a 20 µM cytochalasin D koncentrációkat választottuk. Az 5. ábrán a különböző cytochalasin koncentrációk mellett kapott insulin szekréciós értékeket is, a 21 µM cytochalasin B ill. a 20 µM koncentrációban alkalmazott cytochalasin D jelenlétében mért, 100%-nak tekintett insulin szekréciós értékeihez viszonyítottuk. A cytochalasin B és cytochalasin D egyaránt, valamennyi vizsgált koncentrációjában jelentősen fokozta a 8.3 mM ill. a 16.7 mM D-glukóz által kiváltott insulin szekréciót. Mind a 8.3 mM, mind a 16.7 mM Dglukózzal kiváltott insulin szekréciós válasz fokozása, a 2.5 µg/ml (5 µM) és a 20 µg/ml (39-42 µM) cytochalasin B és D koncentrációk között, a koncentrációval fordított arányban mérsékelt, de mégis szignifikáns mértékű csökkenést mutatott. Ennek valószínű oka az, hogy a cytochalasinok oldására alkalmazott dimetilszulfoxid (DMSO) koncentrációja (az 1.0 µl/ml helyett), a cytochalasin 20-21 µM-nál magasabb koncentrációinál, elérte a 2-4 µl/ml DMSO szintet, amely kedvezőtlenül befolyásolta az 54
insulin szekréciót. Az inkubációs médium 1 µl/ml DMSO koncentrációja mellett mért insulin szekréció értékeihez képest (100.0±3.1%; n=114), a 2-4 µl/ml koncentrációjú DMSO jelenléte ugyanis, az insulin szekréciót 86.4±3.1%-ra (n=114) csökkentette (p<0.005).
Insulin kibocsátás %
16.7 mM D-glukóz
8.3 mM D-glukóz
Cytochalasin B (mg/ml)
Cytochalasin D (mg/ml)
5. ábra. Cytochalasin B és D koncentráció-függő hatása az izolált pancreas szigetek 8.3 mM D-glukózzal (felül) és 16.7 mM D-glukózzal (alul) kiváltott insulin szekréciójára. A cytochalasin koncentrációk µg/ml értékben, logaritmikus skálán láthatók. A cytochalasin B értékei a bal oldalon, a cytochalasin D értékei a jobb oldalon találhatók. Az insulin szekréció értékeinek átlagát (±SEM) tüntettük fel, 24-76 egyedi kísérlet adatai alapján, a 10 µg/ml cytochalasin koncentrációknál mért insulin szekréciót tekintve 100%-nak. 55
5.1.5.3 A cytochalasin B és D hatása a D-glukózzal előidézett insulin szekrécióra A cytochalasin B és D hatását az izolált pancreas szigetek D-glukózzal kiváltott insulin szekréciójára a 6. ábrán mutatjuk be. A cytochalasin B (21 µM) a cytochalasin D-nél (20 µM) hatásosabban fokozta mind a 8.3 mM, mind a 16.7 mM D-glukóz jelenlétében inkubált izolált pancreas szigetek insulin szekrécióját (p£0.02). 100.0±3.0%-nak véve (n=40) a cytochalasin B jelenlétében mért insulin szekréciót, 8.3 mM glukózzal stimulálva, a cytochalasin D által kiváltott insulin szekréció ennek 89.4±3.0%-a (n=40) volt. 100.0±2.5%-nak véve a cytochalasin B jelenlétében mért insulin szekréciót, 16.7 mM D-glukózzal stimulálva, a cytochalasin D által kiváltott insulin szekréció ennek 82.1±2.6%-át (n=40) érte el. Hasonlóképpen a cytochalasin D 10 µM-os koncentrációjánál kiváltott insulin szekréció, 8.3 mM D-glukóz vagy 16.7 mM Dglukóz esetében 88.7±4.1%-a (n=32, p<0.05) volt, az ugyanabban a kísérletben, ugyanazon hexóz koncentrációknál, szintén 10 µM cytochalasin B jelenlétében kapott (100.0±3.0%; n=31) értéknek. A kísérletek további menetét az a hipotézis határozta meg, mely szerint a non-Bszigetsejtek (pl. a glukagon termelő A-sejtek) sejtmembránján keresztül történő Dglukóz transzport cytochalasin B hatására bekövetkező megváltozása, a glukagon kibocsátás fokozásával, indirekt módon befolyásolhatja a B-sejtek insulin szekrécióját. Ennek a hipotézisnek fényében hasonlítottuk össze a cytochalasin B és D hatását a Dglukózzal indukált insulin szekrécióra, forskolinnal (10 µM) inkubált szigetekben. A forskolin a sejtmembránon át könnyen penetráló diterpén vegyület, mely 10 µM koncentrációban,
intakt
pancreas
szigetekben
az
adenilátcikláz
enzim
teljes
aktiválódását váltja ki [66]. Amint a 6. ábra alsó részén látható, a cytochalasin B (21 µM) a cytochalasin D-nél (20 µM) forskolin jelenlétében is jelentősebben fokozta (p£0.005) a 8.3 ill. 16.7 mM D-glukóz által kiváltott insulin szekréciót. Ezekben a kísérletekben a D-glukózzal stimulált insulin szekréció viszonyítási értékei forskolin jelenlétében, de cytochalasin nélkül magasabbak voltak (p<0.001), mint amelyeket ugyanabban a hexóz koncentrációban, a forskolin hiányában kaptunk (ld. 6. ábra).
56
Insulin kibocsátás (mU/sziget/90 perc)
8.3 mM D-glukóz
16.7 mM D-glukóz
300
300
200
200
100
100
0
38
40
40
0
40
40
16.7 mM D-glukóz + 10 mM FSK
8.3 mM D-glukóz + 10 mM FSK 700
700
600
600
500
500
400
400
300
300
200
200
100
100
0
39
24
24
24
0
24
23
24
6. ábra. A cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek D-glukózzal kiváltott insulin szekréciójára (µU/90 perc/sziget). Az ábra bal oldalán a 8.3 mM Dglukózzal, a jobb oldalán a 16.7 mM D-glukózzal kiváltott insulin szekréció, felső részén a forskolin nélkül, az alsó részén a 10 µM forskolinnal (FSK) inkubált szigetek insulin szekréciós értékei láthatók. A bal oldali oszlop a kontroll, a középső oszlop a cytochalasin B, a jobb oldali oszlop a cytochalasin D jelenlétében végzett kísérletek eredményeit ábrázolja. Az értékeket átlag±SEM tüntettük fel, az egyedi kísérletek számát az oszlopok alsó része mutatja. A vízszintes szaggatott vonal jelzi a cytochalasin B jelenlétében kapott (100%-nak tekintett) átlagértékeket.
57
Hangsúlyoznunk kell, hogy ugyanazokban a kísérletekben a cytochalasin B a cytochalasin D-hez képest hatásosabb volt (p£0.05), a 8.3 ill. a 16.7 mM D-glukóz által kiváltott insulin szekréció fokozásában is. A D-glukóz által kiváltott insulin szekréció aránya cytochalasin D jelenlétében, 8.3 mM D-glukóz koncentrációnál 89.8±3.4%-a (n=24) ill. 16.7 mM D-glukóz esetében 85.7±1.9%-a (n=24) volt, az ugyanabban a kísérletben, cytochalasin B alkalmazásánál mért értékeknek (100.0±3.1% ill. 100.0±3.1%; n=24 mindkét esetben).
5.1.5.4 A cytochalasin B és D hatása a nem-glukóz tápanyagokkal kiváltott insulin szekrécióra Ezen kísérlet-sorozat utolsó részében, a cytochalasin B és D hatását vizsgáltuk a nemglukóz tápanyagok által kiváltott insulin szekrécióra. Amint a XVI. táblázat mutatja, mind a cytochalasin B (21 µM), mind a cytochalasin D (20 µM) fokozta (p<0.001) a 2ketoizokapronsavval (10 mM) ill. a L-leucin és L-glutamin együttes jelenlétével (10-10 mM) előidézett insulin szekréciót. A 2-ketoizokapronsavval kiváltott insulin szekréciót a cytochalasin D jelentősebben fokozta (p<0.005), mint a cytochalasin B. Az Lleucinnal és L-glutaminnal kiváltott insulin szekréciót azonban, a cytochalasin B és a cytochalasin D közel azonos mértékben fokozta (p>0.6). XVI. táblázat. A cytochalasin B és D hatása a nem-glukóz tápanyagokkal kiváltott insulin szekrécióra. Tápanyag (mM)
Cytochalasin -
B (21 µM)
D (20 µM)
-
8.7±1.2 (68)a
2-ketoizokapronsav (10)
75.5±5.7 (44)
140.9±7.6 (44)
188.8±12.2 (44)
L-leucin (10) és L-glutamin (10)
91.4±4.9 (24)
245.8±10.7 (24)
252.3±11.2 (24)
a
Az insulin szekréció értékei (mU/90 perc/sziget) átlag±SEM szerepelnek
58
5.2
A
GLUKÓZ METABOLIZMUS VIZSGÁLATA IZOLÁLT PANCREAS SZIGETEKBEN
ÉS TISZTÍTOTT PANCREAS SZIGETSEJTEKBEN
5.2.1 Izolált pancreas szigetek D-glukóz metabolizmusának vizsgálata 5.2.1.1 A glukóz transzport és megoszlási terek vizsgálata. Cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz felvételére A pancreas szigetek glukóz-szenzor funkciójának ellátásában jelentős szerepe van a pancreas B-sejtek plazma membránján keresztül történő gyors D-glukóz koncentráció ekvilibrációnak. Ennek vizsgálatára ad lehetőséget a pancreas szigetekbe bejutó, ott nem metabolizálódó D-glukóz analóg, a 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz felvételének követése és megoszlása, valamint ennek összevetése a 3HOH és [U-14C]szacharóz megoszlásával az izolált pancreas szigetek intracelluláris terében és az extracelluláris térben. Az izolált pancreas szigetek 15 perc, 37°C-on történő inkubációt követően a 3HOH megoszlási vízterében találhatók, mely értéke 5.44±0.18 nl/sziget (n=55). Az extracelluláris tér nagysága a 2.0 mM koncentrációjú [U-14C]szacharóz megoszlása alapján a víztér 20.5±2.1%-a, értéke 1.05±0.14 nl/sziget (n=14). A cytochalasin B ill. D jelenléte nem befolyásolta a víztér nagyságát (ld. XVII. táblázat). A víztér nagysága cytochalasin B jelenlétében 103.4±6.6% (n=14), cytochalasin D esetében 96.3±5.1% (n=13), míg cytochalasin alkalmazása nélkül a kontroll víztér 100.0±5.0% (n=28). A 8.3 mM 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz megoszlási terének és a 3HOH megoszlási terének aránya a [U-14C]szacharóz/3HOH megoszlási terének figyelembevételével, az intracelluláris víztér 71.7±2.8%-a (n=14). Ez az arány cytochalasin B jelenlétében 48.8±3.1%-ra (n=14) csökken, míg a cytochalasin D jelenlétében 75.9±3.4% (n=13). Az eredmények alapján a cytochalasin B jelentősen csökkentette a
14
C-jelzett D-glukóz
analóg, a 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz felvételét (p<0.001), míg a cytochalasin D ilyen fokú hatással nem rendelkezett (p>0.3).
59
XVII. táblázat. Megoszlási terek a pancreas szigetekben 15 perc inkubálást követően, 37ºC-on. (3-O-MDG: 3-O-metil-D-glukóz). 14
3
C-jelzett anyag
14
3-O-metil-D-[U-14C]glukóz
Cytochalasin B
-
-
21 mM
-
Cytochalasin D
-
-
-
20 mM
HOH tér (nl/sziget)
14
[U-14C]szacharóz
C-jelzett tér (nl/sziget) 3
C/ HOH aránya (%)
5.02±0.33 (14)
5.84±0.42 (14) 5.63±0.38 (14) 5.24±0.30 (13)
1.05±0.14 (14)
4.46±0.27 (14) 3.29±0.18 (14) 4.25±0.33 (13)
20.5±2.1 (14)
77.4±2.3 (14)
59.4±2.3 (14)
80.5±2.8 (13)
79.5±2.1 (14)
-
-
-
-
57.0±2.2 (14)
39.0±2.7 (14)
60.4±2.4 (13)
-
71.7±2.8 (14)
48.8±3.1 (14)
75.9±3.4 (13)
3
Intracelluláris HOH tér (a teljes 3HOH %-ban) Intracelluláris 3-O-MDG tér (a teljes 3HOH %-ban) Intracelluláris 3-O-MDG/3HOH aránya
Hasonló eredményre vezettek az inkubációs időt 5 percre lerövidítve végzett vizsgálatok is. A 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz intracelluláris megoszlási tere a 3HOH megoszlási teréhez viszonyítva cytochalasin B jelenlétében csökkent (p<0.001). A 3-Ometil-D-[U-14C]glukóz megoszlási tere 42.5±2.6%-ről (n=14), cytochalasin B jelenlétében 26.8±1.8%-ra (n=14) csökkent (p<0.001). Jóllehet a kapott értékek kisebbek (p<0.001) az 5 perces inkubációt követően, mint a 15 perces inkubálás esetében, a cytochalasin B által kiváltott gátló hatás azonban nem különbözött lényegesen 5 perc inkubálás után (37.0±7.5%; d.f.=26), ill. 15 perc inkubálást követően sem (32.0±5.8%; d.f.=26). 5 perces inkubálás után a 3-O-metil-D-[U-14C]glukóz megoszlási terét a cytochalasin D jelentősen nem befolyásolta. A megoszlási tér cytochalasin D jelenlétében 98.9±6.4% (n=14), míg a kontroll ugyanebben a kísérletben 100.0±4.9% (n=14).
60
5.2.1.2 A cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek D-glukóz metabolizmusára A D-glukóz metabolizmus az izolált pancreas szigetekben, valamint a tisztított B és non-B-sejtekben is, jól jellemezhető a D-[U-14C]glukóz oxidációjának követésével. A képződő
14
CO2,
14
C-jelzett savas anyagcsere metabolitok és
14
C-jelzett aminosavak
mérésével, valamint a D-[5-3H]glukóz felhasználást mérve, a
3
HOH képzés
vizsgálatával. Cytochalasin B (21 µM) gátolta a 8.3 mM D-glukóz jelenlétében inkubált pancreas szigetek glukóz metabolizmusát (p£0.005). A D-[5-3H]glukóz felhasználás 62.7±2.6%ra (n=23) csökkent a cytochalasin B-vel való inkubációt követően, míg a kontroll ugyanebben a kísérletben 100.0±4.6% (n=24). A D-[U-14C]glukóz oxidáció a cytochalasin B jelenlétében 83.9±3.2%-ra (n=23) csökkent, a kontroll értékéhez viszonyítva (100.0±3.5%; n=24). A D-[U-14C]glukóz oxidáció kisebb mértékben csökkent (p<0.001), mint a D-[5-3H]glukóz felhasználás, ez pedig a képződő 3
14
CO2 és
HOH arányát jelentősen növelte (p<0.001) (mindkét paramétert pmol D-glukóz
ekvivalensben fejeztük ki). A cytochalasin B (21 µM) 16.7 mM D-glukóz jelenlétében (XVIII. táblázat) a D-[53
H]glukóz
felhasználását
89.0±1.3%-ra
(n=24)
79.0±2.6%-ra
csökkentette.
A
(n=22),
a
cytochalasin
D-[U-14C]glukóz nélküli
kontroll
oxidációt értékek
ugyanezekben a kísérletekben: 100.0±2.4% (n=22), ill. 100.0±2.8% (n=24). A cytochalasin B jelenléte a D-[U-14C]glukóz oxidációt ismét kevésbé érintette (p<0.001), mint a D-[5-3H]glukóz felhasználását, így a
14
CO2/3HOH arányát ezért növelte
(p<0.05). A cytochalasin D (20 µM) jelenléte a három vizsgált paramétert (glukóz oxidáció, glukóz felhasználás,
14
CO2/3HOH arány) jelentősen nem befolyásolta, sem 8.3 mM D-
glukóz (p³0.6), sem 16.7 mM (p³0.3) D-glukóz jelenlétében (ld. XVIII. táblázat).
61
XVIII. táblázat. Cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek D-glukóz metabolizmusára. D-glukóz (mM)
Cytochalasin B (mM)
D-[U-14C]glukóz
D-[5-3H]glukóz
oxidáció
felhasználás
(pmol/sziget/90 perc)
(pmol/sziget/90 perc)
D (mM)
14
CO2/3HOHa (%)
8.3
-
-
34.8±1.3 (24)
112.1±5.8 (24)
31.6±1.0 (24)
8.3
21
-
29.2±1.1 (23)
69.9±2.5 (23)
42.1±1.2 (23)
8.3
-
20
35.6±1.0 (23)
111.4±5.1 (23)
32.1±1.0 (23)
16.7
-
-
88.4±2.5 (24)
233.0±9.1 (22)
39.7±2.0 (22)
16.7
21
-
78.7±2.1 (24)
182.4±9.3 (22)
46.3±2.1 (22)
16.7
-
20
89.7±2.3 (24)
247.1±13.2 (22)
39.1±2.4 (22)
a
14
3
D-[U- C]glukóz oxidáció és a D-[5- H]glukóz felhasználás aránya
Kísérleteinkben (XVIII. táblázat) a cytochalasin B és D nélkül végzett D-[U-14C]glukóz oxidáció és D-[5-3H]glukóz felhasználás aránya nagyobb volt 16.7 mM, mint 8.3 mM D-glukóz
jelenlétében
(p<0.001).
Ez
az
eredmény
korábbi
megfigyelések
tapasztalataival megegyezik [118]. Hangsúlyozzuk, hogy a cytochalasin B gátló hatása kifejezettebb 8.3 mM, mint 16.7 mM D-glukóz jelenlétében, és ez a különbség statisztikailag szignifikánsan (p<0.001) a D-[5-3H]glukóz nagyobb felhasználásában nyilvánul meg.
5.2.1.3 Az aminosav keverék hatása pancreas szigetekben a D-glukóz anyagcserére A (22 aminosav taurinnal kiegészített fiziológiás koncentrációjú elegyét tartalmazó) aminosav keverék szignifikánsan nem befolyásolta a 8.3 mM D-glukózzal inkubált pancreas szigetekben sem a D-[U-14C]glukóz oxidációt, sem a D-[5-3H]glukóz felhasználást, valamint ezek arányát a
14
CO2/3HOH arány alapján mérve (ld. XIX.
táblázat). XIX. táblázat. A D-glukóz (8.3 mM) metabolizmusa pancreas szigetekben. D-[U-14C]glukóz oxidáció
D-[5-3H]glukóz felhasználás
(pmol/sziget/90 perc)
(pmol/sziget/90 perc)
(%)
nélkül
25.9±1.5 (30)
83.3±6.1 (30)
32.9±1.6 (30)
hozzáadva
25.6±0.9 (30)
87.8±4.9 (30)
29.8±1.7 (30)
Aminosav keverék
62
14
CO2/3HOH
5.2.2 Tisztított pancreas szigetsejtek D-glukóz metabolizmusának vizsgálata 5.2.2.1 Cytochalasin B hatása a pancreas diszperz szigetsejt szuszpenzió D-glukóz metabolizmusára A kísérletek további részében a cytochalasin B hatását vizsgáltuk tisztított pancreas B és non-B-szigetsejtek D-glukóz metabolizmusára. Ezért a kísérletek kezdeti szakaszában először a nem tisztított, diszperz pancreas szigetsejt szuszpenzió glukóz metabolizmusát vizsgáltuk 120 perces 2.8 mM ill. 16.7 mM D-glukózzal való inkubációt követően. Az eredményeket a XX. táblázat mutatja. A glukóz koncentráció emelése közel ötszörösére fokozta (p£0.005) a D-[5-3H]glukóz felhasználást a 3HOH képzésére, és a D-[U14
C]glukóz oxidációt a
14
14
C-jelzett aminosavak megjelenéséig.
CO2 képzésig, valamint
14
C-jelzett savas metabolitok, illetve
XX. táblázat. A cytochalasin B hatása a pancreas diszperz szigetsejt szuszpenzió Dglukóz metabolizmusára. D-glukóz Cytochalasin B
2.8 mM
2.8 mM
16.7 mM
16.7 mM
-
21 mM
-
21 mM
7.70±0.61 (10)
4.08±0.32 (9)
35.60±1.81 (10)
28.16±1.66 (10)
2.58±0.16 (9)
1.99±0.06 (10)
14.07±1.01 (10)
12.54±0.36 (10)
5.90±1.18 (7)
4.04±0.65 (8)
27.87±5.90 (6)
23.52±2.81 (9)
1.42±0.08 (10)
1.36±0.07 (10)
6.67±0.56 (8)
6.17±1.23 (10)
Anyagcsere termékek (pmol/103 sejt/120 perc) 3
HOH
14
CO2 14
Savas [ C]-metabolitok 14
[ C]-aminosavak
A cytochalasin B (21 µM) csökkentette (p<0.001) a diszperz pancreas szigetsejt szuszpenzió D-[5-3H]glukóz felhasználását, a 3HOH értékek alapján mérve 2.8 mM és 16.7 mM D-glukóz inkubációt követően egyaránt (ld. XX. táblázat). Jelentősebb a csökkenés (p<0.001) az alacsonyabb (2.8 mM) D-glukóz koncentráció esetében (46.8±1.4%; n=9), mint a magasabb (16.7 mM) D-glukóz koncentrációnál (20.6±3.8%; n=10).
63
Hasonlóképpen, a cytochalasin B jobban gátolta (p<0.001) a 2.8 mM D-glukóz inkubáció utáni D-[U-14C]glukóz oxidációt (22.2±4.4%; n=10), mint a 16.7 mM Dglukóz inkubáció esetében (9.9±3.5%; n=10). Ugyanakkor megállapítható, hogy a cytochalasin B jelenléte kevésbé befolyásolta a D-[U-14C]glukóz oxidációt, mint a D-[53
H]glukóz felhasználást, mind 2.8 mM (p<0.001), mind 16.7 mM glukóz esetében
(p<0.06). A cytochalasin B jelenléte 73.1±4.2%-ra csökkentette (n=8; p<0.001) a 2.8 mM Dglukózzal inkubált, nem tisztított diszperz pancreas szigetsejt szuszpenzió
14
C-jelzett
savas metabolitjainak képződését, az ugyanebben a kísérletben mért kontrollhoz képest. Ugyanakkor 16.7 mM D-glukóz esetében, a cytochalasin B a
14
C-jelzett savas
metabolitok termelődését csak 12.3±10.1%-al csökkentette (n=9), mely különbség nem szignifikáns. A 14C-jelzett aminosav pool, amely elég gyors izotóp egyensúlyt ér el a szigetsejtekben [120], nem csökkent szignifikánsan cytochalasin B hatására, sem 2.8 mM, sem 16.7 mM D-glukóz jelenlétében (ld. XX. táblázat). Vagyis a
14
C-jelzett aminosav pool
nagyságát a cytochalasin B nem befolyásolta.
5.2.2.2 A D-[5-3H]glukóz metabolizmusa tisztított pancreas B-sejtekben és tisztított non-B-sejtekben A következőkben összehasonlítottuk a tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított nonB-szigetsejtek D-[5-3H]glukóz felhasználását. Tisztított pancreas B-szigetsejtek glukóz felhasználása (a D-[5-3H]glukóz átalakítása 3HOH-vá) 120 perces 2.8 mM D-glukóz inkubációnál 3.12±0.19 pmol/103 sejt (n=18) ill. 16.7 mM D-glukóz alkalmazásánál 27.14±1.94 pmol/103 sejt (n=20) (ld. XXI. táblázat). Tisztított non-B-szigetsejtek glukóz felhasználása 120 perces 2.8 mM D-glukóz inkubációnál 3.32±0.31 pmol/103 sejt (n=17), és 16.7 mM D-glukóz alkalmazásánál 12.47±1.05 pmol/103 sejt (n=12). A 16.7 mM D-glukóz/2.8 mM D-glukóz felhasználás-fokozódás aránya nagyobb (p<0.001) a tisztított pancreas B-szigetsejtek esetében (8.81±0.68; n=20), mint a tisztított pancreas non-B-szigetsejtek esetében (3.54±038; n=12).
64
XXI. táblázat. A cytochalasin B hatása a tisztított pancreas B-szigetsejtek és non-Bszigetsejtek D-glukóz metabolizmusára. D-glukóz (mM) Cytochalasin B (µM) D-[5-3H]glukóz felhasználás (pmol/103 sejt/120 min) B-sejt non-B-sejt D-[U-14C]glukóz oxidáció (pmol/103 sejt/120 min) B-sejt non-B-sejt D-[U-14C]glukóz átalakulás savas metabolitokká (pmol/103 sejt/120 min) B-sejt non-B-sejt D-[U-14C]glukóz átalakulás aminosavvá (pmol/103 sejt/120 min) B-sejt non-B-sejt
2.8 -
2.8 21
16.7 -
16.7 21
3.13±0.19 (18) 3.32±0.31 (17)
2.48±0.17 (19) 1.15±0.19 (11)
27.14±1.94 (20) 12.47±1.05 (12)
23.77±1.84 (19) 8.01±1.17 (13)
2.04±0.16 (18) 1.09±0.09 (16)
1.99±0.16 (18) 0.63±0.04 (13)
12.81±0.97 (20) 4.23±0.15 (16)
13.49±0.88 (20) 3.23±0.45 (20)
1.28±0.17 (13) 1.81±0.19 (14)
1.09±0.30 (12) 0.82±0.27 (13)
8.20±1.04 (15) 6.76±1.35 (11)
6.49±0.87 (15) 3.73±1.02 (15)
1.41±0.15 (15) 1.12±0.19 (13)
1.45±0.20 (15) 0.71±0.14 (14)
9.41±1.40 (15) 8.44±2.76 (12)
8.29±0.93 (15) 3.96±1.25 (15)
Tisztított B-sejtek D-[5-3H]glukóz felhasználását a cytochalasin B (21 µM) jelenléte alig befolyásolta. 2.8 mM D-glukóz koncentrációnál 84.5±7.31%, 16.7 mM koncentráció alkalmazásánál 89.6±4.5% (n=19 mindkét esetben), a cytochalasin nélküli kontroll értékekhez képest (100.0±6.3%; n=18 ill. 100.0±4.3%; n=20). A tisztított nonB-sejtek D-[5-3H]glukóz felhasználását viszont a cytochalasin B jelenléte 2.8 mM és 16.7 mM D-glukóz esetében is egyaránt szignifikánsan gátolta (p£0.025). A D-[53
H]glukóz felhasználását a cytochalasin B jelenléte a non-B-sejtekben 2.8 mM D-
glukóz alkalmazásánál 27.0±13.1%-kal (d.f.=20; p<0.05) nagyobb mértékben gátolta, mint a magasabb 16.7 mM D-glukóz koncentráció esetében. A gátlás mértéke 2.8 mM D-glukóz koncentrációnál 37.2±9.9% (n=11), 16.7 mM koncentráció alkalmazásánál pedig 66.1±11.9% (n=13). A kontroll D-[5-3H]glukóz felhasználás cytochalasin nélkül: 100.0±7.6% (n=11) ill. 100.0±6.9% (n=13).
65
5.2.2.3 Tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított non-B-szigetsejtek D-[U14
C]glukóz oxidációja
A D-[5-3H]glukóz felhasználásával ellentétben (ld. XXI. táblázat) a D-[U-14C]glukóz oxidációja a tisztított pancreas B-sejtekben fokozottabb (p<0.001) alacsonyabb (2.8 mM) D-glukóz koncentráció jelenlétében, mint a non-B-sejtekben. A 16.7 mM/2.8 mM D-glukóz oxidáció-fokozódás aránya a D-[U-14C]glukóz oxidációjakor nagyobb a Bsejtek esetében (p<0.001) (6.35±0.32; n=10), mint a non-B-sejtekben (3.80±0.25; n=16). A cytochalasin B (21 µM) nem befolyásolta a D-[U-14C]glukóz oxidációt a tisztított pancreas B-sejtekben, sem 2.8 mM, sem 16.7 mM D-glukóz koncentrációnál (ld. XXI. táblázat). A kapott értékek a megfelelő cytochalasin B nélküli kontrollokhoz viszonyítva (100.0±3.4%; n=18, ill.100.0±3.8%; n=20) 2.8 mM D-glukóznál 94.7±7.1% (n=18) ill. 16.7 mM D-glukóz esetében 105.4±3.9% (n=20) voltak. A tisztított pancreas non-B-szigetsejtekben azonban, a cytochalasin B szignifikánsan gátolta (p£0.02) a D[U-14C]glukóz oxidációt 2.8 mM és 16.7 mM D-glukóz alkalmazása esetében is. A gátló hatás az alacsonyabb D-glukóz koncentráció mellett kifejezettebben érvényesült (p<0.025), mint a magasabb koncentráció alkalmazásánál. A D-[U-14C]glukóz oxidáció a cytochalasin B alkalmazását követően 2.8 mM D-glukóz jelenlétében 49.1±2.6% (n=13), és 16.7 mM D-glukóz esetében 73.6±8.0% (n=20). Míg a cytochalasin B nélküli kontroll értékei: 100.0±5.0% (n=16) és 100.0±5.8% (n=16). Non-B-sejtekben, a D-[U-14C]glukóz oxidáció cytochalasin B hatására bekövetkező gátlása után megmaradt oxidációs értékek nagyságának aránya, a cytochalasin B nélkül mért kontrollokhoz képest, 2.8 mM és 16.7 mM D-glukóz koncentrációknál is nagyobb volt, mint a D-[5-3H]glukóz felhasználás hasonló arányai. Az átlagosan 119.6±8.0%-kal (n=33; p<0.025) magasabb érték azt jelzi, hogy non-B-sejtekben a cytochalasin B kevésbé érinti a D-[U-14C]glukóz oxidációt, mint a D-[5-3H]glukóz felhasználását.
66
5.2.2.4 D-[U-14C]glukóz átalakulás
14
C-jelzett aminosavvá és
14
C-jelzett savas
metabolitokká, tisztított B-szigetsejtekben és tisztított non-B-szigetsejtekben A D-[U-14C]glukóz átalakítása 14C-jelzett aminosavakká és 14C-jelzett savas anyagcsere termékekké hasonló eredményekkel szolgált, mint amelyeket a D-[5-3H]glukóz felhasználás és D-[U-14C]glukóz oxidáció vizsgálata során kaptunk. Ennek megfelelően, valamennyi esetben a D-glukóz koncentráció 2.8 mM-ról 16.7 mM-ra való emelése, szignifikánsan emelte a
14
C-jelzett radioaktív anyagcsere termékek képződését. A
tisztított pancreas B-sejtekben a cytochalasin B szignifikánsan nem befolyásolta jelentősen a 14C-jelzett savas anyagcsere termékek keletkezését. Tisztított pancreas nonB-sejtekben 2.8 mM vagy 16.7 mM D-glukóz jelenlétében azonban, a cytochalasin B egyaránt csökkentette (p£0.01) a
14
C-jelzett aminosavak és a
14
C-jelzett savas
anyagcsere termékek keletkezését is: 60.6±11.0%-ra (n=29) ill. 51.6±12.4%-ra (n=27). A megfelelő cytochalasin B nélküli kontroll értékek: 100.0±8.3% és 100.0±8.3% (n=25 mindkét esetben). Amint a 7. ábra mutatja, tisztított pancreas non-B-sejtekben a cytochalasin B átlagos gátló hatása a D-[U-14C]glukóz radioaktív 14C-savas anyagcsere termékekké való átalakítására ismét kifejezettebb volt, bár nem szignifikáns mértékben, az alacsonyabb (2.8 mM), mint a magasabb (16.7 mM) D-glukóz koncentráció esetében. Amikor a 3
14
C-savas anyagcsere termékek mérési eredményeit összevontuk a D-[5-
H]glukóz felhasználás és a D-[U-14C]glukóz oxidáció eredményeivel (ld. 7. ábra,
szaggatott vonalak) a tisztított pancreas B-szigetsejtek értékei, a cytochalasin B jelenlétében nem különböztek a megfelelő kontroll értékektől, sem 2.8 mM D-glukóz (p>0.10; d.f.=96), sem 16.7 mM D-glukóz esetében (p>0.10; d.f.=107). Tisztított pancreas non-B-szigetsejtekben azonban ugyanezek a számítások, eltérő értékeket szolgáltattak a D-glukóz katabolizmusról a cytochalasin B jelenlétében. 2.8 mM Dglukóznál 41.9±7.2%-ra (n=37), míg 16.7 mM D-glukóz esetében 68.5±6.6%-ra (n=47) történő katabolizmus csökkenést. Vagyis, a cytochalasin B relatíve nagyobb mértékben gátolja (p<0.01) a D-glukóz katabolizmusát a non-B-szigetsejtekben 2.8 mM D-glukóz jelenlétében, mint 16.7 mM D-glukóz esetében.
67
1.5
B-sejtek
1.0
0.5
0
1.5
non-B-sejtek
1.0
0.5
0 3
HOH
14
CO2
14
C-AM
7. ábra. A cytochalasin B 21 (µM) hatása a D-[5-3H]glukóz 3HOH-vá és a D-[U14
C]glukóz
14
CO2 és
14
C-jelzett savas anyagcsere termékekké (14C-AM) való
átalakulására tisztított pancreas B-szigetsejtekben (felül) és tisztított non-Bszigetsejtekben (alul), 2.8 mM (bal oldal) és 16.7 mM (jobb oldal) koncentrációjú D-glukózzal történő inkubáció után. Az értékek átlag±SEM formában szerepelnek, 12-20 egyedi mérés alapján. Az üres oszloprészek a cytochalasin B nélküli kontroll, a szürke oszloprészek a cytochalasin B jelenlétében kapott eredményeket mutatják ugyanabban a kísérletben. Az alsó szaggatott vízszintes vonal 2.8 mM D-glukóz, valamint a felső szaggatott vízszintes vonal 16.7 mM D-glukóz esetében jelzi a Dglukóz lebontást jellemző három anyagcsere változó (3HOH+14CO2+14C-AM) összesített arányát. 68
Alacsonyabb D-glukóz koncentrációnál a D-[U-14C]glukózból keletkező radioaktív savas metabolitok mennyisége nagyobb volt (p<0.05) a tisztított non-B-sejtekben, mint a tisztított B-sejtekben. Ez a különbség azonban fokozatosan eltűnt (p³0.4) (ld. XXI. táblázat), ha az inkubációs médium cytochalasin B-t tartalmazott (21 µM), vagy ha a Dglukóz koncentrációja 16.7 mM-ra emelkedett. A B és non-B-sejtek közötti különbség (p<0.06) pedig csak magas D-glukóz koncentrációnál és cytochalasin B jelenlétében állt újra vissza.
69
5.3
VIZSGÁLATOK DIABETES RETINOPATHIÁBAN
A klinikai vizsgálatok eredményeit a XXII. táblázatban és a 8. ábrán foglaltuk össze.
5.3.1 SSAO aktivitás értékek a retinopathia különböző stádiumaiban Valamennyi 2-es típusú diabeteses betegünk SSAO aktivitás értékei szignifikánsan magasabbak voltak, mint az egészséges kontroll csoportban kapott értékek (131.72±53.07 pmol/mg protein/óra; n=93 vs. 89.56±26.89 pmol/mg protein/óra; n=42, p<0.0001). A beteganyag és módszer fejezetben bemutatott ETDRS klasszifikáció szerint, a DR négy súlyossági stádiumába (0., 1., 2., 3. csoport) osztottuk be a cukorbetegeket. Az SSAO aktivitás értékei szignifikánsan magasabbak voltak a nagyrizikójú PDR csoportban (3. csoport) (166.96±70.56 pmol/mg protein/óra; n=16), mint a non-proliferatív diabeteses retinopathiás csoportban (1. csoport) (132.24±41.42 pmol/mg protein/óra; n=35, p<0.05) ill. a DR nélküli cukorbetegekben (0. csoport) (119.54±50.49 pmol/mg protein/óra; n=42, p<0.02). A korai PDR betegek (2. csoport) SSAO aktivitás értékei kissé alacsonyabbak voltak (129.54±47.15 pmol/mg protein/óra; n=19), mint a nagy-rizikójú PDR csoporté (3. csoport) (p=NS). A DR nélküli diabeteses betegek (0. csoport) SSAO aktivitás értékei szignifikánsan magasabbak voltak, a nemdiabeteses kontrollokhoz képest (119.54±50.49 pmol/mg protein/óra; n=42 vs. 89.56±26.89 pmol/mg protein/óra; n=42, p<0.02). Nem volt jelentős különbség a korai PDR csoport (2. csoport) és a DR nélküli diabeteses csoport között (0. csoport) ebben a vonatozásban. Variancia analízis szerint az SSAO aktivitás mind a négy diabeteses beteg-csoportban magasabb volt, mint az egészséges kontroll csoportban (0. csoport: p<0.02, 1. csoport: p<0.005, 2. csoport: p<0.02, 3. csoport: p<0.0001). Az SSAO aktivitás értékek hasonlóak voltak a 0., az 1. és a 2. csoportban (ld. 8. ábra).
5.3.2 Vizelet albumin ürítés A vizelet albumin ürítés szignifikánsan magasabb volt a nagy-rizikójú PDR csoportban (3. csoport), mint a DR nélküli diabeteses csoportban (0. csoport) és a kontroll csoportban (p<0.02, p<0.02). Azonban az SSAO aktivitás értékei mikroalbuminuriás diabeteses betegeinkben (30-300 mg/24 óra) vagy makroalbuminuria mellett (>300 mg/24 óra) nem tértek el szignifikánsan az ugyanazon csoportba tartozó mikroalbuminuriát nem mutató betegek értékeitől (ld. XXII. táblázat).
70
XXII. táblázat. A diabeteses beteg-csoportok és kontroll személyek laboratóriumi eredményei. Az adatokat átlagérték±SD formában tüntettük fel. Összes
0. csoport
1. csoport
2. csoport
3. csoport
Kontroll
2-es típusú diabeteses beteg Éhgyomri glukóz (mmol/l)
8.69±2.97
8.60±2.80
8.63±2.73
8.44±3.09
8.77±3.38
5.28±0.54
HbA1c (%)
6.69±1.41
6.55±1.28
6.54±1.22
6.86±1.61
6.95±1.75
5.03±0.70
ALT (U/l)
17.93±7.95
16.90±6.72
22.57±12.24
17.78±6.68
17.07±6.17
36.29±33.89
GGT (U/l)
32.86±27.68
33.61±38.09
32.09±23.73
33.68±19.23
32.87±12.43
38.67±28.00
szérum húgysav (mmol/l)
307.49±106.49
315.03±88.10
280.21±82.13
287.42±122.79
341.33±126.26
275.0±115.88
Szérum kreatinin (µmol/liter)
124.96±96.55
105.74±29.54
99.97±39.03
123.63±68.30
180.19±192.87
78.70±26.81
Vizelet albumin (mg/24 h)
149.69±245.21
84.12±197.22
107.93±145.97
183.80±246.38
285.96±344.55
72.03±78.62
SSAO aktivitás (pmol/mg protein/óra)
131.72±53.07
119.54±50.49
135.44±34.65
129.54±47.15
166.96±70.56
89.56±26.89
ALT: szérum alanin-aminotranszferáz, GGT: szérum gamma-glutamil transzpeptidáz
71
Szérum SSAO aktivitás (pmol/mg protein/óra)
250 200
Összes 2-es típusú DM 0. csoport 1. csoport 2. csoport 3. csoport Kontroll
150 100 50 0
+++
+
++
+
+++
Kontroll vs. beteg-csoportok + = p < 0.02 ++ = p < 0.005 +++ = p < 0.001
8. ábra. Szérum SSAO aktivitás értékek 2-es típusú cukorbetegekben és kontroll személyekben. Összes 2-es típusú diabetes beteg (SSAO aktivitás: 131.72±53.07 pmol/mg protein/óra); 0. csoport, retinopathia nélkül (SSAO aktivitás: 119.54±50.49 pmol/mg protein/óra); 1. csoport, NPDR (SSAO aktivitás: 135.44±34.65 pmol/mg protein/óra); 2. csoport, korai PDR (SSAO aktivitás: 129.54±47.15 pmol/mg protein/óra); 3. csoport, nagy-rizikójú PDR (SSAO aktivitás: 166.96±70.56 pmol/mg protein/óra); Kontroll, nem-diabeteses egészséges személyek (SSAO aktivitás: 89.56±26.89 pmol/mg protein/óra). (Az értékeket átlag±SD tüntettük fel.)
72
5.3.3 A diabetes időtartama A diabetes időtartama lényegesen nem különbözött a beteg-csoportok között. Az SSAO aktivitás egyedül a nagy-rizikójú PDR beteg-csoportban (3. csoport) korrelált a betegség időtartamával (R2=0.280, p<0.04). A diabetes kezdetekor betöltött életkor hasonló volt mind a négy beteg csoportban (ld. XI. táblázat).
5.3.4 A diabetes mellitust jellemző paraméterek Nem volt szignifikáns különbség a szisztolés és diasztolés vérnyomás értékek között a beteg-csoportokon belül. A HbA1c koncentrációk nem mutattak a retinopathia stádiumoknak megfelelő statisztikai különbséget. Az SSAO aktivitás nem korrelált az életkorral, a szérum kreatinin koncentrációval, az ALT és GGT szinttel, a húgysav értékkel, a HbA1c-vel, vagy a BMI-vel (ld. XI. és XXII. táblázat). Más szerzőkhöz hasonlóan nem találtunk eltérést az SSAO értékekben a férfi és női ill. az insulinnal vagy orális antidiabetikumokkal kezelt betegek között [13, 14].
73
6. MEGBESZÉLÉS 6.1
IN VITRO KÍSÉRLETEK EREDMÉNYEINEK ÉRTÉKELÉSE
6.1.1 Insulin szekréciós vizsgálatok izolált pancreas szigetekben Adataink azt mutatják, hogy a patkány plazmában posztprandiálisan kialakuló értéknek megfelelő koncentrációjú D-glukóz (8.3 mM), valamint a szintén fiziológiás koncentrációjú 20 aminosav, citrullin, ornitin és taurin elegye, együttesen kb. 50%-al emelik a táplálkozás után preparált pancreas szigetekben az insulin szekréciót. Az aminosav keverék alacsony (5.6-6.0 mM) D-glukóz koncentrációnál kevéssé befolyásolta az insulin szekréciót (kb. 25%-os fokozódást tapasztaltunk), a magasabb (11.0 ill. 16.7 mM) D-glukóz koncentráció hatására bekövetkező szekréciós választ kb. 35%-al fokozta. Az eredményeket in vivo körülményekre extrapolálva megállapíthatjuk, hogy a keringő aminosavak jelentős szerepet töltenek be az insulin szekréció normál szabályozásában. Az aminosav keverékkel végzett insulin szekréciós vizsgálatainkban nyert adataink alátámasztják az aminosavak kettős szerepét az insulin szekréció fiziológiás szabályozásában. Az aminosavak két különböző mechanizmussal is stimulálhatják ill. fokozhatják az insulin szekréciót. Számos aminosav (pl. L-leucin, L-glutamin, Laszparagin) az insulin termelő B-sejtek tápanyagaként fejti ki insulinotróp hatását [69, 76, 115]. A bázikus aminosavak azonban, mint pl. az L-arginin a B-sejtekben akkumulálódva depolarizálják a plazma membránt és így a feszültség-függő Ca2+ csatornák megnyílását eredményezik [12, 64]. Bizonyos aminosavak, pl. az L-lizin mindkét mechanizmusban részt vehetnek [116]. Az aminosav keverék vizsgálataink szerint nem befolyásolta a pancreas szigetek insulin tartalmát, annak ellenére, hogy az insulin szekréció jelentősen fokozódott a 90 perces inkubálás ideje alatt. Ez arra utal, hogy az aminosav keverék a D-glukózhoz hasonlóan fokozta a proinsulin bioszintézis sebességét, amely a B-sejt tápanyagokra adott jellegzetes, insulin szekréciót eredményező, funkcionális válasza. Az aminosavak tápanyag szerepét ehhez hasonlóan alátámasztja az a tény is, hogy az aminosav keverék hatására magasabb (16.7 mM) D-glukóz koncentráció esetében is, jelentős insulin szekréció fokozódás következett be, noha ismert, hogy ilyen magas D-glukóz koncentrációnál a bázikus aminosavak alig, vagy egyáltalán nem befolyásolják az insulin szekréciót [11]. 74
Az L-glutaminnal és az elágazó szénláncú aminosavakkal (L-izoleucin, L-leucin, L-valin) végzett kísérleti eredmények is összhangban vannak az aminosavak tápanyag szerepét bizonyító korábbi megfigyelésekkel [119]. Kísérleteinkben az L-glutamint és az elágazó szénláncú aminosavakat az aminosav keverékbeli (vagyis fiziológiásan a plazmában mérhető) koncentrációjukban alkalmazva azt kaptuk, hogy az L-glutamin kissé mérsékli, míg az elágazó szénláncú aminosavak hatásosan fokozzák a D-glukózra adott insulin szekréciós választ. Az L-alanin váratlan és látszólagosan negatív insulinotróp hatása a szigetek teljes aminosav keverékre adott insulin szekréciós válaszában kapcsolatban állhat az aminosav keverékben elfoglalt magas koncentrációjával (560 mM). Az L-alanin ugyanis piruváttá transzaminálódhat, elvonva így más aminosavak transzaminálásából az a-ketoglutársavat. Ezt a feltételezést megerősíti, hogy az exogén piruvát csekély insulin szekréciót fokozó hatással rendelkezik [117]. Ezen kívül az L-alanin az ATP-vel együtt allosztérikusan gátolja a piruvát kináz enzimet, vagyis a foszfoenolpiroszőlősav ® piroszőlősav átalakulást. Saját kísérleteinkhez hasonló módon a taurin más, korábbi vizsgálatban sem bizonyult insulinotróp anyagnak [114]. Vizsgálati eredményeink szerint, az aminosav keverék tápanyag-szerű insulin szekréciós hatása nem tulajdonítható az izolált szigetekben, sem fokozott D-glukóz felhasználásnak, sem jelentősebb D-glukóz oxidációnak. A bázikus aminosavak részvételét igazolja az aminosav keverékre adott szekréciós válaszban az, hogy az aminosav keverék annak ellenére fokozta az insulin kibocsátást 8.3 mM D-glukóz expozíció során, hogy nem növelte a
45
Ca felvételét ugyanezen D-glukóz
koncentráció mellett. Ezek az eredmények azt vetik fel, hogy a bázikus aminosavak jelenléte az aminosav keverékben valamely ismeretlen módon elfedte a tápanyag szerepet betöltő aminosavak
45
Ca nettó felvételt növelő hatását. Korábbi megfigyelések szerint a
bázikus aminosavak az izolált szigetek D-glukóz metabolizmusára inkább negatív módon hatnak [11]. A kísérletekben alkalmazott koncentrációban a bázikus aminosavak (Larginin, L-citrullin, L-lizin és L-ornitin) fokozták a 8.3 mM D-glukóz által kiváltott insulin kibocsátást, ez pedig alátámasztja részvételüket a teljes fiziológiás koncentrációjú aminosav keverékre adott szekréciós válasz létrejöttében.
75
Az aminosavakra adott insulin szekréciós válasz mechanizmusát glibenclamid, forskolin, teofillin és cytochalasin B alkalmazásán keresztül, 8.3 mM D-glukózzal, valamint aminosav keverékkel ill. anélkül történő inkubáció során tanulmányoztuk. A különböző insulinotróp anyagok alkalmazásával nyert eredményeink a Ca2+, a ciklikus AMP, és a mikrofilamentáris rendszer közreműködését igazolják az aminosavakra adott insulin szekréciós válaszban. A szulfonilurea-származék glibenclamid, valamint a forskolin jelenlétében kapott adataink alapján, az aminosavak egyaránt elősegíthetik a Ca2+ bejutását a szigetsejtekbe és az adenilátcikláz enzim aktiválását is (pl. a kalciumkalmodulin rendszeren keresztül) [136], mivel mind a forskolin, mind a glibenclamid szekréció fokozó hatása viszonylag kevésbé volt jelentős az aminosav keverékkel együtt, mint anélkül. A teofillin és a cytochalasin B azonban mind az önmagában, mind az aminosav keverékkel együtt alkalmazott D-glukóz esetében, hasonló mértékű insulin kibocsátást idézett elő. Kapott eredményeink összhangban állnak eddigi ismereteinkkel, mely szerint a foszfodieszteráz gátló teofillin és a penészgomba anyagcseretermék cytochalasin B, egyaránt a szekréciós válasz távolabbi helyén, a Ca2+ szigetsejtbe való belépése, valamint a cAMP generálása utáni fázisban fejtik ki hatásukat [126, 139]. A kísérletek során kapott szekréciós, iontranszport, és metabolikus eredményeink összhangban állnak azzal a feltételezéssel, hogy az aminosavak befolyása a pancreas szigetek insulin szekréciójára kettős. Fiziológiás állapotot modellezve igazoltuk, hogy a sejtekben egyes aminosavak tápanyagként hasznosulnak, míg más aminosavak pozitív töltésük következtében akkumulálódnak és ily módon befolyásolják a szigetek insulin szekréciós válaszát. Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy eredményeink új ismeretekkel szolgáltak a pancreas B-sejtek fiziológiás körülmények között történő insulin szekréciójáról, az aminosavak insulin szekréció szabályozásában betöltött szerepéről és hatásának módjáról.
76
6.1.2 A cytochalasin B és D hatása az insulin szekrécióra Ismert, hogy a cytochalasin B egyaránt fokozza a tápanyag (pl. D-glukóz) és nemtápanyag szekréciót serkentő szerek által kiváltott insulin elválasztást, annak ellenére, hogy a D-glukóz felvételét és metabolizmusát gátolja a pancreas szigetekben [68, 102, 139]. Kísérleteinkben a cytochalasin B és a cytochalasin D, 21 ill. 20 mM koncentrációkban alkalmazva gyakorlatilag azonos kiindulási lehetőséget teremtettek a D-glukóz indukált insulin szekréciót befolyásoló hatásuk összehasonlítására, mivel ekkor fokozták egyformán a D-glukóz által kiváltott insulin szekréció mértékét. A kiváltott insulin szekréció tekintetében azonban, ezekben a koncentrációkban a cytochalasin B mégis hatékonyabban fokozta a D-glukóz indukált insulin szekréciót, mint a cytochalasin D. Vagyis, a cytochalasin D, mely a D-glukóz felvételét és metabolizmusát nem befolyásolta izolált szigetekben, szintén fokozta a D-glukóz által kiváltott insulin kibocsátást, de a vártnál kisebb mértékben, mint a cytochalasin B. Ez a különbség nem feltétlenül jelenti azt, hogy a cytochalasin B kifejezettebben venne részt a B-szigetsejtek szekréciós granulumainak exocitózisához vezető mechanikai események befolyásolásában. Hiszen amikor a nem-glukóz tápanyagokkal (2ketoizokapronsavval, vagy L-leucin és L-glutamin együttes jelenlétével) kiváltott insulin szekréció fokozódását vizsgáltuk, akkor a cytochalasin D ugyanolyan hatásos, sőt még hatásosabb is volt, mint a cytochalasin B a szekréciós válasz potencírozásában. A cytochalasin B, cytochalasin D-hez viszonyított nagyobb hatékonyságának - a glukóz indukált insulin szekréció fokozásában - másik magyarázata lehetne az is, hogy a cytochalasin B, a non-B-sejtekben gátolja a D-glukóz metabolizmust, következésképpen a pancreas A-sejteket felszabadítja a D-glukóz glukagon szekréciót gátló hatása alól. Ez pedig azt jelentheti, hogy a B-sejtek insulin szekrécióját potenciálhatja a szomszédos Asejtekből felszabaduló glukagon. Ennek a hipotézisnek a bizonyítása azonban még további kutatásokat igényel. Egyrészt azért, mert a témában született tanulmányok számos eredménye ellenére [60, 58, 57], még mindig nem rendelkezünk elegendő ismeretanyaggal a pancreas szigetekben zajló parakrin folyamatok működéséről. 77
Másrészt pedig, amikor izolált szigetekben az adenilátcikláz enzim teljes aktivitását idéztük elő a megfelelő dózisban alkalmazott a forskolinnal, a cytochalasin B ekkor is hatásosabb maradt a cytochalasin D-nél a glukóz stimulált insulin szekréció fokozásában. Így tehát, bár kísérleti adataink azt mutatják, hogy a tisztított non-B-szigetsejtek érzékenyebbek cytochalasin B hatására, mint a tisztított B-szigetsejtek, - legalábbis a Dglukóz katabolizmus gátlásának tekintetében - hasonló különbség, és ennek lehetséges következménye a non-B-sejtekből történő glukagon ill. más, nem-insulin-szerű hormon szekrécióját illetően, nem tűnik elegendő mértékben meggyőzőnek ahhoz, hogy a cytochalasin B, cytochalasin D-hez viszonyított, glukóz stimulált insulin szekréciót jobban fokozó hatásáért felelős legyen.
6.1.3 A glukóz metabolizmus vizsgálata izolált pancreas szigetekben és tisztított pancreas szigetsejtekben Az eredmények alapján levonható következtetések: 1. Alacsonyabb koncentrációjú (2.8 mM) D-glukóz jelenlétében, a nem oxidatív glikolízissel történő glukóz bontás jelentősebb a non-B-sejtekben, mint a B-sejtekben. 2. A glukóz koncentráció emelése 2.8 mM és 16.7 mM D-glukóz szint között, relatíve hatásosabban fokozta a glikolízist a B-sejtekben, mint a non-B-sejtekben. 3. A cytochalasin B D-glukóz katabolizmust gátló hatására érzékenyebbek a non-Bsejtek, mint a B-sejtek. A cytochalasin B nagyobb mértékben gátolja a D-glukóz metabolizmusát a non-Bsejtekben, mint a B-sejtekben. A pancreas non-B-szigetsejteiben a cytochalasin B Dglukóz katabolizmust gátló hatása 2.8 mM D-glukóz jelenlétében még kifejezettebb volt, mint magasabb (16.7 mM) D-glukóz koncentráció esetén. Tudjuk, hogy fiziológiás körülmények között, normál vércukor szint mellett, a D-glukóz transzport a glukóz metabolizmusát szabályozó szerepet tölt be a pancreas non-Bsejtjeiben, az insulin termelő B-sejtekben azonban nem. A cytochalasin B non-B-sejtek D-glukóz metabolizmusát gátló hatása magyarázatul szolgál arra, hogy a cytochalasin B miért gátolja relatíve nagyobb mértékben az izolált szigetek D-glukóz katabolizmusát alacsonyabb, mint magasabb D-glukóz koncentráció esetében [118].
78
A jelen adatok is megerősítették, hogy a pancreas egészét tekintve, a non-B-sejtek részvétele a D-glukóz katabolizmusában intenzívebb 2.8 mM glukóz koncentrációnál, mint 16.7 mM D-glukóz jelenlétében [97]. Továbbá kimutattuk, hogy a cytochalasin B a pancreas non-B-sejtjeiben relatíve nagyobb mértékben gátolja a D-glukóz lebontását alacsonyabb D-glukóz koncentráció esetében, mint magasabb D-glukóz koncentráció alkalmazásánál. Összefoglalva tehát megállapíthatjuk, hogy a cytochalasin B egy jelenleg még nem ismert mechanizmus útján képes a cytochalasin D-hez viszonyítva, hatékonyabban fokozni a Dglukóz stimulált insulin szekréciót. Ezért jelen eredményeink alapján feltételezhető, hogy a cytochalasin B, valamely módon kölcsönhatásba tud kerülni a B-sejt glukóz-szenzor funkciójával.
79
6.2
KLINIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK MEGBESZÉLÉSE
Eredményeink megerősítik azt a tényt, hogy a szérum szemikarbazid szenzitív aminoxidáz enzim (SSAO) fiziológiás aktivitása fokozottabb 2-es típusú cukorbetegekben [14, 35, 39, 98]. 2-es típusú diabeteses betegeink (n=93) összesített SSAO értékeit tekintve, a szérum SSAO aktivitás átlagosan 47%-kal haladta meg az egészséges kontroll személyek (n=42) aktivitás értékeit (p<0.0001). Kimutattuk, hogy a szérum SSAO aktivitás szignifikánsan magasabb a proliferatív diabeteses retinopathia előrehaladottabb, nagy-rizikójú stádiumában (n=16), mint 2-es típusú diabeteses, DR nélküli betegekben (n=42) (p<0.02). A retinopathia stádiumának megfelelő négy beteg-csoport eredményeit elemezve azonban nem tudtunk direkt összefüggést igazolni a retinopathia súlyossága és a szérum SSAO aktivitás között. A nagy-rizikójú proliferatív retinopathiás betegekben szignifikáns korrelációt találtunk (R2=0.280, p<0.04) a diabetes időtartama és az SSAO aktivitása között. Vizsgálatunk alátámasztja a feltételezést, mely szerint az SSAO enzim valószínűleg szerepet játszhat a cukorbetegséget kísérő késői mikrovaszkuláris szövődmények, így a retinopathia kialakulásában. Az SSAO aktivitás és DR kapcsolatának tisztázására eddig mindössze néhány, kis esetszámú tanulmány készült. Boomsma és mtsai 1-es típusú diabetesben mutatták ki, hogy azon betegekben (n=104), akikben retinopathia vagy nephropathia, ill. mindkettő diagnosztizálható, a plazma SSAO aktivitás magasabb a szövődmény-mentes esetekhez képest és pozitívan korrelál a plazma glikált hemoglobinnal. A retinopathiás betegek csoportjain belül azonban a tanulmány nem tett további különbséget a non-proliferatív és proliferatív retinopathia stádiumok szerint [13]. Garpenstrand és mtsai 2-es típusú cukorbetegekben (n=65) szintén emelkedett SSAO aktivitást mutattak ki. Non-proliferatív stádiumú retinopathiás betegeikben (n=26) magasabb enzim koncentrációt találtak, a retinopathia nélküli esetekhez viszonyítva (n=39) (p=0.012). Az SSAO aktivitás és a HbA1c koncentráció között gyenge korrelációt mutattak ki (p=0.0498). Az SSAO szint és a diabetes időtartama, ill. a BMI között nem találtak összefüggést [35]. A betegek (n=34) 2.8 éves követése során az SSAO aktivitás szintje mind az első vizsgálatkor, mind a követési idő végén, egyaránt és azonos mértékben volt magasabb a retinopathiában szenvedőkben (n=13), mint a DR nélküli esetekben (n=21). Az eltelt idő alatt a retinopathia egyik betegben sem súlyosbodott a proliferatív stádiumig [39].
80
Az SSAO enzim pontos élettani szerepe még nem ismert minden részletében. A jelenleg is intenzíven folyó kutatások a multifunkcionális protein egyre több fiziológiás hatására derítenek fényt a szervezetben. Aminoxidáz enzimként, részt vesz a keringő biogén aminok (pl. metilamin, aminoaceton, hisztamin, kreatin, adrenalin, szarkozin) lebontásában és védelmet nyújt a különböző exogén monoamin vegyületek káros hatása ellen
(scavenger
funkció)
[146].
Simaizomsejtek
[27]
és
zsírsejtek
[33]
differenciálódásában, valamint a kötőszöveti mátrix kialakulásában és szerkezetének fenntartásában, különösen az elasztin szintézisében tölthet be az SSAO enzim szabályozó szerepet [56]. Ezen kívül részt vesz a sejtek intermedier anyagcseréjének szabályozásában is. A zsírsejtek insulin hatásától független glukózfelvételét a GLUT4 transzporter sejtfelszíni transzlokációjával segíti elő, mivel ugyanazon intracelluláris vezikulumban helyezkedik el az SSAO enzim és a GLUT4 transzporter [29]. Az SSAO enzimcsaládba tartozó humán retina specifikus aminoxidáz enzim (RAO) expressziója a retina ganglion sejtjeiben kifejezett. Az enzim génszekvenciája 59%-ban egyezik meg a szarvasmarha szérum SSAO-t kódoló génszakasszal [44]. Szöveti szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim aktivitást emlős állatokban a szemgolyó különböző részeiben is kimutattak. SSAO aktivitás mérhető volt szarvasmarha retinában, chorioideában, irisben és N. opticusban, azonban nem volt kimutatható a lencsében [32]. A patkány aortában talált mennyiséghez képest, viszonylag alacsonyabb, de nem elhanyagolható mértékű SSAO enzim aktivitás mutatható ki patkány sclerában és retinában [24, 153]. Az SSAO pathofiziológiai folyamatokban játszott szerepe sem tisztázott még minden vonatkozásában. Az érszövődmények kialakulásáért elsősorban az angiotoxikus enzimatikus reakciótermékek, valamint sejtadhéziós tulajdonsága tehetők felelőssé. A diabeteses retinopathia szerteágazó, sok szálon futó folyamatrendszerét az SSAO enzim több ponton is érintheti, melyet a 9. ábrán mutatunk be.
81
Diabeteses retinopathia sejtproliferáció, neovaszkularizáció
kapilláris permeabilitás ñ
vazoaktív anyagok
thrombotikus aktivitás pl. vW ñ
leukosztázis,
pl. endothelin ñ, angiotenzin II
thrombocita aktiváció
kapilláris keringés ò
növekedési faktorok pl. HGF, TGFb, VEGF ñ
2. sejtadhéziós molekula:
citokinek pl. TNFa ñ
leukocita aktiváció
leukocita-endothel adhézió ñ
sejtadhéziós molekulák Szolubilis és/vagy
pl. SSAO/VAP-1 expressziója
szöveti SSAO/VAP-1 primer amin: metilamin/aminoaceton
1. enzimatikus aktivitás: oxidatív deamináció aldehid: H2O2
+
formaldehid/metilglioxál
+
NH3
AGE képződés
3. enzim-Cu++ komplex:
hiperglikémia
oxidáció
LDL oxidáció
reaktív szabadgyök képződés: oxidatív stressz
Diabeteses retinopathia
9. ábra. A diabeteses retinopathia pathogenezise. A szérum SSAO enzim lehetséges közvetlen kapcsolódási pontjait a folyamathoz vastagon szedve jeleztük. 82
1. A diabeteses szervezetben a (valamely eddig még nem ismert ok miatt) felerősödött SSAO aktivitás angiotoxikus végtermékeket generál (hidrogén-peroxid, formaldehid, metilglioxál), melyek a retina kapillárisok endothel károsodását okozzák [153]. A formaldehid és a metilglioxál is elősegíti a fehérjék nem-enzimatikus glikációja során képződő késői glikációs végtermékek (AGE termékek) kialakulását [142]. Ennek következtében a kapilláris permeabilitás fokozódása, valamint a bazálmembrán vastagodása alakul ki [18]. A keletkező szabadgyökök oxidatív stresszhez vezetnek: DNS károsodás, fehérje struktúra és funkció változás, lipidperoxidáció indukálásán keresztül. 2. Az enzim VAP-1 tulajdonságának eredményeként létrejövő fokozott leukocitaendothel tapadékonyság a sejtek kapcsolódását követő sejtaktivációhoz, gyulladásos mediátorok, vazoaktív anyagok, növekedési faktorok, citokinek felszabadulásához vezet [113, 124]. A VAP-1/SSAO molekula fokozott endotheliális expresszióját pozitív visszacsatolás során előidézhetik citokinek (IL-1, IL-4, TNFa, IFNg), AGE termékek és az oxidált LDL is [124]. A sejtadhéziós molekulák pl. VAP-1, ICAM-1 (intercelluláris
sejtadhéziós
molekula-1),
VCAM-1
(vaszkuláris
sejtadhéziós
molekula-1) elősegítik a keringő leukociták lehorgonyzását a kapillárisokban, az endothel sérülés helyén. A leukociták nagy tömege átmeneti, majd később krónikus leukosztázishoz vezet [113]. A kapilláris keringés romlása lokális non-perfúziót és következményes hipoxiát okoz. A folyamat végeredménye a periciták és endothelsejtek pusztulása. A hipoxia okozta fokozott vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF) expresszió érújdonképződéshez vezet, mely során azonban kevésbé funkcióképes erek keletkeznek [1]. Az önmagát erősítő folyamat eredményeképpen további fokozott sejtaktiváció, gyulladásos mediátor felszabadulás és sejtproliferáció jön létre. 3. Az SSAO enzim ko-faktora, a rézion elősegíti endothelsejtekben az LDL molekula oxidációját [30].
83
Az emelkedett szérum SSAO aktivitás eredete még nem ismert pontosan. Valószínűleg a szövetekben található SSAO enzim, a sejt károsodása után kiszabadul plazmamembránból és a vérkeringésbe jut [13]. Ugyanígy feltételezhető, hogy a fokozott szubsztrát kínálat (pl. diabetesben a magasabb metilamin szint) enzim indukciót okozhat [148]. Még további bizonyítást kíván, hogy a szérumban jelen levő esetleges endogén SSAO inhibitor mennyiségének csökkenése vezetne az SSAO fokozott aktivitásához [100]. Klinikai vizsgálati eredményeinket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a szérum SSAO szintje emelkedett 2-es típusú diabeteses betegekben, különösen nagy-rizikójú proliferatív stádiumú diabeteses retinopathiában. Adataink alátámasztják azt a feltételezést, hogy az emelkedett szérum SSAO enzim aktivitás felelős lehet a cukorbetegségben kialakuló endothel károsodásért és szemfenéki elváltozásokért. A kisér-károsodást okozó folyamat egyik valószínű mechanizmusa a keringésben található endogén monoaminok (pl. metilamin, aminoaceton) enzimatikus konverziója toxikus aldehidekké és hidrogénperoxiddá. Másrészt a molekula VAP-1 funkciója a fokozott endothel-leukocita adhézión keresztül leukosztázist és leukocita aktivációt okozhat, a kapilláris keringés romlását és hipoxiát eredményezve. Az SSAO szérum szintje és a nagy-rizikójú PDR között, 2-es típusú cukorbetegségben tapasztalt összefüggés jelentőségének tisztázására még további, nagyobb számú diabeteses beteganyagon végzett prospektív vizsgálatok szükségesek.
84
7. KÖVETKEZTETÉSEK A cukorbetegség és szövődményeinek gyógyítása és megelőzése felé a fiziológiás szabályozó rendszerek és a kóros állapotok kialakulásához vezető folyamatok minél alaposabb megismerése vihet közelebb. A gyógyítás lehetséges támadáspontjai így érinthetik a szigetsejtek fiziológiás szabályozó köreinek helyreállítását, ill. a hibás lépések áthidalását, elsősorban a B-sejtek diszfunkciójának gyógyításával. Langerhans-szigetek transzplantációjával, kapszulába helyezett szigetek májvénába juttatásával is ígéretes eredmények születtek már [31, 111].
7.1
AZ
INSULIN
SZEKRÉCIÓ
ZAVARAINAK
FARMAKOLÓGIAI
ÉS
TERÁPIÁS
VONATKOZÁSAI
Akár elsődleges a glukóz anyagcsere zavar szerepe az insulin szekréció károsodásában, akár csak hozzájárul az insulin szekréció károsodásához 2-es típusú cukorbetegségben, a kérdés az, hogyan lehet a kialakult B-sejt diszfunkciót gyógyszeresen kezelni [87]. Az insulin szekréció fokozására, számos támadásponton beavatkozni képes insulinotróp vegyület-csoportok állnak rendelkezésünkre (XXIII. táblázat). XXIII. táblázat. Potenciálisan insulinotróp vegyületek a 2-es típusú diabetes mellitus kezelésében [88]. 1. Az ATP-függő K+ csatorna direkt gátlói ·
Szulfonilurea-származékok
·
Meglitinid analógok
2. Adenozin analóg vegyületek (ATP-analóg prekurzorok) ·
AICA ribozid
·
Formicin A
3. A B-sejtek cAMP szintjét fokozók ·
Adenilátcikláz enzim serkentő peptidek (pl. GLP-1)
·
Foszfodieszteráz gátlók
4. Nem-glukóz tápanyagok ·
Aminosavak
·
Dikarbonsavak metil-észterei pl. glutaminsav, borostyánkősav, piroszőlősav
·
Kombinált molekulák: észterekből és szulfonilurea-származékokból vagy meglitinid analógokból 85
A mindennapi gyakorlatban gyakran használt insulinotróp vegyület a szulfonilureaszármazékok csoportja. A B-sejtek membránjában specifikus receptorokhoz kötődnek, és az ATP-függő K+ csatornák direkt zárása által eredményeznek insulin szekréciót és vércukorcsökkenést. In vitro kísérletekben a szulfonilurea-származékok ATP-áz enzim gátló hatást is mutatnak, így ez a mechanizmus szintén hozzá járulhat szekréció fokozó hatásukhoz [127]. Számos szulfonilurea-származék érhető el Magyarországon is (pl. glibenclamid (Gilemalâ, Glucobeneâ), glimepirid (Amarylâ)). Lényegében érzékennyé teszik a B-sejteket a glukóz és nem-glukóz anyagok insulinotróp hatása iránt. Hasonló hatásmechanizmusú, a jelenleg bevezetés alatt álló vegyület család, a meglitinid analógok csoportja (pl. repaglinid (NovoNormâ), nateglinid (Starlixâ), mitiglinid), melyek szintén az ATP-függő K+ csatornák direkt zárását idézik elő [89]. Gyors, erőteljes, de rövid ideig tartó insulin szekréciófokozódást okoznak, ezért kombinációban való alkalmazásuk előnyös. A gyors korai insulin kiáramlás elvesztését fordítják vissza, csökkentve ezzel a posztprandiális hiperglikémiát. Ezért a tulajdonságukért prandiális glukóz regulátornak is nevezik a vegyület csoportot. Kísérleti körülmények között, a B-sejtekben foszforilálódó adenozin analógokkal (AICA riboziddal (5-aminoimidazol-4-karboxamid-1-béta-D-ribofuranozid) [2, 65, 66], illetve a formicin A-val [77]) imitálható a magas endogén ATP szint, mely így zárhatja a K+ csatornát. Más támadáspontú a glukagon-szerű peptid-1 (GLP-1), mely a B-sejtek tápanyagokkal stimulált insulin szekrécióját, a B-sejtek cAMP szintjének emelésével fokozza [59]. In vitro körülmények között hasonló hatás érhető el az adenilátcikláz enzimet aktiváló, a cAMP szintet fokozó forskolinnal [66], illetve a foszfodieszteráz enzimet gátló teofillinnel [126], mely a cAMP elbontását gátolja. Az adenilátcikláz enzimet aktiváló forskolin és protein kináz C-t aktiváló TPA (12-O-tetradekanoil forbol-13-acetát) a citoszolban lévő szabad Ca2+ közvetítése nélkül fokozzák az insulin szekréciót [133].
86
Miután 2-es típusú DM-ban a D-glukóz-indukált insulin szekréció szenved elsődleges zavart, felmerül a gondolat, hogy nem-glukóz insulinotróp szerekkel áthidalható az insulin szekréció fokozásában kialakult működés-zavar. Az insulin szekréciót fokozó, nem-glukóz tápanyagok, így számos savas metabolit (pl. szukcinát, glutamát, piruvát) kikerüli a B-sejtek D-glukóz metabolizmusának zavarát, ugyanakkor megőrzi a B-sejtek bioszintetikus és szekréciós potenciálját [92]. A vegyületek metil-észtere könnyen bejut a sejtbe, nem igényel speciális transzportert. A sejt belsejében megtörténik a deeszterifikálás és az alapvegyület készen áll a további hasznosításra. Így pl. a szukcinát azonnal hasznosul a citrát körben és a mitokondriális légzési lánc számára [82]. Az ilyen észter-vegyületek sikeresen kombinálhatók szulfonilurea-származékokkal [71], meglitinid analógokkal [8] vagy a GLP-1-el is [59]. Az aminosavakkal végzett kísérleteink is kiindulópontjai lehetnek későbbi farmakológiai kutatásoknak. Az insulin szekréciót fokozó szereknek a perifériás szövetek insulin rezisztenciájának csökkentésére alkalmas vegyületekkel (pl. tiazolidindionok) való kombinációja előnyös lehet a kimerülőben levő B-sejtek insulin szekréciós potenciáljának fokozása szempontjából [45].
7.2
A
DIABETES
MIKROVASZKULÁRIS
SZÖVŐDMÉNYEINEK
TERÁPIÁS
LEHETŐSÉGEI
Nemcsak magának a diabetesnek, de késői szövődményeinek is legbiztosabb megelőzési lehetősége a fiziológiás állapotok helyreállítása ill. minél jobb megközelítése. Életmódbeli változások, megfelelő diéta és fizikai aktivitás alkotják a cukorbetegség kezelésének alappilléreit. A különböző támadáspontú gyógyszeres terápiás lehetőségek ezt kiegészíthetik, a fiziológiás folyamatok megtartását elősegíthetik. A szoros anyagcsere kontroll mindkét diabetes típusban bizonyítottan csökkenti a diabeteses mikrovaszkuláris szövődmények előfordulását [134, 135]. A szisztolés és diasztolés vérnyomás, a szérum lipidek szintjének hosszú távú normalizálása a makrovaszkuláris szövődmények kockázatát, a kardiovaszkuláris mortalitást is csökkenti [25]. A hemoreológiai paraméterek egyensúlyban tartása (anémia rendezése, fokozott trombózis hajlam kivédése) is kiemelt fontosságot kell kapjon a DM komplex szemléletében [140].
87
A több irányban zajló farmakológiai kutatások közül egyes vegyületek pl. Aspirin, Cadobezilát (Doxiumâ) hemoreológiai előnyös hatásai már bizonyítást nyertek, noha nem alkalmazzák azokat a betegek széles körében [132]. Más szerek hatása humán vizsgálatokban nem bizonyult meggyőzőnek, pl. az aldóz reduktáz enzimet gátló Sorbinil nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket [128]. A növekedési faktorok érújdonképződés generálását kivédő vegyületek kipróbálása, jelenleg kísérleti stádiumban van [38]. A diabeteses mikrovaszkuláris szövődmények, így a retinopathiának pathogenezisében kialakuló kóros körök megszakítása több ponton szükséges egyidejűleg. A figyelem középpontjában ezért jelenleg olyan vegyületek állnak, melyek több támadásponttal is rendelkeznek
a
retinopathia
kórfolyamatában.
A
nukleofil
hidrazin-származék
aminoguanidin ilyen több támadáspontú molekula. A toxikus aldehidekkel reakcióba lépve, hatásosan akadályozza meg a nem-enzimatikus glikáció végtermékeinek (AGE termékek) kialakulását [142]. Ezen kívül, az aminoguanidin in vivo és in vitro egyaránt irreverzibilisen gátolja az SSAO aktivitást [148], és a NO szintézist [129]. Diabeteses kísérleti állatokban az aminoguanidin kivédte a kísérletes retinopathia [40, 46], és nephropathia [130] kialakulását. Szelektív SSAO enzim inhibitorok fejlesztése, gyógyszerként való alkalmazása ezért ígéretes perspektívát jelenthet az enzim okozta sejtkárosító hatások kivédésében [47, 149]. Feltételezve, hogy az általunk is igazolt, fokozott SSAO aktivitás kóroki tényező a diabeteses retinopathia létrejöttében, hatékony és specifikus enzim inhibitorok kifejlesztése lehetővé tenné a szövetek és sejtek védelmét a toxikus hatások okozta sérüléstől. Az enzim aktivitás szelektív farmakológiai befolyásolása egyszerre több támadásponton ható, új koncepciójú terápiás eszközt jelenthet a mikrovaszkuláris diabeteses szövődmények prevenciója, a lefolyás késleltetése, valamint kezelése érdekében.
88
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönöm Prof. Dr. Romics László akadémikusnak, témavezetőmnek, hogy mind a klinikai, mind a kísérletes munkámban útmutatást nyújtott és támogatott. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Karádi Istvánnak, hogy munkámat a kezdetektől fogva tanácsaival és odafigyelésével segítette. Köszönöm Prof. Dr. Mandl Józsefnek, a Molekuláris Orvostudományok (Multidiszciplináris Orvostudományok) Doktori Iskola programvezetőjének, hogy a doktori iskola kurzusait elvégezve az experimentális és elméleti alapokat elsajátíthattam. Hálás vagyok Prof. Dr. Salacz Györgynek és Dr. Bögi Júlia adjunktus asszonynak, hogy a szemészet klinikumára és szeretetére megtanítottak, az értekezés megírásban lelkesítően támogattak. Köszönöm a II. sz. Szemklinikán valamennyi munkatársamnak és betegemnek az együttműködést. A szérum szemikarbazid aminoxidáz enzimmel kapcsolatos vizsgálatokkal kapcsolatosan köszönetemet fejezem ki Prof. Dr. Magyar Kálmán akadémikusnak és Dr. Mészáros Zsuzsának közreműködésükért és hasznos tanácsaikért, valamint Oszvald Editnek, Kertész Juditnak és Lévai Ferencnek a vizsgálatok lebonyolításában nyújtott technikai segítségükért. Az értekezés elkészülését az Európai Unió 2000/2001. évi SOCRATES/ERASMUS Ph.D. pre-doktori ösztöndíja segítette, mely koordinálásában Dr. Hrabák András egyetemi docens és Prof. Dr. Bernard Vray nyújtottak segítséget. Ezúton nyílt lehetőség az experimentális diabetológiai kutatások végzésére a Brüsszeli Szabad Egyetem Kísérletes Orvostudományi Intézetében (Université Libre de Bruxelles, Laboratoire de Médecine Expérimentale). Hálásan köszönöm Prof. Dr. Willy J. Malaisse akadémikusnak, intézetvezető igazgatónak az értekezés elkészítésében nyújtott önzetlen támogatását és javaslatait. Prof. Dr. Abdullah Sener közvetlen irányítása alatt ember-központú kutatói szemléletet és gondolkodásmódot tanultam. Szerzőtársaim, munkatársaim Dr. Hassan Jijakli, Hai-Xia Zhang, Dr. Berrin Oguzhan, Laurence Ladriére barátként segítettek a nemzetközi kutatói közösségbe beilleszkedni. Köszönöm Jeanine Schoonheydt és Maryse Urbain laboratóriumi munkákban, különösen a sziget izolálásban nyújtott technikai szakértelmét és türelmét, valamint Catherine Demesmaeker titkárnői segítségét.
Hálásan köszönöm családom kitartó bíztatását és maximális támogatását.
89
9. IRODALOMJEGYZÉK
1. Aiello L.P., Northrup J.M., Keyt B.A., Takagi H., Iwamoto M.A.: Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor in retinal cells. Arch Ophthalmol 1995;113: 1538-1544. 2. Akkan A.G., Malaisse W.J.: Insulinotropic action of AICA riboside. I. Insulin release by isolated islets and the perfused pancreas. Diabetes Res 1994;25: 13-23. 3. Aldington S.J., Kohner E.M., Meuer S., Klein R., Sjølie A.K. for the EURODIAB IDDM Complication Study Group: Methodology for retinal photography and assessment of diabetic retinopathy: the EURODIAB IDDM Complications Study. Diabetologia 1995;38: 437-444. 4. Alejandro R., Shienvold F.L., Hajek S.A.V., Pierce M., Paul R., Mintz D.H.: A ganglioside antigen on the rat pancreatic B cell surface identified by monoclonal antibody R2D6. J Clin Invest 1984;74: 25-38. 5. American Academy of Ophthalmology: Diabetes 2000SM. Elimination of preventable blindness from diabetes by the year 2000. 1994 6. Arola L., Palou A., Remesar X., Alemany M.: Effects of 24 hour starvation on plasma composition in 19 and 21 day pregnant rats and their foetuses. Horm Metab Res 1982;14: 364-371. 7. Arola L., Palou A., Remesar X., Herrera E., Alemany M.: Effect of stress and sampling site on metabolite concentration in rat plasma. Arch Int Physiol Biochim 1980;88: 99-105. 8. Bakkali Nadi A., Malaisse-Lagae F., Malaisse W.J.: Insulinotropic action of meglitinide analogs: concentration-response relationship and nutrient dependency. Diabetes Res 1994;27: 81-87. 9. Barbosa J., Saner B.: Do genetic factors play a role in the pathogenesis of diabetic microangiopathy? Diabetologia 1984;27: 487-492. 10. Barrand M.A., Callingham B.A.: Monoamine oxidase activities in brown adipose tissue of the rat: some properties and subcellular distribution. Biochem Pharmacol 1982;31: 2177-2184. 11. Blachier F., Leclercq-Meyer V., Marchand J., Woussen-Colle M.C., Mathias P.C., Sener A., Malaisse W.J.: Stimulus-secretion coupling of arginine-induced insulin release. Functional response of islets to L-arginine and L-ornithine. Biochim Biophys Acta 1989;1013: 144-151. 90
12. Blachier F., Mourtada A., Sener A., Malaisse W.J.: Stimulus-secretion coupling of arginine-induced insulin release. Uptake of metabolized and nonmetabolized cationic amino acids by pancreatic islets. Endocrinology 1989;124: 134-141. 13. Boomsma F., Derkx F.H., van den Meiracker A.H., Man in 't Veld A.J., Schalekamp M.A.: Plasma semicarbazide-sensitive amine oxidase activity is elevated in diabetes mellitus and correlates with glycosylated haemoglobin. Clin Sci Colch 1995;88: 675679. 14. Boomsma F., van den Meiracker A.H., Winkel S., Aanstoot H.J., Batstra M.R., Man in 't Veld A.J., Bruining G.J.: Circulating semicarbazide-sensitive amine oxidase is raised both in type I (insulin-dependent), in type II (non-insulin-dependent) diabetes mellitus and even in childhood type I diabetes at first clinical diagnosis. Diabetologia 1999;42: 233-237. 15. Boomsma F., van Veldhuisen D.J., de Kam P.J., Man in 't Veld A.J., Mosterd A.S.O.: Plasma semicarbazide-sensitive amine oxidase is elevated in patients with congestive heart failure. Cardiovasc Res 1997;33: 387-391. 16. Boor P.J., Trent M.B., Lyles G.A., Tao M., Ansari G.A.: Methylamine metabolism to formaldehyde by vascular semicarbazide-sensitive amine oxidase. Toxicology 1992;73: 251-258. 17. Bradford M.M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72: 248-254. 18. Brownlee M.: Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 2001;414: 813-820. 19. Buchmann I., Milakofsky L., Harris N., Hofford J.M., Vogel W.H.: Effect of arginine administration on plasma and brain levels of arginine and various related amino compounds in the rat. Pharmacology 1996;53: 133-142. 20. Cai W., Rook S.L., Jiang Z.Y., Takahara N., Aiello L.P.: Mechanisms of hepatocyte growth factor-induced retinal endothelial cell migration and growth. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41: 1885-1893. 21. Carpinelli A.R., Sener A., Herchuelz A., Malaisse W.J.: Stimulus-secretion coupling of glucose-induced insulin release. Effect of intracellular acidification upon calcium efflux from islet cells. Metabolism 1980;29: 540-545. 22. Chayoth R., Nakhooda A.F., Poussier P., Marliss E.B.: Glucoregulatory and metabolic responses to heat exposure in rats. Am J Physiol 1984;246: E465-470. 91
23. Colombo J.P., Cervantes H., Kokorovic M., Pfister U., Perritaz R.: Effect of different protein diets on the distribution of amino acids in plasma, liver and brain in the rat. Ann Nutr Metab 1992;36: 23-33. 24. Danh C.H., Strolin-Bendetti M., Doster P., Musset A.: Age-related changes in the amine metabolizing enzymes in rat eye. J Pharm Pharmacol 1985;37: 357-361. 25. Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Report #18. Davis M.D., Fisher M.R., Gangnon R.E., Barton F., Aiello L.M., Chew E.Y., Ferris F.L. 3rd, Knatterud G.L.: Risk factors for high-risk proliferative diabetic retinopathy and severe visual loss. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39: 233-252. 26. Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group: Grading diabetic retinopathy from stereoscopic color fundus photographs—an extension of the modified Airlie House classification. ETDRS report number 10. Ophthalmology 1991;98: 786-806. 27. El Hadri K., Moldes M., Mercier N., Andreani M., Pairault J., Feve B.: Semicarbazide-sensitive
amine
oxidase
in
vascular
smooth
muscle
cells:
differentiation-dependent expression and role in glucose uptake. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22: 89-94. 28. Elliott J., Fowden A.L., Callingham B.A., Sharman D.F., Silver M.: Physiological and pathological influences on sheep blood plasma amine oxidase: effect of pregnancy and experimental alloxan-induced diabetes mellitus. Res Vet Science 1991;50: 334339. 29. Enrique-Tarancón G., Marti L., Morin N., Lizcano J.M., Unzeta M., Sevilla L., Camps M., Palacín M., Testar X., Carpéné C., Zorzano A.: Role of semicarbazidesensitive amine oxidase on glucose transport and GLUT4 recruitment to the cell surface in adipose cells. J Biol Chem 1998;273: 8025-8032. 30. Exner M., Hermann M., Hofbauer R., Kapiotis S., Quehenberger P., Speiser W., Held I., Gmeiner B.M.: Semicarbazide-sensitive amine oxidase catalyzes endothelial cellmediated low density lipoprotein oxidation. Cardiovasc Res 2001;50: 583-588. 31. Farkas Gy., Szabó M., Vörös P.: Humán fetális Langerhans szigetek in vitro vizsgálata és klinikai transzplantációja. Orv Hetil 1993;134: 1011-1013. 32. Fernández de Arriba A., Lizcano J.M., Balsa D., Unzeta M.: Contribution of different amine oxidases to the metabolism of dopamine in bovine retina. Biochem Pharmacol 1991;42: 2355-2361.
92
33. Fontana E., Boucher J., Marti L., Lizcano J.M., Testar X., Zorzano A., Carpéné C.: Amine oxidase substrates mimic several of the insulin effects on adipocyte differentiation in 3T3 F442A cells. Biochem J 2001;356: 769-777. 34. Fukagawa N.K., Li M., Liang P., Russell J.C., Sobel B.E., Absher P.M.: Aging and high concentrations of glucose potentiate injury to mitochondrial DNA. Free Radic Biol Med 1999;27: 1437-1443. 35. Garpenstrand H., Ekblom J., Bäcklund L.B., Oreland L., Rosenqvist U.: Elevated plasma semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) activity in Type 2 diabetes mellitus complicated by retinopathy. Diabetic Medicine 1999;16: 514-521. 36. Gasa R., Sener A., Malaisse W.J., Gomis R.: Apparent starvation-induced repression of pancreatic islet glucokinase. Biochem Mol Med 1995;56: 99-103. 37. Giroix M.H., Sener A., Pipeleers D.G., Malaisse W.J. Hexose metabolism in pancreatic islets. Inhibition of hexokinase. Biochem J 1984;223:447-453. 38. Growth Hormone Antagonist for Proliferative Diabetic Retinopathy Study Group: The effect of a growth hormone receptor antagonist drug on proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology 2001;108: 2266-2272. 39. Grönvall-Nordquist J.L., Bäcklund L.B., Garpenstrand H., Ekblom J., Landin B., Yu P.H., Oreland L., Rosenqvist U.: Follow-up of plasma semicarbazide-sensitive amine oxidase activity and retinopathy in Type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Complications 2001;15: 250-256. 40. Hammes H.P., Martin S., Federlin K., Geisen K., Brownlee M.: Aminoguanidine treatment inhibits the development of experimental diabetic retinopathy. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88: 11555-11558. 41. Hanks J.H., Wallace R.E.: Relation of oxygen and temperature in preservation of tissues by refrigeration. Proc Soc Exptl Biol Med 1949;71: 196-201. 42. Hayes B.E., Clarke D.E.: Semicarbazide-sensitive amine oxidase activity in streptozotocin diabetic rats. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 1990;69: 71-83. 43. Hutton J.C., Sener A., Malaisse W.J.: The metabolism of 4-methyl-2-oxopentanoate in rat pancreatic islets. Biochem J 1979;184: 291-301. 44. Imamura Y., Kubota R., Wang Y., Asakawa S., Kudoh J., Mashima Y., Oguchi Y., Shimizu N.: Human retina-specific amine oxidase (RAO): cDNA cloning, tissue expression, and chromosomal mapping. Genomics 1997;40: 277-283. 45. Jermendy Gy., Csermely P.: Tiazolidindionok - az oralis antidiabeticumok új hatástani csoportja. Orv Hetil 2001;142: 1547-1554. 93
46. Kern T.S., Engerman R.L.: Pharmacological inhibition of diabetic retinopathy: aminoguanidine and aspirin. Diabetes 2001;50: 1636-1642. 47. Kinemuchi H., Kobayashi N., Takahashi K., Takayanagi K., Arai Y., Tadano T., Kisara K., Oreland L: Inhibition of tissue-bound semicarbazide-sensitive amine oxidase by two haloamines, 2-bromoethylamine and 3-bromopropylamine. Arch Biochem Biophys 2001;385: 154-161. 48. King H., Aubert R.E., Herman W.H.: Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes Care 1998;21: 1414-1431. 49. Klein R., Klein B.E., Moss S.E., Davis M.D., DeMets D.L.: The Wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. III. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is 30 or more years. Arch Ophthalmol 1984;102: 527-532. 50. Klein R., Klein B.E.: Diabetic eye disease. Lancet 1997;350: 197-204. 51. Kohner E.M., Aldington S.J., Stratton I.M., Manley S.E., Holman R.R., Matthews D.R., Turner R.C.: United Kingdom Prospective Diabetes Study, 30. Diabetic retinopathy at diagnosis of non-insulin-dependent diabetes mellitus and associated risk factors. Arch Ophthalmol 1998;116: 297-303. 52. Korányi L., Péterfai É.: A glukóz toxikus hatása (glukózdeszenzitizáció és glukóztoxicitás). in Diabetes mellitus. Szerk. Halmos T., Jermendy Gy. Medicina, Budapest 1997 pp 133-137. 53. Krans H., Porta M., Keen H. (eds.): Diabetes care and research in Europe: the St. Vincent declaration action program. WHO Regional Office for Europe. 1992. p. 8. 54. Kurkijärvi R., Yegutkin G.G., Gunson B.K., Jalkanen S., Salmi M., Adams D.H.: Circulating soluble vascular adhesion protein 1 accounts for the increased serum monoamine oxidase activity in chronic liver disease. Gastroenterology 2000;119: 1096-1103. 55. Lacy P.E., Kostianovsky M.: Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes 1967;16: 35-39. 56. Langford
S.D.,
Trent
M.B.,
Balakumaran
A.,
Boor
P.J.:
Developmental
vasculotoxicity associated with inhibition of semicarbazide-sensitive amine oxidase. Toxicol Appl Pharmacol 1999;155: 237-244. 57. Leclercq-Meyer V., Kadiata M.M., Malaisse W.J.: Stimulation by 2-deoxy-D-glucose tetraacetates of hormonal secretion from the perfused rat pancreas. Am J Physiol 1999;276: E689-696. 94
58. Leclercq-Meyer V., Malaisse W.J.: Dual mode of action of glucose pentaacetates on hormonal secretion from the isolated perfused rat pancreas. Am J Physiol 1998;275: E610-617. 59. Leclercq-Meyer V., Malaisse W.J.: Potentiation of glucagon-like peptide 1 insulinotropic action by succinic acid dimethyl ester. Life Sciences 1996;58: 11951199. 60. Leclercq-Meyer V., Marchand J., Malaisse W.J.: Role of glucose and insulin in the dynamic regulation of glucagon release by the perfused rat pancreas. Diabetologia 1983;24: 191-195. 61. Lefèbvre P., Luyckx A., Robaye B.: Pattern of twenty-four plasma amino acids in rats before and after muscular exercise. Arch Int Physiol Biochim 1972;80: 935-940. 62. Levy J., Herchuelz A., Sener A., Malaisse-Lagae F., Malaisse W.J.: Cytochalasin Binduced impairment of glucose metabolism in islets of Langerhans. Endocrinology 1976;98: 429-437. 63. Lyles G.A., Chalmers J.: The metabolism of aminoacetone to methylglyoxal by semicarbazide-sensitive amine oxidase in human umbilical artery. Biochem Pharmacol 1992;43: 1409-1414. 64. Malaisse W.J., Blachier F., Mourtada A., Camara J., Albor A., Valverde I., Sener A.: Stimulus-secretion coupling of arginine-induced insulin release. Metabolism of Larginine and L-ornithine in pancreatic islets. Biochim Biophys Acta 1989;1013: 133143. 65. Malaisse W.J., Conget I., Sener A., Rorsman P.: Insulinotropic action of AICA riboside. II. secretory, metabolic and cationic aspects. Diabetes Res 1994;25: 25-37. 66. Malaisse W.J., Garcia-Morales P., Dufrane S.P., Sener A., Valverde I.: Forskolininduced activation of adenylate cyclase, cyclic adenosine monophosphate production and insulin release in rat pancreatic islets. Endocrinology 1984;115: 2015-2020. 67. Malaisse W.J., Giroix M.H., Malaisse-Lagae F., Sener A.: 3-O-methyl-D-glucose transport in tumoral insulin-producing cells. Am J Physiol 1986;251: C841-C846. 68. Malaisse W.J., Hager D.L., Orci L.: The stimulus-secretion coupling of glucoseinduced insulin release. IX. The participation of the beta cell web. Diabetes 1972;21: 594-604. 69. Malaisse W.J., Hutton J.C., Carpinelli A.R., Herchuelz A., Sener A.: The stimulussecretion coupling of amino acid-induced insulin release: metabolism and cationic effects of leucine. Diabetes 1980;29: 431-437. 95
70. Malaisse W.J., Jijakli H., Ulusoy S., Cook L., Best L., Vinambres C., VillanuevaPenacarrillo M.L., Valverde I., Sener A.: Insulinotropic action of methyl pyruvate: secretory, cationic, and biosynthetic aspects. Arch Biochem Biophys 1996;335: 229244. 71. Malaisse W.J., Lebrun P., Sener A.: Modulation of the insulinotropic action of glibenclamide and glimepiride by nutrient secretagogues in pancreatic islets from normoglycemic and hyperglycemic rats. Biochem Pharmacol 1993;45: 1845-1849. 72. Malaisse W.J., Magetto C., Leclercq-Meyer V., Sener A.: Interference of glycogenolysis with glycolysis in pancreatic islets from glucose-infused rats. J Clin Invest 1993;91: 432-436. 73. Malaisse W.J., Malaisse-Lagae F., Davies D.R., Vandercammen A., Van Schaftingen E.: Regulation of glucokinase by a fructose-1-phosphate-sensitive protein in pancreatic islets. Eur J Biochem 1990;190: 539-545. 74. Malaisse W.J., Malaisse-Lagae F., Sener A.: The stimulus-secretion coupling of amino acid-induced insulin release metabolic interaction of L-asparagine and Lleucine in pancreatic islets. Biochim Biophys Acta 1984;797: 194-202. 75. Malaisse W.J., Owen A.: Mathematical modelling of stimulus secretion coupling in the pancreatic B cell. VI. Cellular heterogenity and recruitment. Appl Math Model 1989;13: 41-46. 76. Malaisse W.J., Sener A., Carpinelli A.R., Anjaneyulu K., Lebrun P., Herchuelz A., Christophe J.: The stimulus-secretion coupling of glucose-induced insulin release. XLVI. Physiological role of L-glutamine as a fuel for pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol 1980;20: 171-189. 77. Malaisse W.J., Sener A., Gruber H.E., Erion M.D.: Insulinotropic action of formycin A. Biochem Med Metab Biol 1994;53: 22-27. 78. Malaisse W.J., Sener A., Koser M., Herchuelz A.: Stimulus-secretion coupling of glucose-induced insulin release. XXIV. The metabolism of a- and b-D-glucose in isolated islets. J Biol Chem 1976;251: 5936-5943. 79. Malaisse W.J., Sener A., Malaisse-Lagae F., Hutton J.C., Christophe J.: The stimulussecretion coupling of amino acid-induced insulin release. Metabolic interaction of Lglutamine and 2-ketoisocaproate in pancreatic islets. Biochim Biophys Acta 1981;677: 39-49.
96
80. Malaisse W.J., Sener A., Welsch M., Malaisse-Lagae F., Hellerström C., Christophe J.: Mechanism of 3-phenylpypuvate-induced insulin release. Metabolic aspects. Biochem J 1983;210: 921-927. 81. Malaisse W.J., Sener A.: Hexose metabolism in pancreatic islets. Feedback control of D-glucose oxidation by functional events. Biochim Biophys Acta 1988;971: 246-254. 82. Malaisse W.J., Sener A.: Metabolic effects and fate of succinate esters in pancreatic islets. Am J Physiol 1993;264: E434-E440. 83. Malaisse W.J.: Acides aminés et insulinosécrétion. In: XLIIIe Journées de Diabetologie de l'Hôtel-Dieu. Flammarion Médecine Sciences, Paris (megjelenés alatt). 84. Malaisse W.J.: Alteration of pancreatic B-cell D-glucose metabolism in type 2 diabetes: the G quintet. Endocrinologia 1993;40: 309-313. 85. Malaisse W.J.: Glucose-sensing by the pancreatic B-cell: the mitochondrial part. Int J Biochem 1992; 24: 696-701. 86. Malaisse W.J.: Insulin biosynthesis and secretion in vitro. in International Textbook of Diabetes Mellitus, Second Edition. Eds: Alberti K.G.M.M., Zimmet P., DeFronzo R.A., Keen H. John Wiley & Sons Ltd. 1997 pp 316-335. 87. Malaisse W.J.: Metabolic signaling of insulin secretion. Diab Rev 1996;4: 145-159. 88. Malaisse W.J.: Physiology, pathology and pharmacology of insulin secretion. Acta Clinica Belgica 2000;55: 141-147. 89. Malaisse W.J.: Stimulation of insulin release by non-sulfonylurea hypoglycemic agents: the meglitinide family. Horm Metab Res 1995;27: 263-266. 90. Malaisse W.J.: The anomeric malaise: a manifestation of B-cell glucotoxicity. Horm Metab Res 1991;23: 307-311. 91. Malaisse W.J.: The beta cell in NIDDM: giving light to the blind. Diabetologia 1994;37: S36-S42. 92. Malaisse W.J.: The esters of carboxylic nutrients as insulinotropic tools in noninsulin-dependent diabetes mellitus. Gen Pharmacol 1995;26: 1133-1141. 93. Malaisse-Lagae F. and Malaisse W.J.: Insulin release by pancreatic islets. In: Methods in Diabetes Research. Vol. I. Larner J. and Pohl S.L. (eds). Wiley and Sons, New York, pp 147-152, 1984. 94. Malaisse-Lagae F., Malaisse W.J.: The stimulus-secretion coupling of glucoseinduced insulin release. III. Uptake of
45
Endocrinology 1971;88: 72-80. 97
calcium by isolated islets of Langerhans.
95. Malaisse-Lagae F., Ravazolla M., Amherdt M., Gutzeit A., Stauffacher W., Malaisse W.J., Orci L.: An apparent abnormality of the B-cell microtubular system in Spiny mice (Acomys cahirinus). Diabetologia 1975;11: 71-76. 96. Mann G.E., Smith S.A., Norman P.S., Emery P.W.: Fasting, refeeding and diabetes modulate free amino acid concentrations in the rat exocrine pancreas: role of transstimulation in amino acid efflux. Pancreas 1988;3: 67-76. 97. Mercan D., Delville J.P., Leclercq-Meyer V., Malaisse W.J.: Preferential stimulation by D-glucose of oxidative glycolysis in pancreatic islets: comparison between B and non-B cells. Biochem Mol Biol Int 1993;29: 475-481. 98. Mészáros Z., Szombathy T., Riamondi L., Karádi I., Romics L., Magyar K.: Elevated serum semicarbazide-sensitive amine oxidase activity in non-insulin-dependent diabetes mellitus: correlation with BMI and serum triglyceride. Metabolism 1999;48: 113-117. 99. Milakofsky L., Hare T.A., Miller J.M., Vogel W.H.: Comparison of amino acid levels in rat blood obtained by catheterization and decapitation. Life Sci 1984;34: 13331340. 100. Obata T, Yamanaka Y.: Evidence for existence of immobilization stress-inducible semicarbazide-sensitive amine oxidase inhibitor in rat brain cytosol. Neurosci Lett 2000;296: 58-60. 101. Ohneda M., Johnson J.H., Inman L.R., Chen L., Suzuki K., Goto Y., Alam T., Ravazzola M., Orci L., Unger R.H.: GLUT2 expression and function in beta-cells of GK rats with NIDDM. Dissociation between reductions in glucose transport and glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes 1993;42: 1065-1072. 102. Orci L., Gabbay K.H., Malaisse W.J.: Pancreatic beta-cell web: its possible role in insulin secretion. Science 1972;175: 1128-1130. 103. Orci L.: A portrait of the pancreatic B cell. Diabetologia 1974;10: 163-187. 104. Pascal M.M., Forrester J.V., Knott R.M.: Glucose-mediated regulation of transforming growth factor-beta (TGF-beta) and TGF-beta receptors in human retinal endothelial cells. Curr Eye Res 1999;19: 162-170. 105. Pátkai G., Farkas K., Hegedűs J., Jermendy Gy.: Súlyos microangiopathiás szövődmények a diabetes mellitus felismerésekor. Orv Hetil 2001;142: 1687-1690. 106. Picó C., Lladó I., Pons A., Palou A.: Blood cell to plasma gradients of amino acids in arterial and venous blood in fed and fasted rats. Comp Biochem Physiol 1994;107: 589-595. 98
107. Pipeleers D.G.: Islet cell interactions with pancreatic B cells. Experientia 1984;40: 1114-1126. 108. Ramirez R., Jijakli H., Zhang H.-X., Nadi A.B., Sener A., Malaisse W.J.: Effects of D-mannoheptulose upon D-glucose metabolism in pancreatic B and non-B islet cells. Int J Mol Med 2002;9: 159-163. 109. Ramirez R., Rasschaert J., Sener A., Malaisse W.J.: The coupling of metabolic to secretory events in pancreatic islets. Glucose-induced changes in mitochondrial redox state. Biochim Biophys Acta 1996;1273: 263-267. 110. Rasschaert J., Reusens B., Dahri S., Sener A., Remacle C., Hoet J.J., Malaisse W.J.: Impaired
activity
of
rat
pancreatic
islet
mitochondrial
glycerophosphate
dehydrogenase in protein malnutrition. Endocrinology 1995;136: 2631-2634. 111. Ryan E.A., Lakey J.R., Rajotte R.V., Korbutt G.S., Kin T., Imes S., Rabinovitch A., Elliott J.F., Bigam D., Kneteman N.M., Warnock G.L., Larsen I., Shapiro A.M.: Clinical outcomes and insulin secretion after islet transplantation with the Edmonton protocol. Diabetes 2001;50: 710-719. 112. Scharff R., Wool I.G.: Concentration of amino-acids in rat muscle and plasma. Nature 1964;202: 603-604. 113. Schröder S., Palinski W., Schmid-Schönbein G.W.: Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. Am J Pathol 1991;139: 81-100. 114. Scruel O., Malaisse-Lagae F., Reusens B., Remacle C., Hoet J.J., Sener A., Malaisse W.J.: Taurine deficiency and supplementation in protein malnourished rats. Diabetes Res 1997;32: 133-145. 115. Sener A., Best L., Malaisse-Lagae F., Malaisse W.J.: The stimulus-secretion coupling of amino acid-induced insulin release: metabolism of L-asparagine in pancreatic islets. Arch Biochem Biophys 1984;229: 155-169. 116. Sener A., Blachier F., Rasschaert J., Mourtada A., Malaisse-Lagae F., Malaisse W.J.: Stimulus-secretion coupling of arginine-induced insulin release: comparison with lysine-induced insulin secretion. Endocrinology 1989;124: 2558-2567. 117. Sener A., Kawazu S., Hutton J.C., Boschero A.C., Devis G., Somers G., Herchuelz A., Malaisse W.J.: The stimulus-secretion coupling of glucose-induced insulin release. Effect of exogenous pyruvate on islet function. Biochem J 1978;176: 217232. 118. Sener A., Malaisse W.J.: Stimulation by D-glucose of mitochondrial oxidative events in islet cells. Biochem J 1987;246: 89-95. 99
119. Sener A., Malaisse W.J.: The stimulus-secretion coupling of amino acid-induced insulin release: insulinotropic action of branched-chain amino acids at physiological concentrations of glucose and glutamine. Eur J Clin Invest 1981;11: 455-460. 120. Sener A., Malaisse-Lagae F., Malaisse W.J.: Hexose metabolism in pancreatic islets: time-course of the oxidative response to D-glucose. Biochim Biophys Acta 1993;1177: 54-60. 121. Sener A., Malaisse-Lagae F., Malaisse W.J.: Stimulation of islet metabolism and insulin release by nonmetabolizable amino acid. Proc Natl Acad Sci USA 1981;78: 5450-5464. 122. Sener A., Scruel O., Louchami K., Jijakli H., Malaisse W.J.: Inhibition of glucoseinduced insulin release by 3-O-methyl-D-glucose: enzymatic, metabolic and cationic determinants. Mol Cell Biochem 1999;194: 133-145. 123. Sjølie A.K., Steephenson J., Aldington S., Kohner E., Janka H., Stevens L., Fuller J. the EURODIAB IDDM Complication Study Group: Retinopathy and vision loss in insulin-dependent diabetes in Europe. The EURODIAB IDDM Complications Study. Ophthalmology 1997;104: 252-260. 124. Smith D.J., Salmi M., Bono P., Hellman J., Leu T., Jalkanen S.: Cloning of vascular adhesion protein 1 reveals a novel multifunctional adhesion molecule. J Exp Med 1998;188: 17-27. 125. Somers G., Blondel B., Orci L., Malaisse W.J.: Motile events in pancreatic endocrine cells. Endocrinology 1979;104: 255-264. 126. Somers G., Devis G., van Obberghen E., Malaisse W.J.: Calcium antagonists and islet function. II. Interaction of theophylline and verapamil. Endocrinology 1976;99: 114124. 127. Somogyi J, Vér Á, Trója G, Végh E, Bühler C, Hatfaludi F, Csermely P, Popovič S.: Interference of the sulphonylurea antidiabeticum gliquidone with mitochondrial bioenergetics in the rat under in vitro conditions. Acta Physiol Hung 1995;83: 299312. 128. Sorbinil Retinopathy Trial Research Group: A randomized trial of sorbinil, an aldose reductase inhibitor, in diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol 1990;108: 1234-1244. 129. Soulis T., Cooper M.E., Sastra S., Thallas V., Panagiotopoulos S., Bjerrum O.J., Jerums G.: Relative contributions of advanced glycation and nitric oxide synthase inhibition to aminoguanidine-mediated renoprotection in diabetic rats. Diabetologia 1997;40: 1141-1151. 100
130. Soulis-Liparota T., Cooper M.E., Dunlop M., Jerums G.: The relative roles of advanced glycation, oxidation and aldose reductase inhibition in the development of experimental diabetic nephropathy in the Sprague-Dawley rat. Diabetologia 1995;38: 387-394. 131. Stehouwer C.D.A., Lambert J., Donker A.J.M., van Hinsbergh V.W.M.: Endothelial dysfunction and pathogenesis of diabetic angiopathy. Cardiovascular Research 1997;34: 55-68. 132. Szabó M.E., Haines D., Garay E., Chiavaroli C., Farine J.C., Hannaert P., Berta A., Garay R.P.: Antioxidant properties of calcium dobesilate in ischemic/reperfused diabetic rat retina. Eur J Pharmacol 2001;428: 277-286. 133. Tamagawa T., Niki H., Niki A.: Insulin release independent of a rise in cytosolic free Ca2+ by forskolin and phorbol ester. FEBS Lett 1984;177: 17-22 134. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group: The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1993;329: 977986. 135. UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group: Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33) Lancet 1998;352: 837853. 136. Valverde I., Vandermeers A., Anjaneyulu R., Malaisse W.J.: Calmodulin activation of adenylate cyclase in pancreatic islets. Science 1979;206: 225-227. 137. van Dijk J., Boomsma F., Alberts G., Man in ‘t Veld A.J., Schalekamp M.A.D.H.: Determination of semicarbazide-sensitive amine oxidase in human plasma by highperformance liquid chromatography with fluorimetric detection. J Chromatogr 1995;663: 43-50. 138. van Obberghen E., Somers G., Devis G., Ravazzola M., Malaisse-Lagae F., Orci L., Malaisse W.J.: Dynamics of insulin release and microtubular-microfilamentous system. VII. Do microfilaments provide the motive force for the translocation and extrusion of beta granules? Diabetes 1975;24: 892-901. 139. van Obberghen E., Somers G., Devis G., Vaughan G.D., Malaisse-Lagae F., Orci L., Malaisse W.J.: Dynamics of insulin release and microtubular-microfilamentous system. I. Effect of cytochalasin B. J Clin Invest 1973;52: 1041-1051.
101
140. Vékási J., Márton Zs., Késmárky G., Cser A., Russai R., Kovács B.: Haemorheologiai faktorok vizsgálata hypertoniás és diabeteses retinopathiában. Orv Hetil 2001;142: 1045-1048. 141. Vionnet N., Stoffel M., Takeda J., Yasuda K., Bell G.I., Zouali H., Lesage S., Velho G., Iris F., Passa P., Froguel Ph., Cohen D.: Nonsense mutation in the glucokinase gene causes early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature 1992;356: 721-722. 142. Vlassara H.: Recent progress on the biologic and clinical significance of advanced glycosylation end products. J Lab Clin Med 1994;124: 19-28. 143. Welsh M., Hellerström C., Andersson A.: Respiration and insulin release in mouse pancreatic islets. Effects of L-leucine and 2-ketoisocaproate in combination with Dglucose and L-glutamine. Biochim Biophys Acta 1982;721: 178-184. 144. Williams I.H., Chua B.H., Sahms R.H., Siehl D., Morgan H.E.: Effects of diabetes on protein turnover in cardiac muscle. Am J Physiol 1980;239: E178-185. 145. Yamagishi Si S., Amano S., Inagaki Y., Okamoto T., Koga K., Sasaki N., Yamamoto H., Takeuchi M., Makita Z.: Advanced glycation end products-induced apoptosis and overexpression of vascular endothelial growth factor in bovine retinal pericytes. Biochem Biophys Res Commun 2002;290: 973-978. 146. Yu P.H., Lai C.T., Zuo D.M.: Formation of formaldehyde from adrenaline in vivo, a potential risk factor for stress-related angiopathy. Neurochem Res 1997;22: 615-620. 147. Yu P.H., Zuo D.M., Davis B.A.: Characterization of human serum and umbilical artery semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO). Species heterogeneity and stereoisomeric specificity. Biochem Pharmacol 1994;47: 1055-1059. 148. Yu P.H., Zuo D.M.: Aminoguanidine inhibits semicarbazide-sensitive amine oxidase activity implications for advanced glycation and diabetic complications. Diabetologia 1997;40: 1243-1250. 149. Yu P.H., Zuo D.M.: Inhibition of a type B monoamine oxidase inhibitor, (E)-2-(4fluorophenethyl)-3-fluoroallylamine (MDL-72974A), on semicarbazide-sensitive amine oxidases isolated from vascular tissues and sera of different species. Biochem Pharm 1992;43: 307-312. 150. Yu P.H., Zuo D.M.: Oxidative deamination of methylamine by semicarbazidesensitive amine oxidase leads to cytotoxic damage in endothelial cells. Possible consequences for diabetes. Diabetes 1993;42: 594-603.
102
151. Yu W., Niwa T., Fukasawa T., Hidaka H., Senda T., Sasaki Y., Niki I.: Synergism of protein kinase A, protein kinase C, and myosin light-chain kinase in the secretory cascade of the pancreatic beta-cell. Diabetes 2000;49: 945-952. 152. Zhang X., McIntire S.: Cloning and sequencing of a copper-containing, topa quinonecontaining monoamine oxidase from human placenta. Gene 1996;179: 279-286. 153. Zuo D.M., Yu P.H.: Semicarbazide-sensitive amine oxidase and monoamine oxidase in rat brain microvessels, meninges, retina and eye sclera. Brain Res Bull 1994;33: 307-311.
103
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 10.1 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK I.
Dura E., Mészáros Zs., Salacz Gy., Magyar K., Romics L., Karádi I.: Serum Semicarbazide-Sensitive Amine Oxidase Activity in Patients with Retinopathy in Type 2 Diabetes Mellitus. Diabetes Research 2001;35: 127-141.
II.
Jijakli H., Zhang H-X., Dura E., Ramirez R., Sener A., Malaisse W.J.: Effects of cytochalasin B and D upon insulin release and pancreatic islet cell metabolism. Int J Mol Med 2002;9: 165-172. (IF: 1.899)
III.
Dura E., Jijakli H., Zhang H-X., Oguzhan B., Sener A., Malaisse W.J.: Insulinotropic action of amino acids at their physiological concentrations: I. Experiments in incubated islets. Int J Mol Med 2002;9: 527-531. (IF: 1.899)
IV.
Dura E., Mészáros Zs., Salacz Gy., Magyar K., Romics L. és Karádi I.: A szérum szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim aktivitás vizsgálata diabeteses retinopathiában szenvedő 2-es típusú cukorbetegekben. Orv Hetil (közlésre előzetesen elfogadva: OH 26.651 kézirat/2002)
104
10.2 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁN KÍVÜL MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK V.
Dura E., Récsán Zs., Szamosi A., Salacz Gy.: Tompa szemsérülés és következményei a szem elülső szegmentumában. Szemészet 1998;135: 87-92.
VI.
Dura E., Récsán Zs., Salacz Gy.: Tompa szemsérülés és következményei a szem hátsó szegmentumában. Szemészet 1998;135: 95-103.
VII.
Bögi J., Dura E., Fiedler O., Hargitai J., Papp M., Récsán Zs.: Gyakori problémák a pseudoexfoliatiós szemek kezelésében: a szürkehályog-műtétek komplikációi, az argon lézer trabeculoplastica hatásossága. Szemészet 1999;136: 149-155.
VIII.
Salacz Gy., Dura E.: Az üvegtest pótlás új lehetőségei. Orvosképzés 2002;1: 61-68.
105
10.3
TUDOMÁNYOS ELŐADÁSOK, POSZTEREK, TOVÁBBKÉPZŐ ELŐADÁSOK
10.3.1 Az értekezés témájában ELŐADÁSOK Dura
Eszter:
Újdonságok
a
diabeteses
retinopathia
pathomechanizmusában,
gyógyításában. Előadás, Fővárosi Szemorvosok Továbbképző sorozata, SOTE I. sz. Szemészeti Klinika, 1999.02.11 Dura Eszter, Mészáros Zsuzsa, Salacz György, Karádi István: A szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim lehetséges szerepe a diabeteses retinopathia kialakulásában. Előadás, Magyar Szemorvos Társaság Nagygyűlése, Debrecen, 1999.07.29-07.31 POSZTEREK Eszter Dura, Zsuzsa Mészáros, György Salacz, István Karádi: Does serum semicarbazide-sensitive amine oxidase play a role in the pathogenesis of diabetic retinopathy? Poszter, 8th Amine Oxidase Workshop - International Congress on Monoamine Oxidases, Trace Amines, Neuroprotection, and Neuronal Rescue, Balatonöszöd, 1998.09.06-09.10 Eszter Dura, Zsuzsa Mészáros, György Salacz, István Karádi: Serum Semicarbazidesensitive Amine Oxidase in Diabetic Retinopathy. Poszter, VII. Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest, 1998.11.04-11.05 Eszter Dura, Zsuzsa Mészáros, György Salacz, István Karádi: Serum Semicarbazidesensitive Amine Oxidase in Diabetic Retinopathy. Poszter, Annual Meeting of the American Academy of Ophthalmology, New Orleans, USA, 1998.11.08-11.10 Dura Eszter, Mészáros Zsuzsa, Salacz György, Karádi István: Szérum SSAO enzim aktivitás vizsgálata diabeteses retinopathiában. Poszter, Magyar Szemorvos Társaság, Retina Szekció, III. Kongresszus, Szekszárd, 1998.11.26-11.28
106
Eszter Dura, Zsuzsa Mészáros, György Salacz, István Karádi: The role of serum semicarbazide-sensitive amine oxidase in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Poszter, XII. Congress, European Society of Ophthalmology, Stockholm, Sweden, 1999.06.27-07.01 Hassan Jijakli, Eszter Dura, Hai-Xia Zhang, Berrin Oguzhan, Abdullah Sener and Willy J. Malaisse: Metabolic, cationic and insulinotropic action of amino acids under physiological conditions. Poster, Congress of the Société Belge de Physiologie et de Pharmacologie Fondamentales et Cliniques, Brussels, Belgium, 2001.11.17 POSZTGRADUÁLIS TOVÁBBKÉPZŐ ELŐADÁSOK Dura Eszter: A diabetes biokémiája. Előadás, "Diabetes okozta szembetegségek.", Továbbképzés, Semmelweis Egyetem, Budapest, II. sz. Szemészeti Klinika, 2000.01.2425
107
10.3.2 Az értekezés témáján kívül ELŐADÁSOK Dura Eszter, Récsán Zsuzsa: Tompa szemsérültek klinikánk beteganyagában. Előadás, „A természetes környezet és az ember” I. Országos Konferencia, Budapest, 1997.01.2301.24 Dura Eszter, Récsán Zsuzsa, Salacz György: A retina leválás gyakorisága és kezelése tompa szemsérülést követően. Előadás, Magyar Szemorvostársaság Retina Szekció, II. Tudományos Ülés, Seregélyes, 1997.11.14-11.15 Dura
Eszter,
Fiedler
Orsolya,
Papp
Melitta,
Récsán
Zsuzsa,
Bögi
Júlia:
Pseudoexfoliatios szemeken végzett szürkehályogműtétek szövődményeiről. Előadás, Magyar Műlencse Implantatiós és Refraktív Sebészeti Társaság III. Kongresszusa, Keszthely, 1999.03.18-03.20 István Cseke, Gábor Radó, Zsolt Bíró, Eszter Dura, Bálint Kovács: Cataract Surgery on Highly Myopic Eyes. Előadás, 9th International Southern African Congress of South African Society of Cataract and Refracive Surgery (SASCRS), Capetown, South Africa, 2001.02.17-19 Papp
Melitta,
Bögi
Júlia,
Dura
Eszter,
Fiedler
Orsolya,
Récsán
Zsuzsa:
Phacoemulsificatio pseudoexfoliatiós szemeken. Előadás, Magyar Műlencse Implantatiós és Refraktív Sebészeti Társaság V. Kongresszusa, Keszthely, 2001.03.29-03.31 Cseke István, Dura Eszter, Bíró Zsolt: Expulsiv chorioidea vérzés és kivédése phacoemulsificatio során. Előadás, Magyar Műlencse Implantatiós és Refraktív Sebészeti Társaság V. Kongresszusa, Keszthely, 2001.03.29-03.31 Cseke István, Radó Gábor, Dura Eszter: Myopia és életmód. Előadás. Magyar Gyermekszemészek
és
Strabológusok
Társágának
2001.05.11-05.12
108
V.
Kongresszusa,
Budapest,
POSZTEREK Dura Eszter, Récsán Zsuzsa: Tompa szemsérültek klinikánk beteganyagában. Poszter, Magyar Szemorvostársaság Millecentenáriumi kongresszusa, Budapest, 1996.08.29-08.31 Dura Eszter, Récsán Zsuzsa: Blunt eye trauma and its late complications. Poszter, VI. Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest, 1997.11.05-11.07 Melitta Papp, Júlia Bögi, Eszter Dura, Orsolya Fiedler, Zsuzsa Récsán: Intraoperative complication of cataract surgery in eyes with pseudoexfoliation. Poster, XII. Congress, European Society of Ophthalmology, Stockholm, Sweden, 1999.06.27-07.01 Rita Vámos, Eszter Dura, Klaudia Preisz: Syphilitic uveitis - still a diagnostic challenge. Poster, XIII. Congress, European Society of Ophthalmology, Istanbul, Turkey, 2001.06.03-06.07 POSZTGRADUÁLIS TOVÁBBKÉPZŐ ELŐADÁSOK Salacz György, Dura Eszter, Radó Gábor, Cseke István: "Az ideghártya leválás prevenciójának lehetőségei.", Továbbképző kurzus. Magyar Szemorvostársaság, V. Retina Szekció, Tihany, 2000.11.16-18 -
Dura Eszter, Radó Gábor: "A retina leválás figyelmeztető jelei, a prevenció lehetőségei." Előadás
-
Radó Gábor, Dura Eszter: "Myopia és életvitel." Előadás
-
Dura Eszter, Salacz György: "Trauma által kiváltott retina szakadás ill. leválás." Előadás
-
Radó Gábor, Dura Eszter: "Pre- és postoperatív életviteli ajánlások ablatio retinae esetén." Előadás
Salacz György, Radó Gábor, Récsán Zsuzsa, Győry József, Dura Eszter: "Az üvegtestpótlás lehetőségei". Továbbképző kurzus. Magyar Szemorvostársaság, VI. Retina Szekció, Pécs, 2001.10.25-27 Dura Eszter: Intraoculáris expandáló gázok. Előadás, "Üvegtest pótló eljárások". Továbbképzés, Semmelweis Egyetem, Budapest, II. sz. Szemészeti Klinika, 2002.03.28
109
11. ÖSSZEFOGLALÓ (1) A plazmában posztprandiálisan mérhető értéknek megfelelő fiziológiás koncentrációjú 20 aminosav és citrullin, ornitin, valamint taurin elegye, 8.3 mM D-glukóz jelenlétében kb. 50%-al emelte a táplálkozás után preparált patkány pancreas szigetekben az insulin kibocsátást. A metabolikus, iontranszport, és szekréciós eredményeket in vivo körülményekre extrapolálva megállapíthatjuk, hogy a keringő aminosavak jelentős szerepet töltenek be az insulin szekréció normál szabályozásában. Fiziológiás állapotot modellezve igazoltuk, hogy a sejtekben egyes aminosavak (pl. L-glutamin) tápanyagként hasznosulnak, míg más aminosavak (pl. L-arginin, L-lizin) pozitív töltésük következtében akkumulálódnak és ily módon befolyásolják a szigetek insulin szekréciós válaszát. (2) A cytochalasin B (21 mM) egyaránt fokozta D-glukóz ill. nem-glukóz tápanyagok (2ketoizokapronsav, L-leucin és L-glutamin) által kiváltott insulin elválasztást patkány pancreasból izolált szigetekben, annak ellenére, hogy a D-glukóz felvételét és metabolizmusát gátolta a pancreas szigetekben. A cytochalasin D (20 mM), mely a Dglukóz felvételét és metabolizmusát nem befolyásolta izolált szigetekben, szintén fokozta a D-glukóz által kiváltott insulin kibocsátást, de a vártnál kisebb mértékben, mint a cytochalasin B. Nem-glukóz tápanyagokkal stimulált szigetek esetében azonban, a cytochalasin D ugyanolyan hatásos volt, mint a cytochalasin B a szekréciós válasz potencírozásában. Metabolikus vizsgálatainkban a cytochalasin B fokozottabban gátolta a D-glukóz anyagcserét a non-B, mint a B-sejtekben. Továbbá non-B-sejtek esetében, 2.8 mM D-glukóz koncentrációnál a cytochalasin B gátló hatása relatíve nagyobb volt, mint 16.7 mM D-glukóz alkalmazásánál. Eredményeink alapján feltételezhető, hogy a cytochalasin B, a B-sejt glukóz-szenzor funkciójával való kölcsönhatáson keresztül befolyásolja az insulin szekréció folyamatát. (3) Humán klinikai adatok alapján igazoltuk a feltételezést, mely szerint a réz tartalmú szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz (SSAO) enzim fokozott aktivitása szerepet játszhat a diabetes
leggyakoribb
mikrovaszkuláris
szövődményének,
a
retinopathiának
kialakulásában. Az SSAO enzim monoamin vegyületek oxidatív deaminációját katalizálja, mely során citotoxikus hatású aldehidek, valamint hidrogén peroxid és ammónia keletkeznek. Kimutattuk, hogy nagy-rizikójú proliferatív stádiumú diabeteses retinopathiában az SSAO enzim fiziológiás aktivitása szignifikánsan magasabb, mint retinopathia nélküli 2-es típusú cukorbetegekben. Az enzim aktivitás szelektív gyógyszeres befolyásolása a diabeteses retinopathia megelőzésében és gyógyításában új szempontja lehet. 110
12. SUMMARY (1) At a concentration of D-glucose comparable to that found in the rat plasma postprandially (8.3 mM), a mixture of 20 amino acids at their physiological concentrations supplemented together with citrulline, ornithine and taurine augments by about 50% the output of insulin in islets prepared from fed rats. Our metabolic, cationic and secretory findings extrapolated to the situation found in vivo document an impressive role of circulating amino acids in the normal control of insulin release. Simulating physiological conditions, our results were considered as compatible with both the role of certain amino acids as nutrients (e.g. L-glutamine) and the accumulation of other amino acids (e.g. L-arginine, L-lysine) as positively charged molecules in the islet cells. (2) Cytochalasin B (21 mM) enhanced insulin release evoked by D-glucose and nonglucidic secretagogues (2-ketoisocaproate, L-leucine and L-glutamine), despite inhibiting D-glucose uptake and D-glucose metabolism in pancreatic islets. Cytochalasin D (20 mM), which failed to affect D-glucose uptake and metabolism by isolated islets, also augmented glucose-stimulated insulin release, but unexpectedly to a lesser extent than cytochalasin B. However, in islets stimulated by non-glucidic nutrients cytochalasin D was as potent as cytochalasin B in potentiating the secretory response. This situation coincided with the fact that cytochalasin B inhibited more severely D-glucose metabolism in non-B, as distinct from B islet cells and, in the former case, caused a relatively greater inhibition of hexose catabolism at 2.8 mM than at 16.7 mM D-glucose. These findings suggest a so-far-unidentified interference of cytochalasin B with the B-cell glucosesensing device. (3) The copper-containing semicarbazide-sensitive amine oxidase enzyme (SSAO) catalyses the conversion of certain endogenous monoamines, like methylamine into cytotoxic aldehydes, hydrogen peroxide and ammonia. We demonstrated that the physiological activity of serum SSAO enzyme is significantly higher in Type 2 diabetic patients with high-risk proliferative diabetic retinopathy compared to those without retinopathy. Our clinical results support the hypothesis that elevated SSAO activity may be involved in the pathogenesis of microvascular diabetic late complications, such as retinopathy. The pharmacological manipulation of SSAO activity might be an interesting new concept for prevention and treatment of diabetic retinopathy.
111
