Molekul áris diagnosztika rökletes Molekuláris diagnosztika öörökletes betegs égekben betegségekben Tordai Attila OVSZ Molekuláris Diagnosztikai Labor
Bp., 2011. április 21. Labordiagnosztikai szinten tartó tanf.
Molekul áris Diagnosztika Molekuláris Diagnosztika Az orvosi laboratóriumi diagnosztika legfiatalabb (∼ 15 év), sokak szerint a legdinamikusabban fejlődő szakága, amelyen elsősorban nukleinsav (DNS, RNS) alapú teszteket értenek. Tágabb értelmezés szerint ide tartoznak a proteomika és a tömegspektrometria diagnosztikai alkalmazásai is. Lehetséges csoportosítás alkalmazási terület szerint: - Egyén-azonosítás, szöveti tipizálás (igazságügy, apaság, transzplantáció) - Nem saját nukleinsav (mikrobiológia) - Szerzett nukleinsav-eltérések (onkológia) - Örökletes eltérések
Határterület: citogenetika
Alternatív csoportosítás: • egyedi/kis számú eltérések kimutatása - hagyományosabb • nagy számú gén, SNP, mRNS kimutatása – array-k (térben rendezett makromolekula-sorozatok) / nagy kapacitású (high throughput, HT) tesztek
Ö rökletes elt érések kimutat ásának jelent ősége Örökletes eltérések kimutatásának jelentősége Konkrét betegellátás: • A diagnózis pontos megállapítása (monogénes betegségek pl. Wilson kór, izomdystrophiák)
• Kockázati/prognosztikai tényezők azonosítása (multifaktoriális betegségek pl. mélyvénás trombózis)
• Szelektív populációs érintettség/predispozíció Megelőzés: • Hordozó (carrier) és prenatális diagnosztika (súlyos, kevéssé kezelhető betegségek pl. haemophilia, cisztikus fibrózis, Duchenne-izomdystrophia, Huntington chorea)
Klinikai kutatás: • Betegpopuláció feltérképezése • Struktúra-funkció megértése
V érzékenység Vérzékenység
Haemophilia Haemophilia A A és és BB (HA (HA és és HB) HB)
VIII. (HA) ill. IX. (HB) alvadási faktor deficiencia (csökkent szint vagy csökkent aktivitás) X kromoszómához kötött recesszív öröklésmenet (Xq) Spontán vérzések (izületek, izmok, koponyaűr) Gyakoriság: 1:5000 (HA) 1:30000 (HB) férfi.
A érzékenység ((haemophilia) haemophilia) klinikai A vvérzékenység klinikai jelei jelei
(a)Vérzés a könyöktájon. (b)Retina-vérzés. (c)Ismételt ízületi vérzések: súlyos arthritis.
Oszt ályozás ((FVIII/FIX FVIII/FIX aktivit ás): Osztályozás aktivitás): •• súlyos súlyos(<1%) (<1%)––spontán spontán vérzések, vérzések, •• középsúlyos középsúlyos(1-5%) (1-5%)––enyhe enyhe trauma traumaután utánelhúzódó elhúzódóvérzések. vérzések. •• enyhe enyhe(6-30%) (6-30%)––súlyos súlyostrauma, trauma, műtét műtétután utánelhúzódó elhúzódóvérzések. vérzések.
X -kromoszómához kkötött ötött recessz ív ööröklődés röklődés X-kromoszómához recesszív
A ási faktor én szerkezete A VIII. VIII. alvad alvadási faktor ggén szerkezete X kromoszóma
VIII. faktor (FVIII) gén 26. exon 22. intron 186 kb cDNS: >7kb
Xq28
1. exon
Molekul áris genetikai Molekuláris genetikai diagnosztikai diagnosztikai algoritmus algoritmus ---haemophilia -ban szenved ő betegek s csal ádok haemophilia A A-ban szenvedő betegek éés családok Súlyos haemophilia A
Középsúlyos haemophilia A
(FVIII aktivitás: <1 %)
Géninverzió vizsgálat Southern blot/hosszú PCR Informatív?
(FVIII aktivitás: 1-5 %)
BclI PCR-RFLP Informatív?
NEM
NEM
IGEN IGEN
IVS 13 CA repeat Informatív? NEM
Carrier - és prenatális diagnosztika ajánlható
IGEN
IGEN
p39 CA repeat Informatív? NEM
Egyéb kapcsolt marker elemzése
A én kapcsolt A fVIII fVIII ggén kapcsolt markerei markerei X kromoszóma q (hosszú kar) telomerikus régió telomer
centromer
1.exon
26.exon
13. intron IVS 13 CA repeat
18. intron BclI hasítási hely
p39 CA repeat
Csal ádvizsgálat Bcl I marker ítségével (PCR Családvizsgálat BclI marker seg segítségével (PCRRFLP) RFLP) II/1 I/1 I/2 II/2 II/3
I/1
I/2
144bp
II /1 99bp
II /2
II /3
Mi crosatellita-analízis fluoreszcens öléssel Microsatellita-analízis fluoreszcens jel jelöléssel Eljárás: Az p39 (CA)n repeat régiójának amplifikációja PCR-rel és fluorescens jelölésű primerekkel, majd méret szerinti elválasztás kapilláris elektroforézissel (ABI 310)
p39 CA Repeat I/1
I/2
II/1
I/1
II/1
Szekvencia ízis (Sanger): én (HA) Szekvencia anal analízis (Sanger): FVIII FVIII ggén (HA) 11. exon:
beteg mutáns szekvencia
egészséges személy normál szekvencia
9. exon:
Kodon 415: TGG>TGC
Kodon 552: CTC>CCC
c.1300delG
Leu552Pro
HA ádvizsgálat HA csal családvizsgálat A számozott családtagoktól áll rendelkezésre DNS.
3 ? 2
4
1 Indirekt módszer nem informatív
Azonosított mutáció: 68. kodon: TGG>TAG
Trp68Stop
? 5
Nonsense mutáció azonosítható heterozigóta formában a 2, 3, 4, 5 családtagok esetében.
Hemophilia Hemophilia genetikai genetikai diagnosztikai diagnosztikai program program HA
Vizsgált hordozók száma (196 család): 284
Obligát: 122
HB
Potenciális hordozó: 162 Diagnosztizált: 60
Nem hordozó: 102
Vizsgált hordozók száma (35 család): 51
Obligát: 19
Potenciális hordozó : 32 Diagnosztizált: 14
Nem hordozó: 18
Prenatális diagnosztika (HA és HB együtt): 40 fiú magzat: 27 (68%) egészséges, 13 (32%) érintett
M élyvénás Mélyvénás thrombosis thrombosis (MVT) (MVT)
A ózis kialakul ás ffő ő patomechanizmusa A tromb trombózis kialakulás patomechanizmusa A véralvadást elősegítő, illetve gátló folyamatok egyensúlyának megbomlása általában a gátló rendszer csökkent működése következtében.
A élyvénás tromb ózis öörökletes rökletes éés s szerzett ényezői Am mélyvénás trombózis szerzett ttényezői Örökletes
Gyakori: • • •
a FV gén G1691A (Leiden) mutációja a FII (protrombin) gén promoter szakasza G20210A mutációja a metiléntetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) gén C677T mutációja homozigóta formában
Ritka:
Igen ritka: Valószínűleg örökletes: Szerzett:
• • • • • • • • • •
• • •
antitrombin III deficiencia protein C deficiencia protein S deficiencia
•
disfibrinogenémia, homozigóta homocisztinuria
•
emelkedett FVIII, FIX, FXI ill. fibrinogén szintek
műtét vagy sérülés hosszantartó mozgáshiány idősebb életkor malignus betegségek myeloproliferatív kórképek korábbi trombózis terhesség, fogamzásgátlók és hormonpótló kezelés antifoszfolipid antitestek jelenléte enyhe/súlyos hiperhomocisztinémia nem a FV mutációjával összefüggő protein C rezisztencia
Az rökletes trombophilia ői Az öörökletes trombophilia klinikai klinikai jellemz jellemzői • Visszatérő illetve különleges súlyosságú/atípusos lokalizációjú mélyvénás trombózis (MVT) • Pozitív családi anamnézis MVT-re • 45 évnél fiatalabb életkor az első jelentkezéskor • Nem mutatható ki szerzett kockázati tényező • Többszörös vetélés és/vagy halvaszülés az anamnézisben
Ö rökletes trombophilia -tényezők öösszesített sszesített Örökletes trombophilia-tényezők el őfordulási gyakoris ága kontroll s előfordulási gyakorisága kontroll éés betegcsoportokban betegcsoportokban Örökletes trombophilia-tényező
Egészséges populáció
MVT
Trombophilia
Vizsgált egyének (fő)
Érintettség (%)
Protein C deficiencia
15 070
0,2-0,4
2008
3,7
767
4,8
Protein S deficiencia
---
---
2008
2,3
649
4,3
I. típusú antitrombin III deficiencia
9669
0,02
2008
1,9
649
4,3
FV Leiden mutáció
16 150
4,8
1142
18,8
162
40
FII G20210A mutáció
11 932
2,7
2884
7,1
551
16
Vizsgált Érintettség Vizsgált Érintettség egyének (fő) (%) egyének (fő) (%)
MVT: mélyvénás trombózisos betegek Trombophilia: szelektált betegek, életkor 50 év alatt, családi halmozódás, korábbi trombózis Seligsohn 2001, NEJM 344:1222.
N éhány gyakori ázati ttényező ényező relat ív Néhány gyakori MVT MVT kock kockázati relatív kock ázati éértéke rtéke kockázati Eltérés/kockázati tényező FV Leiden FII G20210A
Relatív kockázat*
heterozigóta
4,9
homozigóta
80
heterozigóta
3,8
homozigóta
nincs adat
FV Leiden heteroz. + FII G20210A heteroz.
20
Orális fogamzásgátló (OC)
2,3
FV Leiden heterozigóta + OC
10,2
G20210A heterozigóta + OC
7,1
*Relatív kockázat (relative risk) MVT szempontjából
A óriumi kivizsg álásának A trombophilia trombophilia laborat laboratóriumi kivizsgálásának elemei árom „„fontossági” fontossági” csoportban elemei hhárom csoportban Elsődleges csoport Vizsgálat APCrezisztencia FV Leiden FII G20210A Homocisztein szint VIII. f. szint Lupus antikoaguláns
Genetikai háttér FV Leiden, HR2 10. exon, R506Q Promoter mutáció CBS, MTHFR mutáció nem ismert
Másodlagos csoport Vizsgálat
Genetikai háttér
Protein C aktivitás Protein S szint és aktivitás Antitrombin III
161 különb. mutáció 131 különb. mutáció 127 különb. mutáció szerzett
szerzett
Seligsohn 2001, NEJM 344:1222.
Antikardiolipin antitest
Harmadlagos csoport Vizsgálat
Genetikai háttér
Dysfibrinogen aemia Fibrinogén szint IX. f. szint és aktivitás XI. f. szint és aktivitás MTHFR C677T
20 különb. mutáció nem ismert nem ismert nem ismert 4. exon, A226V
Ö rökletes Örökletes vasfelhalmoz ódás vasfelhalmozódás
Mi a probléma? Túl sok vas szívódik fel a szervezetbe.
+
A szervezet nem képes vasat leadni.
A vasfelesleg által okozott közvetlen szerv/szövetkárosodás: •májcirrhosis •diabetes mellitus, •hypophysis hipofunkció, •cardiomyopathia, •arthropathia, •bronzszínű bőrpigmentáció Előfordulási gyakoriság (prevalencia): 30/10000 kaukázusi férfi, 5/10000 nő
A ódás progresszi ója ööröklődő röklődő A vasfelhalmoz vasfelhalmozódás progressziója hemokromat ózisban az letkor ffüggvényében üggvényében hemokromatózisban az ééletkor
szérum ferritin (ng/ml)
Preszimptómás stádium
Szimptomatikus stádium Cirrhosis és a szervek funkciózavarai
1500
Progresszív szövetkárosodás 1000
Megnövekedett vasraktárak Emelkedett májvas koncentráció
500
Emelkedett transzferrin szaturáció Megnövekedett vasfelszívódás 10
20
30
40
50
60
év
(Powel et al.:Gut 1978.19.538 nyomán)
Az röklődő haemochromatosis épe Az ööröklődő haemochromatosis klinikai klinikai kképe Aspecifikus Aspecifikuskorai koraitünetek tünetek
Hepatomegalia Hepatomegalia Ízületi Ízületifájdalom fájdalom Fáradtság, Fáradtság,gyengeség gyengeség
Átlagos túlélés (%)
Késői Késői„specifikus” „specifikus”tünetek tünetek
Májcirrhosis Májcirrhosis Diabetes Diabetesmellitus mellitus Bronzszínű Bronzszínűbőrpigmentáció bőrpigmentáció
Átlag populáció
HH betegek
év a diagnózistól számítva
Ö rökletes vasfelhalmoz ódással jjáró áró kkórformák órformák Örökletes vasfelhalmozódással
Robson et al. 2004; J.Med.Genet.
A áttere A haemochromatosis haemochromatosis genetikai genetikai hháttere 1. típus: HFE C282Y 2. típus: hepcidin/hemojuvelin 3. típus: TFR2 4. típus: ferroportin 1 HFE fehérje szerkezete
aut.rec Betegek 64-100% aut.rec Szórványos aut.rec esetismertetések aut.dom HFE C282Y allélfrekvencia Európában 9-11 % 6-9 % 3-6 % 1,5-3 % 0,5-1,5 % 0-0,5 %
Feder JN et al.: Nat. Genet. 1996; 13:399
nincs adat
A én A HFE HFE ggén elt érése DNS - éés s eltérése DNSfeh érje szinten fehérje szinten
Kivizsg álási Kivizsgálási algoritmus algoritmus
Algorithm for screening for HFEassociated haemochromatosis. (LFT - liver function test; TS transferrin saturation.) Clin Biochem Rev. 2010 February;31(1):3-8.
A én C282Y ációjának kimutat ása A HFE HFE ggén C282Y mut mutációjának kimutatása PCR -RFLP m ódszerrel PCR-RFLP módszerrel 1. hasítatlan PCR termék 393 2. normál 3. heterozigóta 4. homozigóta 251 restrikciós enzim: Rsa I
142 112
1
2
3
4
Mut áció (SNP) ás val ós idej ű PCR -rel (all élMutáció (SNP)kimutat kimutatás valós idejű PCR-rel (alléldiszkrimin áció) diszkrimináció)
Homozigóta
Normál Heterozigóta
Negatív kontroll
MÓDSZER ELVE: • PCR + fluoriméter (pl. LC480), • minták gyors hőátadású kapilláris-ban amplifikálódnak, • szekvencia specifikus hibridizációs próbák alkalmazása, • specifikus PCR termék keletkezése-kor FRET jelenség • PCR után olvadáspont analízis → ALLÉL-DISZKRIMINÁCIÓ
