Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a hormonális szabályozó rendszer működésének kutatásában. Doktori értekezés. dr

Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a hormonális szabályozó rendszer működésének kutatásában Doktori értekezés dr. Gergics Péter Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Rácz Károly egyetemi tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók:

Dr. Erhardt Éva egyetemi adjuktus, Ph.D. Dr. Sebestyén Anna, tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke:

Dr. Gerendai Ida egyetemi tanár, az MTA doktora

Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Garami Miklós egyetemi docens, Ph.D. Dr. Kovács László Gábor főorvos, Ph.D. Budapest 2009

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke .................................................................................................... 5 I. Bevezetés (irodalmi háttér) ........................................................................................ 7 I. 1. Genetikai variánsok, polimorfizmusok és a hormonális szabályozó rendszer...... 8 I. 1.1. Génpolimorfizmusok vizsgálómódszerei ................................................... 11 I. 1.1.1 Restrikciós emésztés és restrikciós fragment hossz polimorfizmus....... 11 I. 1.1.2. Southern-féle hibridizálás (Southern-blot) .......................................... 12 I. 1.1.3. PCR – direkt DNS-szekvenálás .......................................................... 12 I. 1.1.4. Kvantitatív, valós-idejű (real-time) PCR alapú módszerek (qPCR, RTPCR, allélikus diszkrimináció) ........................................................................ 13 I. 1.1.5. SNP array ........................................................................................... 14 I. 1.2. Génpolimorfizmusok és a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg tengely működése................................................................................................ 15 I. 1.2.1. Glükokortikoid hatást befolyásoló polimorfizmusok........................... 15 I. 1.2.2. Glükokortikoid receptor gén polimorfizmusok klinikai jelentősége anyagcsere- és endokrin betegségekben........................................................... 17 I. 2. Génmutációk monogénes öröklődésű endokrin betegségekben......................... 18 I. 2.1. Génmutációk vizsgálómódszerei ............................................................... 19 I. 2.1.1. Egy vagy néhány nukleotidot érintő mutációk kimutatása................... 19 I. 2.1.2. Teljes vagy részleges gén deléciók kimutatása.................................... 21 I. 2.1.2.1. Klasszikus módszerek (kromoszóma sávtechnikák, kvantitatív Southern-blot, fluoreszcens in situ hibridizáció) .......................................... 22 I. 2.1.2.2. PCR alapú módszerek .................................................................. 23 I. 2.1.2.3. Denaturáló nagy felbontóképességű folyadék-kromatográfia (DHPLC)..................................................................................................... 23 I. 2.1.2.4. Kvantitatív, valós-idejű (real-time) PCR alapú módszerek (qPCR, RT-PCR) ..................................................................................................... 23 I. 2.1.2.5. Mikroszatellita marker (vagy short tandem repeat - STR) analízis 24 I. 2.1.2.6. Multiplex amplifikálható próba hibridizáció (MAPH).................. 24 I. 2.1.2.7. Multiplex ligációs próba analízis (MLPA) ................................... 24 I. 2.1.2.8. Komparatív genom-hibridizálás (CGH)........................................ 25

2

I. 2.1.2.9. Chip (array) módszerek................................................................ 25 I. 2.2. Gén-mutációk jelentősége familiáris tumor szindrómákban ....................... 29 I. 2.2.1. Örökletes phaeochromocytoma........................................................... 29 I. 2.2.1.1. von Hippel-Lindau szindróma...................................................... 30 II. Célkitűzések........................................................................................................... 33 III. Módszerek ............................................................................................................ 35 III. 1. A GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására új allél-specifikus PCR módszer kidolgozása ............................................................................................... 35 III. 1.1. Vizsgálati egyének, DNS-izolálás ........................................................... 35 III. 1.2. Specifikus oligonukleotid próbák (primerek) tervezése ........................... 35 III. 1.3. Allél-specifikus PCR kidolgozása........................................................... 37 III. 1.4. Az allélspecifikus PCR validálása restrikciós emésztéssel és direkt szekvenálással..................................................................................................... 37 III. 1.5. A GR gén Bcl I polimorfizmus populációs eloszlásának statisztikai analízise .............................................................................................................. 38 III. 2. A VHL gén vizsgálatára alkalmazott módszerek............................................ 38 III. 2.1. VHL-szindrómában szenvedő családok................................................... 38 III. 2.2. Látszólag sporadikus phaeochromocytomában szenvedő egyének........... 39 III. 2.3. VHL gén mutációk kimutatása................................................................ 40 IV. Eredmények.......................................................................................................... 44 IV. 1. A GR gén Bcl I polimorfizmus kimutatása új allél-specifikus PCR módszerrel ............................................................................................................................... 44 IV 1.1. Az új allél-specifikus PCR módszer eredményei...................................... 44 IV 1.2. Az új allél-specifikus PCR módszer eredményeinek validálása................ 45 IV 1.3. A GR gén Bcl I polimorfizmus populációs eloszlásának statisztikai analízise .............................................................................................................. 47 IV. 2. A VHL gén vizsgálatának eredményei........................................................... 48 IV. 2.1. VHL szindrómában szenvedő családok klinikai vizsgálatának eredményei ............................................................................................................................ 48 IV. 2.2. VHL szindrómában szenvedő családok genetikai vizsgálatának eredményei.......................................................................................................... 52

3

IV. 2.3. Látszólag sporadikus phaeochromocytomában szenvedő betegek klinikai és genetikai vizsgálatának eredményei................................................................. 54 V. Megbeszélés........................................................................................................... 58 VI. Következtetések.................................................................................................... 63 VII. Összefoglalás....................................................................................................... 65 VIII. Irodalomjegyzék................................................................................................. 67 IX. Saját publikációk jegyzéke.................................................................................... 82 X. Köszönetnyilvánítás ............................................................................................... 85

4

Rövidítések jegyzéke ACTH

adrenokortikotrop hormon

BMI

body mass index – testtömeg-index

Bp

bázispár

BRCA1

breast cancer 1 gene - öröklődő emlőrák 1 gén

DMD

Duchenne-féle izomdisztrófiáért felelős gén, disztrofin

C

citozin

cDNS

komplementer DNS

CGH

comparative genome hybridisation – komparatív genomhibridizáció

CNV

copy number variation – kópiaszám variáció

CRH

kortikotrop releasing hormon

CT

komputertomográfia

CYP21A2

szteroid-21-hidroxiláz

DNS

dezoxiribonukleinsav

dNTP

dezoxiribonukleotid-trifoszfátokat

DHPLC

denaturing high performance liquid chromatography - denaturáló nagy nyomású folyadékkromatográfia

F

forward (oligonukleotid próba)

FISH

fluorescent in situ hybridisation – fluoreszcens in situ hibridizáció

G

guanin

GAPDH

glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz gén

GR

glükokortikoid receptor

GRE

glükokortikoid reszponzív elem

HHM

hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg

HIF1α

hypoxia indukálta faktor 1α

IB

indexbeteg

LDL

low density lipoprotein – alacsony sűrűségű lipoprotein

LSP

látszólag sporadikus phaeochromocytoma

MAPH

multiplex amplifiable probe hybridisation - multiplex amplifikálható próba hibridizáció

MEN

multiplex endokrin neoplasia

5

MLPA

multiplex ligation probe amplification – multiplex ligációs próba amplifikáció

MR

mágneses rezonancia tomográfia

NF 1

neurofibromatózis 1-es típusa

PCR

polimeráz láncreakció

PGL

paraganglioma szindróma

pVHL

VHL protein – VHL-fehérje

R

reverse (oligonukleotid próba)

RET

rearranged during transfction gén

RFLP

restriction fragment length polymorphism - restrikciós fragment hossz polimorfizmus

RNS

ribonukleinsav

SDHX

szukcinil-dehidrogenáz X gének

SNP

single nucleotide polymorphism - egy nukleotidot érintő polimorfizmus

TRIS-HCl

trisz-(hidroximetil)-amino-metán-hidroklorid

TRH

tireotrop releasing hormon

TSH

tireotrop hormon

VHL

von Hippel-Lindau

6

I. Bevezetés (irodalmi háttér) A 20. század közepén született meg a biológiai jelenségek molekuláris szintű vizsgálataival foglalkozó új tudományterület, a molekuláris biológia, melyet a biokémia és a genetika közötti határterületnek is tartanak. A molekuláris biológia elsősorban olyan makromolekulák, folyamatok tanulmányozásával foglalkozik, amelyek a dezoxiribonukleinsav (DNS), a ribonukleinsav (RNS) és a fehérjék bioszintézisével, e biológiai folyamatok kölcsönhatásaival, szabályozó mechanizmusaival kapcsolatosak. A „nuklein” felfedezése 1868-ban Friedrich Miescher nevéhez kötődik, aki fehérvérsejtek magját vizsgálva proteázokkal és lipázokkal nem lebontható anyagot izolált (1). Később Levene 1919-ben élesztőgombában mutatta ki, hogy a nukleint foszfát, bázis és cukor alegységek építik fel (2). 1928-ban Griffith Pneumococcus törzsekkel folytatott kísérleteivel igazolta

a bakteriális genetikai információ

átvihetőségét, azaz a bakteriális transzformációt, mely a géntranszfer jelenlegi elméleti alapját képezi (3). Avery és munkatársainak kísérletei támasztották alá, hogy - a korábbi elképzelésekkel ellentétben - a genetikai információt nem fehérjék, hanem a DNS kódolja (4), végül a T4-fágokkal végzett kísérletek bizonyították, hogy a DNS maga az örökítő anyag (5). 1962-ben a DNS kettős-hélix modell első helyes leírásáért Watson, Crick és Wilkins megkapták az orvosi-fiziológiai Nobel-díjat (6). A biológiai jelentőséggel rendelkező makromolekulák kimutatására számos módszert fejlesztettek ki az 1950-es évek óta. A klasszikus módszerek közé a makromolekulák szétválasztására alkalmas különféle elektroforetikus eljárások tartoztak (gélelektroforézis, pulzációs elektroforézis, kapilláris elektroforézis). Szintén klasszikus módszereknek tartjuk a hibridizációs eljárásokat (Southern-, Northern-, és Western-féle hibridizálás (blot)), melyeknél úgynevezett jelölt próbákat alkalmaznak a kívánt DNS, RNS, illetve fehérje detektálására. Ezen minőségi analízisre alkalmas technikák mellett természetesen szükség volt egyéb módszerekre is, például azokra, melyek alkalmasak az egyes makromolekulák felsokszorozására, illetve módosítására. Ezek közül kiemelendő a polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction - PCR) és az expressziós klónozás, melyek forradalmasították a molekuláris biológiát (7). A polimeráz láncreakció

7

lehetőséget ad kiválasztott DNS szakasz sokszorozására. Az expressziós klónozás során egy jellemzően cirkuláris DNS láncba (plazmid, kozmid, fág, mesterséges élesztőkromoszóma) DNS szakasz beültetésével, majd annak élő sejtbe bejuttatásával annak expresszióját, végső soron a megfelelő fehérje termelődése váltható ki. Ezek a módszerek vezettek a rekombináns technológia kialakulásához, amely a rekombináns gyógyszerek, hormonok (inzulin, növekedési hormon, parathormon, stb.) megjelenését eredményezte.

I. 1. Genetikai variánsok, polimorfizmusok és a hormonális szabályozó rendszer A molekuláris biológiai vizsgálómódszereket ma már elterjeden kezdik alkalmazni a rutin klinikai gyakorlatban is (8). Monogénes öröklődésű betegségek esetén a betegség hátterében álló gén hibájának kimutatása jelenti a genetikai diagnosztikai feladatot. Poligénes öröklődésűnek tartott betegségekben a betegségre való hajlam nem egyetlen gén hibájával, hanem több génvariáns (polimorfizmus) együttes előfordulásával hozható összefüggésbe (9). A gén-polimorfizmusok a népesség legalább 1%-ában, de akár jóval nagyobb gyakorisággal is előfordulhatnak. Természetesen az öröklött hajlamot környezeti tényezők is módosíthatják. A betegség-okozó illetve a betegségre hajlamosító génhibák és gén-variánsok minőségi és mennyiségi szempontok szerint csoportosíthatóak. A részleteket illetően utalok egy interneten elérhető adatbázisra, például a Humán Gén Mutációs Adatbázisra (www.hgmd.org), illetve a jelenleg érvényes mutációs nevezéktanra (10). A DNS szintjén kimutatható hiba (mutáció) nem feltétlenül vezet betegség kialakulásához. Még egyértelmű klinikai kép esetén is szükséges az ok-okozati összefüggés bizonyításához a DNS mutáció által okozott mRNS (messenger RNS), illetve következményes fehérje elváltozás igazolása. Ismertek olyan genetikai variációk, ún. génpolimorfizmusok, amelyek a populáció 1, de akár 5-6 százalékában is előfordulnak. Ezek önmagukban nem okoznak betegséget, sokkal inkább genetikai hajlamosító tényezőként jönnek számításba. Ilyen eltérések lehetnek a jellemzően egyetlen nukleotidot érintő polimorfizmusok, angol rövidítésük alapján SNP-k (single nucleotide polymorphism). Az egyes SNP-ket gyakran nem önmagukban, hanem más

8

SNP-kel együtt vizsgálják. Több SNP előfordulását együttesen vizsgálva egy populációban,

akkor

léteznek

olyan

egyének,

akik

azonos

SNP-mintázattal

(haplotípussal) rendelkeznek. A haplotípus analízis a genotípus – fenotípus összefüggések vizsgálatakor nyújthat nagy segítséget, mely a poligénes öröklődésűnek tartott betegségek esetén, mint az érelmeszesedés, vagy éppen a diabetes mellitus különösen fontos. Az endokrin rendszer működése endokrin, parakrin, illetve autokrin módon kiválasztódó hormonok hatása révén valósul meg. A hormontermelő szervek és szövetek közvetlen, vagy közvetett módon állandó kölcsönhatásban állnak egymással. A szabályozó mechanizmusok gyakran úgynevezett „tengelyek” mentén valósulnak meg. Ez az elrendeződés jellemző a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg (HHM), a hypothalamus-hypophysis-pajzsmirigy,

vagy

a

hypothalamus-hypophysis-gonád

tengelyekre is. A hypothalamusban termelt kortikotrop releasing hormon (CRH) serkenti a hypophysisben az adrenokortikotrop hormon (ACTH) elválasztását, amely a mellékvesekéreg működését serkenti, és ezzel az egyik véghormon, a kortizol elválasztását fokozza. A kortizol emelkedett szérumszintje visszacsatolásos módon (feed-back) gátolja mind a CRH, mind az ACTH termelődését. Ehhez hasonló működési rendszer valósul meg a tireotrop releasing hormon (TRH) - tireotrop hormon (TSH) tiroxin elválasztásakor a hypothalamus-hypophysis-pajzsmirigy tengelyben. E tengelyek egymással is kölcsönhatásban állnak. Ismert például, hogy a TRH a fent részletezett szerepe mellett befolyásolja a hypophysisben a prolaktin elválasztását is. Ezért van az, hogy a pajzsmirigy csökkent hormontermelése miatt emelkedett TRH szint hyperprolactinaemiához is vezet. Az endokrin rendszer kóros működése kötődhet az adott hormon csökkent, vagy fokozott termelődéséhez, illetve a célszövet megváltozott válaszképességéhez (11). Utóbbi esetben a célszerv, célszövet sejtjeinek csökkent vagy fokozott érzékenysége, azaz rezisztencia vagy túlérzékenység áll fenn. A hormon rezisztencia több klinikai példája ismert. Ilyen a Laron-típusú törpeség ahol a növekedési hormonnal szembeni rezisztencia, vagy egyes mentális és szomatikus fejlődési rendellenességek ahol ritkán a TSH, vagy a tiroxin iránti

9

rezisztencia áll a betegség hátterében (12-14). A legtöbb hormon jelenléte az élethez alapvetően szükséges, ezért az adott hormon iránti abszolút rezisztencia az élettel sok esetben összeegyeztethetetlen. A glükokortikoidok iránti érzékenység megváltozása a glükokortikoidokkal kezelt betegségeknél igen gyakran megfigyelt jelenség. Az immunszupresszív terápia részeként egyes autoimmun betegségek, mint a gyulladásos bélbetegségek (Crohnbetegség, colitis ulcerosa), ízületi betegségek (rheumatoid arthritis, Bechterew-kór), bőrbetegségek (pemphigus, psoriasis, kontakt dermatitis), légzőszervi betegségek (asthma bronchiale, krónikus bronchitis), autoimmun hepatitis, poliszisztémás autoimmun

kórképek

(szisztémás

lupus

erythematosus,

Sjögren-szindróma,

polymyositis, dermatomyositis) kezelésében, valamint daganatellenes kemoterápia során is gyakran alkalmaznak glükokortikoidokat. Az említett kórállapotokban a szükséges immunszupresszív hatás eléréséhez szükséges glükokortikoid dózis nagyon gyakran egyéni varianciát mutat. Egyes betegeknél már az átlagosnál jelentősen kisebb, míg másoknál az átlagosnál jelentősen nagyobb glükokortikoid dózisok hatására érhető csak el az adott betegség remissziója. Ennek ellenére a glükokortikoid rezisztencia hátterében csak néhány esetben sikerült egyértelműen betegségokozó mutációk kimutatása. A glükokortikoid receptor (GR) génben létrejövő súlyos funkcionális károsodást (teljes rezisztenciát) okozó mutációk a glükokortikoidok generális hatásait figyelembe véve homozigóta formában igen nagy valószínűséggel intrauterin elhaláshoz vezetnek. Funkcionálisan kevésbé súlyos következménnyel (részleges rezisztencia) járó mutációkat eddig csak néhány családnál sikerült igazolni (15-17). Ennek alapján logikusan felmerül a kérdés, hogy mi áll az eltérő, egyéni válaszképesség hátterében? A jelenlegi legelfogadottabb nézet szerint a glükokortikoidok iránti egyéni, esetleg szervspecifikus érzékenység kialakításában a GR gén polimorfizmusai, illetve az egyes GR izoformák expressziója játszhatnak jelentős szerepet (18, 19).

10

I. 1.1. Génpolimorfizmusok vizsgálómódszerei I. 1.1.1 Restrikciós emésztés és restrikciós fragment hossz polimorfizmus Az SNP-k vizsgálatának első módszere a restrikciós enzim emésztés volt. A restrikciós endonukleáz enzimek palindrom (a DNS két láncán oda-vissza olvasva megegyező

bázissorrendet

tartalmazó)

szekvenciákat

ismernek

fel,

melynek

megfelelően képesek a DNS-lánc kettéhasítására. Ez a módszer abban az esetben alkalmazható, ha a vizsgált SNP egy restrikciós helyet tesz tönkre, vagy hoz létre. Ebben az esetben egy adott DNS szakaszon a restrikciós enzim csak ott lesz képes hasítani a DNS-t, ahol a felismerő helye épen fellelhető. Például a GR gén Bcl I polimorfizmusa, mely az intron B-ben 646 nukleotid távolságra található 3’-irányban a 2. exon után, egy citozin –guanin (C-G) szubsztitúcióhoz köthető, amely a restrikciós hely megszűnését okozza (1. ábra) (20-27). A polimorfizmus első leírása, elnevezése gyakran a restrikciós enzim neve után történik (Bcl I: Bacillus caldolyticus baktérium által termelt enzim) (28).

1. ábra A Bcl I restrikciós enzim felismerő helye és a polimorfizmus okozta hasítóhely megszűnése. A restrikciós fragment hossz polimorfizmus (angol nevén restriction fragment length polymorphism – RFLP) vizsgálat során hagyományosan teljes genomiális DNS-t használnak és a restrikciós enzimmel emésztés után gélelektroforézissel választják szét a DNS-fragmentumokat. A kapott fragmentum mintázat az egyénre jellemző.

11

I. 1.1.2. Southern-féle hibridizálás (Southern-blot) A Southern-féle hibridizálás, azon alapul, hogy a gélelektroforézissel méret szerint szétválasztott és vizsgálómembránra áthelyezett DNS-t a vizsgálandó DNSszakaszra specifikus radioizotóppal jelölt oligonukleotid próbával hibridizálják, majd a próba DNS-hez kötődését autoradiográfiával jelenítik meg. Elsősorban restrikciós enzim felismerőhelyet érintő mutációk, mint például a GR gén Bcl I polimorfizmusának azonosítására alkalmazzák (29-35). I. 1.1.3. PCR – direkt DNS-szekvenálás Napjainkban a genetikai diagnosztika egyik leggyakoribb vizsgálómódszere az adott gén bázis-sorrendjének meghatározása, amelyet rendszerint direkt DNSszekvenálással végeznek. Ennek során perifériás vér fehérvérsejtekből kivont genomiális DNS mintában a vizsgálni kívánt gént vagy gén-szakaszt polimeráz láncreakcióval (PCR) sokszorozzák, majd DNS szekvenáló automatával meghatározzák a DNS bázissorrendjét. A kapott eredményt referencia-szekvenciákhoz hasonlítják, így a direkt DNS-szekvenálással az SNP-k is meghatározhatóak. A DNS szakasz bázissorrendjének azonosítására több, az alkalmazott kémiai módszer szerint különböző módszert fejlesztettek ki: Sanger-féle didezoxi-, avagy láncterminációs szekvenálást, a Maxam-Gilbert-féle

limitált

hasításos

szekvenálást,

a

Nyren-

Ronaghi-féle

piroszekvenálást, valamint legújabban az ún. egy-molekula szekvenálást (singlemolecule sequencing) (36). A szekvenálás eredményeként az egymás után következő nukleotidok sorrendjét (G: guanin, A: adenin, T:timin, C: citozin) és a hozzájuk tartozó jelerősséget elemezzük. A kiértékelés könnyítésére színkódolt kromatogram formájában jelenítjük meg az eredményt (2. ábra). Az ivarsejtekkel ellentétben, a testi sejtekben diploid kromoszómakészlet található, és az autoszomális génekből egy anyai és egy apai, azaz összesen két allél (két kópia) áll rendelkezésre. Ha a két allélon az adott nukleotid pozícióban eltérő nukleotid szerepel (heterozigóta genotípus), akkor a kromatogramban egyszerre két különböző nukleotidnak megfelelő, szemikvantitatív módon kissé csökkent intenzitású jel detektálható (2. ábra). Ha mindkét allélon az adott

12

nukleotid pozícióban azonos nukleotid szerepel, akkor a kromatogramban egyszerre csak egy nukleotidnak megfelelő jel detektálható (homozigóta genotípus).

2. ábra Egészséges és heterozigóta C→G pontmutációt hordozó egyének DNS-szekvenálással kapott kromatogramjának részlete. (RET protoonkogén 11. exon, középen a 634-es kodon, mely a multiplex endokrin neoplázia 2A típusában a mutációk által leggyakrabban érintett kodonnak felel meg). A: Egészséges; B: Cisztein- triptofán aminosav cserével járó heterozigóta TGC-TGG mutáció

I. 1.1.4. Kvantitatív, valós-idejű (real-time) PCR alapú módszerek (qPCR, RT-PCR, allélikus diszkrimináció) A valós-idejű PCR a fluoreszcens fotometria és a PCR együttes alkalmazásán alapul. A PCR termociklusokban keletkező DNS szálak mennyiségével arányosan növekvő floreszcens fényintenzitást detektálnak az idő függvényében (ún. valós időben). A két leggyakrabban alkalmazott kémiai módszer a SYBRGreen, illetve a TaqMan eljárás. A SYBRGreen floureszcens festék a PCR során keletkező kettős DNSszálakhoz kötődik. A festék kötődése nem specifikus ugyan, de a PCR során a sokszorozáshoz használt specifikus próbák miatt a vizsgált DNS szakaszból keletkezik a legnagyobb mennyiségben. Ennek alapján nyilvánvaló, hogy ennél a kémiai módszernél

13

a primerek megtervezése kulcsfontosságú. A TaqMan-próbák olyan floureszcens jelöléssel ellátott oligonukleotidok, amelyek csak akkor válnak gerjeszthetővé fénnyel, amikor a megfelelő, komplementer DNS-szakasszal kötésbe kerülnek. A TaqMan módszer alkalmazása esetén különböző fluoreszcens jelölésű, ezáltal különböző emissziós spektrumú, nagy specificitású próbák felhasználásával - a detektor spektrális érzékenységétől függően - egyszerre akár több lókusz is vizsgálható azonos időben. Az alkalmazott kontrolloktól és a bioinformatikai adatfeldolgozástól függően a mért értékek abszolút vagy relatív mennyiségeket jelezhetnek; pontos moláris mennyiségű kontroll templát DNS-hez viszonyítás esetén meghatározható a vizsgált PCR termék abszolút mennyisége, míg a PCR termék mennyiségének relatív mérésekor az eredményeket azonos mennyiségű mintában mért más géntermék mennyiségéhez viszonyítják. A PCR termék mennyiségének relatív mérése kiválóan alkalmas SNP-k vizsgálatára, ugyanis a polimorf és vad allélra specifikus TaqMan próbák használatával a homozigóta és heterozigóta genotípusok jól elkülöníthetők (allélikus diszkrimináció). A GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására is széles körben alkalmaztak specifikus TaqMan-próbákat (20-23, 37, 38). Nagy mintaszám, illetve nagy SNP szám esetén ezt az eljárást SNP-stream-nek is nevezik, melyet főleg farmakogenomikai vizsgálatokban alkalmaznak (39). A módszer talán egyetlen hátrányának tekinthető, hogy a valós idejű PCR készülék, illetve a TaqMan-próbák költségesek.

I. 1.1.5. SNP array Léteznek olyan, integrált rendszerek, melyben szilíciumlapka meghatározott koordinátáin az adott SNP-allélokra specifikus fluoreszcens próbák helyezkednek el. A mintában

található

DNS

fragmentumok

a

polimorfizmusoknak

megfelelően

hibridizálnak az array felületén, ahonnan a fluoreszcens jel a koordinátáknak megfelelően leolvasható. Ilyen módon egyetlen mintában akár több ezer SNP is vizsgálható és az RFLP mintázathoz hasonlóan SNP térképek hozhatók létre (Affymetrix, Illumina array).

14

I. 1.2. Génpolimorfizmusok és a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg tengely működése Az emberi szervezetet érő stresszhatások a hypothalamus közvetítésével a hypophysis-mellékvesekéreg tengely aktiváltsági szintjét változtatják meg. Ennek eredményeként a véghormonnak tekintett kortizol szérumszintje megnő. A kortizol szinte minden szövetben jelentős hatással bír. A kortizol a GR-on fejti ki a hatását. A GR döntően intracellulárisan, kisebb mennyiségben a sejtmembránban található meg. A glükokortikoidok klasszikus hatásaiért az intracelluláris receptorok felelősek, melyek hősokk fehérjékhez való kötődésükből felszabadulva dimerizált formában a hormont megkötve kapcsolódnak a DNS glükokortikoid reszponzív eleméhez. Teoretikusan a glükokortikoidok a mineralokortikoid receptorokhoz is képesek kötődni, azonban a mineralokortikoid érzékeny sejtekben a 11-béta-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim az aktív kortizolt kortizonná inaktiválja, ezért ép enzimműködés mellett a kortizol általi mineralokortikoid receptor aktiváció elmarad. A GR gén (génazonosító: NR3C1) az 5. kromoszóma 5q31-es lókuszán található és számos transzkripciós faktor átíródására permisszív hatású. A gén több polimorfizmusa ismert, melyek egy része exonikus (N363S, ER22/23EK), míg más része intronikus (Bcl I) elhelyezkedésű, vagy éppen a promoter régióban található (TthIII I). I. 1.2.1. Glükokortikoid hatást befolyásoló polimorfizmusok A glükokortikoidok iránti érzékenység az egészséges populációban is variabilitást mutat (40). Az utóbbi két évtizedben több GR gén SNP-vel kapcsolatban kimutatták, hogy részleges szerepük van a glükokortikoidok iránti érzékenység változatosságában (3. ábra) (19). Az ER22/23EK polimorfizmus enyhe glükokortikoid rezisztenciával, valamint a muszkuláris jellegű fenotípussal mutatott összefüggést (41, 42). Feltételezik, hogy ez a hatás annak köszönhető, hogy a GR-A fehérje izoformából több keletkezik, melynek az ER22/23EK jelenléte esetén kisebb a transzkripciót serkentő hatása (43). Az N363S és a Bcl I polimorfizmusok esetén fokozott glükokortikoid érzékenységgel magyarázható eltéréseket, például nagyobb testtömeg-

15

indexet találtak (19). Az intron B-ben található Bcl I polimorfizmus esetén a legelfogadottabb feltételezés, hogy GR gén transzkripciója során a polimorfizmus a promoter régióval kerül térközelbe és így befolyásolja a transzkripció folyamatát (19). A GR gén promoterében található TthIII I polimorfizmust elsőként 1991-ben írták le (44). Ez a polimorfizmus önmagában nem okoz változást a glükokortikoid érzékenységben, ugyanakkor más polimorfizmusokkal együttes előfordulása esetén a haplotípust a glükokortikoidok iránti érzékenységet befolyásoló tényezőként tartják számon (20). Bár nem polimorfizmus, de meg kell említeni a GR-béta fehérje izoformát is, mely ligandkötésre ugyan nem képes, ugyanakkor a GR-alfa izoformával verseng a transzaktivációs helyhez (GRE) való kötődésért. A GR-béta fehérje nem képes a transzaktiváció kiváltására és ezért gátolja a GR-alfa izoformához kapcsolódó valódi glükokortikoid hatást (45).

3. ábra A GR leggyakrabban vizsgált polimorfizmusainak elhelyezkedése a GR génben. (A számok az egyes exonokat jelölik. J: junkcionális régió)

16

I. 1.2.2. Glükokortikoid receptor gén polimorfizmusok klinikai jelentősége anyagcsereés endokrin betegségekben A GR gén polimorfizmusok lehetséges klinikai jelentőségét több tanulmányban vizsgálták. Munkacsoportunk is több vizsgálatot végzett az N363S, a Bcl I és az ER22/23EK

polimorfizmusok

előfordulásával

kapcsolatban

különböző

betegcsoportokban. Mellékvese incidentalomában szenvedő betegekben az N363S polimorfizmus gyakrabban fordult elő kétoldali mellékvese tumoros betegekben, mint egyoldali tumoros esetekben, vagy a kontroll csoportban (46). Ennek alapján feltételezhető,

hogy az N363S polimorfizmusnak szerepe lehet a

kétoldali

incidentalomák patogenezisében. Luczay és munkatársai congenitalis adrenalis hyperplasia nem klasszikus formájában ritkábbnak találták az N363S polimorfizmus előfordulását, melyet azzal magyaráztak, hogy a fokozott glükokortikoid érzékenység kompenzálja az enzimdefektus egyébként jelentősebbnek várt virilizáló hatását (47). Graves-kórban szenvedő endokrin ophthalmopathias betegekben enyhébb klinikai manifesztáció esetén gyakoribb volt a Bcl I polimorfizmus előfordulása, mint a súlyosabb fenotípus esetén. Ennek oka az endogén glükokortikoidok fokozottabb hatásával magyarázható az érzékenyítő jellegű Bcl I polimorfizmus jelenléte miatt (48). Egészséges terhes nőkben az ER22/23EK polimorfizmus jelenléte védőfaktornak bizonyult a terhesség alatti jelentős testsúly, illetve testömeg-index (BMI) növekedéssel szemben (49). Endogén glükokortikoid túltermeléssel járó állapotokban a Bcl I polimorfizmus homozigóta jelenléte alacsonyabb csontsűrűséggel járt, mint homozigóta vad genotípus esetén (50). A nemzetközi szakirodalomban számos egyéb vizsgálat alátámasztja a GR gén Bcl I polimorfizmus klinikai jelentőségét. A fokozott glükokortikoid érzékenység és a Bcl I polimorfizmus közötti kapcsolatot több tanulmányban megerősítették (21, 33). Így összefüggést mutattak ki a Bcl I polimorfizmus és az antropometriai paraméterek, nagyobb csípő-derék arány, nagyobb BMI, a hasi, illetve visceralis obesitas, a metabolikus szindróma, emelkedett szérum alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) koleszterin szint és az inzulinrezisztencia között (23, 29-31, 34, 35, 51).

17

Akut lymphoblastos leukaemia miatt glükokortikoidokat is tartalmazó kemoterápiás protokollal való kezeléskor összefüggést találtak az előnyösebb relapsus ráta és a homozigóta Bcl I genotípus előfordulása között (22). A megváltozott glükokortikoid érzékenységnek szerepe lehet a HHM-tengely rendellenes működésében is (32), a krónikus pszichoszociális stresszre adott HHMtengely válaszreakcióban, a poszttraumás stressz, a sclerosis multiplex, a rheumatoid arthritis, és a gyermekkori nephrosis szindróma kialakulásában (25-27, 37, 38).

I. 2. Génmutációk monogénes öröklődésű endokrin betegségekben Az örökletes endokrin és anyagcsere rendellenességek között nagyszámú monogénes, azaz egy gén hibájához kötődő betegséget tartanak számon. A legtöbb metabolikus enzim defektusa monogénes és jellemzően autoszomális recesszív módon öröklődik, mint például fenilketonuriában a fenilalanin-hidroxiláz géné. Az endokrinológia területén az enzimeket érintő örökletes zavarok közül a szteroidhormonok szintézisében részt vevő enzimek, mint például a 21-hidroxiláz, vagy az 5-alfa-reduktáz defektusai a legismertebbek, melyek az enzimeket kódoló gének veleszületett hibájával állnak összefüggésben. Más esetekben a hormonokat kódoló gének (parathormont kódoló gén mutáció hypoparathyreosis egyes formáiban), a hormon-szállító

fehérjéket

(pl.

tiroxinkötő-globulin)

kódoló

gének,

a

membránreceptorokat kódoló gének (pl. növekedési hormon receptort kódoló gén mutációja Laron-típusú törpeségben), vagy éppen az intranukleáris receptorokat kódoló gének (D-vitamin receptort kódoló gén D-vitamin-rezisztens rachitisben) mutációi fordulnak elő (52). Az endokrin tumorok hátterében álló génmutációk kiemelkedő jelentőséggel bírnak. Növekedési hormont termelő hypophysistumorokban nagy arányban mutatható ki gsp onkogén mutáció, míg a legáltalánosabbnak tekintett protoonkogén, a p53 mutációját mellékvesekéreg carcinomában mutatták ki (53). A daganatsejtekben kialakuló

szomatikus

gén-eltérések

kutatása

mellett

az

öröklődő

endokrin

tumorszindrómák (von Hippel-Lindau-szindróma, multiplex endokrin neoplasia 1, 2A

18

és 2B típusa, familiáris paraganglioma szindróma) hátterében álló csirasejtes génhibák kutatása is kiemelkedő jelentőségűvé vált. I. 2.1. Génmutációk vizsgálómódszerei I. 2.1.1. Egy vagy néhány nukleotidot érintő mutációk kimutatása A génmutációk és polimorfizmusok gyakorisága közötti különbséget a korábbi fejezet ismertette. A génmutációk lehetnek egy vagy több nukleotidot érintő nukleotidcserék, splice hely mutációk (exon - intron, azaz kódoló és nem kódoló régiók határán található mutációk), rövidebb-hosszabb szakaszt érintő inszerciók, deléciók, komplex átrendeződések, repeat mutációk. Az aminosav cserével járó szubsztitúciós mutációkat missense, míg az aminosavról stop-kodonra cserélő mutációkat nonsense mutációknak nevezzük. Az ismert endokrin tumorszindrómák esetén tipikusan egy gén mutációja okozza a kórképet, azon belül is jellemzően egy nukleotidot érintő szubsztitúciók, illetve rövidebb-hosszabb szakaszt érintő deléciók a gyakoriak. Több gén esetén a mutációk egyes génszakaszokon gyakrabban fordulnak elő (mutációs hot spot). A VHL, a RET (rearranged during transfection) és a SDHX (szukcinildehidrogenáz X) gének esetén ismert mutációs hot spotok döntően szubsztitúciók, illetve deléciók (1. táblázat). 1. táblázat Endokrin tumorszindrómák hátterében álló génmutációk eloszlása a Humán Gén Mutációs Adatbázis (www.hgmd.org) alapján. (*: komplex átrendeződés, repeat mutáció, szabályozóhely mutáció, MEN1: multiplex endokrin neoplázia 1-es típusáért felelős gén, RET: rearranged during transfction gén, SDHX: szukcinil-dehidrogenáz X) Deléció Gén

Szubsztitúció

Splice hely

Inszerció

Kis

Nagy

deléció

deléció

Egyéb*

összesen

együtt (összes százaléka)

VHL

175

17

38

65

23

8

326

88 (27)

MEN1

186

27

57

124

16

19

429

140 (33)

RET

166

23

6

12

2

16

225

14 (6)

SDHX

83

16

13

30

4

3

150

34 (23)

19

A szubsztitúciós és splice hely mutációk, illetve a kisebb deléciók és inszerciók kimutatására a PCR-t követő direkt DNS szekvenálást alkalmazzák a leggyakrabban. Figyelni kell arra, hogy a vizsgálandó gén esetében nagy deléció is előfordulhat, mert a direkt szekvenálással kapott eredményt hibásan értékelhetjük (4. ábra). Figyelembe kell venni, hogy ha a vizsgált génnek csak egyetlen allélja van jelen (hemizigóta) a DNS-izolálás, a PCR és a DNS-szekvenálás eredményesen elvégezhető, de a szekvenálás a homozigóta formának megfelelő képet mutat. A vizsgálat tehát nem ad felvilágosítást arról, hogy a DNS minta hány allélt (kópiát) tartalmaz (teoretikusan egy, kettő, vagy akár kettőnél több allél is előfordulhat). Ez összecseng azzal az alapvető megfigyeléssel, hogy a PCR során a primerek nem tesznek különbséget az egyes allélpárok között, mindkettőhöz azonos arányban képesek hozzákötődni. DNSszekvenálással jelenleg legfeljebb 700 bp hosszúságú szakaszról nyerhetünk megbízható információt, melyet a vizsgálat felbontóképességének tekintünk. Ha a mintában a vizsgálandó DNS-szakasz teljesen hiányzik (nulla allél, mindkét allél deléció), akkor a DNS-szeparációja sikeres, de felsokszorozandó génszakasz hiánya miatt a PCR eredménytelen és a DNS-szekvenálás is sikertelen (4. ábra).

20

4. ábra A DNS-szekvenálás alkalmatlan módszer a nagy géndeléciók kimutatására.

Természetesen az SNP diagnosztikánál ismertetett restrikciós emésztés, Southern-féle hibridizáció, TaqMan kémiát alkalmazó valós idejű PCR, illetve array módszerek nagy génszakaszt érintő deléciók esetén is használhatók. Ugyanakkor a mutációnak megfelelő restrikciós enzim hasítási hely, vagy megbízhatóan alkalmazható specifikus komplementer DNS (cDNS) vagy TaqMan-próba hiánya esetén ezek a módszerek nem alkalmazhatóak. E módszerek közös jellemzője az is, hogy csak meghatározott, ill. előzetesen ismert mutációk kimutatására alkalmasak. Új mutáció felfedezésére bizonyos esetekben a direkt szekvenálás alkalmas lehet, ugyanakkor nagy géndeléció kimutatására más módszerek szükségesek. I. 2.1.2. Teljes vagy részleges gén deléciók kimutatása A genetikai variabilitás egyik nem ritka formája az adott gén vagy DNS szakasz nagy részére vonatkozó ún. kópiaszám variáció (CNV), mely legalább 1000 bázispárt

21

érint (Database of Genomic Variants: http://projects.tcag.ca/variation/). A humán genom

kb.

12%-a

kópiaszám

variációt

tartalmaz

(54).

A

gén-kópiaszám

megváltozásának betegség-okozó vagy betegségre hajlamosító szerepe is lehet. A Duchenne- és Becker-féle izomdisztrófia, a Prader-Willi szindróma és számos egyéb betegség a kóros gén-kópiaszámmal hozható összefüggésbe (55, 56). Külön csoportnak tekintik azokat a gén-hibákat, amikor az adott génnek egy jelentősebb szakasza hiányzik (>100, de rendszerint <1000 bázispár). Az ilyen eseteket ún. nagy géndelécióknak nevezzük, szemben a kisszámú nukleotid hiányával jellemzett ún. kis (mikro) géndeléciókkal (57). A monogénesen öröklődő betegségek jelentős része nem csak a betegség-okozó gén csírasejtes pont-mutációjával, hanem a gén teljes vagy részleges csírasejtes deléciójával is összefügghet. A szomatikus nagy géndeléciók különösen a tumor szuppresszor gének esetében bírnak kiemelt jelentőséggel (Knudsonféle kettős sérülés hipotézis). Elsősorban nagy metabolikus aktivitású daganatok, ill. izombetegségek esetében akár a mitokondriális DNS-ben is nagy géndeléciók ill. CNV-k lehetnek jelen (58). I. 2.1.2.1. Klasszikus módszerek (kromoszóma sávtechnikák, kvantitatív Southern-blot, fluoreszcens in situ hibridizáció) A nagy géndeléciók kimutatására alkalmas legelső genetikai módszereket az 1970-es években dolgozták ki. A legkorábbi módszerek közé az ún. kromoszómasávtechnikák tartoztak, amelyek a kromoszómák szintjén mutatták ki azok eltéréseit. Az izolált kromoszómakészletet tárgylemezen Giemsa-festékkel festették és mikroszkóp alatt vizsgálták a kromoszómaszerelvény G-sáv mintázatát. A kromoszómasávtechnikák (G-, R-, C-, T-, Q-sáv) felbontóképessége 5-10 megabp (59) és alkalmazásuk pl. a myelodysplasiás szindrómák diagnosztikájában még napjainkban is fontos (60). A géndózis pontosabb meghatározása a Southern -blot továbbfejlesztett változatával is lehetséges (kvantitatív Southern-blot). A fluoreszcens oligonukleotid próbák kifejlesztése lehetővé tette az interfázisban vagy metafázisban levő intakt sejtek vizsgálatát (fluoreszcens in situ hibridizáció, FISH). Ezzel a módszerrel akár több lókusz egy időben is vizsgálható (multiplex FISH, spektrális kariotípus-analízis, digitális kariotípizálás) (61). Bizonyos esetekben a módszerrel nemcsak a nagy

22

géndeléciók, hanem a génduplikációk és génáthelyeződések (transzlokációk) is kimutathatóak. A Southern-blot és a FISH felbontása a sávtechnikákéval megegyező. I. 2.1.2.2. PCR alapú módszerek Homozigóta nagy géndeléció kimutatására a legegyszerűbb PCR-alapú módszer, ha a deléció helyének ismeretében a PCR vizsgálathoz olyan oligonukleotid próbákat alkalmazunk, amelyek a templát DNS-láncon csak akkor kerülnek a fragmentumszintézishez megfelelő térközelbe, ha a köztes szakasz homozigóta deléció következtében hiányzik (62). A szteroid-21-hidroxiláz (CYP21A2) gén homozigóta deléciójának (és a leggyakoribb homozigóta és heterozigóta mutációinak) vizsgálatára megbízható, gyors és egyszerűen kivitelezhető PCR alapú módszert dolgoztak ki (63), melynek továbbfejlesztett változata hazai munkacsoportok tevékenységéhez kötődik (64, 65). I. 2.1.2.3. Denaturáló nagy felbontóképességű folyadék-kromatográfia (DHPLC) A

nagy

felbontóképességű

folyadék-kromatográfia

(HPLC)

alkalmas

fluoreszcens jelölés nélküli PCR termékek hatékony szétválasztására és mennyiségének meghatározására. Reverz fázisú (RP) HPLC során a denaturált (D) PCR terméket nagy nyomású folyadékot tartalmazó oszlop segítségével szétválasztják, majd a kontroll mintához való hasonlítással határozzák meg a DNS fragmentum mennyiségét (D(RP)HPLC). A módszerrel a DNS fragmentumok kicsiny méret- és jelintenzitásbeli eltérései is detektálhatók, ezért egy gén több exonjának egyidejű vizsgálatára is alkalmazható (66). I. 2.1.2.4. Kvantitatív, valós-idejű (real-time) PCR alapú módszerek (qPCR, RT-PCR) A valós idejű PCR alkalmazásakor a nagy géndeléciók kimutatására a SYBRGreen, illetve a TaqMan kémiát használó módszerek is alkalmasak. SYBRGreenmódszerrel egész exonokat amplifikálva megállapítható az exon kópiaszáma. Saját vizsgálataimban ezzel a módszerrel von Hippel-Lindau-szindrómában szenvedő 7

23

család tagjai közül két családban mutattam ki a VHL gén 1-1 exonját érintő nagy géndeléciót (67). I. 2.1.2.5. Mikroszatellita marker (vagy short tandem repeat - STR) analízis A mikroszatelliták 2-6 nukleotidból álló, ismétlődően jelenlevő DNS szakaszok (68,

69).

Adatbázisokból

elérhető

próbák

segítségével

(UNISTS;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists) az adott gént környező szakasszal együtt sokszorosítva a kromoszómarégióra specifikus polinukleotid lánc keletkezik. Kapilláris elektroforézissel szétválasztás során megállapítható a mikroszatellita marker jelenléte, illetve kópiaszáma. Az összesen mintegy hétezer mikroszatellitával átlagosan 100 kilobázis méretű kromoszóma szakaszok kópiaszámáról nyerhetünk adatokat (70). A módszer fő hátránya, hogy csak olyan régióról szolgáltat eredményt, amelyeken heterozigóta mikroszatellita marker található (informatív marker), illetve két közeli mikroszatellita marker deléciója esetén valószínűsíthető a köztes szakasz deléciója. I. 2.1.2.6. Multiplex amplifikálható próba hibridizáció (MAPH) A denaturált DNS-t nylon-membránon való immobilizálást követően különböző hosszúságú specifikus próbákkal hibridizálják. A próbák a kópiaszámmal arányosan kötődnek a templát DNS-hez; a hibridizált próbák később PCR-rel sokszorosíthatók és elektroforézissel elválaszthatóak (71). I. 2.1.2.7. Multiplex ligációs próba analízis (MLPA) A

módszer

elve

a

MAPH-hoz

nagymértékben

hasonló,

azonban

a

hibridizáláshoz a próbát kettéhasított állapotban adják hozzá a denaturált, szolúbilis DNS-hez, majd ligáz segítségével az illeszkedő végeket összekapcsolják. A ligáz csak kettősszálú DNS esetén, a próba és a denaturált DNS pontos összekapcsolódásakor működik (72). Mind a MAPH, mind az MLPA akár 40 lókusz egyidejű vizsgálatára alkalmas és mindkét módszer jelentősen nagyobb felbontással bír, mint a mikroszatellita marker analízis. Alkalmasak olyan nagyméretű gének hatékony vizsgálatára, mint a

24

neurofibromatosis 1. típusáért felelős gén (NF1, 60 exon), a Duchenne-féle izomdisztrófiáért felelős gén (DMD, 79 exon), vagy az öröklődő emlőrák 1-es génje (BRCA1, 24 exon). Saját vizsgálataimban von Hippel-Lindau-szindrómában szenvedő családok tagjaiban a VHL gén nagy szakaszát érintő deléciókat ezzel a módszerrel is vizsgáltam. I. 2.1.2.8. Komparatív genom-hibridizálás (CGH) A komparatív genom-hibridizálás a FISH módszerhez hasonlít (73, 74). A vizsgálat során két különböző fluoreszcens jelöléssel ellátott, azonos mennyiségű egészséges kontroll (pl. Cot 1 DNS) és vizsgálandó minta teljes genom DNS-t hibridizálnak tárgylemezen rögzített egészséges metafázisos kromoszómákkal. A fluoreszcens fragmentumok a kópiaszámtól függően kapcsolódnak a kromoszómákhoz. Azokon a kromoszómaszakaszokon, ahol a kétféle jelölésű templátok kiegyenlítetten hibridizálnak a fluoreszcens jelek aránya azonos (=1). Ha a vizsgált mintában a genom fragmentumai intenzívebb fluoreszcens jelet adnak (relatív hányados >1,2), mint az egészséges kontrollok fragmentumai, akkor a vizsgált genom megfelelő szakaszán kópia többlet állapítható meg, míg a kevésbé intenzív jel (relatív hányados <0,85) a vizsgált szakaszon kópia hiányt jelez. A CGH alkalmas pl. tumorsejtek CNV ill. nagy géndeléciós profiljának, valamint a daganat és metasztázis közös klonális eredetének kimutatására (74, 75). A CGH felbontása 100 kilobp (59).

I. 2.1.2.9. Chip (array) módszerek A kópiaszám variációk, ill. a nagy géndeléciók kimutatásának jelenlegi legkorszerűbb módszere az array alapú CGH (Nimblegen-array) (76). Az array-k integrált rendszerekben egyszerre nagyszámú, automatizáltan végrehajtható vizsgálat elvégzését teszik lehetővé. Az array tervezése, a templát precíz előkészítése és a mért adatok informatikai feldolgozása jelentik a mérés legkritikusabb lépéseit. A vizsgálattal pontos és gyors információt szerezhető a templát kópiaszám variációjáról, akár az

25

összes humán kromoszómára, akár 200 bp méretű szakaszokra vonatkozóan (nagyfelbontású CGH). A nagy géndeléciók és kópiaszám változások kimutatására alkalmazott módszerek összehasonlítását a 2. táblázat tartalmazza.

26

2. táblázat Nagy géndeléció és kópiaszám változás kimutatására alkalmazható módszerek jellemzői. (FISH: fluoreszcens in situ hibridizáció, DHPLC: denaturáló nagy nyomású folyadékkromatográfia, PCR: polimeráz láncreakció) Módszer

Minta jellemzői,

Felbontóképesség

Egyidőben

vizsgálathoz szükséges

nagy delécióra

vizsgálható

DNS

vonatkozóan

lókuszok

Kromoszóma

Izolált

5-10 megabp

teljes genom

sávtechnikák

kromoszómakészlet

Southern-féle

Mikrogramm

Előny

Hátrány

Költség

direkt analízis, nincs további

kis felbontóképesség

közepes

radioaktív izotóp,

közepes

jelfeldolgozás 5-10 megabp

1

pontosság

hibridizáció FISH

időigényes Izolált

5-10 megabp

<10

fluoreszcens jelölés

kromoszómakészlet DHPLC

Pikogramm

intakt sejtek

közepes

vizsgálhatók 100 bp-100 kilobp

<10

kis bázispár- és

ismert lókusz

intenzitáskülönbség jól

vizsgálható

közepes

mérhető Multiplex PCR

Pikogramm

100 bp-100 kilobp

<10

gyors

ismert lókusz vizsgálható

alacsony

2. táblázat folytatása Nagy géndeléció és kópiaszám változás kimutatására alkalmazható módszerek jellemzői. (PCR: polimeráz láncreakció, MAPH: multiplex amplifikálható próba hibridizáció, MLPA: multiplex ligációs próba amplifikáció, CGH: komparatív genomhibridizáció) Módszer

Kvantitatív PCR

Minta jellemzői,

Felbontóképesség

Egyidőben

vizsgálathoz szükséges

nagy delécióra

vizsgálható

DNS

vonatkozóan

lókuszok

Nanogramm

100 bp-1 kilobp

<10

Előny

Hátrány

Költség

nagy pontosság

ismert lókusz

magas

vizsgálható Mikroszatellita

Pikogramm

100 kilobp

<10

nagy pontosság

marker analízis MAPH

heterozigóta lókusz

közepes

vizsgálható Pikogramm

100 bp-2 megabp

1-40

jó felbontás, nagy pontosság

MLPA

teljes genom nem

közepes

vizsgálható

CGH

Mikrogramm

100 kilobp

teljes genom

teljes genom vizsgálható

alacsony felbontás

közepes

Array CGH

Nanogramm

500 bp

teljes genom

nagy felbontás

bonyolult

magas

bioinformatikai feldolgozás

28

I. 2.2. Gén-mutációk jelentősége familiáris tumor szindrómákban I. 2.2.1. Örökletes phaeochromocytoma A phaeochromocytoma a mellékvesevelő krómaffin sejtjeiből kiinduló daganat. Az esetek nagyobb hányadában sporadikus megjelenésű. Említést érdemel az ún. 10%os szabály (3. táblázat 2. oszlopa), mely ugyan ma már nem teljesen helytálló, de felhívja a figyelmet a bilaterális, extraadrenalis, familiáris és malignus esetek előfordulásának lehetőségére. 3. táblázat A phaeochromocytoma speciális megjelenési formáinak gyakorisága. Phaeochromocytoma 10%-os szabály

Legújabb irodalmi adatok alapján

Bilaterális

10%

>10%

Extraadrenalis

10%

akár 25%

Familiáris

10%

25%

Malignus

10%

adrenalis 5% extraadrenalis ≥33

Előzetesen nem szelektált phaeochromocytomás betegek körében 10-25%-ban mutatható ki a VHL, RET, NF1, SDHX (szukcinil-dehidrogenáz B, C, D) gének defektusa (77-79). A von Hippel-Lindau szindrómában a phaeochromocytoma retina és központi idegrendszeri haemangiomákkal, világossejtes vesekarcinómával, illetve cisztás elváltozásokkal együtt jelentkezhet, hátterében a VHL tumorszuppresszor gén defektusai állnak (80). A RET protoonkogén mutációi által okozott multiplex endokrin neoplasia 2A típusában a phaeochromocytoma medulláris pajzsmirigykarcinómával és mellékpajzsmirigy hyperplasiával/adenomával, míg a 2B típusban marfanoid külső megjelenés

mellett

medullaris

pajzsmirigykarcinomával

és

mucocutan

ganglioneuromákkal társul (81). A neurofibromatosis 1-es típusában az NF1 gén mutációja következtében a tejeskávéfoltok és a bőr neurofibromák mellett 5,7%-ban jelentkezik phaeochromocytoma. Neurofibromatosis 1-es típusában szenvedő egyénben

hypertonia esetén a phaeochromocytoma gyakorisága akár 50% is lehet (82). A szukcinil-dehidrogenáz enzimkomplexet alkotó fehérjék a légzési lánc terminális oxidációjának elektrontranszport folyamataiban vesznek részt. E fehérjéket kódoló gének mutációit paraganglioma szindrómákban (PGL) és látszólag sporadikus phaeochromocytomákban mutatták ki. Leggyakrabban a szukcinil-dehidrogenáz B (SDHB), ritkábban a SDHD és SDHC gének mutációit észlelték (83). A paraganglioma extraadrenálisan elhelyezkedő phaeochromocytomának felel meg. Említést érdemel, hogy phaeochromocytoma esetén a malignitás szövettani megítélése nehéz, sőt gyakran nem lehetséges, a diagnózis a klinikai képen és kórlefolyáson alapul (recidíva, lokális invázió, metasztázis képződés). A bilaterális phaeochromocytoma gyakran örökletes szindróma részjelensége, egyoldali phaeochromocytoma esetében azonban klinikai vizsgálatokkal gyakran nem állapítható meg, hogy sporadikus esetről van-e szó, vagy később újabb manifesztációk kialakulásával valamely endokrin tumorszindróma elsőként megjelenő komponensének tekinthető. Ezért vezették be a látszólag sporadikus phaeochromocytoma (LSP) fogalmát. LSP-ban a VHL gén mutációk több tanulmány szerint kb. 2-11 %-os gyakorisággal fordulnak elő (84-86), ezért LSP esetén a VHL gén mutációanalízise kiemelten fontosnak tartható. I. 2.2.1.1. von Hippel-Lindau szindróma A

von

Hippel-Lindau-szindróma

(VHL-szindróma)

összetett

endokrin,

szemészeti, neurológiai és urológiai tumorszindróma. Prevalenciája 1:36.000-53.000 közötti (87, 88). VHL-szindrómában a retina, a kisagy, a gerincvelő területén és ezeknél valamivel ritkábban a hasnyálmirigyben, a vesében, a tüdőben és a májban haemangiomák / haemangioblastomák alakulnak ki (89-91). További jellemzői a világossejtes veserák, a phaeochromocytoma, az endolymphatikus zsák tumora, valamint a multiplex vese, mellékhere és hasnyálmirigy ciszták. A mellékhere, valamint a széles méhszalag cystadenomaja, és a hasnyálmirigy neuroendokrin daganata ritka komponense a VHL-szindrómának (92-94). A VHL-szindrómának két fő klinikai altípusa ismert (4. táblázat). A VHL 1-es típusában a phaeochromocytoma nagyon kis valószínűséggel fordul elő, míg a többi említett manifesztáció mindegyike kialakulhat.

30

A 2-es típus fő komponense a phaeochromocytoma; a 2A típusban a világossejtes veserák kialakulásának kockázata kicsi, míg a 2B típusban nagy gyakorisággal fordul elő ez a tumortípus. A 2C altípusban a phaeochromocytoma egyéb más kísérőelem nélkül jelenik meg (80). 4. táblázat A VHL-szindróma klinikai típusai. (LSP: látszólag sporadikus phaeochromocytoma) Retina haemangioblastoma VHL-1

Központi idegrendszeri haemangioblastoma Világossejtes veserák Hasnyálmirigy tumor/ciszta Phaeochromocytoma

VHL-2A

Retina haemangioblastoma Központi idegrendszeri haemangioblastoma Phaeochromocytoma Retina haemangioblastoma

VHL-2B

Központi idegrendszeri haemangioblastoma Világossejtes veserák (Hasnyálmirigy tumor/ciszta) Phaeochromocytoma

VHL-2C

(„Phaeochromocytoma -only”, „LSP)

A VHL-szindróma megjelenése átlagosan a 4. életévtizedben várható, de az életkor tartomány igen széles (1-78 év). A betegség penetranciája 65 éves korra 100%os. Az érintett családtagokban további manifesztációk jelentkezése esetén a betegség reklasszifikációja válhat szükségessé (80). A VHL-szindróma hátterében a VHL tumorszuppresszor gén mutációi állnak. A VHL gént evolúciós konzervativizmus jellemzi, jelentős a homológia a humán a kutya, az egér és a patkány VHL gének között (92, 95, 96). A betegség autoszomális, domináns módon öröklődik. A VHL gén a 3. kromoszóma rövid karján a 3p25-26 régióban

31

található (92). A mutációk a Knudson-féle kettős sérülés hipotézis alapján okoznak daganatképződést, azaz az egyik mutáció megtalálható a csírasejt egyik allélján, míg a második mutáció az érintett szervben szomatikusan alakul ki. A VHL gén 3 exonból áll és két splicing variánssal rendelkezik, melyek a pVHL19 és pVHL30 fehérjéket kódolják (pVHL: VHL-fehérje; a szám a molekulatömeget jelenti kilodalton egységben). Az alternatív splicing hely a hosszabb variáns 55. kodonjánál található, tehát a teljes, 213 aminosavból álló pVHL30 helyett csak a 159 aminosavból álló pVHL19 fehérje íródik át (97). Mindkét VHL fehérjében két funkcionális domén, egy α- és egy β-domén található (96, 98, 99). A kisebb α-domén (155-192. aminosav) három alfa-hélixből áll (H1, H2, H3), míg a nagyobb β-domént (63-154. és 193-204. aminosav) egy hét redőből álló béta-redő és egy alfa-hélix (H4) alkotja. A VHL fehérjében két funkcionális jelentőséggel bíró hely található. Az egyik az α-doménban elhelyezkedő elongin C kötőhely (157-170. aminosav), míg a másik a β-doménban található HIF1α (hypoxia indukálta faktor 1α)-kötőhely (91-113. aminosav) (97). A betegség-okozó mutációk többsége ennek a két kötőhelynek a területén található. A VHL gén mutációs adatbázis (www.umd.be/ vhl) alapján összesen több mint 800 különböző mutáció ismert (100). Bár ismertek genotípus-fenotípus összefüggések, a legtöbb VHL-szindrómás család egyéni fenotípussal rendelkezik. A VHL-szindróma 1es típusában jellemzően a fehérje hidrofób magját érintő missense és nonsense mutációk, illetve deléciók fordulnak elő, melyek súlyosan károsodott, megrövidült fehérje képződéséhez vezetnek és ezáltal teljes funkcióvesztést okoznak. Ezzel szemben a VHL-szindróma 2-es típusában a missense mutációk inkább a fehérjekötő helyeket érintik, ezáltal részleges funkciókiesést okoznak. Az alternatív start kodonként szereplő 55. kodon előtti lokalizációban mindezidáig csak néhány mutációt igazoltak, melyek phaeochromocytoma (25, 38 kodonok), illetve VHL-szindróma (E46X és E52K) esetén fordultak elő (78, 101-103).

32

II. Célkitűzések A hormonális szabályozó rendszer működésének, illetve e rendszert érintő kóros állapotok hátterében álló eltérések megismeréséhez alkalmazott molekuláris biológiai módszerek széles tárházából a megfelelő módszer kiválasztása alapvető fontossággal bír a klinikai jelentőségű genetikai eltérések pontos és gyors meghatározásához. Munkámban az alábbi két feladatcsoport megvalósítását tűztem ki célul. 1. Az endokrin szabályozásban kiemelt jelentőségű hypothalamus-hypophysismellékvesekéreg tengely anyagcsere és egyéb hatásaiért felelős kortizol iránti érzékenységet ismerten befolyásoló GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására hagyományosan alkalmazott módszerek költséges eszközöket (valós idejű PCR), vagy jelentős idő- és költség-ráfordítást igényelnek (Southern-féle hibridizáció, restrikciós emésztés). A Southern-féle hibridizáció esetében sugárvédelmi körülmények is szükségesek. Munkámban célul tűztem ki a GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására a rendelkezésre álló módszereknél egyszerűbb, idő- és költségkímélő, új allél-specifikus PCR módszer kidolgozását. Feladatomnak tartottam, hogy az általam tervezett oligonukleotid próbákkal kivitelezett új módszerrel és a Bcl I polimorfizmus kimutatására korábban alkalmazott két hagyományos módszerrel nyert eredményeket nagyszámú DNS mintán összehasonlítsam, és ezzel bizonyítsam a módszer gyakorlati alkalmazhatóságát. Végül célul tűztem ki nagyszámú, egészséges egyéntől származó DNS mintán a Bcl I polimorfizmus gyakoriságának hazai népességben való meghatározását. 2. Célul tűztem ki, hogy a Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinikán 1998-2008 között vizsgált von Hippel-Lindau szindrómában és vérrokon családtagjaikban, illetve látszólag sporadikus phaeochromocytomában szenvedő betegekben azonosítsam a betegség-okozó csirasejtes VHL génhibákat. A von HippelLindau szindróma hátterében a VHL gén mutációin kívül gén nagy szakaszát érintő deléciók is állhatnak, ezért olyan esetekben, amikor a VHL gén direkt szekvenálása nem igazolt mutációt, a gén nagy szakaszát érintő deléciók vizsgálatára kvantitatív valósidejű PCR és MLPA módszereket is alkalmaztam. A különböző VHL génhibák

33

detektálására alkalmazott módszerekkel olyan szűrőprogramot kívántam kidolgozni, amely alkalmas az érintett betegekben, ill. vérrokon családtagokban a betegség-okozó genetikai eltéréseknek a szokásosnál hatékonyabb kimutatására. A genetikai vizsgálatokkal nyert eredményekre alapozva feladatul tűztem ki a hazai von HippelLindau szindrómás betegekben észlelt VHL gén eltéréseinek összevetését a nemzetközi irodalomban közölt adatokkal. Az elemzés során választ kerestem arra a kérdésre, hogy a vizsgált hazai betegekben talált eltérések között észlelhető-e ”founder” mutációnak megfelelő jelenség, melyet néhány más európai régióban korábban megfigyeltek.

34

III. Módszerek

III. 1. A GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására új allél-specifikus PCR módszer kidolgozása III. 1.1. Vizsgálati egyének, DNS-izolálás 247 egészséges magyar felnőtt DNS mintáját használtam fel. Közöttük 60 férfi és 187 nő volt, átlagos életkoruk 54,5±30,5 év, illetve 55±33 év volt. A vizsgálatba bevont egyének írásos beleegyező nyilatkozatot írtak alá. A genomiális DNS-t a vizsgálatba bevont egyének perifériás vér fehérvérsejtjeiből QIAmp DNA Blood Mini kit (Qiagen, Mannheim, Németország) felhasználásával nyertük. III. 1.2. Specifikus oligonukleotid próbák (primerek) tervezése Két ún. belső primert terveztem a polimorfizmus okozta C-G csere kimutatására: a vad allélra specifikus reverse próbát (vad reverse - VR: 5’-CAATTCCTCTCTTAA AGAGATTG-3’), és a mutáns allélra specifikus forward próbát (mutáns forward - MF: 5’-GACAAGTTATGTCTGCTGATG-3’). A polimorfizmus helyétől 154 bp távolságra 5’-, valamint 263 bp távolságra 3’-irányban tervezett ún. külső próbapárok (forward - F: 5’-AGAGCCCTATTCTTCAAACTG-3’, reverse - R: 5’-GAGAAATTCACCCCTA CCAAC-3’) lehetővé tették a vizsgált régiónak 418 bp méretű fragmentum formájában történő sokszorosítását, melyben a polimorf hely aszimmetrikusan helyezkedik el. A próbákat a Primer Premiere 5.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) program felhasználásával terveztem. A próbák tapadását a GR gén megfelelő szakaszán az 5. ábra szemlélteti, míg a PCR során keletkező fragmentumokat a 6. ábra mutatja be.

35

5. ábra A GR gén 2. exonjának végét (félkövérrel) is tartalmazó 960 bp hosszúságú szakasz DNS szekvenciája. (Szürke háttérrel a 646. intronikus nukleotid, a Bcl I SNP, aláhúzással rendre a primerek (forward: F; mutáns forward: MF; vad reverse: VR; reverse: R) láthatóak.)

6. ábra Az allélspecifikus PCR során amplifikálódó fragmentumok és azok hossza (kétirányú nyilak). (Függőleges nyilakkal a Bcl I SNP-t jelöltem (Guanozin (G) a mutáns allélban, citozin (C) a vad allélban található).)

36

III. 1.3. Allél-specifikus PCR kidolgozása A próbákat az Invitrogen Life Technologies-től (Glasgow, Egyesült Királyság), a nagy tisztaságú dezoxiribonukleotid-trifoszfátokat (dNTP), a Taq polimerázt és a 10X puffert (100 mM TRIS–HCl, pH 9.0, 15 mM MgCl2 és 500 mM KCl) az Amersham Biosciencestől (Buckinghamshire, Egyesült Királyság) vásároltuk. A Taq polimeráz nem tartalmazott endogén nukleáz aktivitást. Az 50 µl végtérfogatú 10 mM Tris–HCl-t, 1,5 mM MgCl2-t. 50 mM KCl-t és 5 % glicerint tartalmazó pufferoldat 160 ng DNS-t, 2 NE (nemzetközi enzimaktivitás egység) Taq polimerázt, a 4 próba mindegyikéből 25 pM-t és 0,2 mM/l dNTP-t tartalmazott. A PCR-t PTC-100 (MJ Research, Cambridge, MA, USA) típusú készülékkel végeztem el. A PCR termociklusa 5 perces 95 °C-on történő elődenaturációt követően 35 ciklusban: 95 °C-on 1 perc, 56 °C-on 1 perc és 72 °C-on 1,5 perc volt, melyet 10 perces végső extenziós fázis követett. A reakciót követően a reakcióelegyet 4 °C-ra hűtöttem. A PCR során keletkező fragmentumokat 2%-os agaróz gélelektroforézissel választottam szét és etídium-bromid felhasználásával ultraibolya fényben láthatóvá tettem. A gélelektroforézist követően DNS markerlétra mellett olvastam le a fragmentek méretét (PCR marker, 50–2000 bp Sigma–Aldrich, Saint Louis, MO, USA).

III. 1.4. Az allélspecifikus PCR validálása restrikciós emésztéssel és direkt szekvenálással Az allél-specifikus PCR-rel vizsgált 247 DNS mintából random módon kiválasztott 50 mintában hagyományos restrikciós emésztéssel és az arany standardnak számító direkt szekvenálással is meghatároztam a Bcl I polimorfizmust. Ezekhez a vizsgálatokhoz korábban leírt PCR-t az allél-specifikus (MF és VR) primerek nélkül, a külső (F, R) primerpárral végeztem el, majd a 418 bp hosszúságú terméket High Pure PCR Product kittel (Roche Diagnostics, Basel, Svájc) tisztítottam meg. A tisztított termékhez 7,5 NE Bcl I enzimet (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Németország) adtam, mellyel 50 °C-on 120 percig inkubáltam. A keletkezett fragmentumokat 2%-os agaróz gélelektroforézissel választottam szét és etídium-bromid

37

jelenlétében ultraibolya fénnyel tettem láthatóvá. A gélelektroforézist követően DNS markerlétra mellett olvastam le a fragmentumok méretét (DNA Molecular Weight Marker VIII, Roche Diagnostics, Basel, Svájc). A direkt szekvenálást megelőzően a tisztított PCR terméket a F és speciális 5’M13 véget tartalmazó R primerrel (RS: 5’-CACGACGTTGTAAAACGACGA GAAATTCACCCCTACCAAC-3’) egy újabb PCR-rel sokszorosítottam. Ismételt tisztítást követően a terméket LI-COR 4000L automata infravörös DNS-szekvenáló automatával (LI-COR, Bad Homburg, Németország) szekvenáltam SequiTherm EXCEL II DNA Sequencing Kit LC (Epicentre, Madison, WI, USA) felhasználásával, melyet a gyártó utasításai szerint alkalmaztam.

III. 1.5. A GR gén Bcl I polimorfizmus populációs eloszlásának statisztikai analízise Annak vizsgálatára, hogy a 247 egyénnél tapasztalt genotípus, illetve allélfrekvencia eloszlás követi-e a várható populációs eloszlást, azaz megfelel-e a Hardy-Weinberg ekvilibriumnak χ2 –próbát alkalmaztam SPSS for Windows 12.0.1 szoftvercsomag felhasználásával (SPSS, Chicago, IL, USA).

III. 2. A VHL gén vizsgálatára alkalmazott módszerek III. 2.1. VHL-szindrómában szenvedő családok Hét VHL-szindrómában szenvedő család összesen 35 tagjának klinikai adatait és genomiális DNS-mintáját dolgoztam fel, akik 1998-2008 között jelentek meg a Semmelweis Egyetem II. számú Belgyógyászati Klinikáján. A betegek kivizsgálása magában foglalta az anamnézis felvételét, a fizikális vizsgálatot, hasi ultrahang, komputertomográfia (CT), agyi, illetve gerinc mágneses rezonancia tomográfia (MR), és szemészeti vizsgálatot, valamint laboratóriumi vizsgálatokat (rutin biokémia, illetve 24 órás gyűjtött vizeletből katecholamin metabolit meghatározás). Minden vizsgált

38

egyén genetikai tanácsadásban részesült és előzetes belegyezés alapján történt a genetikai vizsgálat elvégzése is. Az indexbetegek családtagjainak szűrővizsgálatait is elvégeztük. Az index betegekben, illetve génhibát hordozó családtagokban észlelt klinikai tünetek alapján a családokat a nemzetközi ajánlásoknak megfelelő VHL altípusokba soroltuk. A betegek követése során új VHL-asszociált tumor nem alakult ki, így reklasszifikációra egyetlen család esetében sem volt szükség.

III. 2.2. Látszólag sporadikus phaeochromocytomában szenvedő egyének Összesen 37, egymással rokoni kapcsolatban nem álló, szövettanilag igazolt egyoldali LSP-ban szenvedő egyén klinikai adatait és genomiális DNS-mintáját dolgoztam fel, akik 1998-2008 között jelentek meg a Semmelweis Egyetem II. számú Belgyógyászati Klinikáján. Közöttük 17 férfi és 20 nő volt, átlagos életkoruk 40,6±15,4 év és 37,7±14,4 év volt (tartomány 12-67 év és 19-63 év). A vizsgálatból kizártuk azokat a betegeket, akik kétoldali phaeochromocytomában vagy ismert familiáris szindrómában (VHL, MEN 2, NF 1 vagy familiáris paraganglioma szindróma) szenvedtek. A műtét előtti kivizsgálás magában foglalta az anamnézis felvételét, a fizikális vizsgálatot, hasi ultrahang, komputertomográfia (CT), mágneses rezonancia tomográfia (MR) vizsgálatot, 131-meta-jodobenzilguanidin (MIBG)-szcintigráfiát és szemészeti vizsgálatot, valamint laboratóriumi vizsgálatokat (rutin biokémia, illetve 24 órás gyűjtött vizeletből katecholamin metabolit meghatározás). Azoknál az indexbetegeknél, akiknél betegség-okozó VHL gén mutáció igazolódott egyéb VHL-szindrómához kapcsolódó tumorok jelenlétét is vizsgáltuk, de ezek a vizsgálatok negatív eredménnyel zárultak. A VHL gén mutációt hordozó egyének vérrokon családtagjai számára is felajánlottuk a genetikai és klinikai vizsgálatot. A vizsgálat előtt az indexbetegek és vérrokon családtagjaik genetikai tanácsadáson vettek részt és írásos beleegyező nyilatkozatot írtak alá.

39

III. 2.3. VHL gén mutációk kimutatása Perifériás vér fehérvérsejtjeiből DNA Isolation Kit for Mammalian Blood (Roche, Diagnostics, Basel, Svájc) felhasználásával teljes genomiális DNS-t izoláltam. A VHL gén mindhárom exonját a splicing régióval együtt PCR-rel sokszorosítottam. A vizsgálathoz Pastore és munkatársai által leírt módszert módosítottam (104). A PCR reakcióhoz alkalmazott módosított próbapárokat az 5. táblázat mutatja be. A vizsgálathoz

alkalmazott

próbákat

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)

a

(105),

Primer

3

specificitásukat

szoftverrel az

terveztem

NCBI-BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) program segítségével ellenőriztem. A próbákat az Invitrogen Life Technologies-től (Basel, Svájc) szereztük be. A VHL gén exonjainak sokszorosítására 50 µl végtérfogatú reakcióhoz 25 µl 2X Immomix reagens koncentrátumot (Bioline GmbH, Luckenwalde, Németország), 25-25 pM forward és reverse irányú próbát és 200 ng genomiális DNS-t használtam. A 2X Immomix kétszeres töménységben tartalmazta a nagy tisztaságú dezoxiribonukleotidtrifoszfátokat, a Taq polimerázt valamint a pufferoldatot. A PCR termociklusa 7 perc 95 °C-os elődenaturációt követően 34 ciklusban: 95 °C-on 1 perc, 58 °C-on 1 perc és 72 °C-on 20 másodperc volt, melyet 72 °C -on 1 perces végső extenziós lépés követett. Végül a reakcióelegyet 4 °C-ra hűtöttem. A PCR során keletkező fragmentumokat 2%-os agaróz gélelektroforézissel választottam szét és etídium-bromid felhasználásával ultraibolya fényben láthatóvá tettem. A gélelektroforézist követően DNS markerlétra segítségével határoztam meg a fragmentumok méretét (PCR marker, 50–2000 bp Sigma–Aldrich, Saint Louis, MO, USA) (lásd 5. táblázat). A specifikus fragmentumokat High Pure PCR Product kittel (Roche Diagnostics, Basel, Svájc) tisztítottam meg. A

megtisztított

terméket

LI-COR

4000L

infravörös

DNS-szekvenáló

automatával (LI-COR, Bad Homburg, Németország) és SequiTherm EXCEL II DNA Sequencing Kit LC (Epicentre, Madison, WI, USA) felhasználásával, vagy Applied Biosystems 310 Genetic Analyzer automata kapilláris szekvenáló és Big Dye Terminator Cycle Sequencing v3.1 kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) felhasználásával direkt szekvenálást végeztem a gyártó utasításai szerint.

40

Azokban az esetben, amelyekben direkt szekvenálással nem sikerült mutációt azonosítani, két módszert alkalmaztam a VHL gén nagy deléciójának vizsgálatára. Az első, SYBRGreen kémián alapuló valós idejű PCR módszert Ponchel és munkatársainak munkája alapján dolgoztam ki (106). 25 µl végtérfogatú reakcióelegyhez 120 ng genomiális DNS-t, Power SYBRGreen PCR Master Mix-et (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és saját tervezésű primereket használtam, páronként 12,5 pg mennyiségben (5. táblázat). A valós idejű PCR során belső kontrollként a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz gén (GAPDH) 8. exonját használtam. Abszolút kvantifikációs üzemmódban Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR készüléket használtam (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A valós idejű PCR termociklusa 5 perces 95 °C-on történő elődenaturációt követően 40 ciklusban: 95 °Con 30 másodperc, 62 °C-on 30 másodperc és 72 °C-on 30 másodperc volt, melyet ismételt, 95 °C-on 15 másodpercig tartó denaturáció után olvadási hőmérséklet analízis követett 60 °C-ról kiindulva 95 °C-ig 1 °C/perc sebességű hőmérsékletemeléssel. Végül a reakcióelegyet 4 °C-ra hűtöttem. A kvantitatív PCR-nél szokásos módon minden mintát triplikátumban vizsgáltam. Az eredmények kiértékeléséhez a küszöbértékek összehasonlításának módszerét használtam (comparative threshold: Ct). Az egyes Ct értékeket 1-1 egyén mintájára vonatkozóan akkor fogadtam el, ha a triplikátumban mért Ct értékek szórása 0,05 alatti volt. A ∆Ct = Ct(vhl_exon) - Ct(GAPDH) értéket minden egyes triplikátum átlagos értékére számítottam ki. A PCR ciklusok során keletkező termékek mennyisége exponenciálisan növekszik (2n), ezért a nulla cikluskülönbség azt jelenti, hogy a vizsgált és a kontroll fragmentum azonos arányban van jelen a mintában, azaz 2-(∆Ct)=20=1 (106). Külső kontrollként ismert heterozigóta VHL gén mutációt hordozó, illetve egészséges egyének DNS mintáját használtam. A teljes exont érintő nagy géndeléciót ∆Ct = 0,6 (60%) érték alatt állapítottam meg. A valós-idejű PCR módszer fajlagosságát a fragmentumok olvadási hőmérséklet analízisével ellenőriztem.

41

5. táblázat A VHL gén vizsgálatára használt oligonukleotid próbapárok. (A direkt szekvenáláshoz használt próbák ún. 5’-M13 véget tartalmaztak (CACGACGTTGTAAAACGAC), melyre a SequiTherm szekvenáló kit alkalmazása miatt volt szükség; GAPDH: glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) Primerek (5’-3’)

Fragmentum méret (bp)

Klasszikus PCR, direkt szekvenálás F: CACGACGTTGTAAAACGACVHL exon 1

CGAAGACTACGGAGGTCGAC

500

R: GGCTTCAGACCGTGCTATCG F: CACGACGTTGTAAAACGACVHL exon 2

ATTACAGGTGTGGGCCACCG

295

R: GCCTGACATCAGGCAAAAATTGAG F: CACGACGTTGTAAAACGACVHL exon 3

CCTTGTAC-TGAGACCCTAG

268

R: GCTGAGATGAAACAGTGT Valós idejű PCR VHL exon 1 VHL exon 2 VHL exon 3 GAPDH exon 8

F: CGC GAA GAC TAC GGA GGT R: CTT CAG ACC GTG CTA TCG TC F: AAC CTT TGC TTG TCC CGA TA R: CAG GCA AAA ATT GAG AAC TGG F: GAG ACC CTA GTC TGC CAC TGA R: CCA TCA AAA GCT GAG ATG AAA F: GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT R: TCG CTG TTG AAG TCA GAG GA

500 239 268 147

A VHL nagy géndeléció kimutatására második módszerként multiplex ligációs próba analízist (MLPA) alkalmaztam; a vizsgálatot a DNS szekvenálással mutációt nem hordozó VHL családokban valamint az összes látszólag sporadikus egyoldali phaeochromocytomában szenvedő betegben elvégeztem. A vizsgálathoz a reagens-

42

csomagot a gyártó utasításai szerint használtam fel (SALSA MLPA kit, MRC-Holland, Amsterdam, Hollandia) (107). A 6-FAM fluoreszcens festékkel jelzett fragmentumokat külső laboratóriumban (Biomi KFT, Gödöllő) kapilláris elektroforézissel választották szét (Applied Biosystems 310 Genetic Analyzer, Foster City, CA, USA). A relatív görbe alatti területeket hasonlítottam össze a gyártó ajánlásai alapján PeakScanner (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és MS-Excel (Microsoft, Richmond, Virginia, USA) szoftvercsomagok segítségével. A vizsgált szakaszt érintő deléciót abban az esetben állapítottam meg, ha a kontrollhoz (100%) viszonyított relatív görbe alatti terület 55% alatti volt. Külső kontrollként ismert heterozigóta VHL gén mutációt/polimorfizmust hordozó egyének DNS mintáját használtam fel.

43

IV. Eredmények

IV. 1. A GR gén Bcl I polimorfizmus kimutatása új allél-specifikus PCR módszerrel IV 1.1. Az új allél-specifikus PCR módszer eredményei Az allél-specifikus PCR során egy lépésben keletkezik a belső kontroll fragmentum, valamint a Bcl I polimorfizmus hátterében álló SNP-től függően a vad, mutáns, vagy ezek együttes előfordulására jellemző fragmentunok (6. és 7. táblázatok, 7. ábra). 6. táblázat A GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására kidolgozott új allél-specifikus PCR során keletkező fragmentumok képzéséhez felhasználódó próbapárok és a képződő fragmentumok mérete. (F: forward, R: reverse, VR: vad reverse, MF: mutáns forward) Keletkező

Felhasználódó

Fragmentum

fragmentum

primerpár

hossz

Alléltól függetlenül

F+R

418 bp

Vad allél esetén

F + VR

177 bp

Mutáns allél esetén

MF + R

284 bp

7. táblázat A GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására kidolgozott új allél-specifikus PCR során a genotípustól függően képződő fragmentumok. Allél 1

G (mutáns)

C (vad)

Allél 2

G (mutáns) G (mutáns)

C (vad) C (vad)

418 bp

Van

Van

Van

284 bp

Van

Van

Nincs

177 bp

Nincs

Van

Van

44

7. ábra Gélelektroforézis kép a GR gén Bcl I polimorfizmus új allél-specifikus PCR módszerrel történő kimutatására. 1. oszlop: homozigóta mutáns genotípus (428 bp méretű kontroll és 177 bp méretű fragmentumok), 2. és 4. oszlopok: heterozigóta genotípus (428 bp méretű kontroll, 284 bp és 177 bp méretű fragmentumok), 3. oszlop: homozigóta vad genotípus (428 bp méretű kontroll és 284 bp méretű fragmentumok); M: DNS markerlétra; bp: bázispár

IV 1.2. Az új allél-specifikus PCR módszer eredményeinek validálása A random módon kiválasztott 50 különböző DNS mintában az új allél-specifikus PCR módszer, a restrikciós enzim emésztés és a direkt szekvenálás azonos eredményt

45

adott. A restrikciós emésztés és a direkt szekvenálás eredményeit a 8. és 9. ábrák szemléltetik.

8. ábra Gélelektroforézis kép a GR gén Bcl I polimorfizmus restrikciós emésztéssel történő kimutatására. 1. oszlop: homozigóta mutáns (csak emésztetlen 418 bp méretű kontroll fragmentum), 3. oszlop: homozigóta vad genotípus (a 418 bp méretű fragmentum hiányzik, helyette kettő kisebb, 151 és 267 bp méretű fragmentum jelent meg), 2. és 4. oszlopok: heterozigóta genotípus (csökkent intenzitású 418 bp méretű fragment mellett kettő kisebb, 151 és 267 bp méretű fragmentum látható); M: DNS markerlétra; bp: bázispár

46

9. ábra A GR gén Bcl I polimorfizmusa reverse irányú szekvenálás kromatogramján. Mindhárom képen középen látható a Bcl I polimorfizmus hátterében álló SNP; a középső képen az azonos helyen látható két kisebb csúcs heterozigóta genotípust jelez. IV 1.3. A GR gén Bcl I polimorfizmus populációs eloszlásának statisztikai analízise A vizsgált 247 egyén közül 100 homozigóta vad, 124 heterozigóta és 23 homozigóta mutáns genotípusúnak bizonyult. Allélokban számolva ez összesen 100*2+124 vad és 124+23*2 mutáns allélnak, azaz 324 vad és 170 mutáns allélnak felelt meg. Ennek alapján a mutáns allél gyakorisága 170/(170+324)=0,344 volt. A Hardy-Weinberg-ekvilibrium szerint p+q=1, és p2+2pq+q2=1 ahol p és q a két allél

47

frekvenciája. Ha q=0,344 a mutáns allél frekvenciája (p=0,656), a homozigóta vad genotípus várt előfordulása p2=43,01%, a 2pq=45,14% és a q2=11,84%. Ez 247 egyénre kiszámolva: 106,25 homozigóta vad, 111,5 heterozigóta és 29,25 homozigóta mutáns genotípusú egyénnek felel meg. A mért és a számított genotípus eloszlást χ2–próbával összehasonlítva a próba értéke 0,8122 (<5,9915, df=2, α=0,05 mellett), tehát a számított és mért értékek közötti különbség nem volt szignifikáns. A mért genotípus eloszlás megfelelt Hardy-Weinberg-ekvilibrium alapján várt populációs eloszlásnak.

IV. 2. A VHL gén vizsgálatának eredményei IV. 2.1. VHL szindrómában szenvedő családok klinikai vizsgálatának eredményei Az első családban (A család) az index nőbetegnél multiplex (occipitalis, parietalis és kisagyi lokalizációjú) haemangioblastomákat, vesecisztákat és retina haemangiomákat állapítottak meg. A szülőknél valamint két gyermeke közül az egyiknél semmilyen klinikai tünetet nem észleltek, míg a másik gyermeknél 6 éves korban retina haemangiomát találtak. A második családban (B család) az elsőként vizsgált fiatal férfiban 19 éves korban retina haemangiomát, majd 27 évesen kisagyi haemangioblastomát valamint vese

és

hasnyálmirigycisztákat

mutattak

ki.

Mérsékelt

erythrocytosist

(vörösvértestszám: 5,8 T/l, haemoglobin koncentráció: 162 g/l, haematokrit: 0,48) is észleltek normális fehérvérsejt és thrombocytaszám mellett. A családtagok közül a szülők a genetikai vizsgálatot nem vállalták, míg az indexbeteg öccsénél sem a klinikai sem a genetikai vizsgálat nem mutatott ki eltérést. A harmadik család (C család) férfi indexbetegen 33 évesen kisagyi haemangioblastoma miatt műtétet végeztek. A műtét előtti kivizsgálás során vesecisztákra is fény derült. Két évvel később kétoldali világossejtes veserák miatt kétoldali nephrectomia történt és krónikus dialízist vezettek be. A képalkotó vizsgálatokkal hasnyálmirigycisztát is leírtak. A családtagok közül csak az indexbeteg bátyja volt elérhető, akinél a klinikai és genetikai kivizsgálás negatív eredménnyel zárult.

48

A negyedik családban (D család) az indexbeteg fiatal nő volt, akit 22 évesen kisagyi haemangioblastoma miatt operáltak. Már ekkor ismertek voltak multiplex vesecisztái, továbbá retinaleválása és üvegtesti bevérzése is. 26 éves korában új eltérésként hasnyálmirigyciszta, valamint új gerincvelői haemangioblastoma, illetve recidiváló kisagyi haemangioblastomák jelentek meg. A családtagok kivizsgálására nem volt lehetőség, de a kórelőzmény szerint a beteg édesapja világossejtes veserák miatt hunyt el. Az ötödik családban (E család) a 21 éves korú férfi indexbetegnél nagyszámú veseciszta mellett mindkét vesében hypervascularisatiot mutató térfoglaló folyamatot találtak. Bár a családtagok részletes kivizsgálására nem volt lehetőség, a családi anamnézis alapján megalapozottan merült fel familiáris betegség; az indexbeteg édesanyját és nagyanyját világossejtes veserák miatt operálták és a beteg nagybátyjának gerincvelői tumora volt. A hatodik család (F család) férfi indexbetegénél 27 éves korában egyoldali phaeochromocytomát és retina haemangiomát állapítottak meg. Hasi CT vizsgálat során patkóvesét találtak. A beteg anyját 49 éves korában világossejtes veserák miatt operálták, melyen kívül egyéb eltérés a későbbi gondozás során sem igazolódott. A hetedik családban (G család) a betegség megjelenése öt generáción keresztül nagyszámú családtagon követhető volt (108). Az indexbeteg nőben 34, majd 40 éves korában phaeochromocytoma miatt, ezt követően pedig világossejtes veserák miatt végeztek

műtétet.

42

éves

korában

kisagyi,

nyúltvelői

és

gerincvelői

haemangioblastomát állapítottak meg. A szülőknél a biokémiai, vagy képalkotó vizsgálatok nem utaltak VHL-szindrómához kapcsolódó eltérésekre, azonban a beteg 5 vérrokonában VHL-szindrómának megfelelő tumorokat észleltek (1 esetben kétoldali világossejtes veserák, 1 esetben veseciszták, 3 esetben kisagyi, nyúltvelői és gerincvelői haemangioblastomák, 4 esetben retina haemangioma és 2 esetben phaeochromocytoma). A VHL-szindrómás családok érintett tagjaiban észlelt klinikai eltéréseket a 8. táblázat foglalja össze.

49

8. táblázat VHL-szindrómás családok érintett tagjaiban észlelt klinikai eltérések. (IB: indexbeteg, a: (108), b: a genetikai vizsgálat nem volt elvégezhető)

VHL típus

Egyéb klinikai megjelenés

Retina érintettség

(életkor a megjelenésekor [év])

Phaeochromocytoma

(életkor a megjelenésekor [év])

Központi idegrendszeri

haemangioblastoma

(életkor a megjelenésekor [év])

Világossejtes veserák

(életkor a megjelenésekor [év])

Családtag

Család IB

-

39

-

22

Veseciszták

Fiúgyermek

-

-

-

6

-

B

IB

-

27

-

19

Veseciszták, hasnyálmirigyciszták, polyglobulia

1

C

IB

33

-

-

Veseciszták, hasnyálmirigyciszta

1

D

IB

-

22

-

22

E

IB

21

A

35, kétoldali

Veseciszták, hasnyálmirigyciszta, melléklép Veseciszták, világossejtes veserák és központi idegrendszeri haemangioblastoma több családtagnál

1

1 1

-

-

27

27

Patkóvese

Anya

49

-

-

-

-

IB

40,

42

34

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Hasnyálmirigy neuroendokrin tumor

G a Unokatestvér 1

-

37

-

18

-

Unokatestvér 2

-

38

39

29

-

-

22

-

23

Veseciszták

-

-

26

-

F

IB

kétoldali Nagynéni 1b

45, kétoldali

Nagynéni 2 b

Másodunokatestvér 1 Másodunokatestvér 2

10, kétoldali

(IB: Indexbeteg)

51

2B

2B

IV. 2.2. VHL szindrómában szenvedő családok genetikai vizsgálatának eredményei A vizsgált 7 VHL-szindrómás család mindegyikében sikerült betegség-okozó VHL gén mutációt vagy nagy deléciót azonosítani. Az A családban az indexbetegben és retina haemangiomában szenvedő gyermekében a nemzetközi irodalomban már korábban leírt betegség-okozó, heterozigóta L158V mutációt igazoltam. Ez a mutáció nagy valószínűséggel de novo jelent meg az indexbetegben, ugyanis a szülőkben nem volt jelen a mutáció. A mutáció-hordozó gyermek klinikai újravizsgálata során sem igazolódott egyéb VHL-szindrómához kapcsolódó tumor. A B család indexbetegében heterozigóta R161X mutációt mutattam ki, melyet szintén betegség-okozó mutációként tartanak számon a nemzetközi irodalomban. Az indexbeteg egészséges öccsénél a mutáció nem volt jelen, a szülők nem kívántak részt venni a vizsgálatban. A C család indexbetegénél a 3. exon heterozigóta nagy delécióját találtam, a géndeléció az egészséges fiútestvérnél nem volt jelen (10. ábra).

géndózis %

150

100

50

0 1. exon

2.exon

3.exon

10. ábra A VHL gén 3. exon deléciójának kimutatása valós-idejű PCR módszerrel von HippelLindau szindrómás C család indexbetegében (sötét oszlopok). Az üres oszlopok kontroll személy eredményeit mutatják be.

Az alkalmazott valós idejű PCR módszer specificitását a SYBRGreen-nel való sokszorozás során keletkező fragmentumok olvadási hőmérséklet analízise szemlélteti (11. ábra).

11. ábra A glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) gén 8. exon és a VHL gén 1. 2. és 3 exonok SYBRGreen módszerrel való sokszorosításakor keletkező specifikus fragmentumok olvadási hőmérséklet analízise.

A D család indexbetegében a VHL-szindróma számos komponense jelen volt, beleértve a retinaleválást és az üvegtesti vérzést is, melyek egyes megfigyelések szerint retina haemangioma következményeként is kialakulhatnak (109). A genetikai vizsgálatok során a 2. exon heterozigóta nagy delécióját mutattam ki valós idejű PCR és MLPA módszerrel (12. ábra). A családtagokban a nagy géndeléció vizsgálata nem volt lehetséges.

53

géndózis %

100

50

0 1. exon

2. exon

3. exon

12. ábra A VHL gén 2. exon deléciójának kimutatása MLPA módszerrel von Hippel-Lindau szindrómás D család indexbetegében (sötét oszlopok). Az üres oszlopok kontroll személy eredményeit mutatják be. (MLPA: multiplex ligációs próba amplifikáció) Az E családban szintén az indexbeteg volt a vizsgálatban résztvevő egyetlen személy, akinél a VHL gén 2. exonon egy új, a nemzetközi irodalomban korábban még nem közölt 2 bázispáros deléciót találtam (354_355delCT) heterozigóta formában. Az F család mindkét klinikailag érintett tagjában a nemzetközi irodalomban korábban leírt betegség-okozó R167Q mutációt igazoltam. Végül a G család indexbetegében és 5 további tagjában a nemzetközi irodalomban betegség-okozó mutációként számontartott heterozigóta S80I mutáció igazolódott. Néhány családtag a P25L variánst is hordozta heterozigóta formában, melyet jelenleg neutrális SNP-nek (rs35460768; dbSNP127) tartanak (108).

IV. 2.3. Látszólag sporadikus phaeochromocytomában szenvedő betegek klinikai és genetikai vizsgálatának eredményei A 37 vizsgált egyoldali LSP-ben szenvedő beteg közül 3 betegben igazoltam a VHL gén heterozigóta missense mutációját. L63P mutációt egy 50 éves férfiben

54

mutattam ki, akinek három egészséges, klinikailag tünetmentes fiútestvére közül kettő szintén hordozta a mutációt, míg az indexbeteg egészséges fiánál a mutáció nem volt jelen. Y156C mutációt egy 55 éves nőbetegnél észleltem, akinek egészséges fiánál a genetikai vizsgálat nem mutatott ki eltérést. R167G mutációt egy fiatal, 20 éves nőbetegben találtam, akinek egészséges édesanyja és két egészséges fiútestvére nem bizonyult mutáció-hordozónak. Mindhárom általam kimutatott mutációt korábban betegség-okozó mutációként ismertették a nemzetközi irodalomban. A mutáció-hordozó LSP betegekben a VHLszindróma egyéb megjelenését nem lehetett kimutatni. A betegség-okozó mutációt nem hordozó 34 LSP betegben a VHL gén nagy deléciójának vizsgálatát is elvégeztem, de ilyen eltérést egyetlen esetben sem találtam.

A

VHL-szindrómában,

illetve

LSP-ban

szenvedő

betegek

genetikai

vizsgálatának eredményeit a 9. táblázat összegzi. Az általam kimutatott genetikai eltérek VHL génen belüli lokalizációját a 13. ábra szemlélteti.

55

9. táblázat VHL-szindrómában, illetve LSP-ban szenvedő betegek vizsgálata során kimutatott genetikai eltérések jellemzői. (LSP: látszólag sporadikus phaeochromocytoma; a egy klinikailag érintett családtagnál a

VHL fenotípus

doménja

VHL fehérje érintett

mutácóhordozók száma

Klinikailag tünetmentes

száma

átesett/ mutációhordozók

Genetikai vizsgálaton

génben

Érintett exon a VHL

VHL genotípus

Család

genetikai vizsgálatot nem lehetett elvégezni)

A

L158V

Exon 3

6/2

1

α

1

B

R161X

Exon 3

2/1

0

α

1

Exon 3

2/1

0

α és β

1

Exon 2

1/1

0

β

1

354_355delCT Exon 2

1/1

0

α és β

1

C D E

3. exon deléciója 2. exon deléciója

F

R167Q

Exon 3

2/2

0

α

2B

G

S80I

Exon 1

21/7a

2

β

2B

LSP

L63P

Exon 1

5/3

2

β

2C

LSP

Y156C

Exon 3

2/1

0

β

2C

LSP

R167G

Exon 3

4/1

0

α

2C

56

13. ábra Vizsgálataim során kimutatott mutációk és deléciók lokalizációja a VHL génen. (A P25L neutrális variánsnak felel meg.)

57

V. Megbeszélés A napjainkban elérhetővé váló újabb és újabb terápiás lehetőségek mellett egyre fontosabb a betegségek minél korábbi diagnosztizálása is. Ennek egyik sarokköve a kódolt genetikai információ megismerése, mely sok esetben lehetőséget teremthet még a betegségek kialakulása előtt a hajlam előrejelzésére. Munkámban a glükokortikoidok iránti érzékenységet befolyásoló GR gén Bcl I polimorfizmussal, valamint a von Hippel-Lindau szindróma és a látszólag sporadikus phaeochromocytoma esetek egy részének hátterében álló VHL gén eltérésekkel foglalkoztam. A GR gén Bcl I polimorfizmusának vizsgálatával hazai egészséges egyénekben nyert eredményeimnek a nemzetközi irodalomban közölt adatokkal összehasonlításával megállapítottam, hogy az általam vizsgált populációban a polimorfizmus előfordulása a kaukázusi populációban korábban észlelt gyakorisághoz hasonlít (10. táblázat). Az általam kifejlesztett új allél-specifikus PCR módszerrel nyert eredményeket nagyszámú DNS mintán két korábbi módszerrel ellenőriztem (restrikciós enzim emésztés és direkt DNS szevenálás) és minden esetben azonos eredményeket kaptam. A korábbi módszerekkel azonos pontosság mellett az új módszer előnye a gyors kivitelezhetőség, a viszonylag alacsony költség- és munkaigény. Az új módszer alkalmazásához nem szükségesek robosztus eszközök vagy sugárvédelmi körülmények. A glükokortikoidok iránti érzékenység megváltozása számos, főleg autoimmun patomechanizmusú, vagy daganatellenes kemoterápiát igénylő betegségben, a HHMtengely aktivitás által befolyásolt kórállapotokban, illetve metabolikus zavarokban fontos tényező lehet. A GR gén Bcl I polimorfizmusa a jelenlegi ismeretek alapján a glükokortikoidok iránti érzékenységet módosító genetikai komponensként szerepet játszhat egyes betegségekre való hajlam kialakulásában, bár szerepe és klinikai jelentősége még ma sem tekinthető tisztázottnak. Az általam kidolgozott megbízható, gyors, költség- munka- és eszköz-kímélő új allél-specifikus módszer alkalmasnak tűnik nagy mintaszámú populáció-szintű vizsgálatok elvégzésére, melyekkel feltehetően további pontos adatok nyerhetők a Bcl I polimorfizmus betegségek iránti hajlamot vagy védettséget befolyásoló szerepéről.

58

10. táblázat A GR gén Bcl I polimorfizmus mutáns alléljának előfordulási gyakorisága különböző egészséges népesség-csoportokban. (H: hivatkozás) Populáció (nem és kor, amennyiben elérhető)

Kontrollcsoport Mutáns allél esetszáma

frekvenciája

Észak-amerikai kaukázusi

50

0,55

Kanadai (középkorú férfiak és nők)

152

Kanadai (90 férfi és 83 nő, fiatal felnőttek és felnőttek)

173

0,41 férfiak 0,35 nők 0,35 férfi 0,373 nő

H (28) (34)

(35)

Svéd (középkorú férfiak)

262

0,368

(32)

Kaukázusi (férfiak, életkor tartomány: 18-40 év)

64

0,492

(33)

191

0,348

1963

0,376

370

0,331

209

0,349

(20)

112

0,366

(37)

42

0,404

(25)

Holland (13 férfi és 20 nő)

33

0,257

(38)

Koreai (17 férfi és 132 nő, átlagos életkor: 50,8 év)

149

0,775

(26)

Afrikai

42

0,202

Amerikai indián

33

0,152

Európai

38

0,289

Ázsiai

29

0,328

Közép-kelet-amerikai

36

0,167

Teljes vizsgált esetszám és átlagos allélfrekvencia

3948

0,362

Saját vizsgálati csoportunk (60 férfi és 187 nő, életkor tartomány: 24-86 év)

247

0,342 férfi 0,345 nő

Holland (92 férfi és 99 nő, életkor tartomány: 53-82 év) Holland (933 férfi és 1030 nő, életkor tartomány: 55-80 év) Holland (idős férfiak, 73 év felett) Holland (99 férfi és 110 nő, életkor tartomány: 53-82 év) Európai (férfi ikrek, átlagos életkor: 18,9 év) Ausztrál (veterán férfiak, életkor tartomány: 53-76 év)

59

(21)

(24)

VHL-szindrómás családokban és LPS-ben szenvedő betegekben a VHL gén vizsgálatával foglalkozó hazai összefoglaló tanulmányt korábban még nem végeztek. Munkámban a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikáján 10 év alatt vizsgált 7 VHL-szindrómás családban 7 különböző betegség-okozó VHL gén eltérést mutattam ki, míg a vizsgált 37 LSP beteg közül 3 betegben (8,1%) találtam betegségokozó VHL gén mutációt. Az általam kimutatott összesen 10 betegség-okozó génhiba közül 1 nonsense mutáció (R161X), 6 missense mutáció (L158V, R167Q, S80I, L63P, Y156C és R167G), 1 kis deléció (354_355delCT) és 2 nagy géndeléció volt. Ezeken kívül egy VHL családban benignusnak tartható VHL génvariánst is kimutattam (P25L). Ezek a genetikai eltérések a VHL génben elszórtan helyezkedtek el, nem ismétlődtek a családok között és nem tömörülnek mutációs hot spot(ok)-ba. A gén-hibák típusának és a klinikai fenotípus elemzésével megállapítottam, hogy a nonsense mutáció, ill. 2 bp kis deléció vagy nagy deléció miatt csonkolt VHL fehérjét eredményező génhibák csak a VHL-szindróma 1-es típusába sorolható családokban fordultak elő, míg a missense mutációk döntően, de nem kizárólag a VHLszindróma 2B és 2C típusában voltak jelen. A hazai betegekben tapasztalt mutációs spektrum nem különbözött lényegesen a nyugati, japán, vagy kínai populációkban közölt eltérésektől (110-112). Az egyik legnagyobb beteganyagot feldolgozó tanulmányban 6 mutációs hot spot-ot azonosítottak, melyek közül kettő (R161X és R167Q) saját betegeinkben is fellelhető volt (113). A

nemzetközi

VHL

gén

mutációs

adatbázisok

tanulmányozásával

megállapítottam, hogy egy kivételével mind a 10 általam igazolt betegség-okozó génhibát már korábban ismertették a nemzetközi irodalomban. Az általam észlelt új, 2 bázispárt érintő deléció (354_355delCT) és a korábban már leírt R161X mutáció (melyek a VHL-szindróma 1-es típusával társultak) a korai lánc-termináció révén csonkolt és ezáltal jelentősen károsodott működésű VHL fehérje képződéséhez vezetnek. A VHL gén két különböző exonját (2. és 3. exonok) érintő nagy deléció, mely a VHL-szindróma 1-es típusában jelent meg szintén hiányos fehérje képződésével és súlyos funkcionális következménnyel jár. Bár az összes VHL eset mintegy 20%-ában előforduló nagy géndeléciók rendszerint a VHL-szindróma 1-es típusának képében jelentkeznek (114) az irodalomban olyan belga és lengyel nemzetiségű VHL családokat

60

is közöltek, akiknél kizárólag központi idegrendszeri haemangioblastomát (central nervous system haemangioblastoma only”) észleltek (112, 115). A hazai betegekben kimutatott 6 különböző missense mutáció mindegyikét betegség-okozó mutációként írták le a nemzetközi irodalomban. Az S80I mutációt korábban nyugati országokban VHL-szindróma 1-es típusában szenvedő családokban mutatták ki, azonban – saját eredményeinkhez hasonlóan – újabban egy kínai családban VHL-szindróma 2-es típusához társulva is észlelték (116). Kiemelést érdemel, hogy egy általam vizsgált családban az S80I mutáció a P25L gén-variánssal együtt fordult elő (108). A P25L korábbbi vizsgálatokban benignus gén-variánsnak bizonyult (117, 118), azonban az S80 kodon – a szintén szerin aminosavat kódoló S68, S72 és S65 bázishármasokkal együtt – fontos foszforilációs helyként működik (a glikogén-szintázkináz 3 (GSK3) szubsztrátja a pVHL30 fehérjén belül) (119). Ezek a szerin aminosavat kódoló kodonok a mikrotubulusok stabilizációjában is fontos szerepet játszanak. A GSK3 több olyan jelátviteli útvonal alkotóeleme, amelyek humán daganatokban módosulnak (aktiválódnak vagy gátlódnak). Ezek a szerin aminosavak a pVHL onkogén hatásának

közvetítésében

is

szerepet

játszanak

a

mikrotubulus

dinamika

megváltoztatása révén (119). Lolkema és munkatársai kimutatták, hogy más, szintén savas kémhatású N-terminális végen található szerin aminosavak (S33, S38 és S43) foszforilációja HIF1α-független tumorszuppresszor hatáshoz vezet (120). További érdekes megfigyelésünk, hogy az R161X csonkoló mutációt hordozó VHL-szindróma 2-es típusában szenvedő fiatal indexbetegnél renális eltérés nélkül enyhe polyglobulia fordult elő, ami valószínűtlenné tette annak a lehetőségét, hogy a polyglobulia az eritropoietin (EPO) túltermelésével állt összefüggésben. VHL gén mutációk egy ritka veleszületett rendellenességben, a Chuvash-polycythaemiában (CP) is előfordulhatnak, azonban ez a kórkép nem társul a VHL-szindrómára jellemző tumorokkal (104, 121-126). A nemzetközi irodalomban VHL-szindrómában az erythrocytosis gyakoriságát 5-20% közöttinek tartják, de nem találtam olyan adatot, amely az erythrocytosis eredetét nagy valószínűséggel nem renalis EPO túltermeléssel hozták volna összefüggésbe (93). A VHL és CP lényegesen eltér abban, hogy míg a VHL-szindróma autoszomális domináns módon öröklődik addig a CP autoszomális recesszív öröklésmenetet mutat. CP-ban szenvedőknél csírasejtes homozigóta vagy compound heterozigóta, míg VHL szindrómában heterozigóta VHL gén mutáció

61

észlelhető. Ennek alapján felmerül az a kérdés, hogy CP-ban a VHL-szindrómára jellemző tumorképződés hiányában mely géne(ek)nek lehet szerepe (127, 128). Megfigyeltük, hogy a R167Q mutációt hordozó VHL szindrómás betegben patkóvese fordult elő, amit korábban kivételesen ritkán észleltek (129). Valószínű, hogy a patkóvese az embrionális fejlődés korai szakaszában a mesonephros caudalis irányú vándorlásának rendellenességeként alakul ki, melyben a VHL fehérje is szerepet játszhat (130). Irodalmi adatok szerint VHL-szindrómás családokban a phaeochromocytoma előfordulása 30% körüli (131), melynek saját eredményeink is megfelelnek. Saját vizsgálatomban a vizsgált 7 VHL család közül 3 családban, illetve a 18 klinikailag érintett

egyén

közül

5

eseten

észleltem

phaeochromocytomát.

A

phaeochromocytomával járó örökletes szindrómák hátterében leggyakrabban a VHL (VHL-szindróma), a RET (MEN2 szindróma), az NF1 (neurofibromatosis 1) és az SDHX

gének eltérései mutathatók ki. E gének defektusai nem szelektált

phaeochromocytoma esetek mintegy 20-30 %-ában fordulnak elő (77). Látszólag sporadikus phaeochromocytomás betegek körében a VHL gén defektusainak gyakoriságát 0-11%-osnak találták (78, 79, 84-86), bár néhány vizsgálatban ennél nagyobb gyakoriságot közöltek (132), melyet inkább az adott populációban tapasztalt „alapító hatásnak” (founder effect) tulajdonítottak (133). Vizsgálataim során 37 egyoldali látszólag sporadikus phaeochromocytomában szenvedő beteg közül 3 esetben (8,1%) találtam csírasejtes VHL gén mutációt. Mindhárom betegben különböző mutációt mutattak ki (L63P, Y156C és R167G), melynek alapján az ”alapító hatás” lehetősége elvethető volt. Ezeket a mutációkat VHLszindrómás betegekben már korábban betegség-okozó mutációként írták le. Az L63 a βdomén első aminosava, melynek L63P mutációja esetén a leucin lánctörő prolinra cserélődik (134). Az Y156 aminosav az α- és β-domén kritikus kapcsolódási pontjának bizonyult (97). Az R167 aminosavat érintő missense mutációk VHL-szindrómában gyakran társulnak phaeochromocytomával (94); saját betegeinkben az R167G phaeochromocytomával, míg az R167Q a VHL-szindróma 2-es típusával járt együtt.

62

VI. Következtetések 1. Az endokrin szabályozásban kiemelt jelentőségű hypothalamus-hypophysismellékvesekéreg tengely különösen a kortizol szerepe. A kortizol iránti érzékenységet ismerten befolyásoló GR gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására a már rendelkezésre álló módszereknél egyszerűbb, új allél-specifikus PCR módszert dolgoztam ki. Az általam kifejlesztett allél-specifikus PCR módszerrel nyert eredményeket nagyszámú DNS mintán két korábbi módszerrel (restrikciós enzim emésztés és direkt DNS szevenálás) ellenőriztem, és minden esetben azonos eredményeket kaptam. A korábbi módszerekkel azonos pontosság mellett az új módszer előnye a gyors kivitelezhetőség, a viszonylag alacsony költség- és munkaigény. Az új módszer alkalmazásához nem szükségesek robosztus eszközök vagy sugárvédelmi körülmények. Megállapítottam, hogy hazai egészséges egyénekben a polimorf allél gyakorisága 34,4%, ami hasonló a kaukázusi populációban korábban közölt gyakorisághoz. 2. A Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinikán 1998-2008 között vizsgált 7 VHL szindrómás család 35 tagjában és 37 látszólag sporadikus egyoldali phaeochromocytomában szenvedő betegnél hazánkban elsőként végeztem átfogó jellegű vizsgálatot a betegség-okozó VHL gén eltérések azonosítására. A pontmutációk és kis géndeléciók kimutatására alkalmas direkt DNS szekvenáláson kívül a VHL gén nagy szakaszát érintő deléciók vizsgálatára kvantitatív valós-idejű PCR és MLPA módszereket vezettem be. E módszerek együttes alkalmazásával kidolgozott szűrőprogram

alkalmasnak

bizonyult

az

érintett

betegekben,

ill.

vérrokon

családtagokban a betegség-okozó genetikai eltéréseknek a szokásosnál hatékonyabb kimutatására. A módszer hatékonyságát bizonyítja, hogy a vizsgált 7 VHL-szindrómás családban mindegyikében kimutattam a betegség-okozó VHL génhibát, továbbá a 37 látszólag sporadikus egyoldali phaeochromocytomában szenvedő beteg közül 3 betegben találtam betegség-okozó VHL gén mutációt. Az általam kimutatott összesen 10 betegség-okozó génhiba közül 1 nonsense mutáció (R161X), 6 missense mutáció (L158V, R167Q, S80I, L63P, Y156C és R167G), 1 kis deléció (354_355delCT) és 2 nagy géndeléció volt. Ezek a genetikai eltérések a VHL génben elszórtan helyezkedtek el, nem ismétlődtek a családok között és nem tömörülnek mutációs hot spot(ok)-ba. A

63

gén-hibák típusának és a klinikai fenotípus elemzésével megállapítottam, hogy a nonsense mutáció, ill. 2 bp kis deléció vagy nagy deléció miatt csonkolt VHL fehérjét eredményező génhibák csak a VHL-szindróma 1-es típusába sorolható családokban fordultak elő, míg a missense mutációk döntően, de nem kizárólag a VHL-szindróma 2B és 2C típusában voltak jelen. A hazai betegekben tapasztalt mutációs spektrum nem különbözött lényegesen a nyugati, japán, vagy kínai populációkban közölt eltérésektől. A nemzetközi VHL gén mutációs adatbázisok tanulmányozásával megállapítottam, hogy egy kivételével (354_355delCT) mind a 10 általam igazolt betegség-okozó génhibát már korábban ismertették a nemzetközi irodalomban. Eredményeim alapján a VHL gén vizsgálat VHL-szindrómás betegeken és vérrokon családtagjain kívül látszólag sporadikus phaeochromocytoma esetén is javasolható.

64

VII. Összefoglalás A hormonális szabályozó rendszer működésének, illetve e rendszert érintő kóros állapotok hátterében álló eltérések megismeréséhez alkalmazott molekuláris biológiai módszerek széles tárházából a megfelelő módszer kiválasztása alapvető fontossággal bír a klinikai jelentőségű genetikai eltérések pontos és gyors kimutatásához. Munkán első részében az endokrin szabályozásban kiemelt jelentőségű hypothalamus-hypophysismellékvesekéreg tengely anyagcsere és egyéb hatásaiért felelős kortizol iránti érzékenységet ismerten befolyásoló glükokortikoid receptor (GR) gén Bcl I polimorfizmusának kimutatására a korábban rendelkezésre álló módszereknél egyszerűbb új allél-specifikus PCR módszert dolgoztam ki. A korábbi módszerekkel azonos pontosság mellett az új módszer előnye a gyors kivitelezhetőség, a viszonylag alacsony költség-, eszköz- és munkaigény. Megállapítottam, hogy hazai egészséges egyénekben a polimorf allél gyakorisága 34,4%, ami hasonló a kaukázusi populációban korábban közölt gyakorisághoz. Munkám második részében a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikán 1998-2008 között vizsgált 7 von Hippel-Lindau szindrómás (VHL) család 35 tagjában és 37 látszólag sporadikus egyoldali phaeochromocytomában (LSP) szenvedő betegnél hazánkban elsőként végeztem átfogó jellegű vizsgálatot a betegség-okozó VHL gén eltérések azonosítására. A pont mutációk és kis géndeléciók kimutatására alkalmas direkt DNS szekvenáláson kívül a VHL gén nagy szakaszát érintő deléciók vizsgálatára kvantitatív valós-idejű PCR és MLPA módszereket vezettem be. E módszerek együttes alkalmazásának hatékonyságát bizonyítja, hogy a vizsgált 7 VHL család mindegyikében kimutattam a betegség-okozó VHL génhibát, továbbá a 37 LSP beteg közül 3 betegben találtam mutációt. Az általam kimutatott összesen 10 génhiba közül 1 nonsense mutáció (R161X), 6 missense mutáció (L158V, R167Q, S80I, L63P, Y156C és R167G), 1 kis deléció (354_355delCT) és 2 nagy géndeléció volt. A 354_355delCT új, korábban még nem közölt génhibának felelt meg, a többi VHL gén eltérést már korábban ismertették az irodalomban. A gén-hibák típusának és a klinikai fenotípus elemzésével megállapítottam, hogy a nonsense mutáció, ill. 2 bp kis deléció vagy nagy deléció miatt csonkolt VHL fehérjét eredményező génhibák csak a VHLszindróma 1. típusába sorolható családokban fordultak elő, míg a missense mutációk döntően a VHL-szindróma 2B és 2C típusában voltak jelen. Eredményeim alapján a VHL gén vizsgálat VHL betegeken /családtagokon kívül LSP-ben is javasolható.

65

Summary The appropriate selection of methods from numerous molecular biology techniques for studying the function and for understanding alterations underlying disorders of the hormonal regulatory system seems mandatory for accurate and rapid diagnosis of clinically relevant genetic abnormalities. In the first part of my work I developed a novel allele-specific PCR method for the detection of the Bcl I polymorphism of the glucocorticoid receptor (GR) gene which has known influence on sensitivity to cortisol that mediates the metabolic and other effects of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. While preserving the high sensitivity of earlier techniques, this novel method is timeand labour-saving with a relatively low cost and it does not need expensive laboratory equipments. With the use of the novel method in a large cohort of healthy Hungarian subjects I showed that the frequency of the polymorphic Bcl I allele is 34.4%, which is similar to published data in other Caucasian populations. In the second part of my work I analysed the disease-causing genetic alterations of the von Hippel-Lindau (VHL) gene in 7 families with 35 members with VHL-syndrome and in 37 unrelated patients with apparently sporadic pheochromocytomas (ASP) who were evaluated at the 2nd Department of Medicine, Semmelweis University between 1998 and 2008. My work represents the first comprehensive study of the VHL gene in Hungarian population. In addition to the analysis of point-mutations and small deletions with direct DNA-sequencing, I applied real-time PCR and multiplex ligation probe amplification (MLPA) for the detection of large gene deletions of the VHL gene. Combined application of these methods proved to be highly effective, as I detected different disease-causing VHL gene mutations in each of the 7 VHL families as well as in 3 of the 37 LSP patients. The 10 genetic abnormalities included one nonsense (R161X) and 6 missense mutations (L158V, R167Q, S80I, L63P, Y156C and R167G), one small (354_355delCT) and 2 large deletions. The 354_355delCT proved to be a novel gene defect, however, the other mutations have been already known in the literature. With the analysis of genotype-phenotype correlations I showed that nonsense mutation, 2 basepair small deletion and the 2 large deletions leading to truncated VHL protein were only found in VHL type 1 while missense mutations were predominantly found in VHL types 2B and 2C. Based on the results, VHL gene testing is recommended not only in patients /family members with VHL-syndrome but also in patients with LSP.

66

VIII. Irodalomjegyzék 1.

Dahm R. (2008) Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Hum Genet, 6: 565-581.

2.

Levene PA. (1919) The structure of yeast nucleic acid. IV. Ammonia hydrolysis. J Biol Chem, 2: 415-424.

3.

Griffith F. (1928) The significance of pneumococcal types. J Hyg, 113-159.

4.

Avery OT, MacLeod CM, McCarty M. (1979) Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J Exp Med, 297326.

5.

Hershey AD, Chase M. (1952) Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol, 1: 39-56.

6.

Watson JD, Crick FH. (1953) Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, 4356: 737-738.

7.

Mullis KB, Faloona FA. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol, 335-350.

8.

Cooper GM, Nickerson DA, Eichler EE. (2007) Mutational and selective effects on copy-number variants in the human genome. Nat Genet, 7 Suppl: S22-29.

9.

Beckmann JS, Estivill X, Antonarakis SE. (2007) Copy number variants and genetic traits: closer to the resolution of phenotypic to genotypic variability. Nat Rev Genet, 8: 639-646.

10.

den Dunnen JT, Antonarakis SE. (2000) Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion. Hum Mutat, 1: 7-12.

11.

Larsen PR, Kronenberg HM, Melmed S, Polonsky KS. Principles of Endocrinology. In: Larsen PR, Kronenberg HM, Melmed S Polonsky KS (szerk.), Williams Textbook of Endocrinology 10th edition. Saunders, Philadelphia, 2003: 8-9.

12.

Laron Z. (2004) Laron syndrome (primary growth hormone resistance or insensitivity): the personal experience 1958-2003. J Clin Endocrinol Metab, 3: 1031-1044.

13.

Paschke R, Ludgate M. (1997) The thyrotropin receptor in thyroid diseases. N Engl J Med, 23: 1675-1681.

67

14.

Brooks MH, Barbato AL, Collins S, Garbincius J, Neidballa RG, Hoffman D. (1981) Familial thyroid hormone resistance. Am J Med, 3: 414-421.

15.

Vingerhoeds AC, Thijssen JH, Schwarz F. (1976) Spontaneous hypercortisolism without Cushing's syndrome. J Clin Endocrinol Metab, 5: 1128-1133.

16.

Bronnegard M, Werner S, Gustafsson JA. (1986) Primary cortisol resistance associated with a thermolabile glucocorticoid receptor in a patient with fatigue as the only symptom. J Clin Invest, 5: 1270-1278.

17.

Lamberts SW, Poldermans D, Zweens M, de Jong FH. (1986) Familial cortisol resistance: differential diagnostic and therapeutic aspects. J Clin Endocrinol Metab, 6: 1328-1333.

18.

DeRijk RH, Schaaf M, de Kloet ER. (2002) Glucocorticoid receptor variants: clinical implications. J Steroid Biochem Mol Biol, 2: 103-122.

19.

van Rossum EF, Lamberts SW. (2004) Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and their associations with metabolic parameters and body composition. Recent Prog Horm Res, 333-357.

20.

van Rossum EF, Roks PH, de Jong FH, Brinkmann AO, Pols HA, Koper JW, Lamberts SW. (2004) Characterization of a promoter polymorphism in the glucocorticoid receptor gene and its relationship to three other polymorphisms. Clin Endocrinol (Oxf), 5: 573-581.

21.

van Rossum EF, Koper JW, van den Beld AW, Uitterlinden AG, Arp P, Ester W, Janssen JA, Brinkmann AO, de Jong FH, Grobbee DE, Pols HA, Lamberts SW. (2003) Identification of the BclI polymorphism in the glucocorticoid receptor gene: association with sensitivity to glucocorticoids in vivo and body mass index. Clin Endocrinol (Oxf), 5: 585-592.

22.

Fleury I, Primeau M, Doreau A, Costea I, Moghrabi A, Sinnett D, Krajinovic M. (2004) Polymorphisms in genes involved in the corticosteroid response and the outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pharmacogenomics, 5: 331-341.

23.

Di Blasio AM, van Rossum EF, Maestrini S, Berselli ME, Tagliaferri M, Podesta F, Koper JW, Liuzzi A, Lamberts SW. (2003) The relation between two polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and body mass index, blood pressure and cholesterol in obese patients. Clin Endocrinol (Oxf), 1: 68-74.

68

24.

Fleury I, Beaulieu P, Primeau M, Labuda D, Sinnett D, Krajinovic M. (2003) Characterization of the BclI polymorphism in the glucocorticoid receptor gene. Clin Chem, 9: 1528-1531.

25.

Bachmann AW, Sedgley TL, Jackson RV, Gibson JN, Young RM, Torpy DJ. (2005) Glucocorticoid receptor polymorphisms and post-traumatic stress disorder. Psychoneuroendocrinology, 3: 297-306.

26.

Lee EB, Kim JY, Lee YJ, Song YW. (2005) Glucocorticoid receptor polymorphisms in Korean patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 3: 503-504.

27.

Zalewski G, Wasilewska A, Zoch-Zwierz W, Chyczewski L. (2008) Response to prednisone in relation to NR3C1 intron B polymorphisms in childhood nephrotic syndrome. Pediatr Nephrol, 7: 1073-1078.

28.

Murray JC, Smith RF, Ardinger HA, Weinberger C. (1987) RFLP for the glucocorticoid receptor (GRL) located at 5q11-5q13. Nucleic Acids Res, 16: 6765.

29.

Weaver JU, Hitman GA, Kopelman PG. (1992) An association between a Bcl I restriction fragment length polymorphism of the glucocorticoid receptor locus and hyperinsulinaemia in obese women. J Mol Endocrinol, 3: 295-300.

30.

Ukkola O, Perusse L, Chagnon YC, Despres JP, Bouchard C. (2001) Interactions among the glucocorticoid receptor, lipoprotein lipase and adrenergic receptor genes and abdominal fat in the Quebec Family Study. Int J Obes Relat Metab Disord, 9: 1332-1339.

31.

Ukkola O, Rosmond R, Tremblay A, Bouchard C. (2001) Glucocorticoid receptor Bcl I variant is associated with an increased atherogenic profile in response to long-term overfeeding. Atherosclerosis, 1: 221-224.

32.

Rosmond R, Chagnon YC, Holm G, Chagnon M, Perusse L, Lindell K, Carlsson B, Bouchard C, Bjorntorp P. (2000) A glucocorticoid receptor gene marker is associated with abdominal obesity, leptin, and dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Obes Res, 3: 211-218.

33.

Panarelli M, Holloway CD, Fraser R, Connell JM, Ingram MC, Anderson NH, Kenyon

CJ.

(1998)

Glucocorticoid

69

receptor

polymorphism,

skin

vasoconstriction, and other metabolic intermediate phenotypes in normal human subjects. J Clin Endocrinol Metab, 6: 1846-1852. 34.

Buemann B, Vohl MC, Chagnon M, Chagnon YC, Gagnon J, Perusse L, Dionne F, Despres JP, Tremblay A, Nadeau A, Bouchard C. (1997) Abdominal visceral fat is associated with a BclI restriction fragment length polymorphism at the glucocorticoid receptor gene locus. Obes Res, 3: 186-192.

35.

Tremblay A, Bouchard L, Bouchard C, Despres JP, Drapeau V, Perusse L. (2003) Long-term adiposity changes are related to a glucocorticoid receptor polymorphism in young females. J Clin Endocrinol Metab, 7: 3141-3145.

36.

Schuster SC. (2008) Next-generation sequencing transforms today's biology. Nat Methods, 1: 16-18.

37.

Wust S, Van Rossum EF, Federenko IS, Koper JW, Kumsta R, Hellhammer DH. (2004) Common polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene are associated with adrenocortical responses to psychosocial stress. J Clin Endocrinol Metab, 2: 565-573.

38.

van Winsen LL, Hooper-van Veen T, van Rossum EF, Polman CH, van den Berg TK, Koper JW, Uitdehaag BM. (2005) The impact of glucocorticoid receptor gene polymorphisms on glucocorticoid sensitivity is outweighted in patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 1-2: 150-156.

39.

Bell PA, Chaturvedi S, Gelfand CA, Huang CY, Kochersperger M, Kopla R, Modica F, Pohl M, Varde S, Zhao R, Zhao X, Boyce-Jacino MT, Yassen A. (2002)

SNPstream

UHT:

ultra-high

throughput

SNP

genotyping

for

pharmacogenomics and drug discovery. Biotechniques, 70-72, 74, 76-77. 40.

Huizenga NA, Koper JW, de Lange P, Pols HA, Stolk RP, Grobbee DE, de Jong FH, Lamberts SW. (1998) Interperson variability but intraperson stability of baseline plasma cortisol concentrations, and its relation to feedback sensitivity of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis to a low dose of dexamethasone in elderly individuals. J Clin Endocrinol Metab, 1: 47-54.

41.

van Rossum EF, Koper JW, Huizenga NA, Uitterlinden AG, Janssen JA, Brinkmann AO, Grobbee DE, de Jong FH, van Duyn CM, Pols HA, Lamberts SW. (2002) A polymorphism in the glucocorticoid receptor gene, which

70

decreases sensitivity to glucocorticoids in vivo, is associated with low insulin and cholesterol levels. Diabetes, 10: 3128-3134. 42.

van Rossum EF, Voorhoeve PG, te Velde SJ, Koper JW, Delemarre-van de Waal HA, Kemper HC, Lamberts SW. (2004) The ER22/23EK polymorphism in the glucocorticoid receptor gene is associated with a beneficial body composition and muscle strength in young adults. J Clin Endocrinol Metab, 8: 4004-4009.

43.

Russcher H, van Rossum EF, de Jong FH, Brinkmann AO, Lamberts SW, Koper JW. (2005) Increased expression of the glucocorticoid receptor-A translational isoform as a result of the ER22/23EK polymorphism. Mol Endocrinol, 7: 16871696.

44.

Detera-Wadleigh SD, Encio IJ, Rollins DY, Coffman D, Wiesch D. (1991) A TthIII1 polymorphism on the 5' flanking region of the glucocorticoid receptor gene (GRL). Nucleic Acids Res, 8: 1960.

45.

Bamberger CM, Bamberger AM, de Castro M, Chrousos GP. (1995) Glucocorticoid receptor beta, a potential endogenous inhibitor of glucocorticoid action in humans. J Clin Invest, 6: 2435-2441.

46.

Majnik J, Patocs A, Balogh K, Toth M, Gergics P, Szappanos A, Mondok A, Borgulya G, Panczel P, Prohaszka Z, Racz K. (2006) Overrepresentation of the N363S variant of the glucocorticoid receptor gene in patients with bilateral adrenal incidentalomas. J Clin Endocrinol Metab, 7: 2796-2799.

47.

Luczay A, Torok D, Ferenczi A, Majnik J, Solyom J, Fekete G. (2006) Potential advantage of N363S glucocorticoid receptor polymorphism in 21-hydroxylase deficiency. Eur J Endocrinol, 6: 859-864.

48.

Boyle B, Koranyi K, Patocs A, Liko I, Szappanos A, Bertalan R, Racz K, Balazs C. (2008) Polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene in Graves ophthalmopathy. Br J Ophthalmol, 1: 131-134.

49.

Bertalan R, Patocs A, Boyle B, Rigo J, Jr., Racz K. (2009) The protective effect of the ER22/23EK polymorphism against an excessive weight gain during pregnancy. Gynecol Endocrinol, 1-4.

50.

Szappanos A, Patocs A, Toke J, Boyle B, Sereg M, Majnik J, Borgulya G, Varga I, Liko I, Racz K, Toth M. (2009) BclI polymorphism of the glucocorticoid

71

receptor gene is associated with decreased bone mineral density in patients with endogenous hypercortisolism. Clin Endocrinol (Oxf), 5: 636-643. 51.

Rosmond R. (2002) The glucocorticoid receptor gene and its association to metabolic syndrome. Obes Res, 10: 1078-1086.

52.

Balázs C. A genetikai tényezők szerepe. In: Leövey A (szerk.), A klinikai endokrinológia és anyagcsere-betegségek kézikönyve. Medicina, Budapest, 2001: 39-44.

53.

Rácz K. Adenohypophysis. In: Leövey A (szerk.), A klinikai endokrinológia és anyagcsere-betegségek kézikönyve. Medicina, Budapest, 2001: 160-161.

54.

Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, Feuk L, Perry GH, Andrews TD, Fiegler H, Shapero MH, Carson AR, Chen W, Cho EK, Dallaire S, Freeman JL, Gonzalez JR, Gratacos M, Huang J, Kalaitzopoulos D, Komura D, MacDonald JR, Marshall CR, Mei R, Montgomery L, Nishimura K, Okamura K, Shen F, Somerville MJ, Tchinda J, Valsesia A, Woodwark C, Yang F, Zhang J, Zerjal T, Zhang J, Armengol L, Conrad DF, Estivill X, Tyler-Smith C, Carter NP, Aburatani H, Lee C, Jones KW, Scherer SW, Hurles ME. (2006) Global variation in copy number in the human genome. Nature, 7118: 444-454.

55.

Jakobsson M, Scholz SW, Scheet P, Gibbs JR, VanLiere JM, Fung HC, Szpiech ZA, Degnan JH, Wang K, Guerreiro R, Bras JM, Schymick JC, Hernandez DG, Traynor BJ, Simon-Sanchez J, Matarin M, Britton A, van de Leemput J, Rafferty I, Bucan M, Cann HM, Hardy JA, Rosenberg NA, Singleton AB. (2008) Genotype, haplotype and copy-number variation in worldwide human populations. Nature, 7181: 998-1003.

56.

Nakamura Y. (2009) DNA variations in human and medical genetics: 25 years of my experience. J Hum Genet, 1: 1-8.

57.

Armour JA, Barton DE, Cockburn DJ, Taylor GR. (2002) The detection of large deletions or duplications in genomic DNA. Hum Mutat, 5: 325-337.

58.

Poe BG, Navratil M, Arriaga EA. (2007) Absolute quantitation of a heteroplasmic mitochondrial DNA deletion using a multiplex three-primer realtime PCR assay. Anal Biochem, 2: 193-200.

59.

Carter NP. (2007) Methods and strategies for analyzing copy number variation using DNA microarrays. Nat Genet, 7 Suppl: S16-21.

72

60.

Pozdnyakova O, Miron PM, Tang G, Walter O, Raza A, Woda B, Wang SA. (2008) Cytogenetic abnormalities in a series of 1,029 patients with primary myelodysplastic syndromes: a report from the US with a focus on some undefined single chromosomal abnormalities. Cancer, 12: 3331-3340.

61.

Wang TL, Maierhofer C, Speicher MR, Lengauer C, Vogelstein B, Kinzler KW, Velculescu VE. (2002) Digital karyotyping. Proc Natl Acad Sci U S A, 25: 16156-16161.

62.

Desviat LR, Perez B, Ugarte M. (2006) Identification of exonic deletions in the PAH gene causing phenylketonuria by MLPA analysis. Clin Chim Acta, 1-2: 164-167.

63.

Wedell A, Ritzen EM, Haglund-Stengler B, Luthman H. (1992) Steroid 21hydroxylase deficiency: three additional mutated alleles and establishment of phenotype-genotype relationships of common mutations. Proc Natl Acad Sci U S A, 15: 7232-7236.

64.

Barta C, Sasvári-Székely M, Guttman A. (1998) Simultaneous analysis of various mutations on the 21-hydroxylase gene by multi-allele specific amplification and capillary gel electrophoresis. J Chromatogr A, 1-2: 281-286.

65.

Dolzan V, Solyom J, Fekete G, Kovacs J, Rakosnikova V, Votava F, Lebl J, Pribilincova Z, Baumgartner-Parzer SM, Riedl S, Waldhauser F, Frisch H, Stopar-Obreza M, Krzisnik C, Battelino T. (2005) Mutational spectrum of steroid 21-hydroxylase and the genotype-phenotype association in Middle European patients with congenital adrenal hyperplasia. Eur J Endocrinol, 1: 99106.

66.

Pavlova A, El-Maarri O, Luxembourg B, Lindhoff-Last E, Kochhan L, Bruhn HD, Delev D, Watzka M, Seifried E, Oldenburg J. (2006) Detection of heterozygous large deletions in the antithrombin gene using multiplex polymerase

chain

reaction

and

denatured

high

performance

liquid

chromatography. Haematologica, 9: 1264-1267. 67.

Gergics P, Patócs A, Tóth M, Igaz P, Szücs N, Likó I, Fazakas F, Szabó I, Kovács B, Gláz E, Rácz K. (2009) Germline VHL gene mutations in Hungarian families with von Hippel-Lindau disease and patients with apparently sporadic unilateral phaeochromocytomas. Eur J Endocrinol, 3: 495-502.

73

68.

Weissenbach J, Gyapay G, Dib C, Vignal A, Morissette J, Millasseau P, Vaysseix G, Lathrop M. (1992) A second-generation linkage map of the human genome. Nature, 6398: 794-801.

69.

Murray JC, Buetow KH, Weber JL, Ludwigsen S, Scherpbierheddema T, Manion F, Quillen J, Sheffield VC, Sunden S, Duyk GM, Weissenbach J, Gyapay G, Dib C, Morrissette J, Lathrop GM, Vignal A, White R, Matsunami N, Gerken S, Melis R, Albertsen H, Plaetke R, Odelberg S, Ward D, Dausset J, Cohen D, Cann H. (1994) A comprehensive human linkage map with centimorgan density. Cooperative Human Linkage Center (CHLC). Science, 5181: 2049-2054.

70.

Stewart EA, McKusick KB, Aggarwal A, Bajorek E, Brady S, Chu A, Fang N, Hadley D, Harris M, Hussain S, Lee R, Maratukulam A, O'Connor K, Perkins S, Piercy M, Qin F, Reif T, Sanders C, She X, Sun WL, Tabar P, Voyticky S, Cowles S, Fan JB, Mader C, Quackenbush J, Myers RM, Cox DR. (1997) An STS-based radiation hybrid map of the human genome. Genome Res, 5: 422433.

71.

Armour JA, Sismani C, Patsalis PC, Cross G. (2000) Measurement of locus copy number by hybridisation with amplifiable probes. Nucleic Acids Res, 2: 605-609.

72.

Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res, 12: 57-69.

73.

Wong LJ, Dimmock D, Geraghty MT, Quan R, Lichter-Konecki U, Wang J, Brundage EK, Scaglia F, Chinault AC. (2008) Utility of oligonucleotide arraybased comparative genomic hybridization for detection of target gene deletions. Clin Chem, 7: 1141-1148.

74.

Balázs M, Ádány R. (2001) Molekuláris morfológiai módszerek a laboratóriumi medicinában. Lege Artis Medicinae, 5: 340-346.

75.

Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, Collins C, Kuo WL, Chen C, Zhai Y, Dairkee SH, Ljung BM, Gray JW, Albertson DG. (1998) High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nat Genet, 2: 207-211.

74

76.

Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, Eisen MB, Pergamenschikov A, Williams CF, Jeffrey SS, Botstein D, Brown PO. (1999) Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet, 1: 41-46.

77.

Maher ER, Eng C. (2002) The pressure rises: update on the genetics of phaeochromocytoma. Hum Mol Genet, 20: 2347-2354.

78.

van der Harst E, de Krijger RR, Dinjens WN, Weeks LE, Bonjer HJ, Bruining HA, Lamberts SW, Koper JW. (1998) Germline mutations in the vhl gene in patients presenting with phaeochromocytomas. Int J Cancer, 3: 337-340.

79.

Neumann HP, Bausch B, McWhinney SR, Bender BU, Gimm O, Franke G, Schipper J, Klisch J, Altehoefer C, Zerres K, Januszewicz A, Eng C, Smith WM, Munk R, Manz T, Glaesker S, Apel TW, Treier M, Reineke M, Walz MK, Hoang-Vu C, Brauckhoff M, Klein-Franke A, Klose P, Schmidt H, MaierWoelfle M, Peczkowska M, Szmigielski C, Eng C. (2002) Germ-line mutations in nonsyndromic pheochromocytoma. N Engl J Med, 19: 1459-1466.

80.

Lonser RR, Glenn GM, Walther M, Chew EY, Libutti SK, Linehan WM, Oldfield EH. (2003) von Hippel-Lindau disease. Lancet, 9374: 2059-2067.

81.

Mulligan LM, Kwok JB, Healey CS, Elsdon MJ, Eng C, Gardner E, Love DR, Mole SE, Moore JK, Papi L, Ponder MA, Telenius H, Tunnacliffe A, Ponder BAJ. (1993) Germ-line mutations of the RET proto-oncogene in multiple endocrine neoplasia type 2A. Nature, 6428: 458-460.

82.

Bryant J, Farmer J, Kessler LJ, Townsend RR, Nathanson KL. (2003) Pheochromocytoma: the expanding genetic differential diagnosis. J Natl Cancer Inst, 16: 1196-1204.

83.

Baysal BE, Willett-Brozick JE, Lawrence EC, Drovdlic CM, Savul SA, McLeod DR, Yee HA, Brackmann DE, Slattery WH, 3rd, Myers EN, Ferrell RE, Rubinstein WS. (2002) Prevalence of SDHB, SDHC, and SDHD germline mutations in clinic patients with head and neck paragangliomas. J Med Genet, 3: 178-183.

84.

Lenders JW, Eisenhofer G, Mannelli M, Pacak K. (2005) Phaeochromocytoma. Lancet, 9486: 665-675.

85.

Korpershoek E, Van Nederveen FH, Dannenberg H, Petri BJ, Komminoth P, Perren A, Lenders JW, Verhofstad AA, De Herder WW, De Krijger RR, Dinjens

75

WN. (2006) Genetic analyses of apparently sporadic pheochromocytomas: the Rotterdam experience. Ann N Y Acad Sci, 138-148. 86.

Pacak K, Eisenhofer G, Ahlman H, Bornstein SR, Gimenez-Roqueplo AP, Grossman AB, Kimura N, Mannelli M, McNicol AM, Tischler AS. (2007) Pheochromocytoma: recommendations for clinical practice from the First International Symposium. October 2005. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2: 92-102.

87.

Neumann HP, Wiestler OD. (1991) Clustering of features of von Hippel-Lindau syndrome: evidence for a complex genetic locus. Lancet, 8749: 1052-1054.

88.

Maher ER, Iselius L, Yates JR, Littler M, Benjamin C, Harris R, Sampson J, Williams A, Ferguson-Smith MA, Morton N. (1991) Von Hippel-Lindau disease: a genetic study. J Med Genet, 7: 443-447.

89.

McGrath FP, Gibney RG, Morris DC, Owen DA, Erb SR. (1992) Case report: multiple hepatic and pulmonary haemangioblastomas--a new manifestation of von Hippel-Lindau disease. Clin Radiol, 1: 37-39.

90.

Rojiani AM, Owen DA, Berry K, Woodhurst B, Anderson FH, Scudamore CH, Erb S. (1991) Hepatic hemangioblastoma. An unusual presentation in a patient with von Hippel-Lindau disease. Am J Surg Pathol, 1: 81-86.

91.

Burns C, Levine PH, Reichman H, Stock JL. (1987) Adrenal hemangioblastoma in Von Hippel-Lindau disease as a cause of secondary erythrocytosis. Am J Med Sci, 2: 119-121.

92.

Latif F, Tory K, Gnarra J, Yao M, Duh FM, Orcutt ML, Stackhouse T, Kuzmin I, Modi W, Geil L, Schmidt L, Zhou F, Li H, H. WM, Chen F, Glenn G, Choyke P, Walther MM, Weng Y, R. DD, Dean M, Glavač D, Richards FM, Crossey PA, Ferguson-Smith MA, Le Paslier D, Chumakov I, Cohen D, Chinault AC, Maher ER, Linehan WM, Zbar B, Lerman MI. (1993) Identification of the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene. Science, 5112: 1317-1320.

93.

Friedrich CA. (2001) Genotype-phenotype correlation in von Hippel-Lindau syndrome. Hum Mol Genet, 7: 763-767.

94.

Maher ER, Webster AR, Richards FM, Green JS, Crossey PA, Payne SJ, Moore AT. (1996) Phenotypic expression in von Hippel-Lindau disease: correlations with germline VHL gene mutations. J Med Genet, 4: 328-332.

76

95.

Gao J, Naglich JG, Laidlaw J, Whaley JM, Seizinger BR, Kley N. (1995) Cloning and characterization of a mouse gene with homology to the human von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene: implications for the potential organization of the human von Hippel-Lindau disease gene. Cancer Res, 4: 743747.

96.

Blankenship C, Naglich JG, Whaley JM, Seizinger B, Kley N. (1999) Alternate choice of initiation codon produces a biologically active product of the von Hippel Lindau gene with tumor suppressor activity. Oncogene, 8: 1529-1535.

97.

Stebbins CE, Kaelin WG, Jr., Pavletich NP. (1999) Structure of the VHLElonginC-ElonginB complex: implications for VHL tumor suppressor function. Science, 5413: 455-461.

98.

Lonergan KM, Iliopoulos O, Ohh M, Kamura T, Conaway RC, Conaway JW, Kaelin WG, Jr. (1998) Regulation of hypoxia-inducible mRNAs by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein requires binding to complexes containing elongins B/C and Cul2. Mol Cell Biol, 2: 732-741.

99.

Schoenfeld A, Davidowitz EJ, Burk RD. (1998) A second major native von Hippel-Lindau gene product, initiated from an internal translation start site, functions as a tumor suppressor. Proc Natl Acad Sci U S A, 15: 8817-8822.

100.

Beroud C, Joly D, Gallou C, Staroz F, Orfanelli MT, Junien C. (1998) Software and database for the analysis of mutations in the VHL gene. Nucleic Acids Res, 1: 256-258.

101.

Li C, Weber G, Ekman P, Lagercrantz J, Norlen BJ, Akerstrom G, Nordenskjold M, Bergerheim US. (1998) Germline mutations detected in the von HippelLindau disease tumor suppressor gene by Southern blot and direct genomic DNA sequencing. Hum Mutat, Suppl 1: S31-33.

102.

Olschwang S, Richard S, Boisson C, Giraud S, Laurent-Puig P, Resche F, Thomas G. (1998) Germline mutation profile of the VHL gene in von HippelLindau disease and in sporadic hemangioblastoma. Hum Mutat, 6: 424-430.

103.

Dollfus H, Massin P, Taupin P, Nemeth C, Amara S, Giraud S, Beroud C, Dureau P, Gaudric A, Landais P, Richard S. (2002) Retinal hemangioblastoma in von Hippel-Lindau disease: a clinical and molecular study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 9: 3067-3074.

77

104.

Pastore YD, Jelinek J, Ang S, Guan Y, Liu E, Jedlickova K, Krishnamurti L, Prchal JT. (2003) Mutations in the VHL gene in sporadic apparently congenital polycythemia. Blood, 4: 1591-1595.

105.

Rozen S, Skaletsky H. (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol, 365-386.

106.

Ponchel F, Toomes C, Bransfield K, Leong FT, Douglas SH, Field SL, Bell SM, Combaret V, Puisieux A, Mighell AJ, Robinson PA, Inglehearn CF, Isaacs JD, Markham AF. (2003) Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: an alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions. BMC Biotechnol, 18.

107.

Banks RE, Tirukonda P, Taylor C, Hornigold N, Astuti D, Cohen D, Maher ER, Stanley AJ, Harnden P, Joyce A, Knowles M, Selby PJ. (2006) Genetic and epigenetic analysis of von Hippel-Lindau (VHL) gene alterations and relationship with clinical variables in sporadic renal cancer. Cancer Res, 4: 2000-2011.

108.

Patocs A, Gergics P, Balogh K, Toth M, Fazakas F, Liko I, Racz K. (2008) Ser80Ile mutation and a concurrent Pro25Leu variant of the VHL gene in an extended Hungarian von Hippel-Lindau family. BMC Med Genet, 29.

109.

Shields CL, Shields JA, Barrett J, De Potter P. (1995) Vasoproliferative tumors of the ocular fundus. Classification and clinical manifestations in 103 patients. Arch Ophthalmol, 5: 615-623.

110.

Crossey PA, Richards FM, Foster K, Green JS, Prowse A, Latif F, Lerman MI, Zbar B, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Maher ER. (1994) Identification of intragenic mutations in the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene and correlation with disease phenotype. Hum Mol Genet, 8: 1303-1308.

111.

Chen F, Kishida T, Yao M, Hustad T, Glavac D, Dean M, Gnarra JR, Orcutt ML, Duh FM, Glenn G, Green JD, Hsia YE, Lamiell JF, Li H, Wei MH, Schmidt L, Tory K, Kuzmin I, Stackhouse T, Latif F, Linehan WM, Lerman M, Zbar B. (1995) Germline mutations in the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene: correlations with phenotype. Hum Mutat, 1: 66-75.

78

112.

Hes F, Zewald R, Peeters T, Sijmons R, Links T, Verheij J, Matthijs G, Leguis E, Mortier G, van der Torren K, Rosman M, Lips C, Pearson P, van der Luijt R. (2000) Genotype-phenotype correlations in families with deletions in the von Hippel-Lindau (VHL) gene. Hum Genet, 4: 425-431.

113.

Zbar B, Kishida T, Chen F, Schmidt L, Maher ER, Richards FM, Crossey PA, Webster AR, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Brauch H, Glavac D, Neumann HP, Tisherman S, Mulvihill JJ, Gross DJ, Shuin T, Whaley J, Seizinger B, Kley N, Olschwang S, Boisson C, Richard S, Lips CH, Marston Linchan W, Lerman M. (1996) Germline mutations in the Von Hippel-Lindau disease (VHL) gene in families from North America, Europe, and Japan. Hum Mutat, 4: 348-357.

114.

Casarin A, Martella M, Polli R, Leonardi E, Anesi L, Murgia A. (2006) Molecular characterization of large deletions in the von Hippel-Lindau (VHL) gene by quantitative real-time PCR: the hypothesis of an alu-mediated mechanism underlying VHL gene rearrangements. Mol Diagn Ther, 4: 243-249.

115.

Cybulski C, Krzystolik K, Murgia A, Gorski B, Debniak T, Jakubowska A, Martella M, Kurzawski G, Prost M, Kojder I, Limon J, Nowacki P, Sagan L, Bialas B, Kaluza J, Zdunek M, Omulecka A, Jaskolski D, Kostyk E, Koraszewska-Matuszewska B, Haus O, Janiszewska H, Pecold K, Starzycka M, Slomski R, Cwirko M, Sikorski A, Gliniewicz B, Cyrylowski L, FiszerMaliszewska L, Gronwald J, Toloczko-Grabarek A, Zajaczek S, Lubinski J. (2002) Germline mutations in the von Hippel-Lindau (VHL) gene in patients from Poland: disease presentation in patients with deletions of the entire VHL gene. J Med Genet, 7: E38.

116.

Zhang J, Huang Y, Pan J, Liu D, Zhou L, Xue W, Chen Q, Dong B, Xuan H. (2008) Germline mutations in the von Hippel-Lindau disease (VHL) gene in mainland Chinese families. J Cancer Res Clin Oncol, 11: 1211-1218.

117.

Rothberg PG, Bradley JF, Baker DW, Huelsman KM. (2001) Is the P25L a "real" VHL mutation? Mol Diagn, 1: 49-54.

118.

Pettman RK, Crowley A, Riddell C, Ludman MD. (2006) VHL P25L is not a pathogenic von Hippel-Lindau mutation: a family study. Mol Diagn Ther, 4: 239-242.

79

119.

Hergovich A, Lisztwan J, Thoma CR, Wirbelauer C, Barry RE, Krek W. (2006) Priming-dependent phosphorylation and regulation of the tumor suppressor pVHL by glycogen synthase kinase 3. Mol Cell Biol, 15: 5784-5796.

120.

Lolkema MP, Gervais ML, Snijckers CM, Hill RP, Giles RH, Voest EE, Ohh M. (2005) Tumor suppression by the von Hippel-Lindau protein requires phosphorylation of the acidic domain. J Biol Chem, 23: 22205-22211.

121.

Wiesener MS, Seyfarth M, Warnecke C, Jurgensen JS, Rosenberger C, Morgan NV, Maher ER, Frei U, Eckardt KU. (2002) Paraneoplastic erythrocytosis associated with an inactivating point mutation of the von Hippel-Lindau gene in a renal cell carcinoma. Blood, 10: 3562-3565.

122.

Ang SO, Chen H, Gordeuk VR, Sergueeva AI, Polyakova LA, Miasnikova GY, Kralovics R, Stockton DW, Prchal JT. (2002) Endemic polycythemia in Russia: mutation in the VHL gene. Blood Cells Mol Dis, 1: 57-62.

123.

Pastore Y, Jedlickova K, Guan Y, Liu E, Fahner J, Hasle H, Prchal JF, Prchal JT. (2003) Mutations of von Hippel-Lindau tumor-suppressor gene and congenital polycythemia. Am J Hum Genet, 2: 412-419.

124.

Cario H, Schwarz K, Jorch N, Kyank U, Petrides PE, Schneider DT, Uhle R, Debatin KM, Kohne E. (2005) Mutations in the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene and VHL-haplotype analysis in patients with presumable congenital erythrocytosis. Haematologica, 1: 19-24.

125.

Bento MC, Chang KT, Guan Y, Liu E, Caldas G, Gatti RA, Prchal JT. (2005) Congenital polycythemia with homozygous and heterozygous mutations of von Hippel-Lindau gene: five new Caucasian patients. Haematologica, 1: 128-129.

126.

Randi ML, Murgia A, Putti MC, Martella M, Casarin A, Opocher G, Fabris F. (2005) Low frequency of VHL gene mutations in young individuals with polycythemia and high serum erythropoietin. Haematologica, 5: 689-691.

127.

Kaelin WG, Jr. (2004) The von Hippel-Lindau tumor suppressor gene and kidney cancer. Clin Cancer Res, 18 Pt 2: 6290S-6295S.

128.

Perrotta S, Nobili B, Ferraro M, Migliaccio C, Borriello A, Cucciolla V, Martinelli V, Rossi F, Punzo F, Cirillo P, Parisi G, Zappia V, Rotoli B, Ragione FD. (2006) Von Hippel-Lindau-dependent polycythemia is endemic on the island of Ischia: identification of a novel cluster. Blood, 2: 514-519.

80

129.

Crawford ED, Henning DC, Wendel RG. (1979) Renal cell carcinoma in a horseshoe kidney associated with von Hippel-Lindau disease. J Urol, 5: 677678.

130.

Richards FM, Schofield PN, Fleming S, Maher ER. (1996) Expression of the von

Hippel-Lindau

disease

tumour

suppressor

gene

during

human

embryogenesis. Hum Mol Genet, 5: 639-644. 131.

Koch CA, Vortmeyer AO, Zhuang Z, Brouwers FM, Pacak K. (2002) New insights into the genetics of familial chromaffin cell tumors. Ann N Y Acad Sci, 11-28.

132.

Neumann HP, Berger DP, Sigmund G, Blum U, Schmidt D, Parmer RJ, Volk B, Kirste G. (1993) Pheochromocytomas, multiple endocrine neoplasia type 2, and von Hippel-Lindau disease. N Engl J Med, 21: 1531-1538.

133.

Bar M, Friedman E, Jakobovitz O, Leibowitz G, Lerer I, Abeliovich D, Gross DJ. (1997) Sporadic phaeochromocytomas are rarely associated with germline mutations in the von Hippel-Lindau and RET genes. Clin Endocrinol (Oxf), 6: 707-712.

134.

Miller F, Kentsis A, Osman R, Pan ZQ. (2005) Inactivation of VHL by tumorigenic mutations that disrupt dynamic coupling of the pVHL.hypoxiainducible transcription factor-1alpha complex. J Biol Chem, 9: 7985-7996.

81

IX. Saját publikációk jegyzéke Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények: 1.

Gergics P, Patocs A, Majnik J, Balogh K, Szappanos A, Toth M, Racz K. (2006) Detection of the Bcl I polymorphism of the glucocorticoid receptor gene by single-tube allele-specific polymerase chain reaction. J Steroid Biochem Mol Biol, 4-5: 161-166.

2.

IF: 2,825

Gergics P, Patocs A, Toth M, Igaz P, Szucs N, Liko I, Fazakas F, Szabo I, Kovacs B, Glaz E, Racz K. (2009) Germline VHL gene mutations in Hungarian families with von Hippel-Lindau disease and patients with apparently sporadic unilateral pheochromocytomas. Eur J Endocrinol, 3: 495-502.

IF

(2008):

3,791 3.

Gergics P, Tőke J, Szilágyi Á, Szappanos Á, Kender Z, Barta G, Tóth M, Igaz P, Rácz K, Patócs A. (2009) A nagy géndeléciók kimutatásának módszerei és alkalmazásuk egyes örökletes betegségekben. Orv Hetil, közlésre elfogadva

Az értekezés témájához nem kapcsolódó közlemények: 1.

Adler I, Barsi P, Czirjak S, Varga I, Gergics P, Jakab C, Racz K. (2005) Rapid re-enlargement of a macroprolactinoma after initial shrinkage in a young woman treated with bromocriptine. Gynecol Endocrinol, 6: 317-321.

2.

IF: 0,852

Balogh K, Hunyady L, Patócs A, Valkusz Z, Bertalan R, Gergics P, Majnik J, Tőke J, Tóth M, Szücs N, Gláz E, Fűtő L, Horányi J, Rácz K, Tulassay Z. (2005) Az 1-es tipusú multiplex endokrin neoplasia klinikai tünetei, diagnózisa és kezelése. A genetikai vizsgálatok hazai tapasztalatai. Orv Hetil, 43: 21912197.

3.

Patocs A, Liko I, Varga I, Gergics P, Boros A, Futo L, Kun I, Bertalan R, Toth S, Pazmany T, Toth M, Szucs N, Horanyi J, Glaz E, Racz K. (2005) Novel mutation of the CYP17 gene in two unrelated patients with combined 17alphahydroxylase/17,20-lyase deficiency: demonstration of absent enzyme activity by

82

expressing the mutant CYP17 gene and by three-dimensional modeling. J IF: 2,866

Steroid Biochem Mol Biol, 3: 257-265. 4.

Gergics P, Czirják S, Mondok Á, Tóth M, Varga I, Rácz K, Tulassay Z. (2006) Vízszerű

orrfolyás

vagy

nasalis

agyvízcsorgás?

Acromegaliát

okozó

hypophysisdaganat tanulságos esete. Magy Belorv Arch, Supplementum 2: 139143. 5.

Majnik J, Patócs A, Balogh K, Luczay A, Török D, Szabó V, Borgulya G, Gergics P, Szappanos A, Bertalan R, Belema B, Tőke J, Sereg M, Nagy ZZ, Sólyom J, Tóth M, Gláz E, Rácz K, Németh J, Fekete G, Tulassay Z. (2006) A glükokortikoidreceptor

gén

szekvenciavariánsai

és

jelentőségük

a

glükokortikoidok iránti érzekenység meghatározásában. Orv Hetil, 44: 21072115. 6.

Majnik J, Patocs A, Balogh K, Toth M, Gergics P, Szappanos A, Mondok A, Borgulya G, Panczel P, Prohaszka Z, Racz K. (2006) Overrepresentation of the N363S variant of the glucocorticoid receptor gene in patients with bilateral adrenal incidentalomas. J Clin Endocrinol Metab, 7: 2796-2799. IF: 5,799

7.

Patocs A, Klein I, Szilvasi A, Gergics P, Toth M, Valkusz Z, Forizs E, Igaz P, Al-Farhat Y, Tordai A, Varadi A, Racz K, Esik O. (2006) Genotype-phenotype correlations in Hungarian patients with hereditary medullary thyroid cancer. Wien Klin Wochenschr, 13-14: 417-421.

8.

IF: 0,804

Balogh K, Hunyady L, Patocs A, Gergics P, Valkusz Z, Toth M, Racz K. (2007) MEN1 gene mutations in Hungarian patients with multiple endocrine neoplasia type 1. Clin Endocrinol (Oxf), 5: 727-734. IF: 3,370

9.

Reismann P, Varga I, Patócs A, Gergics P, Tóth M, Szücs N, Gláz E, Rácz K, Tulassay Z. (2007) A hormonvizsgálatok fejlődésének 50 éve, nemzetközi visszatekintés és hazai tapasztalatok. Magy Belorv Arch, 5: 403-411.

10.

Toke J, Czirjak G, Patocs A, Enyedi B, Gergics P, Csakvary V, Enyedi P, Toth M. (2007) Neonatal severe hyperparathyroidism associated with a novel de novo heterozygous R551K inactivating mutation and a heterozygous A986S polymorphism of the calcium-sensing receptor gene. Clin Endocrinol (Oxf), 3: 385-392.

11.

IF: 3,370

Tóth M, Tőke J, Horányi J, Stenczer B, Patócs A, Balogh K, Jakab Z, Szücs N,

83

Gergics P, Varga I, Rácz K, Tulassay Z. (2007) A sporadikus és familiaris hyperparathyreosis klinikai és laboratóriumi jellemzői. Magy Belorv Arch, Supplementum 2: 154-159. 12.

Tőke J, Tóth M, Patócs A, Bertalan R, Gergics P, Stenczer B, Speer G, Lakatos P, Rácz K, Tulassay Z. (2007) A kálcium-szenzor gén mutációvizsgálatának hazai tapasztalatai. Magy Belorv Arch, 5: 451-454.

13.

Patocs A, Gergics P, Balogh K, Toth M, Fazakas F, Liko I, Racz K. (2008) Ser80Ile mutation and a concurrent Pro25Leu variant of the VHL gene in an extended Hungarian von Hippel-Lindau family. BMC Med Genet, 29.

IF:

2,762 14.

Sallai A, Hosszu E, Gergics P, Racz K, Fekete G. (2008) Orolabial signs are important clues for diagnosis of the rare endocrine syndrome MEN 2B. Presentation of two unrelated cases. Eur J Pediatr, 4: 441-446.

15.

IF: 1,277

Sallai Á, Igaz P, Patócs A, Gergics P, Rácz K, Fekete G. (2008) Profilaktikus thyreoidectomia gyermekkorban. Gyermekgyógyászat, 2: 48-52.

16.

Pregun I, Gergics P, Dabasi G, Igaz P, Racz K, Tulassay Z. (2009) Serum chromogranin A reflects regression of metastatic carcinoid during prolonged octreotide treatment. Eur J Gastroenterol Hepatol, 4: 476-477.

IF

(2008):

2,080 17.

Szoke D, Molnar B, Solymosi N, Racz K, Gergics P, Blasko B, Vasarhelyi B, Vannay A, Mandy Y, Klausz G, Gyulai Z, Galamb O, Spisak S, Hutkai B, Somogyi A, Berta K, Szabo A, Tulassay T, Tulassay Z. (2009) Polymorphisms of the ApoE, HSD3B1, IL-1beta and p53 genes are associated with the development of early uremic complications in diabetic patients: results of a DNA resequencing array study. Int J Mol Med, 2: 217-227.

IF

(2008):

1,880 18.

Toke J, Patocs A, Balogh K, Gergics P, Stenczer B, Racz K, Toth M. (2009) Parathyroid hormone-dependent hypercalcemia. Wien Klin Wochenschr, 7-8: 236-245.

19.

IF (2008): 0,857

Tőke J, Patócs A, Gergics P, Bertalan R, Tóth M, Rácz K, Tulassay Z. (2009) Az extracelluláris kálciumkoncentráció érzékelése egészséges és kóros állapotokban. Orv Hetil, 17: 781-790.

84

X. Köszönetnyilvánítás Doktori értekezésem nem születhetett volna meg számos kiemelkedő szaktudású, mindenkor bíztató és segítő munkatársam közreműködése nélkül. Köszönettel tartozom: Elsőként témavezetőmnek, Prof. Dr. Rácz Károlynak, Klinikánk igazgatójának szeretnék köszönetet mondani a számomra felbecsülhetetlen értékű szakmai és emberi szemlélet átadásáért, mellyel reményeim szerint a jövőben is magas színvonalú kutatói, klinikai gyógyítói munkát végezhetek. Prof. Dr. Tulassay Zsoltnak, a Semmelweis Egyetem II.sz. Belgyógyászati Klinika előző igazgatójának, a Klinikai Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola igazgatójának, aki lehetővé tette PhD-munkám megvalósítását. Prof. Dr. Gláz Edit és Prof. Dr. Gerendai Ida Tanárnőnek, akik szakmai munkásságukkal méltó, követendő példát állítottak fel számomra. Dr.

Adler Ildikónak, egykori belgyógyászat

gyakorlatvezetőmnek,

akinek a

belgyógyászat-endokrinológia megismerését, megszeretését köszönhetem. Klinikánk Endokrinológia-Anyagcsere Munkacsoportjában dolgozó Kollégáknak: dr. Tóth Miklósnak, dr. Szücs Nikolettenek, dr. Igaz Péternek, dr. Pusztai Péternek, dr. Sármán Beatrixnak, dr. Békési Gábornak, dr. Varga Ibolyának, akiknek nemcsak a beteganyag gyűjtését köszönhetem, hanem mindenkor magas szakmai színvonalú munkájukból kutató és gyógyító orvosként is messzemenőkig sokat tanulhattam Dr. Patócs Attilának, Klinikánk Molekuláris Biológiai Laboratóriumának vezetőjének, aki tudásával, észrevételeivel, molekuláris biológiai készségeim fejlesztésében mindenkor nagy segítségemre volt és doktoranduszként méltán magas mércét állított fel számomra. Intézeti védésem opponenseinek, dr. Műzes Györgyi egyetemi docensnek és dr. Sármán Beatrix egyetemi tanársegédnek, akik értékes kritikai megjegyzéseikkel segítették dolgozatom színvonalának javítását. PhD-hallgató és közvetlen munkatársaimnak: dr. Tőke Juditnak, dr. Balogh Katalinnak, dr. Majnik Juditnak, dr. Mondok Ágnesnek, dr. Bertalan Ritának, dr. Boyle Belemának, dr. Szappanos Ágnesnek, dr. Sereg Mártának, dr. Szabó Péternek, dr. Tömböl Zsófiának, dr. Butz Henriettnek, dr. Reismann Péternek a közös kutatómunka fáradtságaiért és a kitartó biztatásért.

85

Laboratóriumunk asszisztensének Krauszné Vaczula Máriának, akitől a laboratóriumi munka alapszabályait tanultam. Klinikánk Endokrin és Izotóp Laboratótiumi asszisztenseinek. Végül, de nem utolsó sorban Feleségemnek, Gyermekeimnek, Édesanyámnak, Húgomnak és családom többi tagjának, hogy megértésükkel, lelki támogatásukkal doktori munkámat végezhettem.

86