PhD (doktori) értekezés AZ OLIVOCOCHLEÁRIS RENDSZER ÉS A HALLÓPÁLYA ANATÓMIÁJÁRÓL SZERZETT ÚJABB ISMERETEK Dr. Horváth Miklós
Témavezetok: Prof. Dr. Palkovits Miklós és Prof. Dr. Ribári Ottó Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskolája (7) Pathobiokémia Program (7/2) Programvezeto: Prof. Dr. Mandl József Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Z. Szabó László (elnök) Prof. Dr. Sziklai István Dr. Bánhegyi Gábor Opponensek (javaslat): Dr. Büki Béla Dr. Szirmai Ágnes Dr. Küstel Marianna (póttag) Bíráló bizottság (javaslat): Prof. Dr. Z. Szabó László (elnök) Prof. Dr. Pytel József Dr. Tamás László Budapest, 2003
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 1 1. 1. A cochlea afferens és efferens beidegzése. 1. 2. Az olivocochleáris rendszer. 1. 3. A hallópálya anatómiája. 1. 4. Leszálló kapcsolatok a hallópályában. 1. 5. Idegi kapcsolatok kialakulása a gerinces idegrendszerben. 1. 6. Neuronális plaszticitás, GAP-43. 1. 7. Az olivocochleáris rendszer és a hallópálya állatkísérletes kutatásának klinikai vonatkozásai. 2. Célkituzések
14
3. Módszerek 15 3. 1. Immunhisztológiai vizsgálatok patkány agymetszeteken a posztnatális fejlodés során. 3. 2. A cochlea mechanikus léziója és posztoperatív immunhisztológiai vizsgálatok felnott patkány agy metszetein. 3. 3. Neuronpályák jelölésére alkalmas módszerek, a jelen munka során alkalmazott jelöloanyagok. 3. 4. Fluoreszcens jelöloanyagok (diamidino yellow és fast blue) applikációja patkány belsofülbe és az azonos oldali ventrális cochleáris magba. 3. 5. Pseudorabies vírus injekciója tengerimalac cochleába. A vírus immunhisztológiai kimutatása agymetszeteken. 4. Eredmények 23 4. 1. A GAP-43 expresszió posztnatális változása az oliva superiorban és a cochleáris magban. 4. 2. Cochleáris lézió hatása az oliva superior és a cochleáris mag GAP-43 expressziójára. 4. 3. Az olivocochleáris sejtek kettos jelölése fluoreszcens jelöloanyagokkal. 4. 4. Az olivocochleáris sejtek, a hallópálya és monoaminerg agyterületek jelölodése pseudorabies vírus intracochleáris injekcióját követoen. 5. Megbeszélés 60 5. 1. Az oliva superior és a cochleáris mag GAP-43 expressziója. 5. 2. Cochleáris lézió kiváltotta GAP-43 re-expresszió a laterális olivocochleáris sejtekben és a cochleáris magban. 5. 3. Az azonos oldali ventrális cochleáris magba kollaterálist adó olivocochleáris sejtek. 5. 4. Leszálló hallópálya: neuronlánc a hallókéreg és a cochlea között. 5. 5. A hallópálya kapcsolata monoaminerg agyterületekkel. 5. 6. Az eredmények klinikai jelentosége. 6. Következtetések
75
7. Köszönetnyilvánítás
77
8. Irodalomjegyzék
78
9. Saját közlemények jegyzéke
90
Rövidítések jegyzéke
ABC = avidin-biotin komplex AuC = auditory cortex (hallókéreg) AVCN = anteroventral cochlear nucleus (anteroventrális cochleáris mag) Aq = aqueductus cerebri BDA = biotinilált dextrán amin CB = cerebellum (kisagy) cg = central gray (központi szürkeállomány) CGRP = calcitonin gene related protein (calcitonin gén asszociált fehérje) CTB = cholera toxin B alegység DAB = diamino benzidine DCN = dorsal cochlear nucleus (dorzális cochleáris mag) DR = dorzális raphe mag DY = diamidino yellow FB = fast blue GABA = gamma-amino-butyric acid (gamma-amino-vajsav) GAP-43 = growth-associated protein-43 (növekedés-asszociált fehérje 43) GC = growth cone (növekedési kúp) HRP = horseradish peroxidase (tormaperoxidáz) IC = colliculus inferior lfp = fasciculus longitudinalis LC = locus coeruleus LL = lemniscus lateralis LOC = lateral olivocochlear cell (laterális olivocochleáris sejt) LSO = lateral superior olive (az oliva superior laterális magja) ml = molecular layer (molekuláris réteg) MGB = medial geniculate body (corpus geniculatum mediale) MOC = medial olivocochlear cell (mediális olivocochleáris sejt) MSO = medial superior olive (az oliva superior mediális magja) MNTB = medial nucleus of the trapezoid body (a trapéztest mediális magja) MVN = mediális vesztibuláris mag
N5 = nucleus tractus spinalis nervi trigemini n7 = nervus facialis n8 = nervus vestibulocochlearis NCAM = neural cell adhesion molecule (idegi sejtadhéziós molekula) PHA-L = phaseolus vulgaris leucoagglutinin Pn = hídmagvak POD = postoperative day (posztoperatív nap) PR = dorzális raphemag hídi szakasza PRV = pseudorabies vírus PRV-Ba = pseudorabies vírus Bartha törzse pt = pyramidal tract (piramispálya) PVCN = posteroventral cochlear nucleus (poszteroventrális cochleáris mag) RPO = rostral periolivary nucleus (rosztrális perioliváris mag) SC = colliculus superior SOC = superior olivary complex (oliva superior magkomplexum) SPO = superior periolivary nucleus (felso perioliváris mag) SubC = subcoeruleus area SyPhy = synaptophysin stt = tractus spinalis nervi trigemini tb = trapezoid body (trapéztest) VCN = ventral cochlear nucleus (ventrális cochleáris mag) VNTB = ventral nucleus of the trapezoid body (a trapéztest ventrális magja)
Az anatómiai struktúrák elnevezése és helyesírása során Szentágothai és Réthelyi (1985) „Funkcionális anatómia” címu tankönyvét tekintettem irányadónak. Az egyéb latin és angol kifejezéseket mindig lefordítva, magyarosan igyekeztem írni. Ettol csak akkor tekintettem el, ha a fordítás eroltetett, a gyakorlatban nem használatos kifejezést eredményezett volna. A helyesírás szempontjából az MTA Helyesírási Tanácsadó Szótárát tekintettem irányadónak.
1. Bevezetés
1. 1. A cochlea afferens és efferens beidegzése
A hallás élettanában kulcsszerepet játszik a cochleában, a membrana basilarison elhelyezkedo Corti-szerv. A Corti-szervet receptorsejtek (külso és belso szorsejtek), valamint támasztósejtek (Deiters, Hensen, Claudius) alkotják (1. ábra). Békésy György a cochlea muködésérol alapveto felfedezést tett, megalkotta a haladó hullám elméletet (16). Eszerint a stapestalp elmozdulása az ovális ablakban a membrana basilarison keresztül ható szinuszoid nyomásgrádienst hoz létre. A keletkezo hullám karakterisztikus, frekvenciaspecifikus helyén a hullám energiáját a membrana basilaris absorbeálja. A haladó hullám burkoló görbéjének amplitúdómaximuma annál közelebb van a cochlea csúcsához, minél alacsonyabb az akusztikus stimulus frekvenciája. A cochlea ezen hidrodinamikai viselkedése az alapja a frekvencia-diszkrimináció képességének. Békésy György a kísérleteit cadaver cochleákon végezte. Az élo fülben a membrana basilaris hullámmozgása megjelenésében hasonló a haladó hullámhoz, attól azonban minoségileg és mennyiségileg is jelentosen különbözik: sokkal élesebben hangolt és kifejezetten nonlineáris. Ennek alapja a külso szorsejtek azon speciális képessége, hogy elektromos ingerlés hatására a hallás frekvenciatartományában rövidülnek és megnyúlnak (34). Ez a jelenség a mechanoelektrikus transzdukció. Újabban Zheng és munkatársai az összehúzódásért felelos proteineket is izolálták (206). Az aktív összehúzódás kísérojelensége és bizonyítéka az otoakusztikus emisszió (82), melyet a klinikai gyakorlatban is kiterjedten alkalmazunk. Legújabb ismereteink szerint a belso szorsejtek a tulajdonképpeni receptorsejtek, míg a külso szorsejtek cochleáris erosítoként muködnek (46, 205). Spoendlin munkássága nyomán vált világossá, hogy a belso és a külso szorsejtek afferens és efferens beidegzése alapvetoen különbözo (158). A ganglion spirale sejtjeinek 95 %-a a belso szorsejtekkel áll kapcsolatban és azok gazdag afferens beidegzését adja. A külso szorsejtek afferens beidegzésében csak a ganglion spirale maradék 5%-át kitevo veloshüvely nélküli neuronok vesznek részt (2. ábra).
1. ábra. A membrana basilarison elhelyezkedo Corti-szerv felépítése. A szorsejtek sejttestjei a perilymphához hasonló Corti-lymphában helyezkednek el, a stereociliumok az endolymphába nyúlnak (122).
2. ábra. A belso és a külso szorsejtek jelentosen különbözo afferens beidegzésének vázlata (122).
A szorsejtek efferens beidegzése ezzel ellentétes: a külso szorsejteken számos efferens rost képez szinapszist, míg a belso szorsejtek efferens beidegzése szegényes, a sejttesteken nem, csak posztszinaptikusan, az afferenseken található efferens szinapszis (3. ábra). Ez a beidegzési mintázat is alátámasztja a külso és belso szorsejtek alapvetoen eltéro funkcióját.
3. ábra. A cochleáris szorsejtek efferens beidegzési mintázata. A mediális olivocochleáris sejtek a külso szorsejteken, a laterálisok a belso szorsejtek afferensein képeznek szinapszisokat (157). 1. 2. Az olivocochleáris rendszer A szorsejtek efferens beidegzését adó sejtek perikaryonjai az agytörzsben a nyúltvelohíd határán levo oliva superiorban találhatók. Rassmussen említette eloször ezt a központi idegrendszer és a cochlea közötti leszálló kapcsolatot és olivocochleáris rendszernek nevezte el (120). Az olivocochleáris sejtek axonjainak anatómiáját a cochlea szintjén Spoendlin írta le eloször (158), majd White és Warr 1983-ban feltárták, hogy az olivocochleáris sejtek két nagy csoportra oszthatók (197). Az oliva superior laterális magvában (LSO) helyezkednek el a kicsiny (10-15 µm átméroju), fuziformis
laterális olivocochleáris neuronok (LOC), melyeknek veloshüvely nélküli rostjai a cochleában a belso szorsejtek afferenseihez futnak.
Mediálisabban, a corpus
trapezoideum ventrális magvában és periolivárisan találhatók a nagyobb átméroju (2025 ? m), multipoláris mediális olivocochleáris sejtek (MOC), melyek veloshüvelyes rostjai a cochleában a külso szorsejteket idegzik be (4. ábra).
4. ábra. A mediális és laterális olivocochleáris sejtek és pályák anatómiája vázlatosan. A mediális olivocochleáris sejtek nagyobb része keresztezodik, míg a laterális olivocochleáris sejtek foleg az azonos oldali cochleába projiciálnak (187).
Az efferens neurotranszmitter az acethylkolin és a GABA, de egyéb neuraktív anyagok (pl. CGRP, dopamin, enkephalin, nitrogénmonoxid) szerepét is feltételezik újabban. Számos tanulmány keretében analizálták az olivocochleáris sejtek elhelyezkedését és számát (10, 181, 188). Kiderült, hogy az egyes állatfajok között eltérések vannak, de minden emlosben felismerheto a laterális és a mediális olivocochleáris rendszer. Újabban Vetter és munkatársai a LOC sejteket elhelyezkedésük és dendritikus morfológiájuk alapján két alcsoportba osztották (182). A kicsiny, fusiformis, az oliva superior laterális magvában elhelyezkedo LOC sejtek mellett leírták a mag körül kagyló alakban elhelyezkedo, nagyobb, multipoláris, úgynevezett “kagyló” sejteket is. A nemzetközi irodalomban számos, különbözo állatfajokat vizsgáló közlemény foglalkozott
már
az
olivocochleáris
sejtek
kollaterálisainak
kérdésével.
A
következtetések azonban nem egyértelmuek, az egyes állatfajok közt különbségek
mutatkoznak. Ryan és munkatársai szerint a LOC sejtek a ventrális cochleáris mag centrális részébe, a MOC sejtek pedig a ventrális cochleáris mag perifériás területeibe adnak axon kollaterálist (139). Brown és Benson szerint a LOC sejteknek nincsenek kollaterálisai, míg a MOC sejtek nagy része kollaterálist ad a ventrális cochleáris magba (32). Winter és munkatársai eredményei alapján csak a MOC sejtek 3-9 %-a ad axon kollaterálist a ventrális cochleáris magba (200). White és Warr tormaperoxidázt (HRP) használtak retrográd neuronális tracerként. A cochleába adott tormaperoxidáz kimutatható volt az olivocochleáris sejtek nagy részében és azok axon lefutását követve fedezték fel, hogy a sejtek egy része kollaterálist ad a dorzális és a ventrális cochleáris magba (197). Nehezen vizsgálható és kevéssé ismert, hogy mely agyterületek sejtjei képeznek szinapszist az olivocochleáris sejteken (172). Az oliva superiorba adott tracereket nemcsak az olivocochleáris sejtek veszik fel, hiszen azok a magcsoport elenyészoen kicsiny részét alkotják csak. Retrográd terjedo jelöloanyag intracochleáris és anterográd úton terjedo tracer egyéb agyi magba történo injekciójának kombinációjával lehetové vált az olivocochleáris sejtek és a rajtuk szinapszist alkotó axonok identifikálása. FayeLund, valamint Vetter és munkatársai kimutatták, hogy a colliculus inferior sejtjeinek axonjai a MOC sejteken képeznek szinapszisokat (55, 183).
Az ellenoldali
poszteroventrális (168) és anteroventrális (210) cochleáris mag sejtjei is szinapszisokat alkotnak az olivoohleáris sejtek egy részén. Feliciano és munkatársai, valamint Weedman és Ryugo kimutatták, hogy a hallókéreg egyes sejtjeinek axonjai az olivocochleáris sejteken végzodnek (56, 193, 194). Immunhisztokémia és neuronpályajelölés kombinációját alkalmazva újabban sikerült feltárni, hogy az olivocochleáris sejtek felszínén szerotoninerg és noradrenerg szinapszisok is vannak (106, 107, 170). Mindezek ellenére az olivocochleáris sejtek centrális kapcsolatainak mibenléte nem kelloen tisztázott. Az olivocochleáris sejteknek a hallás élettanában és pathológiájában játszott szerepe intenzív kutatások tárgya. A keresztezodo, mediális efferens rostok elektromos stimulációja a 4. agykamra ventrális felszínén gátolja a hallóidegen regisztrálható, clickinger által kiváltott akciós potenciált (59). Ezzel szemben zajos környezetben az efferens rostok ingerlése növeli a hallóideg click-inger kiváltotta akciós potenciálját (110). Ez arra utal, hogy a mediális efferenseknek a zaj maszkoló hatásának
csökkentésében lehet szerepük. A mediális efferensek elektromos stimulációja ugyanakkor növeli a cochleáris mikrofonpotenciál amplitúdóját (úgynevezett “MOCpotenciál”). A nem keresztezodo laterális efferens rostok stimulációja szintén gátolja a hallóideg click-inger kiváltotta akciós potenciálját, a cochleáris mikrofonpotenciált azonban nem befolyásolja (57). Újabb megfigyelések szerint a mediális olivocochleáris efferensek befolyásolják az otoakusztikus emissziót és a cochleáris erosítoként muködo külso szorsejtekre hatva a cochlea szenzitivitását is (28, 34, 47). Az ipszilaterális és kontralaterális akusztikus stimuláció hatással van a hallóideg akciós potenciáljára és az otoakusztikus emisszióra is: ez az úgynevezett “olivocochleáris akusztikus reflex” (67). A mediális olivocochleáris efferensek részben bizonyított és részben feltételezett élettani hatásai a következok: 1. A hallás dinamikai tartományának növelése (átlagosan 70 dB-rol 90 dB-re). 2. A környezeti zajok maszkoló hatásának csökkentése (a hallás javítása zajos környezetben). 3. Részvétel a szelektív figyelem kialakításában (pl. a hallóideg aktivitásának csökkentése intenzív vizuális inger esetén). 4. A szorsejtek védelme az eros zajok károsító hatása ellen (ez a szerep vitatott és csak 10 kHz körüli zajok esetén érvényesül). A laterális olivocochleáris rendszer élettani szerepe kevésbé tisztázott. Valószínuleg a hangok lokalizációjában vesz részt, valamint hozzájárulhat a zajok szorsejtkárosító hatásainak csökkentéséhez (67).
1. 3. A hallópálya anatómiája A VIII. agyideg (nervus vestibulocochlearis) pars cochlearisának elsodleges érzo neuronjait tartalmazó dúc a ganglion spirale, mely a cochleában a canalis spiralis modioliban helyezkedik el (165). A ganglion spirale sejtjei bipolárisak, disztális nyúlványaik a lamina spiralis ossea finom csatornácskáin keresztül jutnak el a membrana basilaris fölé és spirális lefutás után érik el a szorsejteket, melyeken végzodnek. Centrális nyúlványaik képzik a nervus vestibulocochlearis pars cochlearisát. Az elsodleges hallóneuronok centrális nyúlványai a pedunculus cerebellaris inferior laterális részén tangenciálisan hatolnak be a nyúltvelo-híd átmenetbe. Itt minden rost mediál felé lead egy ágat a pedunculus cerebelláris inferiorba ventrolaterálisan beékelodo ventrális cochleáris magba. A rostok nagy része tovább futva dorsal felé körülhalad a pedunculus cerebellaris inferior felületes rétegein és kehely alakú szinapszisokkal végzodik a dorzális cochleáris magban. A másodlagos neuronok a
dorzális cochleáris magból mediál felé futnak, majd keresztezodnek és az ellenoldali oliva superiorban végzodnek. A ventrális cochleáris magból induló másodlagos rostok foleg az azonos oldali oliva superiorban végzodnek. Az oliva superior egy magkomplexum, mely laterális és mediális magból áll, de ide sorolják a trapéztest mediális, ventrális és laterális magját, valamint a környezo úgynevezett perioliváris sejteket is.
5. ábra. A felszálló hallópálya anatómiája sémásan (122) Az
oliva
superiorból
eredo
harmadlagos
rostok
a
corpus
trapezoideumban
keresztezodnek, ill. a már keresztezett dorzális cochleáris magból származó rostok által hozott információt közvetíto harmadlagos rostok nem keresztezodve hatalmas felszálló pályát, a lemniscust lateralist alakítják ki. Ez a híd-középagyi határon kívülrol megkerüli a pedunculus cerebellaris superiort, majd egészen felületessé válik (trigonum lemnisci). Itt két közbeiktatott mag (a lemniscus lateralis dorzális és ventrális magja) helyezkedik el, melyekben azonban csak a harmadlagos rostok mellékágai végzodnek. Végül az egész pálya a colliculus inferiorban végzodik. A colliculus inferiorból eredo negyedrendu neuronok a brachium colliculi inferiorisban haladva a corpus geniculatum medialéba vezetnek. Az utolsó-ötödrendu-neuronok a corpus geniculatum mediáléból az
elsodleges kérgi hallómezohöz jutnak (radiatio acustica). A felszálló pályák nagy része tehát keresztezodik, de a hallószervbol boséges vezetés van a saját oldali hallókéreg felé is (138, 165). Az 5. ábra a felszálló hallópálya anatómiáját ábrázolja sémásan. 1. 4. Leszálló kapcsolatok a hallópályában A hallópálya minden szintjén vannak leszálló neuronok, amelyek révén a magasabb szint mintegy kontrollálja a felfelé vezetett információ továbbítását (185). Spangler és Warr 1991-es átfogó közleménye ad képet a leszálló (efferens) hallópályáról, melynek végso közös pályája az olivocochleáris rendszer (157). A hallókéregnek számos efferens, leszálló kapcsolatát írták le (6. ábra, 8, 51, 70, 83, 140), valamint a hallópálya subcorticalis magvaiból is több leszálló pálya veszi kezdetét (75, 80).
6. ábra. A hallókéreg leszálló kapcsolatainak vázlata az agy szagittális metszetén (140).
A corpus geniculatum mediáléból a colliculus inferiorhoz futó rostok mellett (75) leírtak a colliculus inferiorból az agytörzsi auditorikus magokhoz futó rostokat is (55, 183). A hallópálya leszálló kapcsolatainak funkciója nem teljesen ismert. Egyes feltételezések szerint a hallókéregtol a cochleáig tartó egységes efferens rendszernek tekintheto (167, 209), míg mások szerint a leszálló hallópálya egymással laza kapcsolatban álló regionális feedback körök láncolata (50, 157).
1. 5. Idegi kapcsolatok kialakulása a gerinces idegrendszerben.
A különbözo etiológiájú halláscsökkenések az otoakusztikus emisszió és az agytörzsi kiváltott válasz segítségével már újszülött korban diagnosztizálhatók és a betegek hallókészülék, illetve cochleáris implantátum segítségével rehabilitálhatók (123). Megfigyelték, hogy a korai rehabilitáció eredményei sokkal jobbak, mint a késon alkalmazott hallókészülékkel vagy cochleáris implantátummal elérheto hallás és beszédértés (104). A hallórendszer fejlodése során vannak olyan idoszakok, amikor különösen fontos a megfelelo szenzoros input (54, 134, 136). Munkám során a hallópálya fejlodésének, plaszticitásának egyes aspektusait is vizsgáltam, ezért a következokben röviden áttekintem az idegi kapcsolatok kialakulásával és a neuronális plaszticitással kapcsolatos alapfogalmakat. A gerinces idegrendszerben a neuronok közötti kapcsolatrendszer kialakulásának bonyolult folyamata nagy vonalakban öt jól elkülönítheto, finoman koordinált fázisból áll (166): 1. Axonképzodés és axonnövekedés a célsejt irányába. Az idegi nyúlványok (axonok és dendritek) az úgynevezett növekedési kúp (growth cone = GC) segítségével növekszenek. A GC az idegnyúlvány végén egy kiterjesztett tenyérhez hasonló képlet, ami csak akkor fejlodik ki, ha a nyúlvány megfelelo kapcsolatban van valamilyen szubsztráttal. A GC irányítását a neuron környezetében, az extracelluláris mátrixban elhelyezkedo molekulák, a környezo sejtek membránjához kötött fehérjék (sejtadhéziós molekulák), valamint a GC közelében felszabaduló kismolekulájú diffuzibilis faktorok (neurotranszmitterek, növekedési faktorok) irányítják. Ugyanazon ingerkombinációra a különbözo GC-k receptorkészletüktol függoen eltéroen reagálhatnak. Egyesek irányt változtatnak, mások elágaznak vagy egyenes irányban folytatják útjukat. A receptorok az általuk felvett információt a citoplazmatikus oldalra továbbítják, ahol másodlagos hírvivo rendszereket (cAMP, Ca2+, protein kináz C) aktiválnak. 2. A megfelelo célsejt kiválasztása az axonok által. Amikor az axon növekedése során a célsejtrégióba érkezik, megváltozik a sejtadhézió erossége. Ezt elsosorban sejtadhéziós molekulák (neural cell adhesion molecule = NCAM) és antiadhéziós hatások (pl. az adhéziós molekulákhoz kötodo polisziálsav) szabályozzák. 3. Kezdetleges szinaptikus kapcsolatok és struktúrák kialakítása. A specifikus sejt-sejt kapcsolatok kialakulásának elso lépése a szinaptikus partnerek kölcsönös felismerése. Ezt követi a pre- és posztszinaptikus struktúrák kialakulása. Egyes megfigyelések arra
utalnak, hogy a célsejtterületen belül a szinapszisok kialakulása nem elore eldöntött, hanem “próba-szerencse” alapon történik. Ez a folyamat az úgynevezett “kritikus periódus”. Ezt elsosorban a látókéreg kialakulásánál vizsgálták (198). A kritikus periódus azt jelenti, hogy az idegvégzodés és a célsejt között a dialógus ekkor a legintenzívebb és a környezetbol származó információ (hatás) ekkor a leghatékonyabb (54, 58). A preszinaptikus idegvégzodés és a posztszinaptikus sejt belso program alapján elore rendelkeznek a leendo szinapszis elemeinek a nagy részével (neurotranszmitter
termelés
és
felszabadítás
a
preszinaptikus
oldalon
és
neurotranszmittert felismero receptorok szintetizálása és a membránban való megjelenése a posztszinaptikus oldalon). Ezekbol az elemekbol áll össze a muködo szinapszis a pre- és posztszinaptikus sejt-sejt kapcsolat által aktivált antero- és retrográd jelzések hatására. 4. Pontatlan és felesleges szinaptikus kapcsolatok felszámolása, ezzel párhuzamosan szükségtelen axon- és dendritágak, valamint neuronok kiiktatása. A felesleges szinapszisok eltávolítása javítja a posztszinaptikus sejt plasztikus alkalmazkodó, kapcsolatkialakító képességét a késobbiekben. 5. A végleges szinaptikus kapcsolatok funkcionális megerosítése. Az emlos idegrendszerben a fejlodés során eloször kialakult idegi kapcsolatrendszer csak megközelítése a végleges formának. A neuronhálózatok összehangolt, hatékony muködéséhez további finomításra, átrendezésre, bizonyos szinapszisok megerosítésére, mások leépítésére van szükség. Ehhez a folyamathoz a már kapcsolatban levo neuronok együttes elektromos aktivitása is szükséges. Az akciós potenciálok idozítése kritikus tényezo
egyes
szinaptikus
összeköttetések
megerosödésében,
illetve
mások
kiküszöbölésében.
1. 6. Neuronális plaszticitás, GAP-43
Neuronális plaszticitáson sokféle jelenséget értenek. Egyesek az idegrendszer fejlodése közben mutatkozó változásokat, mások az idegi sérüléseket követo regenerációt, ismét mások kondicionálási, tanulási folyamatokat neveznek így. Mindezeket lefedo meghatározás, hogy a neuronális plaszticitás az idegrendszer többé-kevésbé tartós adaptív változásokra való képessége (166). Ma már nyilvánvaló, hogy az idegrendszer
plaszticitása nem korlátozódik a születés utáni kritikus fejlodési szakaszra. Az idegrendszer felnottkorban is komoly plaszticitással rendelkezik (113). Az idegi kapcsolatok kialakulásában és a neuronális plaszticitásban számos extra- és intracelluláris molekula vesz részt. Az egyik legjelentosebb a growth-associated protein43 (GAP-43, régebbi nevei: B-50, F1, pp46, P-57, neuromodulin). A GAP-43 az ontogenezis során növekvo axonok és a növekedési kúp membránjának citoplazmatikus oldalán elhelyezkedo foszfoprotein (66, 100, 155). A növekedési kúpban a protein kináz C legfobb szubsztrátuma a GAP-43 (102), amely kulcsszerepet tölt be az axonok kialakulásában és a növekedési kúp célsejtrégió felé vándorlásában (177). A GAP-43 nem idegi típusú sejtekben is filopodium képzodést indít el (208). Axonsérülését követoen a GAP-43 expressziója fokozódik a perikaryonban és a regeneráció során gyors axonális transzport segítségével jut a sérülés helyére (17, 71, 147, 153, 154, 178). Számos kutató immunhisztológiai módszerrel vizsgálta a GAP-43 immunreaktivitást az agy ontogenezise során (48, 49, 99). Az idegnyúlványok képzodése és növekedése során intenzív GAP-43 immunrektivitás detektálható az axonok egész hosszában. Ez az intenzív axonális immunreaktivitás a szinaptogenezis során csökken és ekkor a GAP-43 döntoen a neuropilban, a szinaptogenezis és szinapszis-stabilizáció helyszínén található. Itt, a neuropilban a GAP-43 immunfestodés a szinaptogenezis kritikus periódusának és a szinapszis-stabilizációnak a végéig intenzív, majd fokozatosan csökken. Felnott állatok agyában csak minimális GAP-43 festodést találtak, elsosorban a plasztikus, remodellizációra képes rostrális agyi területeken (48, 109). Az ontogenezisben betöltött szerepe mellett a GAP-43 a neuronok adaptív változásokra adott reakcióiban is résztvesz. Axotomizált szenzoros (142) és motoros rostokban (116) nagymértékben megno a GAP-43 expresszió. Felnott állatok központi idegrendszerében szinaptikus reorganizáció kapcsán emelkedett GAP-43 immunfestodést találtak (62, 161). Collingridge és Bliss (1995) bizonyították a GAP-43 részvételét a tanulás és a memória sejtszintu folyamataiban (42, 60 95, 96). Mindezek alapján a GAP-43 az axonogenezis, a szinaptogenezis és a neuronális plaszticitás egyik legspecifikusabb markerének tekintheto. Jelen munka egyik célkituzése volt a GAP-43-expresszió meghatározása a hallópálya magvaiban az ontogenezis során és cochlea léziót követoen.
1. 7. Az olivocochleáris rendszer és a hallópálya állatkísérletes kutatásának klinikai vonatkozásai Cochleáris eredetu halláscsökkenés, fülzúgás Az emberi cochlea a temporális csontban rendkívül rejtetten helyezkedik el. A cochleáris struktúrák finom volta, a szövettani vizsgálat in vivo kivihetetlensége a cochlea megbetegedéseinek kutatását rendkívül megnehezíti. A különbözo károsító behatásokra a cochlea meglehetosen egyhangú válaszokat produkál, halláscsökkenés, fülzúgás jön létre. Ezen tényezok miatt a cochlea megbetegedéseinek anatómiai és élettani alapjai nem teljesen tisztázottak. Állatkísérletetes vizsgálatok alapján felteheto, hogy a különbözo, a cochleát károsító tényezok (genetikai eltérések, ototoxikus anyagok, zaj, hormonális eltérések, traumák, infekciók) elsosorban a szorsejteket, a ganglion spiralet és a cochlea homeostasisát károsítják. Újabb megfigyelések szerint azonban a szorsejtek efferens beidegzésének károsodása is jelentos tényezo a halláscsökkenés és a fülzúgás kialakulásában (119, 184). Az olivocochleáris rendszer anatómiájának pontosabb megismerése így alapvetoen hozzájárulhat a hallás élettani és kóros muködésének megértéséhez. Cochleáris implantáció Az utóbbi 15 évben terjedt el világszerte a cochleáris implantáció, melynek lényege a süket, illetve súlyosan nagyothalló gyermekek és felnottek hallásrehabilitációja a cochleába ültetett implantátum segítségével (123). A készülék egy külso mikrofonból és peszédprocesszorból, valamint egy belso egységbol áll, melynek elektródáját a cochleába vezetjük (93). Az elektróda segítségével a készülék elektromosan ingerli a ganglion spirale sejtjeit és ez hangélményt vált ki. Az új eljárás számos olyan kérdést vet fel, melyek részben állatkísérletek segítségével válaszolhatók meg. Megfigyelték, hogy süket gyermekek esetében a korai cochleáris implantációval jobb hallás- és beszédfejlodés érheto el, mint késoi mutét esetén (104). A jelenlegi álláspont szerint 2-3 éves korban elvégzett implantáció esetén várható a legjobb eredmény. Késobb, a beszédmegértés szempontjából kritikus idoszak után már nem alakul ki jó beszédértés az implantátummal. Klinikai szempontból is érdekes a hallópálya fejlodésének, a szinapszisok kialakulásának állatkísérletes kutatása. Felnottkorban kialakult süketség esetén a cochleáris implantációval kiváló hallás- és beszédértés érheto el (118). Kivételes esetekben veleszületett süketek felnottkori implantációja is sikeres volt. E
megfigyelések arra utalnak, hogy a hallórendszer felnottkorban sem veszti el teljesen plaszticitását. A neuronális plaszticitás állatkísérletes kutatása is hozzájárulhat a klinikai tapasztalatok jobb értelmezéséhez és az implantációs stratégia továbbfejlesztéséhez. Ribári és munkatársai (124) felfedezték, hogy egyes betegeknél a cochleáris implantáció után az ellenoldalon is hallásjavulás alakul ki. Ez a hallásjavulás olyan mértéku lehet, hogy hallókészülék használata is lehetové válhat és bizonyos esetekben szükségtelenné teheti a kétoldali cochleáris implantációt (125). E jelenség jobb megértéséhez is hozzájárulhat a hallórendszer plaszticitásának, valamint az afferens és az efferens hallópálya anatómiájának alaposabb megismerése. Agytörzsi implantáció Kétoldali hallóideg daganat esetén kialakult süketségben újabban lehetoség van úgynevezett agytörzsi implantációra (76). Az agytörzsi implantáció során egy, a cochleáris implantációhoz hasonló elven muködo készüléket ültetnek be, melynek lapszeru elektródáját a cochleáris magra helyezik (89). Az elektróda segítségével a cochleáris mag sejtjei direkt úton ingerelhetok, mely a felszálló hallópálya aktiválódásához vezet. Nem kelloen tisztázott azonban, hogy a hallóideg pusztulása ill. mutéti eltávolítása milyen központi idegrendszeri változásokhoz vezet. Állatkísérletek segítségével tisztázható, hogy a cochlea vagy a hallóideg léziója milyen reakciókat, molekuláris és anatómiai változásokat vált ki a hallópálya magvaiban és a hallókéregben.
2. Célkituzések
A jelen dolgozat alapját képezo állatkísérletek során az olivocochleáris rendszer és a hallópálya anatómiájának, fejlodésének egyes aspektusait kutattuk. Vizsgáltuk továbbá, hogy a cochlea mechanikus léziója hatással van-e a cochleáris mag és az oliva superior GAP-43 expressziójára.
1. Célul tuztük ki, hogy kimutassuk az axonogenezisben és a szinaptogenezisben kulcsszerepet betölto GAP-43-at az oliva superiorban és a cochleáris magban patkányban. Vizsgálni kívántuk, hogy miként változik a GAP-43 expressziója ezen magvakban a születés utáni kritikus periódusban és kimutatható-e felnottkorban.
2. A cochlea mechanikus léziója révén megszüntettük a periféria felol az agytörzsbe jutó auditorikus inputot, elpusztítottuk a ventrális cochleáris magba projiciáló ganglion spirale sejtjeit, valamint axotomizáltuk az olivocohleáris sejteket. Célul tuztük ki, hogy immunhisztológiai vizsgálatokkal igazoljuk a hallóideg rostok degenerációját, valamint meghatározzuk a GAP-43 expresszióban a cochlea mechanikus léziójának hatására létrejövo változásokat az oliva superiorban és a cochleáris magban.
3. Célul tuztük ki, hogy fluoreszcens jelöloanyagok segítségével feltérképezzük a cochleába projiciáló olivocochleáris sejteket. Két különbözo jelöloanyag egyideju beadásával és kimutatásával vizsgálni kívántuk, hogy az olivocochleáris sejtek adnak-e axon kollaterálist a hallópálya elso átkapcsoló állomásaként muködo ventrális cochleáris magba.
4. A retrográd transzportálódó és transzneuronálisan terjedo pseudorabies vírus intracochleáris injekciója és immunhisztológiai kimutatása révén meg kívántuk határozni, hogy fertozheto-e a tengerimalac agy a cochlea felol. Célul tuztük ki, hogy különbözo túlélési idoket követoen feltérképezzük a retrográd terjedo pseudorabies vírus által fertozött agyterületeket. A túlélési idok helyes megválasztásával meg kívántuk határozni a vírus által a cochlea felol megfertozött primér, szekundér és tercier neuronok elhelyezkedését.
3. Módszerek
Az
értekezés
eredményei
és
következtetései
állatkísérleteken
alapulnak.
Az
állatkísérletek során összesen 75 patkányt és 17 tengerimalacot használtunk fel. Az állatok gondozása, érzéstelenítése, mutétjei és leölése során mindvégig betartottuk a vonatkozó törvényeket és rendeleteket, valamint az Európa Tanács 1986 november 26án nyilvánosságra hozott irányelveit (86/609/EEC).
3. 1. Immunhisztológiai vizsgálatok patkány agymetszeteken a posztnatális fejlodés során
A cochleáris magok és az oliva superior GAP-43 expressziójának posztnatális vizsgálata céljából patkányokat tenyésztettünk és születésük után különbözo életkorban leöltük oket. Összesen 30 patkány agyát vizsgáltuk. A patkányok születéstol számított (posztnatális) életkorát napokban kifejezve P betuvel jelöljük. A legfiatalabb állatokat (P0: 3 db; P1: 1 db; P2: 1 db; P4: 3 db; P6: 1 db; P8: 1 db; P10: 1 db; P12: 1 db; P14: 1 db; P16: 1 db) barbiturát halálos adagjával altattuk el. Az állatok agyát gyorsan eltávolítottuk és jéghideg fixáló oldatba helyeztük. Az oldat összetétele 0.1 M-os foszfát pufferben oldott paraformaldehyd (4%), glutáraldehyd (0,1 %) és pikrinsav (15%) volt. Az agyak immerziós fixálása 3 napig tartott. A kicsit nagyobb patkányokat (P4: 1 db; P8: 2 db; P12: 3 db; P16: 2 db; P21: 1 db; P28: 1 db; P35: 1 db; P42: 2 db; P50: 1 db; P120: 2 db) Nembutal (Abbott, North Chicago, USA) halálos adagjával öltük le, majd transzkardiálisan perfundáltuk a fenti összetételu, 4 Co -os fixáló oldat 1 literjével. A perfúziót követoen kipreparáltuk a patkányok agyát. A fixálást követoen az agyakat 0,1 M-os foszfát pufferben oldott 25 %-os szukróz oldatba helyeztük egy éjszakára. Ezután kriosztát segítségével 30 mikrométer vastag frontális és szagittális agymetszeteket készítettünk. A metszeteken 3 lépcsos preinkubációt végeztünk: 45 percig 0,05% H2 O2 -ben, 30 percig 1 %-os tejporban, végül 30 percig 10 %-os marhaszérum és 0,05%-os Triton X-100 oldatában úsztattuk a metszeteket. A GAP-43 immuncitokémiai kimutatásához egérben eloállított primér antitestet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA) és egér elleni, biotinilált szekunder antitestet (Vector Laboratórium, Burlingame, USA) használtunk. A metszeteket 72 óráig inkubáltuk 4 Co -on a primér antitestet tartalmazó oldatban (1 : 5000; 0,1 ? gramm/ml). Ezt követoen a metszeteket a biotinilált szekunder antitestet tartalmazó oldatba (1:200) helyeztük. Végül a metszeteket 30 percre avidin-biotinperoxidáz komplex oldatába helyeztük (74). A peroxidázzal történt jelölést 0,05 % diaminobenzidint (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) és 0,3 % ammoniumnikkel-szulfátot tartalmazó 0,1
M-os Tris pufferrel és 0,0015% H2 O2-vel tettük
láthatóvá. Az inkubációs ido 3 perc volt. Az immunhisztokémiai reakció után a metszeteket többször foszfát pufferben mostuk, majd tárgylemezre húztuk. Száradás és dehidrálás után fedtük a metszeteket. A primér antitestben nem inkubált kontroll metszeteket is készítettünk. Ezeken sohasem láttunk festodést.
A kísérletek során ügyeltünk arra, hogy az eredményeket esetleg befolyásoló tényezok (inkubációs idok, homérséklet, oldatok koncentrációja) konstansak legyenek. Az azonos korú immerziós és perfúziós módszerrel fixált agyak (P4, P8, P12 és P16) összehasonlítása arra utalt, hogy a fixálási módszer a GAP-43 immunreaktivitás jellegét nem, de intenzitását minimális mértékben befolyásolta.
3. 2. A cochlea mechanikus léziója és posztoperatív immunhisztológiai vizsgálatok felnott patkány agy metszetein. A cochlea machanikus léziója A cochlea mechanikus léziója által kiváltott hatások vizsgálatára 29 felnott patkányt használtunk. Az állatokat Ketanest (100 mg/kg, Parke-Davis, USA) és Rompun (5mg/kg, Bayer Leverkusen, Németország) injekciójával altattuk el. A bal fülkagyló mögötti, retroauricularis metszés után kipreparáltuk a bulla tympanicát. A külso hallójárat felol szélesen megnyitottuk a bullát, látótérbe hoztuk a bulla mediális faláról eloemelkedo cochleát. Kerekfeju fúróval megnyitottuk, majd eltávolítottuk a cochleát. A cochlea bazális és apikális kanyarulatait, valamint a ganglion spiralét is eltávolítottuk. A bullát Gelfoammal (Gelita, B. Braun, Németország) töltöttük ki, majd csomós öltésekkel zártuk a bormetszést. A mutétet követoen az állatok fájdalomcsillapítót (Novalgin, 10 mg/kg, Hoechst, Németország) kaptak intramuszkulárisan, majd visszakerültek az állatházba. Immunhisztológia Különbözo túlélési idoket (2, 4, 7, 14, 28 és 56 nap) követoen az állatokat Nembutal (Abbott, North Chicago, USA) halálos adagjával öltük le, majd transzkardiálisan perfundáltuk 4% paraformaldehydet, 0,1% glutáraldehydet és 15% pikrinsavat tartalmazó 4 Co -os fixáló oldat 1 literjével. A perfúziót követoen kipreparáltuk a patkányok agyát. A fixálást követoen az agyakat 0,1 M-os foszfát pufferben oldott 25 %-os szukróz oldatba helyeztük egy éjszakára. Ezután kriosztát segítségével 30 mikrométer vastag frontális és szagittális agymetszeteket készítettünk. A metszeteken 3 lépcsos preinkubációt végeztünk: 45 percig 0,05% H2 O2 -ben, 30 percig 1 %-os tejporban, végül 30 percig 10 %-os marhaszérum és 0,05%-os Triton X-100 oldatában úsztattuk a metszeteket.
A GAP-43 immuncitokémiai kimutatásához egérben eloállított primér antitestet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA) és egér elleni, biotinilált szekunder antitestet (Vector Laboratórium, Burlingame, USA) használtunk. A metszeteket 72 óráig inkubáltuk 4 Co -on a primér antitestet tartalmazó oldatban (1 : 5000; 0,1 ? gramm/ml). Ezt követoen a metszeteket a biotinilált szekunder antitestet tartalmazó oldatba (1:200) helyeztük. Végül a metszeteket 30 percre avidin-biotin-peroxidáz komplex
oldatába
helyeztük
(74).
A
peroxidázzal
történt
jelölést
0,05
%
diaminobenzidint (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) és 0,3 % ammoniumnikkel-szulfátot tartalmazó 0,1
M-os Tris pufferrel és 0,0015% H2 O2-vel tettük
láthatóvá. A cochlea lézió eredményességének a megítélése céljából párhuzamos metszeteken glutamát (1:15000, Sigma-Aldrich, Németország) és calretinin (1:5000, Swant, Svájc) ellenes primér antitestekkel is elvégeztük az immunhisztológiai eljárást. Néhány metszeten a prészinaptikus struturákat jelölo synaptophysin (1: 100, Boehringer Mannheim, USA) ellenes primér antitesteket is használtunk. Az immunhisztokémiai reakció után a metszeteket többször foszfát pufferben mostuk, majd tárgylemezre húztuk. Száradás és dehidrálás után fedtük a metszeteket. A primér antitestben nem inkubált kontroll metszeteket is készítettünk. Ezeken sohasem láttunk festodést.
3. 3. Neuronpályák jelölésére alkalmas módszerek, a jelen munka során alkalmazott jelöloanyagok Az idegrendszer anatómiájának, kapcsolatainak feltérképezése a XIX. század második felében kezdodött. Eleinte léziók segítségével, az idegsejtek retrográd és anterográd degenerációja alapján következtettek a sejtek közötti kapcsolatokra, az axonok lefutására (30). A XX. század 70-es éveiben kezdték alkalmazni a tormaperoxidázt, mely kituno retrográd transzportálódó jelöloanyagnak bizonyult (90). Cowan és munkatársai vezették be az anterográd transzportálódó, radioaktív izotópokat tartalmazó aminosavak autoradiográfiás kimutatását (45). Az elmúlt 20-30 évben számos anterográd és retrográd transzportálódó neuronális jelöloanyagot alkalmaztak az idegrendszer anatómiájának mind pontosabb megismerése érdekében. A fluoreszcens jelöloanyagok szenzitív, megbízható eszköznek bizonyultak. Elso képviseloik a diamidino yellow, a fast blue és a fluorogold (24). Újabb fluoreszcens
jelöloanyagok a carbocyanine festékek és a fluoreszcens dextránok (72). A fluoreszcens jelöloanyagok az idegszövetben könnyen, egy adott hullámhosszú fényben mutathatók ki. Különbözo színben fluoreszkálnak, így több jelöloanyag szimultán használatára is lehetoség van. Kísérleteink során az olivocochleáris sejtek kollaterálisainak vizsgálata céljából fluoreszcens neuronális jelöloanyagokat, a diamidino yellowt és a fast bluet alkalmaztuk. Ezek a jelöloanyagok alkalmasak egyazon idegsejt szimultán jelölésére, hiszen a diamidino yellow a sejtmagot sárgára, míg a fast blue a citoplazmát kék színure festi (43). Számos kutató alkalmazta már ezeket a fluoreszcens festékeket az olivocochleáris sejtek jelölésére (11, 127, 128, 200). A fluoreszcens jelöloanyagok mellett sok egyéb, foleg anterográd transzportálódó jelöloanyag használatos egy adott sejtcsoport efferenseinek feltérképezésére: a cholera toxin B alegysége (CTB), a Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L), a biocytin, a neurobiotin és a biotinylált dextrán amin (BDA). Az utóbbi években egy újabb módszer terjedt el a neuroanatómiában: az idegpályák transzneuronális jelölése neurotróp vírusok segítségével (5, 25, 40, 88). Ezen vírusokra jellemzo, hogy az idegek perifériás végzodései specifikus receptorok segítségével megkötik és felveszik oket. A vírusok a sejtben retrográd (ill. kisebb mértékben anterográd is) transzportálódnak, a perykarionban elszaporodnak. Még mielott kikerülnének a sejtbol, megfertozik a szinapszison keresztül az adott sejten szinapszist képzo neuront, abban ismét retrográd transzportálódnak és a folyamat ismétli önmagát (12). Az elsoként megfertozött sejt a primer, a második a szekunder neuron. A vírussal megfertozött sejtek immunhisztokémiai módszerrel kimutathatók. A beadás utáni túlélési ido változtatásával multiszinaptikus neuronpályák feltérképezése válik lehetové (175). Jelen munka során a neurotróp, transzneuronálisan terjedo pseudorabies vírust (az Aujeszky féle sertésbetegséget okozó vírust) a cochleába injektáltuk. Az általunk használt vírust már sikeresen alkalmazták számos más szerv efferens innervációjának vizsgálata során (81, 112, 133, 141, 160, 164, 173, 191).
3. 4. Fluoreszcens jelöloanyagok (diamidino yellow és fast blue) applikációja patkány belsofülbe és az azonos oldali ventrális cochleáris magba.
Az olivocochleáris sejtek és a ventrális cochleáris magba adott kollaterálisaik vizsgálata céljából 16 felnott patkányt használtunk. A kísérletek során diamidino yellow (DY, Sigma-Aldrich, Németország) és fast blue (FB, Sigma-Aldrich, Németország) fluoreszcens jelöloanyagokat juttattunk a cochleába és az azonos oldali ventrális cochleáris magba. Az állatokat Ketanest S (50 mg/kg, Parke-Davis, USA) és Rompun (5 mg/kg, Bayer Leverkusen, Németország) intraperitonealis injekciójával altattuk el. Az állatokat két csoportra osztottuk. Az egyik csoportban (6 állat) a fluoreszcens jelöloanyagokat a cochleába juttattuk. A másik csoportban (10 állat) FB-t injekcióztunk a ventrális cochleáris magba, majd DY-t juttattunk az azonos oldali cochleába.
Intracochleáris applikáció (6 állat) Az altatást követoen retroauriculáris metszést végeztünk a bal fül mögött, szabaddá preparáltuk és megnyitottuk a bulla tympanicát. Látótérbe hoztuk a cochleát. Óvatosan két piciny lyukat fúrtunk basalisan és apikálisan a csontos falon. A kifolyó perilymphát kis gelfoam darabokkal felfogtuk. Fluoreszcens jelöloanyaggal (4 esetben FB-vel, 2 esetben DY-al) feltöltöttük lassan a cochleát. Sebészi viasszal zártuk a nyílásokat a cochleán. A bullát Gelfoammal (Gelita, B. Braun, Németország) töltöttük fel, majd csomós öltésekkel zártuk a sebet.
Intracochleáris applikáció és injekció a ventrális cochleáris magba (10 állat) Az állatok ezen csoportjában FB-t injekcióztunk a ventrális cochleáris magba, majd DY-val töltöttük fel az azonos oldali cochleát. Altatást követoen a bal oldalon occipitálisan
craniotomiát
végeztünk.
Eltávolitottuk
a
kisagy
flocculusát
és
paraflocculusát, látótérbe hoztuk a cochleáris magot. Ötven mikrométer átméroju üveg mikropipettával 0,15 mikroliter telített FB oldatot injektáltunk lassan a ventrális cochleáris magba. Az injekciót követoen 10 percig hagytuk bent a mikropipettát, majd lassan eltávolitottuk. A flocculus és paraflocculus helyét gelfoammal töltöttük ki. Ezt követoen a fent leírt módon DY-t jutattunk az állatok cochleájába, a cochleáris magba adott
injekcióval
megegyezo
oldalon.
A
mutéteket
követoen
az
állatok
fájdalomcsillapítót
(Novalgin,
10
mg/kg,
Hoechst,
Németország)
kaptak
intramuscularisan, majd visszakerültek az állatházba.
Hat nappal a mutétek után az állatokat Nembutal (Sanofi, Francoiaorság) halálos adagjával öltük le és transzkardiálisan perfundáltuk 4 % paraformaldehydet tartalmazó, 0,1 M-os, 4 Co-os foszfátpufferrel. Harminc mikrométer vastag frontális agymetszeteket készítettünk majd tárgylemezre húztuk oket. A fluoreszcens jelöloanyagot tartalmazó sejteket Zeiss fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. Az injekciós hely és a jelölt sejtek meghatározása céljából camera lucida rajzokat készítettünk. A jelölt sejteket megszámoltuk,
az
egyes
metszeteken
kapott
sejtszámokat
összeadtuk.
A
metszéspontokban levo sejtek dupla számolását elkerülendo a kapott sejtszámokat Abercombie egyenlete alapján korrigáltuk (1, 68).
3. 5. Pseudorabies vírus injekciója tengerimalac cochleába. A vírus immunhisztológiai kimutatása agymetszeteken.
A leszálló hallópálya vizsgálata céljából az Aujeszky-féle, sertésbetegséget okozó pseudorabies vírusának gyöngített, Bartha-féle törzsét (14) injektáltuk tengerimalacok cochleájába. Különbözo túlélési idoket követoen immunhisztológiai eljárással mutattuk ki a vírust az agyban. Összesen 17 tengerimalacot használtunk a kísérletekhez.
Intracochleáris vírusinjekció A pseudorabies vírus Bartha törzsét (PRV-Ba) sertés vese sejttenyészetben szaporítottuk. A vírosból oldatot (109 plakk-képzo egység/ml) készítettünk és –70 o C-on tároltuk. A vírust tartalmazó oldatot használat elott gyorsan 37 o C-ra melegítettük. A vírusfertozött állatokat elkülönítve tartottuk. Az állatokat ketamin (80 mg/ml) és xylazine (15mg/ml) intramusculáris injekciójával altattuk el. Baloldali retroauriculáris metszés után szabaddá tettük és megnyitottuk a bulla tympanicát. Felkerestük a kerekablakot. A kerekablakot megnyitottuk és a kicsorgó perilymphát Gelfoammal felfogtuk. A kerekablakon keresztül mikropipettával 50 mikroliter vírusoldatot injektáltunk lassan, fokozatosan a cochleába. Az injekciót követoen sebészi viasszal zártuk a kerekablakot. A bulla tympanicát alaposan kitakarítottuk és kitöltöttük Gelfoammal. A sebet csomós boröltésekkel zártuk.
A vírus immunhisztológiai kimutatása A tengerimalacokat különbözo túlélési idoket követoen ismét elaltattuk, majd transzkardiálisan fiziológiás sóoldattal (50 ml) és fixáló oldattal (400 ml 4% paraformaldehydet és 15% pikrinsavat tartalmazó 0,1 M-os foszfát puffer) perfundáltuk oket. A túlélési idok a következok voltak: 15 óra (n=1), 25 óra (n=2), 37 óra (n=3), 40 óra (n=2), 48 óra (n=3), 72 óra (n=2), 90 óra (n=2), 96 óra (n=1), 108 óra (n=1). A perfúziót
követoen
kipreparáltuk
az
agyakat
és
50
mikrométeres
frontális
sorozatmetszeteket készítettünk fagyasztásos technikával a nyúltvelotol a hallókéregig. A metszeteken 3 lépcsos preinkubációt végeztünk: 45 percig 3% H2 O2 -ben, 20 percig methanolban, végül több foszfát-pufferes mosás után 1 óráig 10 %-os kecskeszérumban úsztattuk a metszeteket. Többszöri ismételt mosás után a metszeteket 48 órán át inkubáltuk a primér, vírusellenes antitestet (1: 5000 higításban) tartalmazó oldatban. Az antitestet
nyúlban
termelték
és
R.
R.
Miselis
(Philadelphia)
bocsátotta
rendelkezésünkre. Ezt követoen a metszeteket a biotinilált szekunder antitestet tartalmazó oldatba (1:200) helyeztük. Végül a metszeteket 30 percre avidin-biotinperoxidáz komplex oldatába (Vectastain Elite ABC Kit, Vector, Burlingame, USA) helyeztük. A peroxidázzal történt jelölést 0,05 % diaminobenzidint (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) tartalmazó 0,1 M-os Tris pufferrel és 0,0015% H2 O2vel tettük láthatóvá. Az immunhisztokémiai reakció után a metszeteket többször foszfát pufferben mostuk, majd tárgylemezre húztuk. Száradás és dehidrálás után fedtük a metszeteket. A primér antitestben nem inkubált kontroll metszeteket is készítettünk. Ezeken sohasem láttunk festodést. A jelölt sejtek lokalizációjának meghatározásához tengerimalac agy atlasz segítségét vettük igénybe (126).
4. Eredmények
4. 1. A GAP-43 expresszió posztnatális változása az oliva superiorban és a cochleáris magban 4. 1. 1. Oliva superior
Újszülöttkorban (P1-P8) az oliva superiorban intenzív GAP-43 immunreaktivitást detektáltunk (7. ábra, A). Ez az eroteljes festodés fokozatosan csökkent és felnottkorban az oliva superiorban csak alacsony GAP-43 szintet találtunk (7. ábra, B). Nagy nagyítású objektívvel is áttekintve a metszeteket jól láthatóvá vált, hogy az intenzív újszülöttkori GAP-43 festodés diffúzan az oliva superior neuropiljére terjedt ki (8. ábra). Az elso két posztnatális hét során ez az intenzív, diffúz festodés (8. ábra, P1) fokozatosan granulárissá vált és az intenzitása is jelentosen csökkent. Felnottkorban a GAP-43 az oliva superiorban futó rostok varikozitásaiban, pontszeruen helyezkedett el, a sejttestekben csak minimális GAP-43 szint volt sejtheto (8. ábra, felnott).
4. 1. 2. Cochleáris mag
Az oliva superiorhoz hasonlóan a cochleáris magban is újszülöttkorban intenzív GAP43 immunreaktivitást találtunk (9. ábra, A). Ez az eroteljes festodés felnottkorra drámaian lecsökkent (9. ábra, B). Nagy nagyítással vizsgálva a metszeteket az elso posztnatális napokban eroteljes, diffúz neuropil festodést találtunk a cochleáris magban, a sejttestek nem festodtek (10. ábra, P1). Az elso két posztnatális héten a festodés fokozatosan granuláris jelleguvé vált és intenzitása jelentosen csökkent. A 16. posztnatális napra eltunt az intenzív, diffúz GAP-43 immunreaktivitás (10. ábra, P16). A
GAP-43
ekkor
már
csak
pontszeruen,
varikozitásokban,
prészinaptikus
axonvégtalpacskákban volt kimutatható. A pontszeruen festodo végtalpacskák nemegyszer sejttestek körül helyezkedtek el (10. ábra, felnott). A cochleáris mag GAP43 immunreaktivitása felnottkorban nem volt teljesen homogén, hiszen a dorzális cochleáris mag mélyebb rétegeiben intenzívebb GAP-43 festodést találtunk mint a ventrális cochleáris magban (11. ábra).
7. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az oliva superiorban a 8. posztnatális napon (P8, A) és felnott állatban (felnott, B) patkány agytörzs frontális metszeteinek részletein. Az újszülöttkori intenzív, diffúz neuropil festodés felnottkorra nagymértékben csökken és pontszeruvé válik az oliva superiorban (SOC). Méretjel = 0, 5 mm. n7 = arcideg; tb = trapéztest;
8. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az oliva superior laterális magvában nagy nagyítással, különbözo posztnatális napokon. Az újszülöttkori intenzív, diffúz immunreaktivitás (P1, P4) fokozatosan csökkent és a 16. napra (P16) pontszeruvé vált. Felnottkorban csak minimális, pontszeru festodést detektáltunk axonális struktúrákban (felnott, nyilak). Méretjel = 20 µm.
9. ábra. GAP-43 immunreaktivitás a cochleáris magban a 8. posztnatális napon (P8, A) és felnott állatban (felnott, B). Az újszülöttkori intenzív, diffúz neuropil festodés felnottkorra nagymértékben lecsökken és pontszeruvé válik a cochleáris magban. A mag felszíne alatt, valamint dorzomediálisan kissé erosebb a GAP-43 festodés (nyilak). Méretjel = 0, 5 mm. AVCN = anteroventrális cochleáris mag; tb = trapéztest; CB = cerebellum.
10. ábra. GAP-43 immunreaktivitás a ventrális cochleáris magban nagy nagyítással, különbözo posztnatális napokon. Az újszülöttkori intenzív, diffúz immunreaktivitás (P1, P4) fokozatosan csökkent és a 16. napra (P16) pontszeruvé vált. Felnottkorban csak minimális, pontszeru festodést detektáltunk axonális struktúrákban, gyakran sejttestek körül (felnott, nyilak). Méretjel = 20 µm.
11. ábra. GAP-43 immunreaktivitás felnott állat dorzális (DCN) és poszteroventrális (VCN) cochleáris magjában. Jól látható a cochleáris mag alacsony GAP-43 tartalma az agytörzs egyéb struktúráihoz képest, valamint a dorzális és ventrális cochleáris mag közötti különbség. Méretjel = 1mm. ml = a dorzális cochleáris mag molekuláris rétege; tb = trapéztest. 4. 2. Cochleáris lézió hatása az oliva superior és a cochleáris mag GAP-43 expressziójára
Kísérleteink során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a cochlea mechanikus léziójának hatására megváltozik-e a GAP-43 expresszió az agytörzsben? A cochlea- és így a ganglion spirale- teljes léziójának igazolása és dokumentálása céljából
immunhisztológiai vizsgálatokat végeztünk glutamát és calretinin ellenes primér antitestekkel is. A hallóideg rostjai nagy mennyiségben tartalmazzák a glutamátot (7) és a calretinint (201), így ezek kimutatása a ventrális cochleáris magban jól ábrázolta a hallóideg pusztulását (12. ábra). A hallóideg rostjainak degenerálódása már a 4. posztoperatív napra nyilvánvalóvá vált (12. ábra A és E). Két hónappal a mutét után a ventrális cochleáris magban szinte csak sejtek festodtek, a hallóideg rostjai elhaltak (12. ábra C és G). A cochlea mechanikus lézióját követoen az operált oldalon a ventrális cochleáris magban és az oliva superiorban a GAP-43 immunreaktivitás jelentosen megváltozott (13. ábra). Nagy nagyítással is összehasonlítottuk az operált és a nem operált oldalt. A korrekt összevetés érdekében az egyes magvaknak mindig ugyanazon területét fényképeztük le (14. ábra).
4. 2. 1. Oliva superior
A cochlea mechanikus léziójának hatására az oliva superior GAP-43 expressziója drámaian megváltozott (13. ábra). Felnottkorban az oliva superior GAP-43 szintje alacsony, a sejtekben nem található GAP-43. A cochleáris lézió után 4 nappal az oliva superior laterális magvában az operált oldalon GAP-43 pozitív sejtek jelentek meg (15. ábra, B). Nagy nagyítású objektívvel vizsgálva a metszeteket láthatóvá vált, hogy a megnövekedett GAP-43 expresszió a sejtekben következett be (16. és 17. ábra). A GAP-43 a 4. posztoperatív napon a sejttestekben jelent meg (16. ábra, C), a 7. napon már a dendritekben is detektálható volt (16. ábra, E). A neuropilban számos axonvégtalpacska is GAP-43 pozitív volt, itt azonban nem volt különbség a nem operált oldallal illetve kontroll állatokkal összehasonlítva. A GAP-43 pozitív sejtek száma és a festodés intenzitása a 14. posztoperatív naptól fokozatosan csökkent (17. ábra). Az operált oldali oliva superior laterális magvában festodött GAP-43 pozitív sejteket megszámoltuk és a sejtszámokat oszlopdiagrammon ábrázoltuk (18. ábra). Az ellenoldali oliva superiorban és az azonos oldali oliva superior mediális magvában, valamint a trapéztest magvaiban nem találtunk GAP-43 pozitív sejteket.
4. 2. 2. Cochleáris mag
Ventrális cochleáris mag Cochleáris lézió hatására a ventrális cochleáris mag GAP-43 immunreaktivitása az operált oldalon jelentosen megemelkedett (13. ábra). A felnottkorban jellemzo alacsony GAP-43 expresszió a ventrális cochleáris magban 4 nappal a cochlea léziót követoen vált intenzívebbé. Az expresszió növekedése a mutét után 7 nappal érte el maximumát. Két hónappal a cochlea lézió után a GAP-43 expresszió változása a ventrális cochleáris magban már alig volt kimutatható. A 19. és 20. ábra nagy nagyítással mutatja a GAP-43 immunreaktivitást a ventrális cochleáris mag centrális részén a cochlea lézióval megegyezo oldalon és kontralaterálisan. Két nappal a mutét után (POD2) még nem találtunk eltérést a kontrollhoz képest. A negyedik posztoperatív napon intenzív, suru GAP-43 expressziót jelent meg az operált oldali ventrális cochleáris mag neuropiljében. A festodés foleg a sejtek körül volt intenzív, de maguk a sejttestek nem tartalmaztak GAP-43-at (19. ábra C). A GAP-43 festodés intenzitása a 7. posztoperatív napra érte el maximumát (19. ábra E), majd fokozatosan csökkent és két hónappal a cochlea lézió után a GAP-43 expresszió változása már alig volt kimutatható (20. ábra E). A prészinaptikus terminálisokban elhelyezkedo synaptophysin immunreaktivitást összehasonlítottuk a cochleáris lézió utáni GAP-43 immunreaktivitással (21. ábra). Kontroll (nem operált) állatok ventrális cochleáris magjában a synaptophysin immunreaktivitás (21. ábra A) a cochleáris lézió utáni GAP-43 immunreaktivitással (21. ábra B) megegyezo képet mutatott. E hasonlóság arra utal, hogy a lézió okozta fokozott GAP-43 immunreaktivitás a prészinaptikus terminálisokra lokalizálódik. Dorzális cochleáris mag A dorzális cochleáris mag neuropiljében a cochleáris lézió hatására csak minimális GAP-43 expresszió növekedés következett be. Hosszú (56 nap) túlélési idot követoen azonban az ellenoldali dorzális cochleáris magban GAP-43-at expresszáló sejtek jelentek meg. Ilyen GAP-43 pozitív sejtre mutat példát a 22. ábra. Kontroll, nem operált állatokban sohasem láttunk GAP-43 pozitív sejteket a cochleáris magban. Mivel az ellenoldali dorzális cochleáris mag sejtjeit a cochleárius lézió közvetlenül nem érinthette, ezért a fokozott GAP-43 expresszió transz-szinaptikus hatások eredménye lehet.
12. ábra (a következo oldalon) A ventrális cochleáris mag centrumának részlete nagy nagyítással glutamát (A-D) és calretinin (E-H) immunhisztológiai kimutatásával cochleáris lézió után az operált és a nem-operált oldalon. A 4. posztoperatív napon (POD 4) az operált oldalon (A) a glutamát immunhisztológiai kimutatása a rostok jelentos részének pusztulását jelzi az ép oldalhoz (B) képest. Az 56. posztoperatív napra (POD 56) a glutamáterg rostok nagy része eltunt (C), míg a nem operált oldalon a roststruktúra ép (D). A calretinin immunreaktív rostok szétesése, eltunése az operált oldalon (E és G) és épsége a nem operált ventrális cochleáris magban (F és H) szintén arra utal, hogy a 4. (POD 4) ill. az 56. (POD 56) posztoperatív napra a cochleáris lézió hatására a hallóideg ventrális cochleáris magba futó rostjai degenerálódtak. Méretjel = 20 ? m.
13. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az agytörzsben 7 nappal a cochleáris lézió után. Az ellenoldali anteroventrális cochleáris mag (AVCN) és oliva superior (SOC) GAP-43 expressziója minimális (A). A mutött oldalon az oliva superiorban GAP-43 pozitív sejtek jelentek meg és a ventrális cochleáris mag GAP-43 immunreaktivitása jelentosen megemelkedett az ellenoldalhoz képest (B). Méretjel = 1mm. n7 = nervus facialis; n8 = nervus vestibulocochlearis; SOC = oliva superior; AVCN = anteroventrális cochleáris mag;
14. ábra. Az agytörzs frontális metszetének rajza az oliva superior laterális magvának (LSO) magasságában. A sötétített négyzetek azokat a területeket jelzik, ahol az LSO-ból és az anteroventrális cochleáris magból (AVCN) származó nagy nagyítású felvételeket készítettük. Méretjel = l mm; stt = tractus spinalis n. trigemini; N5 = nucleus tractus spin. n. trigemini; tb = trapéztest; MSO = az oliva superior mediális magja; SPO = felso perioliváris mag; MNTB = a trapéztest mediális magja; pt = piramispálya; n7 = nervus facialis; n8 = nervus vestibulocochlearis.
15. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az oliva superiorban az azonos oldali cochlea léziója után, különbözo túlélési idoket követoen. A második posztoperatív napon még nem volt detektálható változás (A). A 4. posztoperatív napon GAP-43 pozitív sejtek jelentek meg az oliva superior laterális magjában (B, nyilak). Hét nappal a mutét után jelölodött a legintenzívebben a legtöbb sejt (C). A 14. (D) és a 28. (E) posztoperatív napon kevesebb és kevésbé festodött sejtet találtunk. Két hónappal a mutét után a GAP43 pozitív sejtek eltuntek, a festodés a kontroll (nem operált) állathoz volt hasonló (F). Méretjel = 200 µm. SPO = felso perioliváris mag; MSO = az oliva superior mediális magja; LSO = az oliva superior laterális magja; tb = trapéztest.
16. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az oliva superior laterális magjában 2 (POD 2, A és B), 4 (POD 4, C és D), valamint 7 (POD 7, E és F) nappal a cochleáris léziót követoen, nagy nagyítással. Baloldalon az azonos-, jobboldalon az ellenoldali oliva superior részlete. A nyilak a B képen GAP-43 pozitív axonvégtalpacskára mutatnak. Az elso GAP-43 pozitív sejtek az azonos oldali oliva superiorban a 4. posztoperatív napon jelentek meg (C, nyilak). A legintenzívebb, a dendritekre is terjedo festodést a 7. posztoperatív napon találtuk (E). Méretjel = 20 µm.
17. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az oliva superior laterális magjában 14 (POD 14, A és B), 28 (POD 28, C és D), valamint 56 (POD 56, E és F) nappal a cochleáris léziót követoen, nagy nagyítással. Baloldalon az azonos-, jobboldalon az ellenoldali oliva superior részlete. A késobbi posztoperatív idoszakban az immunpozitív sejtek száma és a festodés intenzitása jelentosen csökkent. Két hónappal a mutét után csak egyes sejtek citoplazmája tartalmazott GAP-43-az (E). Méretjel = 20 µm.
18. ábra. Az azonos oldali oliva superior laterális magvában cochleáris lézió hatására megjelent GAP-43 pozitív sejtek számát mutató oszlopdiagramm. A vízszintes tengelyen a cochleáris lézió utáni posztoperatív ido, a függolegesen a GAP-43 pozitív sejtek száma. A legkifejezettebb reakció 1 héttel a mutét után jelentkezett.
19. ábra. GAP-43 immunreaktivitás a ventrális cochleáris magban 2 (POD 2, A és B), 4 (POD 4, C és D), valamint 7 (POD 7, E és F) nappal a cochleáris léziót követoen, nagy nagyítással. Baloldalon az azonos-, jobboldalon az ellenoldali ventrális cochleáris mag részlete. A nyilak a C és D képen GAP-43 pozitív axonvégtalpacskára mutatnak. A GAP-43 festodés a 4. posztoperatív napon vált eloször intenzívvé. Axonális struktúrák festodtek a sejttestek (C, csillag) körül. Méretjel = 20 µm.
20. ábra. GAP-43 immunreaktivitás a ventrális cochleáris magban 14 (POD 14, A és B), 28 (POD 28, C és D), valamint 56 (POD 56, E és F) nappal a cochleáris léziót követoen, nagy nagyítással. Baloldalon az azonos-, jobboldalon az ellenoldali ventrális cochleáris mag részlete. A késobbi posztoperatív idoszakban a GAP-43 festodés intenzitása jelentosen csökkent. Két hónappal a mutét után az operált oldalon (E) majdnem a kontroll szintjére esett vissza a GAP-43 immunreaktivitás. Méretjel = 20 µm.
21. ábra. Synaptophysin immunreaktivitás az anteroventrális cochleáris mag centrális részén kontroll állatban (A) és GAP-43 immunreaktivitás 7 nappal a cochleáris lézió után az azonos oldali cochleáris magban ugyanott (B). A nyilak immunpozitív axonvégtalpacskákra mutatnak. A két festodés hasonlósága arra utal, hogy a GAP-43 reexpressziója cochlea lézió után a prészinaptikus struktúrákban következett be. SyPhy = synaptophysin; Méretjel = 20µm.
22. ábra. GAP-43 pozitív neuron az ellenoldali dorzális cochleáris magban 2 hónappal a cochleáris lézió után. A GAP-43 a citoplazmára lokalizálódott, a sejtmag halványabb festodést mutatott. A nyíl egy immunpozitív dendritre mutat.
4. 3. Az olivocochleáris sejtek kettos jelölodése fluoreszcens jelöloanyagokkal
Különbözo színu fluoreszcens jelöloanyagokat alkalmaztunk, hogy feltérképezzük az olivocochleáris sejteket, a ventrális cochleáris magba projiciáló sejteket, valamint a kettosen jelölt, a ventrális cochleáris magba kollaterálist adó olivocochleáris sejteket.
4. 3. 1. Az olivocochleáris sejtek jelölodése a fluoreszcens jelöloanyagok (fast blue és diamidino yellow) intracochleáris applikációja után
A fast blue (FB) és a diamidino yellow (DY) intracochleáris applikációját követoen retrográd jelölt sejtek jelentek meg bilaterálisan az oliva superiorban. A jelölt sejtek elhelyezkedése a korábban közöltekhez hasonló volt (11, 197). Kicsi (10-12 µm), fusiformis neuronokat találtunk az ipszilaterális oliva superior laterális magvában (23. ábra). Nagyobb (15-20 µm), multipoláris sejteket találtunk a trapéztest ventrális magvában mindkét oldalon, ellenoldali dominanciával. Lokalizáció, morfológia és sejtszám alapján az LSO-ban talált sejtek a laterális olivocochleáris sejteknek, a VNTBben levok a mediális olivocochleáris sejteknek feleltek meg. Ezenkívül számos nagyobb (15 µm) jelölt sejtet találtunk az ipszilaterális LSO mellett dorzálisan, caudálisan és rostrálisan (23. ábra A). E sejtek az LSO-t kagylószeruen veszik körül, ezért Vetter és Mugnaini nyomán a laterális olivocochleáris rendszer ún. „kagylóneuronjainak” tekinthetok (182). Az 24. ábra az FB intracochleáris injekcióját követoen retrográd úton jelölt sejtek lokalizációját mutatja. A jelölt sejtek eloszlása azonos volt FB és DY applikációja után. A jelölt sejteket megszámoltuk. Az FB applikáció után 901 (±17,7), a DY applikácót követoen 1129 (±13,0) jelölt sejtet találtunk. A 6 kísérlet eredményeit átlagolva az ipsilaterális LSO-ban 509,2 (±19,8), a VNTB-ben 170 (±13,7) jelölt sejtet, valamint az LSO-tól dorzálisan, rostrálisan és caudálisan 54,2 (±5,0) „kagylóneuront” találtunk. Az ellenoldali LSO-ban összesen csak 1-2 jelölt sejt volt, a VNTB-ben 228 (±17,7) jelölt sejtet és 14,3 (±1,3) kagylóneuront találtunk. A DY csak a sejtek magját festette meg, a jelölt neuronok dendritikus morfológiája az FB beadás után vált láthatóvá.
4. 3. 2. A ventrális cochleáris magba projiciáló sejtek jelölodése fast blue injekciót követoen
Az állatok másik csoportjánál (n=10) az olivocochleáris sejtek jelölését kombináltuk az azonos oldali ventrális cochleáris magba projiciáló neuronok jelölésével. A cochleát DY-val töltöttük fel, a ventrális cochleáris magba FB-t injektáltunk.
A metszetek elkészítését és tárgylemezre húzását követoen minden esetben sötétkamrás rajzok segítségével analizáltuk az injekciós helyet. A 10 kísérletbol 5 esetben szorítkozott a jelöloanyag injekciója a ventrális cochleáris magra. A másik 5 esetben a jelöloanyag injekciója a ventrális cochleáris magtól mediálisan elhelyezkedo struktúrákat is elérte, így ezekben az esetekben aspecifikus jelölodést is kaptunk. Azt az 5 esetet értékeltük ki részletesen, ahol az FB injekció csak a ventrális cochleáris magra terjedt ki (25. ábra A). A mag legventrálisabb és legrosztrálisabb részét nem lehetett teljesen kitölteni a jelöloanyaggal. Az FB injekciót követoen retrográd jelölodtek a ventrális cochleáris magba projiciáló sejtek. A 25. ábra B része mutatja a jelölt sejteket mindkét oldali oliva superiorban. Itt a beadás oldalán több jelölt sejt volt található mint az ellenoldalon (kb 1,5 : l arányban). Az oliva superior lateralis magja csak az azonos oldalon tartalmazott jelölt sejteket (átlagosan mindössze 8, 8 (± 2,3) sejtet). Számos sejt jelölodött periolivárisan és a trapéztest magvaiban. Az oliva superior mellett az ellenoldali ventrális és dorzális cochleáris mag, valamint mindkét oldali colliculus inferior is tartalmazott jelölt sejteket.
4. 3. 3. A ventrális cochleáris magba projiciáló olivocochleáris sejtek kettos jelölodése diamidino yellow-val és fast blue-val
A DY és az FB kombinációja lehetoséget biztosított arra, hogy feltérképezzük a kettosen jelölodött olivocochleáris sejteket. Az olivocochleáris sejtek sejtmagja sárgán festodött a DY intracochleáris applikációja után (23. ábra B). A ventrális cochleáris magba projiciáló sejtek citoplazmája az FB-vel kék színnel jelölodött. A ventrális cochleáris magba projiciáló olivocochleáris sejtek sejtmagja DY-vel sárga, citoplazmája FB-vel kék színre festodött (26. ábra B). Az 27. ábra B része a kettosen jelölodött sejtek elhelyezkedését mutatja az agytörzs frontális metszeteinek rajzain. Ilyen kettosen jelölt sejteket periolivárisan az oliva superior lateralis magva körül („kagylóneuronok”), valamint mindkét oldali trapéztest ventrális magvában (mediális olivocochleáris sejtek) találtunk. Az oliva superior laterális magvában található laterális olivocochleáris sejtek citoplazmája nem jelölodött az FB-vel. A mediális olivocochleáris sejtek 56 %-a, míg a „kagylóneuronok” 39 %-a jelölodött mindkét fluoreszcens jelöloanyaggal.
23. ábra. Retrográd jelölt sejtek az azonos oldali oliva superior laterális magvában DY intracochleáris applikációja után kis (A) és nagy (B) nagyítással. A nyilak az LSO körül elhelyezkedo úgynevezett kagylóneuronokra mutatnak.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------24. ábra (a következo oldalon). Retrográd jelölodött sejtek az agytörzsben az FB intracochleáris applikációját követoen. Baloldalon a beadással megegyezo, jobboldalon az ellenoldal látható. A háromszögek a foleg ipszilaterálisan jelölodött laterális olivocochleáris
sejteket,
a
négyzetek
a
bilaterálisan
elhelyezkedo
mediális
olivocochleáris sejteket reprezentálják. A jelölt sejtek száma három szomszédos metszeten talált jelölt sejtek összege. Az oliva superior laterális magvában egy háromszög 5 jelölt sejtet, egyebütt a szimbólumok 1 jelölt sejtet jelképeznek. LSO = az oliva superior laterális magja; MSO = az oliva superior mediális magja; SPO = felso perioliváris mag; MNTB = a trapéztest mediális magja; VNTB = trapéztest ventrális magja; n7 = nervus facialis; pt = piramispálya; lfp = fasciculus longitudinalis; Pn = hídmagvak; n5sr = a nervus trigeminus érzo magja; n5sp = tractus spinalis nervi trigemini. Méretjel = 1mm.
25. ábra (B része a túloldalon). Az FB ventrális cochleáris magba adott injekciója után jelölodött, az oliva superiorból a ventrális cochleáris magba projiciáló sejtek elhelyezkedése frontális agytörzsi metszeteken. Az ábrázolt kísérlet során az FB injekció a ventrális cochleáris magra korlátozódott. A mag középso fekete része az injekció központját, a szürke zóna a központ körül a jelöloanyag lokális diffúzióját mutatja (A). A ventrális cochleáris magba adott injekció után számos sejt jelölodött az agytörzsben (B). A nyitott körök a csak a ventrális cochleáris magba projiciáló sejteket, a kitöltött körök a kettosen jelölt, a ventrális cochleáris magba projiciáló olivocochleáris sejteket jelölik. A rajzok1-1 metszeten látható jelölt sejteket reprezentálják. Baloldalon a beadással megegyezo, jobboldalon az ellenoldal látható. Az 24. ábrával összehasonlítva feltüno, hogy az oliva superiorban jóval több sejt projiciál a ventrális cochleáris magba, mint a cochleába. AVCN = anteroventrális cochleáris mag; PVCN = poszteroventrális cochleáris mag; DCN = dorzális cochleáris mag;LSO = az oliva superior laterális magja; MSO = az oliva superior mediális magja; SPO = felso perioliváris mag; MNTB = a trapéztest mediális magja; VNTB = trapéztest ventrális magja; n7 = nervus facialis; N7 = nucleus nervi facialis; pt = piramispálya; lfp = fasciculus longitudinalis; Pn = hídmagvak; n5sr = a nervus trigeminus érzo magja; n5sp = tractus spinalis nervi trigemini. Méretjel = 1mm.
26. ábra. Retrográd jelölt sejtek az oliva superiorban DY intracochleáris applikációja és az FB azonos oldali ventrális cochleáris magba történt injekciója után. Az azonos oldali trapéztest (tb) ventrális magjában számos jelölt sejtet találtunk (A). A kettosen jelölt, az azonos oldali ventrális cochleáris magba is projiciáló olivocochleáris sejtek jól felismerhetoek voltak, hiszen a sejtmag DY-val sárgára, a citoplazma FB-vel kékre festodött (B, nyilak).
27. ábra (B része a túloldalon). A DY intracochleáris applikációja és az FB ventrális cochleáris magba adott injekciója után jelölodött olivocochleáris sejtek elhelyezkedése frontális agytörzsi metszeteken. Az ábrázolt kísérlet során az FB injekció a ventrális cochleáris magra korlátozódott. A mag középso fekete része az injekció központját, a szürke zóna a központ körül a jelöloanyag lokális diffúzióját mutatja (A). Az ábra B része a kettos jelölés után retrográd jelölodött olivocochleáris sejtek lokalizációját mutatja. A háromszögek a laterális, a négyzetek a mediális olivocochleáris sejteket jelképezik. Az üres szimbólumok a csak DY-al jelölt, a kitöltöttek a kettosen jelölt, a ventrális cochleáris magba kollaterálist adó sejteket reprezentálják. Baloldalon a beadással megegyezo, jobboldalon az ellenoldal látható. AVCN = anteroventrális cochleáris mag; PVCN = poszteroventrális cochleáris mag; DCN = dorzális cochleáris mag; LSO = az oliva superior laterális magja; MSO = az oliva superior mediális magja; SPO = felso perioliváris mag; MNTB = a trapéztest mediális magja; VNTB = trapéztest ventrális magja; n7 = nervus facialis; N7 = nucleus nervi facialis; pt = piramispálya; lfp = fasciculus longitudinalis; Pn = hídmagvak; n5sr = a nervus trigeminus érzo magja; n5sp = tractus spinalis nervi trigemini. Méretjel = 1mm.
4. 4. Az olivocochleáris sejtek, a hallópálya és monoaminerg agyterületek jelölodése pseudorabies vírus intracochleáris injekcióját követoen
Kísérleteink során a foleg retrográd transzportálódó, transzneuronálisan terjedo pseudorabies vírus intracochleáris injekciója segítségével kívántuk feltérképezni az olivocochleáris sejteket és az azokkal szinaptikus kapcsolatban álló leszálló neuronokat. Az általunk használt jelöloanyag elonye, hogy a transzneuronális terjedés révén nem csak egy neuron, hanem az egymással funkcionális kapcsolatban lévo pályarendszerek is feltérképezhetok. A pseudorabies vírus intracochleáris injekciója után 15 órával (n=1) nem találtunk fertozött sejteket az agyban. Hosszabb túlélési idoket (25-108 óra, n=16) követoen jelölt sejtek jelentek meg az oliva superiorban, az agytörzs auditoros magvaiban mindkét oldalon, valamint a hallókéregben és monoaminerg agyterületeken. A jelölt sejtek lokalizációja alapján a fertozés 3 fázisát tudtuk megkülönböztetni. Az elso fázist (25 óra, n=2) az olivocochleáris sejtek fertozodése jellemezte (28. ábra). A második fázisban (37-72 óra, n=10) jelölt sejtek jelentek meg a hallópálya agytörzsi magvaiban és monoaminerg agyterületeken is (29. ábra). Hosszabb túlélési idok esetében (3. fázis, 90-108 óra, n=4) jelölt sejteket találtunk a corpus geniculatum medialeban és a hallókéregben is.
4. 4. 1. Elso fázis (túlélési ido: 25 óra, n=2): az olivocochleáris sejtek jelölodése
Az elso vírussal fertozodött sejtek 25 órával az intracochleáris injekció után az azonos oldali oliva superior laterális magvában és periolivárisan jelentek meg,. Az azonos oldali LSO-ban kisméretu (10-15 µm átméroju) fusiformis sejtek (30. ábra A) és rostok jelölodtek. Az LSO mentén dorzomediálisan és dorzolaterálisan is találtunk nagyobb fertozött sejteket. Mindkét oldali oliva superiorban számos nagyobb (15-20 µm), multipoláris sejt is jelölodött. Ezek a nagyobb sejtek a trapéztest ventrális magvában (VNTB) és a rosztrális perioliváris régióban (RPO) helyezkedtek el (30. ábra B). A sejtek kb 1/3-a a vírusinjekcióval azonos oldalon, 2/3-a kontralaterálisan helyezkedett el. Morfológia és lokalizáció alapján az LSO-ban talált sejtek a laterális olivocochleáris sejtcsoportnak, a VNTB-ben és RPO-ban látott sejtek a mediális olivocochleáris sejteknek feleltek meg. Az ipsilateralis LSO-ban jelölodött sejteket megszámoltuk, átlagosan 560 (? 20,5) sejtet találtunk itt. Ilyen rövid túlélési idot követoen nem találtunk jelölt sejteket a cochleáris magban vagy egyéb agytörzsi magokban. Mindkét
agyban nagyon kevés, de erosen festodött sejtet találtunk a dorzális raphe mag hídi szakaszán is (28. ábra C és D).
4. 4. 2. Második fázis (túlélési ido: 37-72 óra, n=10): jelölodés a hallópálya magvaiban és monoaminerg agyterületeken
Az olivocochleáris sejtek retrográd fertozodése nem volt mindig egyformán sikeres. Az oliva superiorban mindig találtunk jelölt sejteket, de a 10 közül csak 6 agyban volt egyértelmu az olivocochleáris sejtek fertozodése. Ahol sikeresen fertozödtek az olivocochleáris sejtek, ott a jelölt sejtek száma az oliva superiorban nagyobb volt, mint az elso fázisban (az ipszilaterális LSO-ban átlagosan 650 (? 32,5) sejtet számoltunk meg) A vírus transzneuronális terjedése révén jelölt sejtek jelentek meg az agytörzs egyéb auditoros magvaiban is (29. ábra). Ebben a fázisban 1-2 jelölt sejtet láttunk a ventrális cochleáris magban és a mediális vestibuláris magban mindkét oldalon. A lemniscus lateralis ventrális és dorzális magja is tartalmazott jelölt sejteket. A colliculus inferior centrális magjának sejtjei is nagy számban jelölodtek (30. ábra C). Ezeken a területeken a jelölodés bilaterális volt, kontralaterális dominanciával. Az agytörzs auditoros magvai mellett monoaminerg sejtcsoportok neuronjai is nagy számban jelölodtek ebben a fázisban. Nagyon sok jelölt sejtet találtunk a dorzális raphe mag hídi szakaszán (31. ábra C, D). A tíz közül 3 agyban egyéb szerotoninerg régiók (dorzális raphe mag középagyi szakasza, nyúltveloi raphe magvak) egyes sejtjei is jelölodtek. A második fázisban a locus coeruleus és a subcoeruleus mag sejtjei is nagy számban jelölodtek mindkét oldalon (31. ábra C).
4. 4. 3. Harmadik fázis (túlélési ido: 90-108 óra, n=4): a corpus geniculatum mediale és a hallókéreg jelölodése.
Hosszú túlélési idoket követoen számos jelölt sejtet találtunk a második fázishoz hasonlóan az olivocochleáris sejtek területén valamint az agytörzs auditoros és monoaminerg magjaiban. Az ipsilaterális LSO-ban ebben a fázisban 724 (? 36,5) sejtet számoltunk meg. Ezek mellett azonban vírussal fertozött sejtek jelentek meg bilaterálisan a corpus geniculatum mediáléban (MGB) és a primér hallókéregben is. Az
MGB ventrális részén több jelölt sejt volt, mint dorzálisan (30. ábra D). A hallókéregben a jelölt sejtek az V. rétegre lokalizálódtak (31. ábra
A) és piramis
alakúak voltak. A jelölt sejtek morfológiája egyértelmuen arra utalt, hogy a hallókéreg efferens piramissejtjeihez tartoznak (31. ábra B). A corpus geniculatum medialéban és a hallókéregben is az ellenoldalon fertozodött több sejt, mint ipszilaterálisan.
28. ábra. Tengerimalac agytörzs frontális metszeteinek sémás rajzai az elso fázisban (túlélési ido: 25 óra) jelölt sejtek tipikus elhelyezkedésével. A kis keresztek a jelölt sejtek elhelyezkedésére utalnak, számuk nem azonos az 1-1 metszeten látott jelölt sejtek számával. Baloldalon a vírusbeadással megegyezo, jobboldalon az ellenkezo oldal látható. Aq = aqueductus cerebri; IC = colliculus inferior; LL = lemniscus lateralis; LSO = az oliva superior laterális magja; RPO = rosztrális perioliváris régió; VCN = ventrális cochleáris mag; VNTB = a trapéztest ventrális magja; Pons = híd; PR = dorzális raphe mag hídi szakasza; 4V = 4. agykamra; 5n = nervus trigeminus; 7n = nervus facialis;
29. ábra. Tengerimalac agytörzs frontális metszeteinek sémás rajzai a második fázisban (túlélési ido: 37-72 óra) jelölt sejtek tipikus elhelyezkedésével. A kis keresztek a jelölt sejtek elhelyezkedésére utalnak, számuk nem azonos az 1-1 metszeten látott jelölt sejtek számával. Baloldalon a vírusbeadással megegyezo, jobboldalon az ellenkezo oldal látható. Aq = aqueductus cerebri; IC = colliculus inferior; LC = locus coeruleus; LL = lemniscus lateralis; LSO = az oliva superior laterális magja; MVN = mediális vestibuláris mag; RPO = rosztrális perioliváris régió; SubC = subcoeruleus area; VCN = ventrális cochleáris mag; VNTB = a trapéztest ventrális magja; Pons = híd; PR =
dorzális raphe mag hídi szakasza; 4V = 4. agykamra; 5n = nervus trigeminus; 7n = nervus facialis;
30. ábra. Vírussal fertozodött sejtek és rostok az oliva superiorban, a colliculus inferiorban és a corpus geniculatum medialéban. Sok kicsi, fusiformis neuron jelölodött ipszilaterálisan az oliva superior laterális magjában 25 órával a pseudorabies vírus intracochleáris injekciója után (A). A jelölt sejtek morfológiája és lokalizációja alapján a laterális olivocochleáris rendszerhez tartoznak. Az ellenoldali trapéztest ventrális magjában jelölodött nagyobb, multipoláris sejtek a mediális olivocochleáris rendszer fertozodésére utalnak (B). A második fázisban a colliculus inferior centrális részén számos jelölt sejtet találtunk (C). 108 órával a mutét után jelölt sejtek jelentek meg a corpus geniculatum medialéban is (D). cg = központi szürkeállomány; IC = colliculus inferior; LSO = az oliva superior laterális magja; MGB = corpus geniculatum mediale;
SC = colliculus superior; VNTB = a trapéztest ventrális magja. Méretjel = 100 µm (A és B); 250 mm (C és D).
31. ábra. Vírussal fertozött sejtek a hallókéregben és monoaminerg agyterületeken pseudorabies vírus intracochleáris applikációja után. 108 órával a mutét után számos sejt jelölodött az azonos és az ellenoldali hallókéregben. A jelölt sejtek a hallókéreg 5. sejtrétegére lokalizálódtak (A). Nagyobb nagyítással vizsgálva a sejteket láthatóvá vált hogy a hallókéreg efferens piramissejtjei jelölodtek (B). Számos jelölt sejt a subcoeruleus magban és a dorzális raphe mag hídi szakaszán 72 órával a mutét után (C). Jelölt sejtek nagyobb nagyítással a dorzális raphe magban (D). AuC = hallókéreg; SubC = subcoeruleus mag; DR = dorzális raphe; 4V = 4. agykamra; Méretjel = 200µm (A és C); 100 µm (D) és 50µm (B).
5. Megbeszélés
5. 1. Az oliva superior és a cochleáris mag GAP-43 expressziója
Az idegrendszer ontogenezise során az axonképzodés és szinaptogenezis irányításában számos extra- és intracelluláris molekula vesz részt. A sejtmembrán citoplazmatikus oldalán elhelyezkedo GAP-43-nak szerepe van az axonképzodésben (102, 155, 208) és a szinapszisok végleges kialakulásában, stabilizálódásában (48, 109) egyaránt. Célul tuztük ki, hogy meghatározzuk a hallópálya agytörzsi magjainak (oliva superior, cochleáris mag) GAP-43 expresszióját a posztnatális fejlodés során és felnottkorban. Az elso két posztnatális hét során a születéskor nagyon intenzív GAP-43 immunreaktivitás fokozatosan csökkent az oliva superiorban és a cochleáris magban egyaránt. Az immunfestés
intenzitásának
fokozatos
csökkenése
mellett
GAP-43
pozitív
axonvégtalpacskák, prészinaptikus terminálisok jelentek meg a hallópálya agytörzsi magjaiban. Az immunfestés intenzitásának csökkenése leginkább az 1. és a 8. nap között volt megfigyelheto, míg az axonvégtalpacskák immunpozitivitására utaló pontszeru festodés a 2. hét végére jelent meg és felnottkorban is megfigyelheto volt (8. ábra). A sejttestekben nem találtunk festodést. Az immunpozitív axonterminálisok perikaryonok körüli lokalizációja arra utal, hogy a GAP-43 a prészinaptikus terminálisoknak megfeleloen helyezkedett el. Eredményeink azt mutatják, hogy a GAP43-expresszió a hallópálya vizsgált magjaiban hasonló jelleggel, mértékben és idorendben változik meg a születés utáni elso hetekben. A felnott állatokra is jellemzo alacsony intenzitású, pontszeru immunfestodés a 16. napra alakul ki.
GAP-43 és a hallórendszer fejlodése
A hallóideg rostjai és a cochleáris mag sejtjei közötti szinapszisok kialakulása és érése egy komplex, több lépcsos folyamat (35, 36, 79, 98, 108, 148). A hallóideg rostjai eloször (a 4. nap körül) a cochleáris mag sejtjeinek dendritjeivel lépnek kapcsolatba, majd késobb (a 12. nap körül) alakulnak ki a szinapszisok a sejttesten (98). A cochleáris mag és az oliva superior GAP-43 immunreaktivitása ekkor, a 8. és a 16. nap között változik meg, válik fokozatosan granulárissá, pontszeruvé. Ez a változás a szinapszisok
végleges kialakulásának, stabilizálódásának idoszaka. Érdekes módon ez a folyamat csak részben függ külso impulzusoktól, hiszen a patkány külso hallójárata csak a 11. és a 13. posztnatális nap körül nyílik ki (78, 176, 207), valamint a hallópálya aktivitása eloször csak a 14. napon detektálható (26). Ismert, hogy az érzékszervek, így a hallórendszer fejlodése során kritikus periódusok ismerhetok fel (54, 58). Az ilyen kritikus idoszakok során adekvát szenzoros stimulus nélkül nem alakulnak ki a megfelelo szinapszisok (134). Az irodalmi adatok alapján a patkány hallórendszerének fejlodése során a 2. posztnatális hét a legkritikusabb periódus (36, 41, 98, 176). Eredményeink ezt megerosítve azt mutatják, hogy a GAP-43 festodés ekkor, a 8. és 16. nap között változik meg jelentosen. A diffúz, a neuropilra terjedo GAP-43 festodés fokozatosan granulárissá, pontszeruvé válása kíséri azokat a folyamatokat, melyek révén kialakulnak és stabilizálódnak a szinapszisok.
GAP-43 a felnott hallórendszerben
Az irodalomban csak kevés adat található a cochlea és a hallópálya GAP-43 immunreaktivitásáról. Benowitz és munkatársai szerint felnott patkányban a hallópálya magjai nem expresszálnak GAP-43-at (18). Emberi magzati agyak vizsgálatakor sem találtak GAP-43-at az oliva superiorban és a colliculus inferiorban (85). Ezzel szemben a cochleáris magcsoportban még a születés utáni 3. hónapban is detektálható volt a GAP-43 (85). Az olivocochleáris rostok a 18. embrionális naptól a második posztnatális hónap kezdetéig mutattak GAP-43 immunreaktivitást (103). Jelen munka során azt tapasztaltuk, hogy ha nagyon kis mennyiségben is, de a GAP-43 érett, felnott állatok agytörzsében is kimutatható az oliva superiorban és a cochleáris magban egyaránt. Korábbi közlemények (48, 97, 19, 20, 21) szerint a GAP-43 jelenléte felnott agyban a plasztikus, szinaptikus reorganizációra képes agyterületekre jellemzo. Eredményeink arra utalnak, hogy a hallópálya felnottkorban sem veszti el plaszticitását. E feltételezést erosíti az a klinikai tapasztalat is, hogy siket felnottek kiválóan rehabilitálhatók a hallóideget elektromosan stimuláló cochleáris implantáció segítségével (118. 123).
5. 2. Cochleáris lézió kiváltotta GAP-43 re-expresszió a laterális olivocochleáris sejtekben és a cochleáris magban
A cochlea mechanikus léziójának a hallópályát érinto hatása 3 pontban foglalható össze: 1. A szenzoros sejtek pusztulása miatt a lézió oldalán megszunik a szenzoros input. 2. A ganglion spirale sejtek pusztulása miatt degeneratív folyamatok indulnak el, direkt úton degenerálódnak a cochleáris magba futó hallóideg rostjai, mely indirekt úton a cochleáris mag posztszinaptikus sejtjeire is hatással van. 3. A cochleába projiciáló olivocochleáris sejtek axotomizálódnak. Jelen munka során célul tuztük ki, hogy különbözo posztoperatív túlélési idoket követoen megvizsgáljuk a cochlea lézió GAP43 expresszióra kifejtett hatását a hallópálya agytörzsi magjaiban. Azt tapasztaltuk, hogy cochleáris léziót követoen jelentosen megváltozik az oliva superior és a cochleáris mag GAP-43 immunreaktivitása. Az oliva superior azonos oldali laterális magvában számos immunpozitív sejt jelent meg, míg az azonos oldali ventrális cochleáris magban a
neuropil
immunfestodése
intenzívebbé
vált,
GAP-43
pozitív
rostokat
és
axonvégtalpacskákat találtunk. A cochlea -és így a ganglion spirále- lézióját glutamát és calretinin immunhisztológiai kimutatásával igazoltuk. A calretinin calcium-köto fehérje, melyet a hallóideg rostjai nagy mennyiségben expresszálnak (201), míg a glutamát a hallóideg rostjainak fo excitatórikus neurotranszmittere (7). A cochlea léziójának hatására a ganglion spirale sejtjei és így a hallóideg rostjai elpusztultak. A cochleáris magba futó rostok dezorganizációját majd elhalását jól mutatták a calretinin és glutamát ellenes antitestekkel elvégzett vizsgálatok (12. ábra).
Oliva superior
A cochlea lézióját követoen az azonos oldali oliva superior laterális magjában számos sejt GAP-43 pozitívvá vált (15. ábra). Ezek a sejtek lokalizáció, morfológia és sejtszám alapján egyértelmuen az ipszilaterális laterális olivocochleáris sejteknek feleltek meg. A GAP-43 expresszió ezekben a neuronokban nem meglepo, hiszen a sejtek axonjai a cochleában a belso szorsejtek afferenseit idegzik be, így a cochlea léziója során axotomizáltuk
oket.
Szomatomotoros
és
viszceromotoros
neuronok
GAP-43
expressziója nagymértékben növekszik axotomia hatására (204). E reakció idobeli lefolyására jellemzo, hogy 3 héttel a lézió után éri el maximumát és 36 hét múlva már nem mutatható ki. Verkade és munkatársai kimutatták, hogy a lézió indukálta GAP-43
expresszió növekedés csak myelinhüvely nélküli neuronokra jellemzo, a myelinizált sejtekben nem látható (179). Nem meglepo tehát, hogy kísérleteink során csak a myelinhüvely nélküli laterális olivocochleáris sejtekben, a myelinhüvellyel rendelkezo mediális olivocochleáris sejtekben nem láttunk GAP-43 immunfestodést. Ismert, hogy a retinális ganglionsejtek is GAP-43 expresszióval reagálnak az axotomiára (52). A GAP-43 fehérjét minden axotomizált retinális neuronban kimutatták, függetlenül attól, hogy az axonregeneráció sikeres volt-e. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a lézió indukálta GAP-43 expresszió a potenciális, és nem a tényleges regenerációt jelzi. A nervus facialis és hypoglossus átmetszése után a GAP-43 fehérjét kódoló mRNS szintézisét is kimutatták a sejtmagban (87, 116). Ez a reakció nagyon hamar, egy napon belül detektálható volt és 6-8 hétig tartott. Az irodalmi adatokkal (52, 87, 116) egybecsengoen, jelen kísérleteink során a laterális olivocochleáris sejtekben eloször a 4. posztoperatív napon expresszálódott a GAP-43. A legintenzívebb, legtöbb sejtet érinto változást a 7. napon láttuk, majd a GAP-43 pozitív sejtek száma 14. naptól fokozatosan csökkent, de még 2 hónappal a lézió után is kimutatható volt.
Ventrális cochleáris mag
A cochlea lézióját követoen az ipszilaterális ventrális cochleáris magban nagymértékben megnott a GAP-43 immunreaktivitás (13. és 19. ábra). A sejttestek nem festodtek, csak rostok és axonvégtalpacskák. A legintenzívebb GAP-43 expressziót a 7. posztoperatív napon észleltük, de a reakció még 2-4 héttel a mutét után is detektálható volt (19.-20. ábra). A GAP-43 pozitív axonvégtalpacskák sok esetben perikaryonok körül helyezkedtek el, a festodés feltunoen hasonlított a szinapszisokat jelölo synaptophysin immunreaktivitásra (21. ábra). A ventrális cochleáris magban tapasztalt intenzív GAP43 expresszió váratlan volt, hiszen a cochlea léziója során a cochleáris mag sejtjeit nem axotomizáltuk. Alapveto és nehezen megválaszolható kérdés, hogy hol szintetizálódott a ventrális cochleáris magban a mutét után talált GAP-43. A következo lehetoségek merülnek fel: (1) A GAP-43 már a mutét elott is az érett neuronok disztális axonjában volt és a lézió hatására poszttranszlációs módosuláson (foszforiláción) esett át. Ennek ellentmond, hogy az általunk használt primér antitest a GAP-43 mindkét (foszforilált és defoszforilált) formáját felismeri. (2) A GAP-43 a hallóideg rostjaiban, axonális
struktúráiban expresszálódott. Ez a lehetoség azonban kizárható, hiszen a cochlea lézió során a ganglion spirale sejtjei és így a hallóideg rostjai is degenerálódtak, elpusztultak, amit dokumentáltunk is (12. ábra). (3) A legvalószínubb, hogy a GAP-43 szintézise a cochleáris magon kívül történt és a GAP-43 anterográd axonális transzport útján került a cochleáris magba. A laterális olivocochleáris sejtekben a mutét után intenzív GAP-43 expressziót találtunk, ezen sejtek azonban jelen ismereteink szerint csak a cochleába és nem a cochleáris magba projiciálnak (31, 33). Ismert, hogy a mediális olivocochleáris sejtek kollaterálist adnak a ventrális cochleáris magba (73). Ezekben a sejtekben azonban nem észleltünk GAP-43 expressziót a cochleáris lézió után. A GAP-43 fontos szerepet tölt be az ontogenezis során az axonogenezisben és a szinaptogenezisben (48, 99). Felnott állatok központi idegrendszerében a GAP-43 a szinaptikus reorganizáció, tanulás és memória folyamataiban vesz részt (42, 62, 161). A cochlea léziót követoen a ventrális cochleáris magban expresszálódó GAP-43 –a szintézis helyétol függetlenül- intenzív szinaptikus reorganizációra utal. Eredményeink alapján a hallórendszer felnottkorban sem veszti el neuronális plaszticitását és a cochlea lézióra a szinaptikus reorganizációban résztvevo GAP-43 re-expressziójával reagál.
Dorzális cochleáris mag, transz-szinaptikus hatás
A cochlea léziót követoan az ipszilaterális dorzális cochleáris mag neuropiljében csak minimális GAP-43 immunrektivitást találtunk. Ezzel szemben hosszú túlélési idot (56 nap) követoen az ellenoldali dorzális cochleáris magban elszórtan GAP-43 pozitív sejtek jelentek meg (22. ábra). Ez a reakció meglepo és nagyon érdekes, hiszen a dorzális cochleáris mag sejtjeit nem axotomizáltuk a cochlea lézió során. A GAP-43 megjelenése a sejtekben így a degeneráció és a szenzoros depriváció kiváltotta transzszinaptikus hatások eredoje lehet. Az irodalomban csak kevés szerzo utal a GAP-43 expresszió emelkedésére olyan neuronokban, melyeket nem axotomizáltak. Baekelandt retinális ganglionsejtek lézióját követoen a corpus geniculatum lateraleban talált emelkedett GAP-43 szintet (13). Booth és Brown a gerincveloben írták le a GAP-43 mRNS fokozott szintézisét axotomiát követoen az ellenoldali, nem érintett motoneuronokban (27). A dorzális cochleáris magban transz-szinaptikus hatásokra re-
expresszálódó GAP-43-nak szerepe lehet a hallópálya cochleáris lézióra bekövetkezo változásaiban, új szinaptikus kapcsolatok kialakulásában (111).
A hallópálya agytörzsi szakaszának plaszticitása
A kutatók a hallórendszer plaszticitása, a megváltozott szenzoros inputra adott adaptív reakciók szempontjából elsosorban a rosztrálisabb agyi struktúrák, a hallókéreg (4, 146, 192, 199), a corpus geniculatum mediale (53) és a colliculus superior (84, 202) szerepét hangsúlyozzák. Megfigyelték azonban, hogy a megváltozott auditoros stimuláció az anteroventrális posztszinaptikus
cochleáris
magban
struktúrákban
is
a
prészinaptikus
(121)
membránban
elektronmikroszkóppal
(69)
és
detektálható
változásokat hoz létre. Gonzalez-Lima és munkatársai kimutatták, hogy a cochleáris mag és az oliva superior neuronjainak akusztikus stimulációra bekövetkezo aktivitásváltozása nemcsak a stimulus fizikai paramétereitol, hanem tanult tényezoktol is függ (63). A neuronális plaszticitásban és szinaptikus reorganizációban kulcsszerepet betölto GAP-43 expresszió jelentos változása cochleáris léziót követoen arra utal, hogy az oliva superiorban és a cochleáris magban bekövetkezo szinaptikus reorganizáció is szerepet játszik a hallórendszer megváltozott szenzoros inputra adott adaptív reakciójában.
5. 3. Az azonos oldali ventrális cochleáris magba kollaterálist adó olivocochleáris sejtek Az olivocochleáris sejtek elhelyezkedése, morfológiája
Fluoreszcens jelöloanyagok intracochleáris applikációját követoen identifikáltuk és megszámoltuk a laterális és mediális olivocochleáris sejteket (24. ábra). Az oliva superior laterális magjában két különbözo típusú jelölt sejttel találkoztunk: (1) Az ipszilaterális LSO-ban elhelyezkedo kicsiny, fuziformis, belso vagy úgynevezett “intrinsic” sejtekkel. (2) Mindkét oldali LSO körül dorzálisan, caudálisan és rosztrálisan elhelyezkedo nagyobb “kagylósejtekkel”. Mediálisabban mindkét oldali trapéztest ventrális magjában nagyobb, multipoláris mediális olivocochleáris sejteket találtunk. A jelölt sejtek elhelyezkedése és száma megfelelt az irodalomból ismertnek. White és Warr 1983-ban tormaperoxidáz intracochleáris injekciója segítségével írták le az
olivocochleáris sejtek ezen duális (laterális és mediális) elhelyezkedését (197). Tormaperoxidáz injekciója után 350 laterális és 300 mediális olivocohleáris sejtet számoltak össze (197). Az általunk talált 509,2 ( ? 19,8) sejt az LSO-ban és 398 (? 30,8) sejt a VNTB-ben valamivel több ennél, de kicsit kevesebb, mint ahány olivocochleáris sejtet fluoreszcens jelöloanyagokkal Aschoff és Ostwald (11) és Robertson (130) leírtak. Felismertük a Vetter által 1991-ben choleratoxin intracochleáris injekciója segítségével
leírt
úgynevezett
kagylóneuronokat
is
(182).
Ezek
a
laterális
olivocochleáris sejtek közé tartoznak, de nem az LSO-n belül, hanem azt kagyló alakban körülölelve elszórtan és bilaterálisan helyezkednek el. A kagylóneuronok terminális arborizáiója a cochleában eltér az LSO-ban elhelyezkedo sejtekétol (190).
A ventrális cochleáris magba projiciáló sejtek lokalizációja
A ventrális cochleáris magba injektált fast blue retrográd transzportálódva számos sejtet megfestett az agyban. Jelölt sejteket találtunk az azonos oldali dorzális cochleáris magban, mindkét oldali oliva superiorban és colliculus inferiorban, valamint az ellenoldali ventrális és dorzális cochleáris magban is. A ventrális cochleáris magba projiciáló sejtek lokalizációja és száma hasonló volt ahhoz, amit korábban macskában (2, 3, 38, 156), tengerimalacban (115, 149, 150, 151, 152, 195) és patkányban (6, 189) leírtak. Jelen munka során az oliva superiorban elhelyezkedo olivocochleáris sejtekre fókuszáltunk.
A ventrális cochleáris magba kollaterálist adó olivicochleáris sejtek
Kísérleteink során a DY intracochleáris applikációját az FB azonos oldali ventrális cochleáris
magba
történo
injekciójával
kombináltuk.
A
jelöloanyagok
ezen
kombinációját számos agyi pályarendszer feltérképezésekor használták már. A kettosen jelölt sejtek könnyen felismerhetoek a DY által sárgára festett sejtmagról és az FB jelölodés miatt kéken fluoreszkáló citoplazmáról (26. ábra, B). A bilaterálisan, mindkét cochleába projiciáló olivocochleáris sejteket is ezzel a jelöloanyag-kombinációval térképezték fel (129, 200).
A trapéztest ventrális magvában elhelyezkedo mediális olivocochleáris sejtek nagy része (ipszilaterálisan 58, kontralaterálisan 54 %) kettosen jelölodött (27. ábra). A ventrális cochleáris magba adott FB azonban nem töltötte ki az egész magot (27. ábra A), így a kettosen jelölt sejtek száma valószínuleg kevesebb, mint a ventrális cochleáris magba kollaterálist adó mediális olivocochleris sejtek tényleges mennyisége. Becslésünk szerint a mediális olivocohleáris sejtek 80-100 %-a ad kollaterálist az azonos oldali ventrális cochleáris magba. Ez megfelel az egyéb emlosállatok esetében megfigyelteknek. Tormaperoxidáz intracochleáris injekcióját követoen a vastag, myelinizált mediális olivocochleáris rostok 67-100 %-ánál figyeltek meg a ventrális cochleáris magba futó kollaterálist macskában (31) és egérben (31, 32) egyaránt. Patkányban tormaperoxidáz intracochleáris injekcióját követoen a dorzális és posteroventrális cochleáris mag határán figyeltek meg az olivocohleáris nyalábot a ventrális
cochleáris
mag
irányában
elhagyó
kollaterálist
(197).
A
mediális
olivocochleáris sejtek kollaterálisai által innervált posztszinaptikus sejtek pontosan nem ismertek, de elektronmikroszkópos megfigyelések szerint a kollaterálisok a ventrális cochleáris mag felszínéhez közeli kis sejteken, valamint nagyobb multipoláris sejtek dendritjein végzodnek (22, 23). Az olivocochleáris sejtek fo neurotranszmittere az acetilkolin. White és Warr acetilkolinészteráz festés segítségével is ábrázolta az olivocohleáris sejteket és azok kollaterálisait (197). Ezzel ellentétben indirekt megfigyelések alapján Osen és Godfrey azt valószinüsítették, hogy az olivocochleáris sejtek nem adnak kollaterálist a cochleáris magba. Az olivocochleáris nyaláb átvágása ugyanis nem csökkentette számottevoen a ventrális cochleáris mag acetilkolinészteráz aktivitását (64, 65, 114). A laterális olivocochleáris sejtek két csoportja között jelentos különbséget találtunk. Az úgynevezett “intrinsic”, az LSO-n belül elhelyezkedo kicsiny fuziformis neuronok sohasem voltak kettosen jelölve, míg az LSO körül elhelyezkedo nagyobb “kagylóneuronok” nagy részét az FB és a DY egyaránt megfestette. Eredményeink összhangban vannak azon korábbi megfigyelésekkel, hogy tengerimalacban (115, 150, 200), macskában (156) és patkányban (193) nincsenek a cochleáris magba projiciáló sejtek az LSO-ban. Eredményeink erosítik azt a vélekedést, hogy a laterális olivocohleáris sejtek két alcsoportja alapvetoen különbözik egymástól. A Vetter és Mugnaini által leírt “kagylóneuronok” (182) terminális arborizációja a cochleában
nagymértékben különbözik a piciny fusiformis “intrinsic” neuronokétól (190). Emellett míg a kagylóneuronok nagy része kollaterálist ad a ventrális cochleáris magba, az LSOban található laterális olivocochleáris sejtek kizárólag a cochleába futnak.
Az olivocochleáris sejtek kollaterálisainak jelentosége
Az olivocochleáris rostok alkotják az efferens, leszálló hallópálya végso közös pályáját, de az elllenoldali cochleáris magból futó rostok révén impulzusokat kapnak az ellenoldali cochlea felol is (129, 168). A mediális olivocochleáris sejtek direkt úton innerválják az aktív cochleáris erosítoként muködo külso szorsejteket (46, 92) és a kollaterálisok révén a cochleáris mag szekunder szenzoros neuronjait is. Ezáltal a cochleából, a hallóidegbol, a cochleáris magból és az olivocochleáris sejtekbol álló régionális feedback kör jön létre, megteremtve az auditorikus információk agytörzsi szinten történo integrációjának lehetoségét (131). Emellett a hallópálya agytörzsi magvait a colliculus inferior (55, 183) és a hallókéreg (56, 193, 194) felol leszálló impulzusok is befolyásolják.
5. 4. Leszálló hallópálya: neuronlánc a hallókéreg és a cochlea között A laterális és mediális olivocochleáris sejtek lokalizációja, morfológiája és terminális arborizációja a cochleában jól ismert (10, 11, 127, 128, 162, 163, 186, 187). Az olivocochleáris rendszer direkt úton befolyásolja a külso és indirekt módon a belso szorsejteket a cochleában (61, 143, 144, 145). Az olivocohleáris sejtek viszonylag könnyen vizsgálhatók a cochleába adott retrográd úton terjedo jelöloanyaggal (159). Nehezebben vizsgálhatóak azonban az olivocohleáris sejtek centrális kapcsolatai, a leszálló hallópálya. Jelen munka során célul tuztük ki, hogy a transzneuronálisan terjedo pseudorabies vírus intracochleáris injekciója és immunhisztológiai kimutatása révén meghatározzuk az olivocochleáris sejteken szinapszist képzo neuronok lokalizációját. Retrográd és anterográd terjedo jelöloanyagok kombinációjával végzett vizsgálatok szerint az ellenoldali ventrális cochleáris mag (168), mindkét oldali colliculus inferior (183) és a hallókéreg sejtjei (105) képeznek szinapszis az olivocochleáris sejteken. Eredményeink arra utalnak, hogy a cochleába adott pseudorabies vírust az
olivocohleáris sejtek axon terminálisai felvették, majd retrográd transzport után fertozodtek a sejttestek az agytörzsben. Replikációt követoen a vírus transzneuronálisan terjedve megfertozte az olivocochleáris sejteken szinapszist alkotó neuronokat: a hallópálya magvait és monoaminerg agyterületek sejtjeit. A pseudorabies vírus neurotróp, az idegsejtek receptor mediálta endocytosissal veszik fel, majd a vírus DNS-t tartalmazó nukleokapszidok jönnek létre és transzportálódnak a sejtmaghoz (132). Az elvégzett kísérletek nagy részében az olivocochleáris sejtek felvették a cochleába adott vírust, mely a sejttestben kimutatható volt. A sikeres esetekben megszámoltuk a jelölt sejteket az ipszilaterális LSO-ban. A fertozött sejtek átlagos száma (560-724) alapján valószínu, hogy közel az összes laterális olivocochleáris sejt jelölodött, hiszen az irodalmi adatok szerint az ipszilaterális LSOban 5-600 laterális olivocochleáris sejt helyezkedik el (10, 11, 73). Ugyanakkor nem kaptunk jelölodést nagyon rövid (15 óra, n=1) túlélési idot követoen, illetve 4 esetben hosszabb túlélési ido (37-72 óra) után sem. A rövid (15 óra) túlélési ido valószínuleg nem volt elég ahhoz, hogy a vírus a cochleából az agytörzsbe transzportálódjon és ott elszaporodjon. Nehezen magyarázható ugyanakkor, hogy 4 esetben miért nem kaptunk jelölodést hosszabb túlélési ido után sem. Mindig ugyanazt a vírustörzset (14) használtuk, mindig ugyanabban a koncentrációban (109 plakképzo egység) és mennyiségben (50? l). A beadásnál ügyeltünk arra, hogy az intracochleáris injekciót követoen a vírusoldat teljes egészében a cochleában maradjon. A vírus fertozoképessége közötti különbségek hátterében az állatok közötti individuális különbségek és a vírusoldat perilymphatikus diffúziója állhatnak. A transzneuronális pályajelölésre használatos vírusok az axonban anterográd és retrográd is transzportálódnak (94, 174). Számos jel arra utal azonban, hogy a pseudorabies vírus általunk használt Bartha törzse (14) a nervus vestibulocochlearisban kizárólag retrográd transzportálódott. Az intracochleáris vírusinjekciót követoen rövid túlélési idok esetén csak az olivocochleáris sejtekben láttunk fertozodést, a cochleáris és vestibuláris magok nem jelölodtek. Késobb, a második fázisban a mediális vestibuláris magban és a ventrális cochleáris magban is láttunk jelölodést. A cochlea feloli kétirányú vírustranszportot nem tudjuk tehát teljesen kizárni, bár a cochleáris és vestibuláris magvak az olivocochleáris sejtek felol is fertozodhettek (168, 210). Virológiai megfigyelések is arra utalnak, hogy azok a vírusok, amelyeknek glycoprotein I és
glycoprotein E génjei hiányoznak (a Bartha vírus is ilyen) kizárólag retrográd transzportálódnak az axonban (39, 77, 91, 196). A vírus DNS és új kapszidok szintézise a fertozött sejtek magjában történik. Az újonnan szintetizált vírus exocytosissal kerül ki a sejtbol, majd a környezo sejtek a vírust a szinapszisoknak megfeleloen veszik fel (94, 174). Az ido elorehaladtával a fertozött neuronlánc egyre több tagja fertozödik (másod-, harmad- és negyedrendu neuronok). A túlélési idok helyes megválasztásával állapítható meg, hogy az egyes fertozött sejtek hol helyezkednek el az adott neuronlánc hierarchiájában (174). A pseudorabies vírus intracochleáris injekcióját követoen a központi idegrendszer fertozésének három fázisát tudtuk elkülöníteni. Az elso fázisban (25 óra) az olivocochleáris sejtek fertozodtek. A második fázisban (37-72 óra) a hallópálya agytörzsi magvaiban (colliculus inferior, ventrális cochleáris mag, lemniscus lateralis magjai) és monoaminerg területeken láttunk jelölodést. A harmadik fázist (90-108 óra) a corpus geniculatum mediale és a hallókéreg fertozodése jellemezte. A fertozodés idorendje azonban nem feltétlenül egyezik a leszálló hallópálya neuronláncában elhelyezkedo sejtek sorrendjével. Az egyes sejtek fertozodését a transzneuronális propagáció és a hosszú axonális transzport is késleltetheti. Ismert, hogy a hallókéregbol efferens rostok futnak a corpus geniculatum medialehoz, a colliculus inferiorhoz és superiorhoz is (157). Mulders és Robertson kimutatták, hogy a hallókéreg egyes sejtjei szinapszist alkotnak az olivocochleáris sejteken is (105), így a hallókéreg a hallópálya magjai felol, de direkt úton, az olivocohleáris sejtek feloli transzneuronális propagáció útján is fertozodhetett. A felszálló, a hallókéreghez vezeto hallópálya mellett a központi idegrendszerben számos leszálló projekció befolyásolja az auditoros információk centrális feldolgozását (157, 167). Ezek a leszálló projekciók a felszálló hallópálya adott szakaszával együtt regionális feedback köröket alkotnak. Hagyományos, egy neuronpályát jelölni képes anterográd
és
retrográd
transzportálódó
tracerekkel
ezek
a
feedback
körök
feltérképezhetok, nehezen vizsgálható azonban az egész, 2-5 leszálló neuronból álló efferens hallópálya. A transzneuronálisan terjedo pseudorabies vírus intracochleáris injekcióját követoen a vírus megjelent az olivocochleáris sejtekben, majd a hallópálya magjaiban, végül a hallókéregben is. Ez arra utal, hogy a hallókéregtol a cochleáig futó leszálló hallópálya nem csak regionális feedback körök laza láncolata, hanem egy, a hallókéregtol a hallópálya magjain átkapcsolódva a cochleába projiciáló leszálló
neuronlánc. A leszálló neuronláncot a hallókéreg 5. sejtrétegének sejtjei, a corpus geniculatum mediale (ventrális rész), a colliculus inferior (centrális mag), a lemniscus lateralis magjai (ventrális és dorzális), valamint az olivocochleáris sejtek alkotják. A hallókéregbol induló leszálló impulzusok nem csak ezen a 4-5 átkapcsolóállomásból álló efferens hallópályán érhetik azonban el a cochleát, hiszen ismert a hallókéregtol a cochleáris szorsejteket innerváló olivocochleáris sejtekhez futó direkt projekció is (105). A leszálló hallópálya valószínuleg számos élettani (éles hallás, zajvédelem, szelektív hallás) és kórélettani (halláscsökkenés, fülzúgás) folyamatban vesz részt. A cochleáris implantációt követo ellenoldali hallásjavulás (124, 125) létrejöttében az idegrendszer plaszticitása mellett a leszálló hallópályának és az olivocochleáris rendszernek is szerepe lehet.
5. 5. A hallópálya kapcsolata monoaminerg agyterületekkel
A monoamin természetu neurotranszmitterek: a katecholaminok közül a noradrenalin, adrenalin és dopamin, az indolaminok és a triptaminok közül foleg a szerotonin kimutatása a központi idegrendszerben több, ezekkel a hatóanyagokkal muködo neuronrendszer felismerését tette lehetové. E neuronrendszerek perikaryonjai foleg az agytörzsben foglalnak helyet, idegrostjaik a központi idegrendszerben kiterjedten sugároznak szét és jelentos regenerációs kapacitással rendelkeznek. Már régóta ismert, hogy a hallópálya magjai egyaránt tartalmaznak noradrenalint (180) és szerotonint (117). A szerotoninerg sejteknek elsosorban a vegetatív idegrendszeri szabályozásban van szerepük. A cochleáris magban végzodo szerononinerg sejtek a dorzális és mediális raphe magban helyezkednek el (171). Az olivocochleáris sejtekhez futó szerotoninerg rostokat is leírták már (15, 170), valamint kettos immunhisztológiai eljárással az olivocochleáris sejtekkel kontaktusban lévo szerotoninerg axonvégtalpacskákat is kimutattak (203). Az olivocochleáris sejtekhez futó szerotoninerg rostok eredete még nem kelloen tisztázott. Jelen munka során a második fázisban, 36-72 órával a pseudorabies vírus intracochleáris injekciója után a dorzális raphe mag hídi szakaszán számos jelölt sejtet találtunk. Mivel az elso fázisban foleg az olivocochleáris sejtek jelölodtek, ezért a transzneuronális propagáció utáni második fázisban jelölodött sejtek nagy valószínuséggel az olivocochleáris sejtekkel kapcsolatban álló neuronok.
Eredményeink arra utalnak, hogy az olivocohleáris sejtek szerotoninerg innervációja a dorzális raphe mag hídi szakaszán elhelyezkedo sejtekbol ered. A noradrenerg neuronrendszer elsosorban neuroendokrin, motivációs és hangulati mechanizmusokba, valamint a szervezet általános készenlétébe (éberség, figyelem) avatkozik be. A hallópálya agytörzsi magvaiban noradrenerg rostok végzodnek (9, 86). Anterográd és retrográd terjedo jelöloanyagok kombinációjával végzett kísérletek arra utaltak, hogy az olivocochleáris sejteken is végzodnek noradrenerg rostok, melyek eredete a locus coeruleus (107). Jelen munka során a második fázisban számos jelölt sejtet találtunk a locus coeruleusban és a subcoeruleus magban. Eredményeink megerosítik azokat a korábbi megfigyeléseket, hogy az olivocochleáris sejtek noradrenerg innervációja a locus coeruleusból és a subcoeruleus magból ered. Megfigyeléseink és irodalmi adatok alapján az agytörzsi monoaminerg neuronrendszer nemcsak a hallópályát, hanem -az olivocochleáris sejtek közvetítésével- a cochleát is befolyásolhatja. A hallópálya és a monoaminerg rendszer kapcsolatának alaposabb vizsgálata kettos immunhisztológiai vizsgálattal (jelöloanyag és neurotranszmitter egyideju kimutatása) lehetséges, melyet tervezünk is a közeljövoben. 5. 6. Az eredmények klinikai jelentosége Az állatkísérletek eredményei alapján csak óvatosan, kritikusan vonhatók le következtetések az emberi hallószerv muködésére és megbetegedéseire vonatkozóan. Bizonyos, hogy az emberi hallószerv fejlodése során is léteznek kritikus periódusok. Ha ilyenkor nincs jelen az adekvát szenzoros stimulus (a közép- és belsofül muködése), nem alakulnak ki megfelelo szinaptikus kapcsolatok a központi idegrendszerben. Erre utal, hogy hallássérült gyermekek korai rehabilitációja hallókészülékkel és cochleáris implantátummal jó hallást és beszédmegértést tesz lehetové, míg a késobb megkezdett rehabilitáció már nem eredményes. Eredményeink arra utalnak, hogy a GAP-43 felnottkorban is jelen van a hallópálya magjaiban, a hallórendszer felnottkorban sem veszti el plaszticitását. Ezt a megfigyelést erosíti, hogy azok, akik felnottkorban vesztik el a hallásukat, kitunoen rehabilitálhatók cochleáris implantáció segítségével. A cochleáris lézió a hallópálya agytörzsi magvaiban GAP-43 re-expressziót okozott, mely szinaptikus reorganizációra utal. Valószínu, hogy a központi idegrendszerben
zajló szinaptikus reorganizáció is hozzájárul ahhoz, hogy a különbözo eredetu halláscsökkenések
során
nagymértékben
csökken
a
hallórendszer
frekvencia-
diszkriminációs képessége és a dinamikai tartomány. A cochleáris károsodásokat gyakran kíséro tinnitus pathomechanizmusában is szerepe lehet a szinaptikus reorganizációnak. Az olivocochleáris sejtek kollaterálisaik révén a ventrális cochleáris magot is befolyásolják. A különbözo eredetu cochleáris halláscsökkenések kialakulásában szerepe van az olivocochleáris sejtek károsodásának is. Valószínu, hogy a cochlea különbözo léziói a hallóidegen és az olivocochleáris rostokon keresztül a központi idegrendszert is befolyásolják. Ennek is szerepe lehet a cochleáris nagyothallás esetén megfigyelheto jelenségek (dinamikai tartomány csökkenése, frekvencia-diszkrimináció romlása, fülzúgás) kialakulásához. Eredményeink arra utalnak, hogy a hallókéreg és a hallópálya subcorticalis magjai a leszálló rostok révén befolyásolni tudják az olivocochleáris sejteket és így a cochleát. A cochleáris implantációt követoen kialakuló ellenoldali hallásjavulásban a központi idegrendszer plaszticitása mellett ezeknek a leszálló kapcsolatoknak is jelentoségük lehet.
6. Következtetések 6. 1. Az elso két posztnatális hét során a születéskor intenzív GAP-43 immunreaktivitás fokozatosan csökken az oliva superiorban és a cochleáris magban egyaránt, de felnott állatban is kimutatható. A GAP-43 jelenléte felnott agyban a plasztikus, szinaptikus reorganizációra képes agyterületekre jellemzo, ezért eredményeink arra utalnak, hogy a hallórendszer felnottkorban sem veszti el plaszticitását. A GAP-43 festodés jellege a 8. és 16. nap között változik meg jelentosen. A felnott állatokra is jellemzo alacsony intenzitású, pontszeru immunfestodés a második hét végére alakul ki. A diffúz, a neuropilra terjedo GAP-43 festodés fokozatosan granulárissá, pontszeruvé válása kíséri azokat a folyamatokat, melyek révén a hallópálya agytörzsi magvaiban kialakulnak és stabilizálódnak a szinapszisok.
6. 2. A neuronális plaszticitásban és szinaptikus reorganizációban kulcsszerepet betölto GAP-43 expresszió jelentos változása a cochlea mechanikus lézióját követoen arra utal, hogy az oliva superiorban és a cochleáris magban bekövetkezo szinaptikus reorganizáció is szerepet játszik a hallórendszer megváltozott szenzoros inputra adott adaptív reakciójában. A cochleáris léziót követoen az azonos oldali oliva superior laterális magjában számos sejt GAP-43 pozitívvá vált, melyek lokalizáció, morfológia és sejtszám alapján egyértelmuen az ipszilaterális laterális olivocochleáris sejteknek feleltek meg. A cochlea mechanikus léziója során az olivocochleáris sejtek axotomizálódtak,
melynek
következtében
a
myelinhüvely
nélküli
laterális
olivocochleáris sejtekben GAP-43 re-expresszió következett be. A cochlea lézióját követoen az ipszilaterális ventrális cochleáris magban is nagymértékben megnott a neuropil GAP-43 immunreaktivitása, mely a szintézis helyétol függetlenül nagyfokú szinaptikus reorganizációra utal. A dorzális cochleáris magban transz-szinaptikus hatásokra re-expresszálódó GAP-43-nak szerepe lehet a hallópálya cochleáris lézióra bekövetkezo változásaiban, új szinaptikus kapcsolatok kialakulásában.
6. 3. Eredményeink arra utalnak, hogy az aktív cochleáris erosítoként muködo külso szorsejteket innerváló mediális olivocochleáris sejtek kollaterálisaik révén a cochleáris mag szekunder szenzoros neuronjait is befolyásolni tudják, ezáltal a cochleából, a hallóidegbol, a cochleáris magból és az olivocochleáris sejtekbol álló régionális feedback kör jön létre, megteremtve az auditorikus információk agytörzsi szinten történo
integrációjának
lehetoségét.
Fluoreszcens
jelöloanyagok
intracochleáris
applikációját követoen identifikáltuk és megszámoltuk a laterális és mediális olivocochleáris, valamint az azonos oldali ventrális cochleáris magba projiciáló sejteket. A kettosen jelölt sejteket a diamidino yellow által sárgára festett sejtmagról és a fast blue miatt kéken fluoreszkáló citoplazmáról ismertük fel. A trapéztest ventrális magvában elhelyezkedo mediális olivocochleáris sejtek nagy része kettosen jelölodött. Becslésünk szerint a mediális olivocohleáris sejtek 80-100 %-a ad kollaterálist az azonos oldali ventrális cochleáris magba. Ezzel szemben a laterális olivocohleáris sejtek két alcsoportja alapvetoen különbözik egymástól: míg a kagylóneuronok nagy része kollaterálist ad a ventrális cochleáris magba, az LSO-ban található laterális olivocochleáris sejtek kizárólag a cochleába futnak.
6. 4. Eredményeink arra utalnak, hogy a hallókéregtol a cochleáig futó leszálló hallópálya nem csak regionális feedback körök laza láncolata, hanem egy, a hallókéregtol a hallópálya magjain átkapcsolódva a cochleába projiciáló leszálló neuronlánc. Eredményeink és az irodalmi adatok alapján az agytörzsi monoaminerg neuronrendszer nem csak a hallópályát, hanem -az olivocochleáris sejtek közvetítésévela cochleát is befolyásolhatja. A pseudorabies vírus intracochleáris injekcióját követoen a központi idegrendszer fertozésének három fázisát tudtuk elkülöníteni. Az elso fázisban (25 óra) az olivocochleáris sejtek fertozodtek. A második fázisban (37-72 óra) a hallópálya agytörzsi magvaiban (colliculus inferior, ventrális cochleáris mag, lemniscus lateralis magjai) és monoaminerg agyterületeken láttunk jelölodést. A harmadik fázist (90-108 óra) a corpus geniculatum mediale és a hallókéreg fertozodése jellemezte. A leszálló neuronláncot a hallókéreg 5. sejtrétegének sejtjei, a corpus geniculatum mediale (ventrális rész), a colliculus inferior (centrális mag), a lemniscus lateralis magjai (ventrális és dorzális), valamint az olivocochleáris sejtek alkotják. Korábban
leírták
az
olivocochleáris
sejtekhez
futó
szerotoninerg
rostokat.
Eredményeink arra utalnak, hogy ezek a dorzális raphe mag hídi szakaszán elhelyezkedo sejtekbol erednek. A második fázisban jelölodött sejtek elhelyezkedése megerosíti azokat a korábbi megfigyeléseket, hogy az olivocochleáris sejtek noradrenerg innervációja a locus coeruleusból és a subcoeruleus magból ered.
7. Köszönetnyilvánítás
Hálás köszönetemet fejezem ki témavezetoimnek, Palkovits Miklós akadémikus úrnak és Ribári Ottó professzor úrnak a kutatómunkához nyújtott hasznos, önzetlen és kitartó segítségükért. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem Neuromorfológiai Laboratórium minden dolgozójának, hogy mindig önzetlenül, szívesen és kedvesen segítettek munkámban. Köszönet illeti a Freiburgi Egyetem Fül-orr-gége Klinika kutatólaboratóriumának vezetojét, Robert Illing professzort és a laboratórium minden munkatársát. A Semmelweis Egyetem és a Freiburgi Egyetem együttmuködése keretében két szép és hasznos évet töltöttem náluk.
Köszönöm munkahelyi vezetom, Répássy Gábor professzor úr támogatását, valamint a Semmelweis Egyetem Fül-orr-gégészeti és Fej-, Nyaksebészeti Klinika minden dolgozójának támogató hozzáállását. Köszönöm családom támogatását, a bíztatást és a nyugodt háttér biztosítását. 8. Irodalom 1. Abercrombie M. 1946. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec, 94: 239-247. 2. Adams JC, Warr WB. 1976. Origins of axons in the cat´s acoustic striae determined by injection of horseradish peroxidase into severed tracts. J Comp Neurol, 170:107-122. 3. Adams JC. 1983. Cytology of periolivary cells and the organization of their projections in the cat. J Comp Neurol, 215: 275-289. 4. Ahissar E, and Ahissar M. 1994. Plasticity in auditory cortical circuitry. Curr Op Neurobiol, 4: 580-587. 5. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, and Watson JD. 1994. Viruses, plasmids, and transportable genetic elements. In: Molecular Biology Of The Cell, Garland Publishing, New York, pp. 273-280. 6. Alibardi L. 1998. Ultrastructural and immunocytochemical characterization of commissural neurons in the ventral cochlear nucleus of the rat. Anat Anz, 180: 427-438. 7. Altschuler RA, Sheridan CE, Horn JW, and Wenthold RJ. 1989. Immunocytochemical localization of glutamate immunoreactivity in the guinea pig cochlea. Hear Res, 42: 167-173 8. Anderson RA, Knight PL, and Merzenich MM. 1980. The thalamocortical and corticothalamic connections of AI, AII, and the anterior auditory field (AAF) in the cat: evidence for two largely segragated systems of connections. J Comp Neurol, 194, 663701. 9. Appeltants D, Ball GF, and Balthazart J. 2002. The origin of chatecholaminergic inputs to the song control nucleus RA in canaries. Neuroreport, 13, 649-653. 10. Aschoff A, Ostwald J. 1987. Different origin of cochlear efferents in some bat species, rats and guinea pigs. J Comp Neurol, 264: 56-72. 11. Aschoff A, and Ostwald J. 1988. Distribution of cochlear efferents and olivocollicular neurons in the brainstem of rat and guinea pig. Exp Brain Res, 71: 241-251.
12. Aston-Jones G, and Card JP. 2000. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain: opportunities and limitations. J Neurosci Met, 103: 5161. 13. Baekelandt VL, Arckens W, Annaert UT, Eysel GA, Orban G, and Vandesande F. 1994. Alterations in GAP-43 and synapsin immunoreactivity provide evidence for synaptic reorganization in adult cat dorsal lateral geniculate nucleus following retinal lesions. Eur J Neurosci, 6: 754-765. 14. Bartha A. 1961. Experiments to reduce the virulance of Aujeszky’s disease virus. In Hungarian. Magyar Állatorvosok Lapja, 16: 42. 15. Behrens EG, Schoefield BR, and Thompson AM. 2002. Aminergic projections to cochlear nucleus via descending auditory pathways. Brain Res, 955: 34-44. 16. Békésy G. 1960. Experiments in hearing. McGraw-Hill, New York 17. Benowitz LI, Shashoua VE, and Yoon M. 1981. Specific changes in rapidly transported proteins during regeneration of the goldfish optic nerve. J Neurosci, 1: 300307. 18. Benowitz LI, Apostolides PJ, Perrone-Bizzozero N, Finkelstein SP, and Zwiers H. 1988. Anatomical distribution of the growth-associated protein GAP-43/B-50 in the adult rat brain. J Neurosci, 8: 339-352. 19. Benowitz LI, Perrone-Bizzozero N, Neve RL, Rodriguez W. 1990. GAP-43 as a marker for structural plasticity in the mature CNS. Prog Brain Res, 86: 309-320. 20. Benowitz LI, and Perrone-Bizzozero N. 1991. The relationship of GAP-43 to the development and plasticity of synaptic connections. Ann NY Acad Sci USA, 627: 58-74. 21. Benowitz LI, Routtenberg A. 1997. GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity. Trends Neurosci, 20:84-91. 22. Benson TE, Brown MC. 1990. Synapses formed by olivocochlear axon branches in the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol, 295:52-70. 23. Benson TE, Berglund AM, Brown MC. 1996. Synaptic input to cochlear nucleus dendrites that receive medial olivocochlear synapses. J Comp Neurol, 365:27-41. 24. Bentivoglio M, Kuypers HGJM, Catsman-Berrevoets CE, Loewe H, Dann O. 1980. Two new fluorescent retrograde neuronal tracers which are transported over long distances. Neuroscience Lett, 18: 25-30. 25. Billig I, Foris J, Card JP and Yates BJ. 1999. Transneuronal tracing of neural pathways controlling an abdominal muscle, rectus abdominus, in the ferret. Brain Res, 820: 31-44.
26. Blatchley BJ, Cooper WA, and Coleman JR. 1987. Development of auditory brainstem response to tone pip stimuli in the rat. Dev Brain Res, 32:75-84 27. Booth CM, and Brown MC. 1993. Expression of GAP-43 mRNA in mouse spinal cord following unilateral peripheral nerve damage: is there a contralateral effect? Eur J Neurosci, 5: 1663-1676. 28. Büki B, Wit HP, and Avan P. 2000. Olivocochlear efferent vs. middle-ear contributions to the alteration of otoacoustic emissions by contralateral noise. Brain Res, 852: 140-150. 29. Brideau AD, Card JP, and Enquist LW. 2000. Role of pseudorabies virus Us9, a type II membrane protein, in infection of tissue culture cells and the rat nervous system. J Virol, 74: 834-845. 30. Brodal A. 1949. Experimentelle Untersuchungen über retrograde Zellveraenderungen in der unteren Olive nach Laesionen des Kleinhirns. Z Ges Neurol Psychiat, 166: 647-704. 31. Brown MC, Liberman MC, Benson TE, Ryugo DK. 1988. Brainstem branches from olivocochlear axons in cats and rodents. J Comp Neurol, 278: 591-603. 32. Brown MC, Benson TE. 1992. Transneuronal labeling of cochlear nucleus neurons by HRP-labeled auditory nerve fibers and olivocochlear branches in mice. J Comp Neurol, 321: 645-665. 33. Brown MC. 1993. Fiber pathways and branching patterns of biocytin-labeled olivocochlear neurons in the mouse brainstem. J Comp Neurol, 337: 600-613. 34. Brownell WE, Bader CR, Bertrand D, de Ribaupierre Y. 1985. Evoked mechanical response of isolated cochlear outer hair cells. Science, 277: 194-196. 35. Bruce LL, Kingsley J, Nichols DH, Fritzsch B. 1997. The development of vestibulocochlear efferents and cochlear afferents in mice. Int J Dev Neurosci, 15: 671692. 36. Brugge JF. 1983. Development of the lower brainstem auditory nuclei. In R. Romand (ed): Development of Auditory and Vestibular Systems. New York: Academic Press, pp. 89-120. 37. Caicedo A, Herbert H. 1993. Topography of descending projections from the inferior colliculus to auditory brainstem nuclei in the rat. J Comp Neurol, 328: 377-392. 38. Cant NB, Gaston KC. 1982. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. J Comp Neurol, 212:313-326.
39. Card JP, Whealy ME, Robbins AK, and Enquist LW. 1992. Pseudorabies virus envelope glycoprotein gI influences both neurotropism and virulence during infection of the rat visual system. J Virol., 66, 3032-3041. 40. Card JP, Rinaman L, Lynn RB, Meade RP, Miselis RR and Enquist LW. 1993. Pseudorabies virus infection of the rat central nervous system: ultrastructural characterization of viral replication, transport and pathogenesis. J Neurosci, 13: 2515. 41. Coleman J, Blatchley BJ, and Williams JE. 1982. Development of the dorsal and ventral cochlear nuclei in rat and effects of acoustic deprivation. Dev Brain Res, 4: 119123. 42. Collingridge GL, and Bliss TVP. 1995. Memories of NMDA receptors and LTP. Trends Neurosci, 18: 54-56. 43. Conde F. 1987. Further studies on the use of the fluorescent tracers fast blue and diamidino yellow: effective uptake area and cellular storage sites. J Neurosci Methods, 21:31-43. 44. Covey E, Jones DR, Casseday JH. 1984. Projections from the superior olivary complex to the cochlear nucleus in the tree shrew. J Comp Neurol, 226: 289-305. 45. Cowan WM, Gottlieb DI, Hendrickson AE, Price JL, Woolsey TA. 1972. The autoradiographic demonstration of axonal connections in the central nervous system. Brain Res, 37: 21-51. 46. Dallos P, Geisler CD, Matthews JW, Ruggero MA, Steele CR. 1990. The mechanisms and biophysics of hearing. Springer, Heidelberg New York, pp 1-418. 47. Dallos P, Evans BN. 1995. High-frequency motility of outer hair cells and the cochlear amplifier. Science, 267: 2006-2009. 48. Dani JW, Armstrong DM, and Benowitz LI. 1991. Mapping the development of the rat brain by GAP-43 immunocytochemistry. Neuroscience, 40: 277-287. 49. De la Monte SM, Federoff HJ, Ng SC, Grabczyk E, and Fishman MC. 1989. GAP43 gene expression during development: persistence in a distinctive set of neurons in the mature central nervous system. Dev Brain Res, 46: 161-168. 50. Desmedt JE. 1975. Physiological studies of the efferent recurrent auditory system. In: Keidel, W. D. and Neff, W. D. (ed), Handbook Of Sensory Physiology, Springer, Berlin, pp. 219-246. 51. Diamond IT, Jones EG, and Powell TPS. 1969. The projection of the auditory cortex upon the diencephalon and brainstem in the cat. Brain Res, 15: 305-340.
52. Doster SK, Lozano AM, Aguayo AJ, and Willard MB 1991. Expression of the growth-associated protein GAP-43 in adult rat retinal ganglion cells following axon injury. Neuron, 6: 635-647 53. Edeline JM, and Weinberger NM. 1991. Subcortical adaptive filtering in the auditory system: Associative receptive field plasticity in the dorsal medial geniculate body. Behav Neurosci 105: 154-175 . 54. Eggermont JJ, and Bock GR. 1986. Critical periods in auditory development. Acta Otolaryngol Suppl, 429: 5-64. 55. Faye-Lund H. 1986. Projection from the inferior colliculus to the superior olivary complex in the albino rat. Anat Embryol, 175:35-52. 56. Feliciano M, Saldana E, Mugnaini E. 1995. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal region, superior olivary complex and cochlear nuclei. Aud Neurosci, 1:287-308. 57. Fex J. 1967. Efferent inhibition in the cochlea related to hair-cell dc activity: study of postsynaptic activity of the crossed olivo-cochlear fibers in the cat. J Acoust Soc Am, 41: 666-675. 58. Fox K, and Zahs K. 1994. Critical period control in sensory cortex. Curr Opin Neurobiol, 4: 112-119. 59. Galambos R. 1956. Suppression of auditory activity by stimulation of efferent fibers in the cochlea. J Neurophysiol, 19: 424-437. 60. Gianotti C, Nunzi MG, Gispen WH, Corradetti R. 1992. Phosphorylation of the presynaptic protein B-50 (GAP-43) is increased during electrically induced long-term potentiation. Neuron, 8: 843-848. 61. Giraud AL, Garnier S, Micheyl C, Lina G, Chays A, and Chery-Croze S. 1997. Auditory efferents involved in speech-in-noise intelligibility. NeuroReport, 8: 17791783. 62. Gispen WH, Nielander HB, De Graan PNE, Oestreicher AB, Schrama LH, and Schotman P.1991. Role of the growth-associated protein B-50/GAP-43 in neural plasticity. Molec Neurobiol, 5: 61-85. 63. Gonzalez-Lima F, Finkenstadt T, and Ewert JP. 1989. Learning-related activation in the auditory system of the rat produced by long-term habituation: A 2-deoxyglucose study. Brain Res, 489: 67-79. 64. Godfrey DA, Park-Hellendall JL, Dunn JD, Ross CD. 1987. Effect of olivocochlear bundle transection on choline acetyltransferase activity in the rat cochlear nucleus. Hear Res, 28: 237-251.
65. Godfrey DA, Beranek KL, Carlson L, Parli JA, Dunn JD, Ross CD. 1990. Contribution of centrifugal innervation to choline acetyltransferase activity in the cat cochlear nucleus. Hear Res, 49: 259-280. 66. Gorgels TGMF, Van Lookeren Campagne M, Oestreicher AB, Gribnau AAM, and Gispen WH. 1989. B-50/GAP-43 is localized at the cytoplasmic site of the plasma membrane in developing and adult rat pyramidal tract. J Neurosci, 9: 3861-3869. 67. Guinan JJ. 1996. Physiology of olivocochlear efferents. In: Dallos P, Popper AN, and Fay RR. (eds.): The Cochlea, Springer, New York 68. Guillery RW, Herrup K. 1997. Quantification without pontification: Choosing a method for counting objects in sectioned tissues. J Comp Neurol, 386: 2-7. 69. Gulley RL, Landis DMD, and Reese TS. 1978. Internal organization of membranes at end bulbs of Held in the anteroventral cochlear nucleus. J Comp Neurol, 180: 707742. 70. Herrera M, Hurtado-Garcia JF, Collia F, and Lanciego J. 1994. Projections from the primary auditory cortex onto the dorsal cortex of the inferior colliculus in albino rats. Arch Ital Biol, 132, 147-164. 71. Hoffmann PN. 1989. Expression of GAP-43, a rapidly transported growthassociated protein, and class II ß-tubulin, a slowly transported cytoskeletal protein, are coordinated in regenerating neurons. J Neurosci, 9: 893-897. 72. Honig MG, Hume RI. 1989. DiI and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labeling and pathway tracing. Trends Neurosci, 12: 333-341. 73. Horváth M, Kraus KS, Illing RB. 2000. Olivocochlear neurons sending axon collaterals into the ventral cochlear nucleus of the rat. J Comp Neurol, 422: 95-105. 74. Hsu SM, Raine L, and Fanger H. 1981. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabelled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem, 29: 577-580. 75. Huffman RF, and Henson OW. 1990. The descending auditory pathway and acousticomotor systems: connections with the inferior colliculus. Brain Res Rev, 15: 295-323. 76. Jackson KB, Mark G, Helms J, Müller J, and Behr R. 2002. An auditory brainstem implant system. Am J Audiol, 11: 128-133. 77. Jasmin L, Burkey AR, Card JP, and Basbaum A. 1997. Transneuronal labelling of a nociceptive pathway, the spino-(trigemino-)parabrachio-amygdaloid, in the rat. J Neurosci, 17: 3751-3765.
78. Jewett DL, and Romano MN. 1971. Neonatal development of auditory system potentials averaged from the scalp of rat and cat. Brain Res, 36: 101-115. 79. Kane ES and Habib CP. 1978. Development of the dorsal cochlear nucleus of the cat: An electron microscopic study. Am J Anat, 153: 321-344. 80. Kane ES and Conlee JW. 1979. Descending inputs to the caudal cochlear nucleus of the cat: degeneration and autoradiographic studies. J Comp Neurol, 187: 759-784. 81. Kaufmann GD, Mustari MJ, Miselis RR, and Perachio AA. 1996. Transneuronal pathways to the vestibulocerebellum. J Comp Neurol, 370: 501-523. 82. Kemp DT. 1978. Stimulated acoustic emissions from within the human auditory system. J Acoust Soc Am, 64: 1386-1391. 83. Khalfa S, Bougeard R, Morand N, Veuillet E, Isnard J, Guenot M, Fischer C, and Collet L. 2001. Evidence of peripheral auditory activity modulation by the auditory cortex in humans. Neuroscience, 104: 347-58. 84. King AJ and Moore DR. 1991. Plasticity of auditory maps in the brain. Trends Neurosci, 14: 31-7. 85. Kinney HC, Rava LA, and Benowitz LI. 1993. Anatomic distribution of the growthassociated protein GAP-43 in the developing human brainstem. J Neuropathol Exp Neurol, 52: 39-54. 86. Klepper A, Herbert H. 1991. Distribution and origin of noradrenergic and serotoninergic fibers in the cochlear nucleus and inferior colliculus of the rat. Brain Res, 557: 190-201. 87. Kobayashi N, Kiyama H, and Tohyama M. 1994. GAP-43 (B50/F1) gene regulation by axonal injury of the hypoglossal nerve in the adult rat. Mol Brain Res, 21: 9-18. 88. Kuypers HG, and Ugolini G. 1990. Viruses as transneuronal tracers. Trends Neurosci, 13: 71-5. 89. Laszig R, Kuzma J, Seifert V, and Lehnhardt E. 1991. The Hannover auditory brainstem implant: a multiple-electrode prosthesis. Eur Arch Otorhinolaryngol, 248: 420-421. 90. LaVail JH, LaVail MM. 1972. Retrograde axonal transport in the central nervous system. Science, 176: 1416-17. 91. Leak RK, Card JP, and Moore LY. 1999. Suprachiasmatic pacemaker organization analyzed by transynaptic transport. Brain Res, 819: 214-224.
92. Liberman MC, Dodds LW, Pierce S. 1990. Afferent and efferent innervation of the cat cochlea: quantitative analysis with light and electron microscopy. J Comp Neurol, 301: 443-60 93. Loeb GE. 1990. Cochlear prosthetics. Annu Rev Neurosci, 13: 357-371. 94. Loewy AD. 1995. Pseudorabies virus: a transneuronal tracer for neuroanatomical studies. In: Kaplitt, M. G. and Loewy A. D. (eds): Viral Vectors, Gene Therapy and Neuroscience Applications. Academic Press, San Diego, pp. 349-366. 95. Lovinger DM, Akers RF, Nelson RB, Barnes CA, McNaughton BL, and Routtenberg A. 1985. A selective increase in phosphorylation of protein F1, a protein kinase C substrate, directly related to three day growth of long term synaptic enhancement. Brain Res, 343: 137-143. 96. Lovinger DM, Colley PA, Akers RF, Nelson RB, and Routtenberg A. 1986. Direct relation of long-term synaptic potentiation to phosphorylation of membrane protein F1, a substrate for membrane protein kinase C. Brain Res, 399: 205-211. 97. Masliah E, Fagan AM, Terry RD, DeTeresa R, Mallory M, and Gage FH. 1991. Reactive synaptogenesis assessed by synaptophysin immunoreactivity is associated with GAP-43 in the dentate gyrus of the adult rat. Exp Neurol, 113: 131-142. 98. Mattox DE, Neises GR, and Gulley RL. 1982. A freeze-fracture study of the maturation of synapses in the anteroventral cochlear nucleus of the developing rat. Anat Rec, 204: 281-287. 99. McGuire CB, Snipes GJ, and Norden JJ. 1988. Light-microscopic immunolocalization of the growth- and plasticity-associated protein GAP-43 in the developing rat brain. Dev Brain Res, 41: 277-291. 100. Meiri KF, Pfenninger KH, and Willard MB. 1986. Growth associated protein, GAP-43, a polypeptide that is induced when neurons extend axons, is a component of growth cones and corresponds to pp46, a major polypeptide of a subcellular fraction enriched in growth cones. Proc Natl Acad Sci USA, 83: 3537-3541. 101. Meiri KF, and Gordon-Weeks PR. 1990. The growth associated protein GAP-43 is a component of the growth cone membrane skeleton. J Neurosci, 10: 256-265. 102. Meiri KF, Bickerstaff LE, and Schwob JE. 1991. Monoclonal antibodies show that kinase C phosphorylation of GAP-43 during axonogenesis is both spatially and temporally restricted in vivo. J Cell Biol, 112: 991-1005. 103. Merchán-Pérez A, Bartolomé MV, Ibánez MA, and Gil-Loyzaga P. 1993. Expression of GAP-43 in growing efferent fibers during cochlear development. J OtoRhino-Laryngol, 55: 208-210.
104. Miyamoto RT, Houston DM, Kirk KI, Perdew AE, Svinsky MA. 2003. Language development in deaf infants following cochlear implantation. Acta Otolaryngol, 123: 241-244. 105. Mulders WH, and Robertson D. 2000a. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hear Res, 144: 65-72. 106. Mulders WH, and Robertson D. 2000b. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hear Res, 144: 53-64. 107. Mulders WH, and Robertson D. 2001. Origin of the noradrenergic innervation of the superior olivary complex in the rat. J Chem Neuroanat, 21: 313-322. 108. Neises GR, Mattox DE, and Gulley RL. 1982. The maturation of the end bulb of Held in the rat anteroventral cochlear nucleus. Anat Rec, 204: 271-279. 109. Neve RL, Finch EA, Bird ED, and Benowitz LI. 1988. Growth-associated protein GAP-43 is expressed selectively in associative regions of the adult human brain. Proc Natl Acad Sci USA, 85: 3638-3642. 110. Nieder P, Nieder I. 1970. Crossed olivocochlear bundle: electrical stimulation enhances masked neural responses to loud clicks. Brain Res, 21: 135-137. 111. Nordeen KW, Killackey HP, and Kitzes LM. 1983. Ascending projections to the inferior colliculus following unilateral cochlear ablation in the neonatal gerbil, Meriones unguiculatus. J Comp Neurol, 214: 144-153. 112. O´Donnell P, Lavin A, Enquist LW, Grace AA, and Card JP. 1997. Interconnected parallel circuits between rat nucleus accumbens and thalamus revealed by retrograde transport of pseudorabies virus. J Neurosci, 17: 2143-2167. 113. O'Leary DD, Ruff NL, and Dyck RH. 1994. Development, critical period plasticity, and adult reorganizations of mammalian somatosensory systems. Curr Op Neurobiol, 4: 535-544. 114. Osen KK, Mugnaini E, Dahl AL, Christiansen AH. 1984. Histochemical localization of acetylcholinesterase in the cochlear and superior olivary nuclei. A reappraisal with emphasis on the cochlear granule cells system. Arch Ital Biol, 122: 169-212. 115. Ostapoff EM, Benson CG, Saint Marie RL. 1997. GABA and glycine immunoreactive projections from the superior olivary complex to the cochlear nucleus in guinea pig. J Comp Neurol, 381: 500-512. 116. Palacios G, Mengod G, Sarasa M, Baudier J, and Palacios JM. 1994. De novo synthesis of GAP-43: in situ hybridization histochemistry and light and electron
microscopy immunocytochemical studies in regenerating motor neurons of cranial nerve nuclei in the rat brain. Mol Brain Res, 24: 107-117. 117. Palkovits M, Brownstein M, and Saavedra JM. 1974. Serotonin content of the brainstem nuclei in the rat. Brain Res, 80: 237-249. 118. Pasanisi E, Bacciu A, Vincenti V, Guida M, Barbot A, Berghenti MT, Bacciu S. 2003. Speech recognition in elderly cochlear implant recipients. Clin Otolaryngol, 28: 154-7. 119. Puel JL, Ruel J, Guitton M, and Pujol R. 2002. The inner hair cell afferent/efferent synapses revisited: a basis for new therapeutic strategies. Adv Otorhinolaryngol, 59: 124-130. 120. Rasmussen GL. 1960. Efferent fibers of cochlear nerve and cochlear nucleus. In: Rasmussen GL, Windle WF (eds) Neural Mechanism of the Auditory and Vestibular Systems. Springfield, IL: Thomas, pp. 105-115. 121. Rees S, Güldner FH, Aitkin L. 1985. Activity dependent plasticity of postsynaptic density structure in the ventral cochlear nucleus of the rat. Brain Res, 325: 370-374. 122. Ribári O. 1997. Fül-orr-gégegyógyászat. Medicina Kiadó, Budapest 123. Ribári O, Küstel M. 1998. Overview of our 13-year-long experience with cochlear implants. Acta Chir Hung, 37: 33-37. 124. Ribári O, Küstel M, Szirmai Á, Répássy G. 1999. Cochlear implantation influences contralateral hearing and vestibular responsiveness. Acta Otolaryngol, 119: 225-8. 125. Ribári O, Szirmai Á, Küstel M, RépássyG. 2002. How does cochlear implantation affect the contralateral vestibular system? International Tinnitus Journal, 8: 108-110. 126. Roessner W. 1965. Stereotaktischer Hirnatlas vom Meerschweinchen (Stereotaxic Atlas of the Guinea Pig Brain). Pallas Verlag, Lochharn bei München. 127. Robertson DK, Cole S, Corbett K. 1987a. Quantitative estimate of bilaterally projecting medial olivocochlear neurones in the guinea pig brainstem. Hearing Res, 27: 177-181. 128. Robertson D, Cole KS, Harvey AR 1987b. Brainstem organization of efferent projections to the guinea pig cochlea studied using the fluorescent tracers fast blue and diamidino yellow. Exp Brain Res, 66: 449-457. 129. Robertson D, Winter IM. 1988. Cochlear nucleus inputs to olivocochlear neurones revealed by combined anterograde and retrograde labelling in the guinea pig. Brain Res, 462: 47-55.
130. Robertson D, Harvey AR, Cole KS. 1989. Postnatal development of the efferent innervation of the rat cochlea. Dev Brain Res, 47: 197-207. 131. Robertson D, and Mulders WH. 2000. Distribution and possible functional roles of some neuractive peptides in the mammalian superior olivary complex. Micr Res Tech, 51: 307-317. 132. Roizman B and Sears AE. 1990. Herpes Simplex Viruses and Their Replication. In: Fields BN and Knipe DM. (ed): Virology. Raven Press, New York, pp. 1795-1828. 133. Rotto-Percelay DM, Wheeler JG, Osorio FA, Platt KB, and Loewy AD. 1992. Transneuronal labeling of spinal interneurons and sympathetic preganglionic neurons after pseudorabies virus injections in the rat medial gastrocnemius muscle. Brain Res, 574: 291-306. 134. Rubel EW. 1984. Ontogeny of the auditory system function. Annu Rev Physiol, 46: 213-229. 135. Rubel EW. 1985. Strategies and problems for future studies of auditory development. Acta Otolaryngol Suppl, 421: 114-128. 136. Ruben RJ. 1986. Unresolved issues around critical periods with emphasis on clinical application. Acta Otolaryngol Suppl, 429: 61-64. 137. Ruben RJ, and Rapin I. 1980. Plasticity of the developing auditory system. Ann Otol, 89: 12-24. 138. Ryan AF, Woolf NK, and Sharp FR. 1982. Tonotopic organization in the central auditory pathway of the mongolian gerbil: a 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol, 207: 369-380. 139. Ryan AF, Keithley EM, Wang ZW, and Schwartz IR. 1990. Collaterals from lateral and medial olivocochlear efferent neurons innervate different regions of the cochlear nucleus and adjacent brainstem. J Comp Neurol, 300: 572-582. 140. Saldana E, Feliciano M, and Mugnaini E. 1996. Distribution of descending projections from primary auditory neocortex to inferior colliculus mimics the topography of intracollicular projections. J Comp Neurol, 371: 15-40. 141. Sams JM, Jansen ASP, Mettenleiter TC, and Loewy AD. 1995. Pseudorabies virus mutants as transneuronal markers. Brain Res, 687: 182. 142. Schaden H, Stuermer CAO and Bähr M. 1994. GAP-43 immunoreactivity and axon regeneration in retinal ganglion cells of the rat. J Neurobiol, 25: 1570-1578. 143. Scharf B, Nadol J, Magnan J, Chays A, and Marchioni A. 1993. Does efferent input improve the detection of tones in monaural noise? In: Verillo R. (ed): Sensory Research: Multimodal Perspectives. Hillsdale, NJ: Erlbaum Press pp 299-306.
144. Scharf B, Magnan J, Collet L, Ulmer E, and Chays A. 1994. On the role of the olivocochlear bundle in hearing: a case study. Hear Res, 75: 11-26. 145. Scharf B, Magnan J, and Chays A. 1997. On the role of the olivocochlear bundle in hearing: 16 case studies. Hear Res, 103: 101-122. 146. Scheich H. 1991. Auditory cortex: comparative aspects of maps and plasticity. Curr Opin Neurobiol, 1: 236-247. 147. Schreyer DJ, and Skene JH. 1993. Injury-associated induction of GAP-43 expression displays axon branch specificity in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurobiol, 24: 959-970. 148. Schwartz AM, and Kane ES. 1977. Development of the octopus cell area in the cat ventral cochlear nucleus. Am J Anat, 148: 1-18. 149. Shoefield BR. 1991. Superior paraolivary nucleus in the pigmented guinea pig: separate classes of neurons project to the inferior colliculus and the cochlear nucleus. J Comp Neurol, 312: 68-76. 150. Shoefield BR. 1994. Projections to the cochlear nuclei from principal cells in the medial nucleus of the trapezoid body in guinea pigs. J Comp Neurol, 344: 83-100. 151. Shore SE, Helfert RH, Bledsoe SC Jr., Altschuler RA, Godfrey DA. 1991. Descending projections to the dorsal and ventral divisions of the cochlear nucleus in guinea pig. Hear Res, 52: 255-268. 152. Shore SE, Godfrey DA, Helfert RH, Altschuler RA, Bledsoe SC Jr. 1992. Connections between the cochlear nuclei in guinea pig. Hear Res, 62:16-26. 153. Skene JHP, and Willard M. 1981a. Changes in axonally transported proteins during axon regeneration in toad retinal ganglion cells. J Cell Biol, 89: 86-95. 154. Skene JHP, and Willard M. 1981b. Axonally transported proteins associated with axon growth in rabbit central and peripheral nervous system. J Cell Biol, 89: 96-103. 155. Skene JHP, Jacobson RD, Snipes GJ, McGuire CB, Norden JJ, and Freeman JA.1986. A protein induced during nerve growth (GAP-43) is a major component of growth cone membranes. Science, 233: 783-786. 156. Spangler KM, Cant NB, Henkel CK, Farley GR, Warr WB. 1987. Descending projections from the superior olivary complex to the cochlear nucleus of the cat. J Comp Neurol, 259: 452-465. 157. Spangler KM, Warr WB. 1991. The descending auditory system. In: Altschuler RA, Hoffman DW, Bobbin RP, Clopton B, editors: Neurobiology of Hearing, Vol.2, New York: Raven Press, pp. 27-45.
158. Spoendlin HH. 1969. Innervation patterns in the organ of Corti of the cat. Acta Otolaryngol, 67: 239-254. 159. Stopp PE. 1990. The problem of obtaining reproducible quantitative data of the olivocochlear pathway as exemplified in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol, 247: 29-32. 160. Strack AM, Sawyer WB, Platt KB, Loewy AD. 1989. CNS cell groups regulating the sympathetic outflow to adrenal gland as revealed by transneuronal cell body labeling with pseudorabies virus. Brain Res, 491: 274-296. 161. Strittmatter SM, Vartanian T, and Fishman MC. 1992. GAP-43 as a plasticity protein in neuronal form and repair. J Neurobiol, 23: 507-520. 162. Strutz J, and Spatz WB. 1980. Superior olivary and extraolivary origin of centrifugal innervation of the cochlea in guinea pig. A horseradish peroxidase study. Neurosci Lett, 17: 227-230. 163. Strutz J, and Bielenberg K. 1984. Efferent acoustic neurons within the lateral superior olivary nucleus of the guinea pig. Brain Res, 299: 174-177. 164. Sur JH. 1995. Study of transneuronal passage of pseudorabies virus in rat central nervous system by use of immunohistochemistry and in situ hybridization. Am J Vet Res, 56: 1195. 165. Szentágothai J, Réthelyi M. 1985. Funkcionális anatómia. Medicina Könyvkiadó, Budapest 166. Szente M, Toldi J. 1999. A gerinces idegrendszer ontogenezise és plaszticitása. Dialóg Campus Kiadó, Budapest-Pécs 167. Syka J, Popelar J, Druga R, and Vlkova A. 1990. Descending central auditory pathway-structure and function. In: Syka J and Masterton RB (ed), Auditory PathwayStructure and Function. Plenum Press, New York and London, pp. 279-292. 168. Thompson AM, Thompson GC. 1991. Posteroventral cochlear nucleus projections to olivocochlear neurons. J Comp Neurol, 303: 267-285. 169. Thompson AM and Thompson GC. 1993. Relationship of descending inferior colliculus projections to olivocochlear neurons. J Comp Neurol, 335: 402-412. 170. Thompson AM and Thompson GC. 1995. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Res, 695: 263-266. 171. Thompson AM, Moore KR, and Thompson GC. 1995. Distribution and origin of serotoninergic afferents to guinea pig cochlear nucleus. J Comp Neurol, 351: 104-116.
172. Thompson AM and Schofield BR. 2000. Afferent projections of the superior olivary complex. Microsc Res Tech, 51: 330-54. 173. Tóth IE, Palkovits M. 1997. Viral labelling of synaptically connected neurons. Neurobiology, 5: 17-41. 174. Ugolini G. 1995a. Transneuronal tracing with alpha-herpesviruses: a review of methodology. In: Kaplitt MG and Loewy AD (ed): Viral Vectors. Gene Therapy and Neuroscience Applications. Academic Press, New York. pp. 293-317. 175. Ugolini G. 1995b. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. J Comp Neurol, 356: 457-80. 176. Uziel A, Romand R, and Marot M. 1981. Development of cochlear potentials in rats. Audiology, 20: 89-100. 177. Van Hoof COM, DeGraan PNE, Oestreicher AB, and Gispen WH. 1988. B-50 phosphorylation and polyphosphoinositide metabolism in nerve growth cone membranes. J Neurosci, 8: 1789-1795. 178. Verhaagen J, Zhang Y, Hamers FP, and Gispen WH. 1993. Elevated expression of B-50 (GAP-43)-mRNA in a subpopulation of olfactory bulb mitral cells following axotomy. J Neurosci Res, 35: 162-169. 179. Verkade P, Oestreicher AB, Verkleij AJ and Gispen WH. 1995. The increase in B50/GAP-43 in regenerating rat sciatic nerve occurs predominantly in unmyelinated axon shafts: a quantitative ultrastructural study. J Comp Neurol, 356: 433-443. 180. Versteeg DHG, Gugten JV, De Jong W, and Palkovits M. 1976. Regional concentrations of noradrenaline and dopamine in rat brain. Brain Res, 113: 563-574. 181. Vetter DE, Adams JC, Mugnaini E. 1991. Chemically distinct rat olivocochlear neurons. Synapse, 7: 21-43. 182. Vetter DE, Mugnaini E. 1992. Distribution and dendritic features of three groups of rat olivocochlear neurons. Anat Embryol, 185:1-16. 183. Vetter DE, Saldana E, Mugnaini E. 1993. Input from the inferior colliculus to medial olivocochlear neurons in the rat: A double label study with PHA-L and cholera toxin. Hear Res, 70:173-186. 184. Veuillet F, Khalfa S, and Collet L. 1999. Clinical relevance of medial efferent auditory pathways. Scand Audiol Suppl, 51: 53-62. 185. Walther JB and Rasmussen GL. 1960. Descending connections of auditory cortex and thalamus of the cat. Fed Proc, 19: 291
186. Warr WB. 1975. Olivocochlear and vestibular efferent neurons of the feline brain stem: their location, morphology and number determined by retrograde axonal transport and acetylcholinesterase histochemistry. J Comp Neurol, 161: 159-181. 187. Warr WB. 1980. Efferent components of the auditory system. Ann Otol Rhinol Laryngol Suppl, 89: 114-120. 188. Warr WB, Guinan JJ, White JS. 1986. Organization of the efferent fibers: the lateral and medial olivocochlear systems. In: Altschuler RA, Hofmann DW, Bobbin RP, editors. Neurobiology of Hearing: The Cochlea. New York: Raven Press, pp. 333-348. 189. Warr WB, Beck JE. 1996. Multiple projections from ventral nucleus of the trapezoid body in the rat. Hear Res, 93: 83-101. 190. Warr WB, Beck JE, Neely ST. 1997. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hear Res, 108: 89-111. 191. Warren WS, Adkison MG and Bartness TJ. 1996. CNS neurons regulating the sympathetic outflow to white adipose tissue as revealed by transneuronal labeling with pseudorabies virus. Soc Neurosci Abstr, 22: 556.9. 192. Weinberger NM. 1993. Learning-induced changes of auditory receptive fields. Curr Opin Neurobiol, 3: 570-577. 193. Weedman DL, Ryugo DK. 1996a. Pyramidal cells in primary auditory cortex project to cochlear nucleus in rat. Brain Res, 706: 97-102. 194. Weedman DL, Ryugo DK. 1996b. Projections from auditory cortex to the cochlear nucleus in rats: synapses on granule cell dendrites. J Comp Neurol, 371: 311-324. 195. Wenthold RJ. 1987. Evidence for a glycinergic pathway connecting the two cochlear nuclei: an immunocytochemical and retrograde transport study. Brain Res, 415: 183-187. 196. Whealy ME, Card JP, Robbins AK, Dubin JR, Rziha HJ, and Enquist LW. 1993. Specific pseudorabies virus infection of the rat visual system requires both gI and gp63 glycoproteins. J Virol, 67: 3786-3797. 197. White JS, Warr WB. 1983. The dual origins of the olivocochlear bundle in the albino rat. J Comp Neurol, 219: 203-214. 198. Wiesel TN. 1982. Postnatal development of the visual cortex and the influence of environment. Nature, 299: 583-591.
199. Willott JF, Aitkin LM, and McFadden SL. 1993. Plasticity of auditory cortex associated with sensorineural hearing loss in adult C57BL/6J mice. J Comp Neurol, 329: 402-411. 200. Winter IM, Robertson D, Cole KS. 1989. Descending projections from auditory brainstem nuclei to the cochlea and cochlear nucleus of the guinea pig. J Comp Neurol, 280:143-157. 201. Winsky L, and Jacobowitz DM. 1995. Effects of unilateral cochlear ablation on the distribution of calretinin mRNA and immunoreactivity in the guinea pig ventral cochlear nucleus. J Comp Neurol, 354: 564-582. 202. Withington DJ, Binns KE, Ingham NJ, and Thornton SK. 1994. Plasticity in the superior collicular auditory space map of adult guinea-pigs. Exp Physiol, 79: 319-325. 203. Woods CI and Azeredo WJ. 1999. Noradrenergic and serotoninergic projections to the superior olive: potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Res, 836: 918. 204. Woolf CJ, Reynolds ML, Molander C, O'Brian C, Lindsay RM, and Benowitz LI. 1990. The growth-associated protein GAP-43 appears in dorsal root ganglion cells and in the dorsal horn of the rat spinal cord following peripheral nerve injury. Neuroscience, 34: 465-478. 205. Zenner HP. 1994. Physiologische und biochemische Grundlagen des normalen und gestörten Gehörs. In: Naumann HH, Helms J, Herberhold C, Kastenbauer E. OtoRhinolaryngologie in Praxis und Klinik, Bd 1. Thieme, Stuttgart, 81-231. 206. Zheng J, Shen W, He DZ, Long KB, Madison LD, Dallos P. 2000. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature, 405: 149-55. 207. Zimmer WM, Rosin DF, and Saunders JC. 1994. Middle-ear development VI: Structural maturation of the rat conducting apparatus. Anat Rec, 239: 475-484. 208. Zuber MX, Goodman DW, Karns LR, and Fishman MC. 1989. The neuronal growth- associated protein GAP-43 induces filopodia in non-neuronal cells. Science, 244: 1193-1195. 209. Xiao Z, Suga N. 2002. Modulation of cochlear hair cells by the auditory cortex in mustached bat. Nat Neurosci, 5: 57-63. 210. Ye Y, Machado DG, and Kim DO. 2000. Projection of the marginal shell of the anteroventral cochlear nucleus to olivocochlear neurons in the cat. J Comp Neurol, 420: 127-138. 9. A doktori értekezés témájában megjelent közlemények és absztraktok Közlemények:
Illing RB, Horváth M. 1995. Re-emergence of GAP-43 in cochlear nucleus and superior olive following cochlear ablation in the rat. Neuroscience Letters 194: 9-12. Horváth M, Förster CR, Illing RB. 1997. Postnatal development of GAP-43 immunoreactivity in the auditory brainstem of the rat. Journal of Comparative Neurology 382: 104-115. Illing RB, Horváth M, Laszig R. 1997. Plasticity of the auditory brainstem: effects of cochlear lesions on GAP-43 expression in rat. Journal of Comparative Neurology 382: 116-138. Horváth M, Kraus KS, Illing RB. 2000. Olivocochlear neurons sending axon collaterals into the ventral cochlear nucleus of the rat. Journal of Comparative Neurology 422: 95105. Horváth M, Ribári O, Répássy G, Tóth IE, Boldogkoi ZS, Palkovits M. 2003. Intracochlear injection of pseudorabies virus labels descending auditory and monoaminerg projections to olivocochlear cells in guinea pig. European Journal of Neuroscience, közlésre elfogadva Absztraktok: Förster CR, Horváth M, Illing RB. 1995. Postnatal development and reemergence of GAP-43 in auditory brainstem nuclei following cochlear lesioning. European Journal of Neuroscience, Suppl. 8: p. 34. Illing RB, Horváth M, Michler S, Laszig R. 1996. Gibt es inhibitorische Synapsen an Neuronen der Cochlea? HNO Informationen, 21: 99. Illing RB, Förster CR, Horváth M. 1996. Evaluating the plasticity potential of auditory brainstem nuclei in the rat. American Journal of Otology, Suppl. 6: pp. 52-53.
Michler S, Illing RB, Häufel T, Horváth M, Laszig R. 1999. Audiometrie der Ratte: Hörvermögen und Ertaubungsmodelle. HNO, 47: 413. Michler S, Häufel T, Horváth M, Illing RB. 1999. Three different models of monaural deafness of the rat: brainstem audiometry and histology. Proceedings of the 1st Göttingen Conference of the German Neuroscience Society pp. 294. Horváth M, Kraus KS, Illing RB, Laszig R. 2000. Medial olivocochlear neurons innervate the ventral cochlear nucleus in rat. Laryngo-Rhino-Otologie, Suppl. 79: pp. 119.
Ribári O, Palkovits M, Horváth M. 2001. Kontralaterale Hörverbesserung nach Cochlear Implant: Klinische Ergebnisse und anatomische Grundlagen. HNO Informationen, 25: pp. 167 Horváth M, Palkovits M. 2003. Az olivocochleáris sejtek és a leszálló hallópálya jelölése pseudorabies vírus intracochleáris injekciójával tengerimalacban. Tavaszi Szél Konferencia Kiadvány, 47-50.
A doktori értekezés témájában elhangzott eloadások Horváth M, Tóth IE, Boldogkoi Zs, Medveczky I, Ribári O, Palkovits M. 1997. Investigation of descending pathways of the auditory system via transsynaptic labelling in guinea pig. VI. Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest. Ribári O, Küstel M, Horváth M. 1998. Tinnitus controll in cochlear implant patients. A Nemzetközi Neurootológiai és Equilibrometriai Társaság 25. Kongresszusa, Bad Kissingen. Horváth M, Illing RB, Ribári O. 1998. Cochlea-lézió hatása a nucleus cochlearis és az oliva superior GAP-43 immunreaktivitására. A Magyar Fül-orr-gégeorvosok Egyesülete Audiológiai Szekciójának Vándorgyulése, Szeged. Horváth M, Tóth IE, Boldogkoi Zs, Medveczky I, Ribári O, Palkovits M. 1998. Labelling of descending pathways of the auditory system via pseudorabies virus. A WHMA (Worldwide Hungarian Medical Academy) 4. Nemzetközi Kongresszusa, Budapest. Horváth M, Tóth IE, Bodogkoi Zs, Ribári O, Palkovits M. 2000. Az olivocochleáris sejtek innervációjának vizsgálata transz-szinaptikus pályajelöléssel patkányban és tengerimalacban. PhD 2000 Konferencia, Budapest. Horváth M, Tóth IE, Boldogkoi Zs, Ribári O, Palkovits M. 2000. Innervation of the olivocochlear cells studied by transsynaptic tracing in guinea pig and rat. A Magyar Idegtudományi Társaság 4. Konferenciája, Budapest Horváth M, Répássy G, Ribári O, Palkovits M. 2000. Az olivocochleáris rendszer anatómiájáról szerzett újabb ismereteink. A Magyar Fül-orr-gégeorvosok Egyesületének Tudományos Ülése, Budapest. Horváth M, Ribári O, Répássy G, Palkovits M. 2000. Az olivocochleáris sejtek kapcsolatainak vizsgálata transz-szinaptikus pályajelöléssel patkányban és tengerimalacban. A Magyar Fül-orr-gégeorvosok Egyesületének 36. Kongresszusa, Hévíz
Horváth M, Ribári O, Répássy G, Küstel M, Palkovits M. 2002. Ellenoldali hallásjavulás cochleáris implantáció után: anatómiai alapok. A Magyar Fül-orrgégeorvosok Egyesületének 37. Kongresszusa, Siófok Horváth M. 2003. A Corti-szerv efferens kontrolljának anatómiai alapjai. A Magyar Fül-orr-gégeorvosok Egyesületének Tudományos Ülése, Budapest.
