MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
MiRNA a její význam v nádorové diagnostice Bakalářská práce
Kristýna Hudcová
Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Michal Masařík, Ph.D.
BRNO 2011
Bibliografický záznam: Autor:
Kristýna Hudcová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
MiRNA a její význam v nádorové diagnostice
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
RNDr. Michal Masařík, Ph.D.
Rok obhajoby:
2011
Klíčová slova:
MiRNA, karcinom prostaty, diagnostika nádorů, metalothionein
2
Bibliographic entry: Author:
Kristýna Hudcová Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of thesis:
MiRNA and its consequence with diagnostic of tumor diseases
Degree programe:
Biochemistry
Field of study:
Biochemistry
Supervisor:
RNDr. Michal Masařík, Ph.D.
Year of defence:
2011
Keywords:
MiRNA, prostate cancer, diagnostic of carcinoma, methallothionein
3
Poděkování: Ráda bych poděkovala vedoucímu své práce RNDr. Michalovi Masaříkovi, Ph.D., za odborné vedení, cenné připomínky a vytvoření příjemného pracovního prostředí. Dále děkuji Mgr. Mariánovi Hlavnovi za užitečné rady, čas a trpělivost, kterou mi věnoval při řešení praktické části práce. V neposlední řadě děkuji svým rodičům za veškerou podporu a vytvoření zázemí, bez kterého bych nemohla své bakalářské práci věnovat tolik úsilí.
4
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem svou bakalářskou práci na téma MiRNA v nádorové diagnostice vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Michala Masaříka, Ph.D., s použitím citovaných pramenů uvedených v seznamu literatury na konci práce.
V Brně ………………….
….…………………… Kristýna Hudcová 5
Obsah Obsah ........................................................................................................................ 6 Úvod .......................................................................................................................... 8 Seznam použitých zkratek ....................................................................................... 9 1. MikroRNA ............................................................................................................ 11 1.1. Historie miRNA ........................................................................................................................... 11 1.2. RNA interference ........................................................................................................................ 11 1.3. Biogeneze miRNA ....................................................................................................................... 11 1.3.1. Primární transkript.............................................................................................................................. 12 1.3.2. Drosha ................................................................................................................................................ 12 1.3.3. Exportin 5 komplex ............................................................................................................................ 13 1.3.4. Dicer ................................................................................................................................................... 13 1.3.5. RISC ................................................................................................................................................... 14
1.4. Funkce miRNA ............................................................................................................................ 14 1.5. MiRNA a onkogeneze ................................................................................................................. 15 1.6. SiRNA .......................................................................................................................................... 16
2. Prostata ............................................................................................................... 16 2.1. Anatomie prostaty ...................................................................................................................... 17 2.2. Funkce prostaty .......................................................................................................................... 17 2.3. Karcinom prostaty ...................................................................................................................... 18 2.4. MiRNA a karcinom prostaty ....................................................................................................... 18 2.5. Biomarkery nádoru prostaty ...................................................................................................... 19 2.5.1. MiRNA v séru .................................................................................................................................... 20 2.5.2. PSA .................................................................................................................................................... 21 2.5.3. α-Methylacyl-CoA racemáza ............................................................................................................. 22 2.5.4. Metalothionein ................................................................................................................................... 22
2.6. Způsoby diagnostiky karcinomu prostaty .................................................................................. 24 2.6.1. Základní rozdělení čtyř stádií rakoviny prostaty ................................................................................ 24 2.6.2. Obecné označení rakoviny mezinárodním systémem TNM ............................................................... 24 2.6.3. Gleasonův gradingový systém ............................................................................................................ 24
6
2.7. Karcinom prostaty v závislosti na hormonálním působení ........................................................ 25 2.8. Léčba........................................................................................................................................... 25
3. Cíle práce ............................................................................................................ 27 4. Praktická část ..................................................................................................... 28 4.1. Aberace genů spojené s danými chromozomy (1,7,8,17) a nádorem prostaty ......................... 28 4.2. Chromozomy 1, 7, 8, 17 a jejich některé geny asociované s karcinomem prostaty ................. 29 4.3. Exprese miRNA v prostatických buňkách v závislosti na metalothioneinu ................................ 29 4.3.1. Charakteristiky jednotlivých miRNA ................................................................................................. 30
4.4. Materiál ...................................................................................................................................... 30 4.5. Použité chemikálie...................................................................................................................... 31 4.6. Použité přístroje ......................................................................................................................... 31 4.7. Metody ....................................................................................................................................... 31 4.7.1. Izolace a kontrola kvality RNA .......................................................................................................... 31 4.7.2. Reversní Transkripce .......................................................................................................................... 33 4.7.3. Kvantitativní PCR v reálném čase ...................................................................................................... 34 4.7.4. Zpracování a analýza dat .................................................................................................................... 35
5. Výsledky .............................................................................................................. 36 5.1. Regulace Zinku pomocí MT ........................................................................................................ 36 5.2. Exprese MT1A a MT2A ............................................................................................................... 36 5.3. Koncentrace vyizolovaných RNA ................................................................................................ 37 5.3.1. Koncentrace RNA z buněčných linií různých zinkových koncentrací ............................................... 37 5.3.2. Koncentrace vyizolovaných krátkých úseků RNA ze vzorků sér:...................................................... 38
5.4. Srovnání hladin exprese miRNA u jednotlivých zinkových koncentrací ..................................... 38 5.5. Exprese miRNA ze sér ................................................................................................................. 43
6. Diskuze ................................................................................................................ 44 7. Závěr .................................................................................................................... 46 8. Souhrn ................................................................................................................. 47 9. Summary ............................................................................................................. 48
7
Úvod Dle posledních vědeckých údajů je v součastné době vysoký nárůst nádorového onemocnění měkkých tkání, kam se vedle varlat, tlustého střeva a plic řadí také prostata. V Evropě je karcinom prostaty druhý nejčastější typ rakoviny a třetí nejčastější příčina úmrtí na maligní nádor u mužů. V České republice nádor prostaty zaujímá třetí pozici (10 %) ve výskytu nádoru u mužů (po karcinomu plic a tlustého střeva). Nejčastěji jsou jí postiženi muži staršího věku (kolem sedmdesáti let). Navzdory vysokému pokroku ve výzkumu karcinomu prostaty, nové diagnostice, prognostice i terapeutice, je stále zapotřebí včasnější detekce nemoci a výběr účinné léčby. V posledních letech se pohled odborníků studujících onkogenezi zaměřuje na mikroRNA. Užití těchto biomolekul k diagnostickým, prognostickým i terapeutickým účelům bude mít pravděpodobně v budoucnu velký význam. 1 Bylo prokázáno, že jednořetězcové, 18-24 nukleotidů dlouhé nekódující řetězce RNA zvané mikroRNA, mají zásadní roli v regulaci genové exprese. Tyto nedávno objevené krátké úseky RNA otevřely zcela nový pohled ke studiu mechanismu regulace genové exprese a funkce. 2 Tato práce se zabývá objasněním exprese určitých miRNA v prostatických buněčných liniích v závislosti na metalothioneinu, jakožto hlavního faktoru pro výběr jednotlivých miRNA a je součástí grantového projektu GAČR 301/09/P436 a IGA MZ NS10200-3.
8
Seznam použitých zkratek miRNA / miR
mikroRNA
pri-miRNA
primární mikroRNA
pre-miRNA
prekurzorová miRNA
mRNA
mediátorová RNA
DGCR8
DiGeorge syndrome critical region gene 8
RNAi
RNA Interference
GTP
guanosintrifosfát
siRNA
small interfering RNA (malé interferující RNA)
dsRNA
double-strand RNA (dvouvláknová RNA)
ssRNA
single-strand RNA (jednovláknové RNA)
FBS
fetal bovine serum
SNP
single nucleotide polymorphism (jednonukleotidový polymorfismus)
GDP
guanosindifosfát
ATP
adenosintrifosfát
RISC
RNA induced silencing komplex (multiproteinový komplex asociovaný s miRNA)
3´UTR
3´ netranslatovaná oblast
PSA
prostatický specifický antigen
AR
androgenní receptor
AMACR
α-Methylacyl-CoA racemáza
MT
metalothionein
MTF-1
metal-regulatory-transcription factor – 1 (transkripční faktor ovlivňující regulaci kovů)
MRE
metal responsive element
MT1A
metalothionein 1A
MT2A
methalotihonein 2A
DTH
dihydrotestosteron
q-PCR
kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase
cDNA
komplementární DNA
RT
reversní transkripce 9
dNTP
deoxyribonukleotidtrifosfát
RT-PCR
PCR v reélném čase
FISH
fluorescence in situ hybridisation (fluorescenční in situ hybridizace)
ISH
in situ hybridization (hybridizace in situ)
CGH
comparative genomic hybridization (komparativní genomická hybridizace)
LOH
loss of heterozygosity (ztráta heterozygozyty)
10
1. MikroRNA MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující jednovláknové RNA o délce zhruba 18 - 24 nukleotidů. Svými posttranskripčními ději se podílejí na mnoha důležitých biologických a patologických procesech jako je embryogeneze, diferenciace, proliferace, produkce cytokinů či apoptóza. 3
1.1. Historie miRNA První miRNA byly objeveny v laboratoři Victoria Ambrose u hlístice Caenorhabditis elegans roku 1993 týmem Leeho a jeho kolegů. 4 Ta úplně první byla pojmenována lin-4 a její zásadní funkcí je kontrola apoptózy. Následovala miRNA let-7, která se také účastní na regulaci buněčného cyklu u Caenorhabditis elegans. Až v roce 2001 byl poprvé použit termín mikroRNA v časopise Science ve článku Marianna-Lagos Quintana a Thomase Tuschla, kteří dokázali přítomnost mikroRNA i v dalších organismech. 5 V součastné době známe více než 700 druhů různých savčích miRNA, regulujících až několik tisíc genů. Odhadovaný počet genů kódujících miRNA je 3-4 % z celkového genomu a tyto miRNA regulují až 60 % všech genů. 6, 7
1.2. RNA interference K objasnění tohoto důležitého molekulárního mechanismu přispěli v roce 1998 laureáti na Nobelovu cenu Fire a Mello, když zjistili, že dvouřetězcová RNA (dsRNA) podléhá rozkladu a inhibuje genovou expresi.
8
Mechanismus účinku RNA interference
(RNAi) spočívá v párování krátkého úseku RNA (miRNA, siRNA) s komplementárními úseky transkriptů specifických mRNA a vytváření tak dvouřetězcových molekul, které mají za následek snížení své regulace. Interakci s proteinem uskutečňuje miRNA buď rozštěpem specifického úseku mRNA nebo jeho posttranskripční inhibicí.9 Odhaduje se, že více než 90 % lidského genomu je regulováno tímto procesem, známým jako miRNA-guided RNA silencing (umlčování RNA prostřednictvím miRNA). 10
1.3. Biogeneze miRNA Produkce miRNA (obr. 3) začíná transkripcí DNA v jádře RNA polymerázou II nebo RNA polymerázou III. Enzym Drosha v jádře stříhá primární miRNA do vlásenkové struktury, která je odtud transportována do cytoplasmy a zde podléhá dalším regulačním dějům pomocí endonukleázy Dicer a komplexu RISC (RNA-induced silencing complex).11 11
1.3.1. Primární transkript Většina hlavních lidských miRNA je exprimována z intronů, nekódujících úseků genomu.
12
Intron o velikosti zhruba 400 nukleotidů je vystřižen z primárního transkriptu a
transkripcí RNA polymerázou II se z něj stává primární miRNA (pri-miRNA). vzniklá pri-miRNA
13,14
Takto
obsahuje polyadenylovaný 3´konec a čepičku (CAP) na 5´konci,
podobně jako ostatní transkripty. 15 Pokud je ovšem transkripce provedena RNA polymerázou III, tak je přítomna repetitivní sekvence Alu. 16 1.3.2. Drosha Po transkripci je pri-miRNA rozpoznána proteinovým komplexem, který je složený z enzymu Drosha a proteinu DGCR8, také známým jako Pasha, který následně formuje pri-miRNA do struktury vlásenky. Snížená produkce obou složek tohoto komplexu způsobená RNAi má za následek úbytek miRNA. Jsou tudíž pro biogenezi miRNA esenciální. 17 Drosha je enzym z rodiny dvouvláknových RNA specifických RNáz III. Rodina obsahuje další dva enzymy, z nichž jeden je Dicer a třetí enzym se účastní pochodů úpravy mitochondriální rRNA. Studie zaměřené na proteiny ovlivňující biogenezi miRNA označují Droshu jako jadernou nukleázu, která zahajuje tento složitý proces biogeneze miRNA.
18
Poprvé byl
enzym Drosha popsán v procesu regulace genové exprese prostřednictvím RNAi. Pomocí svých dvou RNázových domén provede rozštěp obou vláken pri-miRNA a dá vzniknout prekurzorové miRNA (pre-miRNA) s vlásenkovou strukturou o velikosti ~70 nukleotidů. Vzniklá vlásenka má na svém 3´ konci přesah dva nukleotidy 19, který je důležitý pro pozdější nasednutí enzymu Dicer. DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8) se nachází na 22. chromozomu, v regionu q11.2. Heterozygotní delece v genu pro DGCR8 vede k DiGeorgevovu syndromu. Tým Hana a spol.20 navrhli nový model, jak může komplex Drosha-DGCR8 rozpoznat substrát. Poznatek založili na faktu, že Drosha je enzym, který může v buňce rozštěpit široké spektrum pri-miRNA. Ve svém modelu rozčlenili pri-miRNA do 4 částí (obr. 1): koncová klička (terminal loop), horní část (upper stem), spodní část (lower stem) a základní segment (basal stem). V biogenezi miRNA figuruje DGCR8 jako templát pro správnou tvorbu primiRNA, který se vyskytuje zhruba 11 párů bází od základního segmentu.
12
Obr. 1: Rozdělení pri-miRNA na 4 segmenty (zleva): základní segment, spodní část, horní část a koncová klička. Převzato z Han et al. 18
1.3.3. Exportin 5 komplex Pre-miRNA je transportována z jádra do cytoplazmy přes jaderné póry pomocí transportního komplexu Exportinu-5, který rozpoznává specifickou sekvenci vlásenky v přítomnosti GTP-vázajícího kofaktoru Ran. Na kofaktor je v inaktivní formě navázán GTP. Aby bylo docíleno aktivace Exportinu 5, je zapotřebí hydrolyzovat Ran-GTP komplex a rozštěpit tak makroergickou vazbu. Odštěpí se jedna molekula fosfátu a z Ran-GTP se stane Ran-GDP. Hydrolýzu zajišťuje enzym nacházející se v cytoplasmě – Ran GTPáza. 21 1.3.4. Dicer Dicer je multidoménový ATP-dependentní enzym o hmotnosti 200 kDa, řadící se do rodiny RNAs III. Byl objeven v roce 2001 na základě výzkumu S2 buněk Drosophila melanogaster.
17
Přítomnost Diceru v cytoplasmě je u savců nezbytná. Ve spolupráci s TRBP
proteinem (trans-activator RNA binding protein) štěpí specificky dvoušroubovicovou RNA (dsRNA) na dvouřetězcové fragmenty miRNA o délce ~22 nukleotidů, později pojmenované jako siRNA , které fungují jako efektor v průběhu RNAi. Dicer se skládá z pěti základních domén (obr.2). Na N-konci se nachází DExH RNA helikázová/ATPázová doména. Funkce domény DUF283 doposud nebyla objasněna. Sousední doménou je PAZ a následují tři nejdůležitější domény – RNáza IIIa, RNáza IIIb a dsRBD doména na C-konci. Tyto domény se podílejí na hydrolytickém štěpení fosfodiesterové vazby dsRNA, ze kterého pak vznikají molekuly s dvounukleotidovým přesahem a hydroxylovou skupinou na 3´-konci a s fosfátovou skupinou na 5´-konci.22
13
Obr 2: Schéma domény multienzymového enzymu Dicer u H. sapiens (zleva): Největší helikázová doména je následována doménou DUF283 s neobjasněnou funkcí. Modře je vyznačena doména PAZ, za níž se nacházejí dvě Rnázové domény III (RIIIa a RIIIb). Enzym končí doménou dsRBD na C-konci. Převzato z Meister et al.
23
1.3.5. RISC RISC (RNA-induced silencing complex) je multiproteinový komplex, který na sebe váže nově vzniklý řetězec miRNA. Druhý řetězec z miRNA duplexu je ihned degradován. Aktivní miRNA (může to být i siRNA) se navazuje na mRNA a interaguje na základě komplementarity bází mezi miRNA a 3’UTR (3‘-untranslated region) mRNA.
Komplex
RISC má centrální část tvořenou proteiny z argonautové rodiny (Argonaute protein), přesněji proteinem Ago2, pro který je charakteristická jeho návaznost na domény PAZ a PIWI. Na PAZ doménu se váže dvounukleotidový přesah na 3´ konci dsRNA. PIWI doména plní funkci endoribonukleázy, štěpící fosfodiesterové vazby v cílové mRNA. Připojuje se tedy na fosfát na 5´konci miRNA.24 Ago2 protein spolu s ostatními proteiny (Ago1-4 protein) ovládají štěpící aktivitu RISC. 25
1.4. Funkce miRNA Míra homologie mezi miRNA a 3’UTR mRNA určuje další průběh vyjádření genetické informace ovlivňovaného genu. Zda bude translace potlačena, nebo bude celá buňka degradována. Při celkové komplementaritě RICS s mRNA nastává degradace mRNA, která však není u savců příliš běžná.26 Degradace se děje pomocí procesů deadenylace, deccapingu a exonukleotickému štěpení mRNA.
27
Jestliže ale komplementarita s mRNA není úplná,
nastává potlačení translace. Za stresových podmínek ovšem může miRNA působit opačným efektem a způsobit tak zvýšenou translaci mRNA. Tento stav nastává jen za určitých okolností díky složité kaskádě mechanismů, při které se určité sekvence ovlivňující funkci miRNA transformují na translační aktivační signál a tím přispívají k celkovému zvýšení translace mRNA.28 Jedna miRNA se může vázat na více mRNA a mít tak zásadní dopad na buněčnou fyziologii. 14
Obr 3: Cesta biogeneze miRNA. Endogenní miRNA gen je transkribován RNA polymerázou II (III) do pri-miRNA transkriptu. Pri-miRNA je komplexem Drosha/DGCR8 sestřihnuta do struktury vlásenky o délce okolo 70 nukleotidů nazývanou pre-miRNA,která je exportována do cytoplasmy přenašečem Exportinem 5. Enzym dicer stříhá pre-miRNA na vedoucí vlákno a vlákno určené k degradaci. Vedoucí vlákno se inkorporuje do komplexu RISC a vzniká „aktivní miRNA“. Převzato z Winter et al. 29
1.5. MiRNA a onkogeneze MiRNA hraje důležitou roli i v onkogenezi, pro kterou je charakteristické narušení běžných regulačních dějů jako je proliferace, diferenciace a apoptóza. Mnohé studie poukazují na to, že exprese miRNA je v nádorové tkáni rozdílná oproti expresi v normální tkáni.
30
Z tohoto pohledu můžeme miRNA klasifikovat jako onkogeny, či nádorové
supresory. Rozdělit miRNA na onkogeny a nádorové supresory můžeme podle jejich cílové mRNA. Onkogenní miRNA jsou v nádorové tkáni zvýšené a umlčují tak translaci nádorových supresorů.
31
Zatímco nízké exprese miRNA v nádorové tkáni značí, že se jedná o nádorové
supresory, které svým působením umlčují translaci onkogenů. 32 Řada studií se zabývá jednotlivými miRNA a pozorují jejich expresi v závislosti na případném dalším faktoru. Za mnohé jeden konkrétní příklad regulace proteinu c-Myc. 15
C-Myc protein má vliv na aktivaci exprese šesti miRNA umístěných na chromozomu 13. Změna regulace exprese či funkce genu c-Myc (8q24) je jednou z nejčastěji se vyskytujících abnormalit ve zhoubných nádorech. E2F1 protein je transkripčním faktorem pro c-Myc, který se podílí na regulaci buněčného cyklu a proliferaci buněk. E2F1 je negativně ovlivňován dvěmi miRNA z již zmíněných šesti zkoumaných miRNA. Jsou to miR-17-5p a miR-20a, inhibující translaci proteinu E2F1 v buňce, čímž při své zvýšené expresi působí jako negativní regulátory proteinu c-Myc. 33 Asi 50 % genů pro miRNA je lokalizováno ve zlomových oblastech či v oblastech chromozomů, které mají nějakou asociaci s nádorovou transformací.34
1.6. SiRNA Molekuly siRNA (small interfering RNA) byly poprvé zaznamenány v roce 1999 jako součást posttranskripčního umlčování genů v rostlinách.35 O dva roky později byly představeny syntetické siRNA jako možné mediátory při indukci RNAi.36 Tento důležitý objev odstartoval výzkum pro využití siRNA a RNAi v biomedicínských oborech. SiRNA vznikají štěpením dlouhých RNA, stejně jako tomu je u miRNA – pomocí RNázy Dicer. Ta dává vzniknout dvouvláknovým molekulám RNA o velikosti 21-23 nukleotidů mající stejně jako u miRNA přesah dvou bází na 3´konci. Po interakci siRNA s komplexem RISC, který díky své helikázové aktivitě rozplete dvouvláknovou siRNA, zůstane na RISC navázáno pouze jedno vlákno. Druhé vlákno (vedlejší) je pravděpodobně rozštěpeno pomocí enzymu Ago-2, který je obsažen v komplexu RISC.37 Takto aktivovaný komplex siRNA-RISC může interagovat s komplementární mRNA, kterou rozštěpí (zhruba uprostřed komplementárního úseku) svou nukleázovou aktivitou. Tím je mRNA poškozena a buněčnými mechanismy degradována, čímž je následně potlačena exprese cílového genu. Potlačení genu je specifické, čehož se využívá pro umlčení exprese genu vnesením syntetické siRNA do buňky. Díky siRNA je umožněno zjistit, jakou mají různé geny funkci, použijí-li se siRNA pro cílenou inaktivaci určitých genů. Mezi další významné aplikace patří využití molekul siRNA v antivirové terapii.38
2. Prostata Prostata je přídatná pohlavní žláza, tvořící alkalickou tekutinu, která je spolu s dalšími produkty varlat obsažena v ejakulátu a napomáhá tak správné funkci spermií.
16
2.1. Anatomie prostaty Prostata je umístěna mezi stydkou kostí a konečníkem, kde obepíná močovou trubici pod močovým měchýřem. Zdravá prostata váží zhruba 20 gramů. 39 Prostata se dělí dle McNeala 40 (užívá se pro urologickou praxi) na 3 zóny (obr. 4): I. Centrální zóna zaujímající zhruba 25 % objemu žlázy, tvořena z epitelu sinus urogenitalis a z Wolffova vývodu. Vzniká tu 25 % karcinomů prostaty II. Periferní zóna tvořící zhruba 65 % objemu celé žlázy je tvořena epitelem pocházejícího z entodermového epitelu sinus urogenitalis a vzniká tu největší procento (až 70 %) karcinomů prostaty, ventrálně je periferní zóna přerušena fibromuskulárním stromatem III. Přechodná (tranzitorní) oblast vytváří jen 5 % žlázy, ve starším věku je u mužů příčinou vzniku benigní hyperplazie prostaty
Obr. 4: Rozdělení prostaty na 3 zóny: Centrální, transitorní a periferní přerušena fibromuskulárním stromatem. Převzato z Baylor College of Medicine.
2.2. Funkce prostaty Jako přídatná pohlavní žláza zajišťuje prostata tvorbu sekretu o pH 6,4, který je zhruba třetinovou součástí ejakulátu. Obsahuje mnoho složek, které napomáhají při přenosu, stabilitě a funkci ejakulátu, jako jsou např. proteázy, spermin, spermidin, prostaglandiny a imunoglobuliny. Zajišťuje také tvorbu prostatického specifického antigenu, který slouží jako nádorový marker. 17
Funkce prostaty je závislá na androgenech, především testosteronu, bez kterých žláza časem ztrácí svou funkci, zbytňují malé žlázky a může docházet k benigní hyperplazii prostaty. 41
2.3. Karcinom prostaty Karcinom prostaty zaujímá přední místa ve výskytu mezi nádorovými onemocněními. V Evropě je druhým nejčastějším typem maligního nádorového onemocnění a v České republice je na třetím místě. Nejčastěji jsou jí postiženi muži staršího věku (kolem sedmdesáti let). Její příznaky nejsou nijak zřetelné jako u ostatních karcinomů, ze začátku jsou velmi mírné a nenápadné. Příznaky indikující možnou přítomnost karcinomu prostaty (únik moči, nutnost častého močení, zpomalené močení, atd.) se projevují až je karcinom v pokročilém stádiu. Jeli toto nádorové onemocnění zachyceno včas, má pacient velmi dobrou prognózu. V pokročilejších stádiích primární nádor metastázuje a to nejčastěji do kostí. Přesná příčina výskytu tohoto onemocnění není objasněna, ale určité faktory tu jsou (strava, genetická výbava, atd.). Postatou tohoto typu nádorového onemocnění je maligní růst žlázových buněk, nacházející se obvykle uvnitř žláz, které produkují tekutinu tvořící většinu spermatu. Za určitých podmínek mohou tyto buňky začít nekontrolovatelně proliferovat a tím vzniká nádorová tkáň. Nádor svým růstem napadá okolní tkáň a prorůstá prostatu. Jestliže přeroste přes vnější pouzdro a tukový obal prostaty, může se rakovina rozšířit do sousedních tkání, jako jsou močový měchýř a semenné váčky. Dále se může část buněk z primárního nádoru uvolnit do krevního či lymfatického oběhu a metastázovat do celého těla. 42, 43
2.4. MiRNA a karcinom prostaty Studiem miRNA spojeným s nádorem prostaty se zabývá mnoho vědeckých týmů po celém světě. Zatím nebyla prokázaná výrazná role miRNA spojená s nádorem prostaty, aby ji bylo možné použít jako prognostického markeru. Základním přístupem v této oblasti je zjistit nejčastěji exprimované miRNA asociované s nádorem prostaty a ty pak použít jako markeru. Na obrázku č. 5 jsou zobrazeny potenciální mechanismy vedoucí k abnormálně exprimované miRNA v neoplastické tkáni prostaty. Patří sem a) epigenetická modifikace, zvláště methylace DNA v blízkosti genu pro miRNA, což inhibuje transkripci miRNA genu, která snižuje pak její expresi; b) genomické přeskupení zahrnující ztrátu – snížení exprese nebo přebytek – zvýšení exprese miRNA genu; c) SNP (single nucleotide polymorphism) – jednonukleotidový polymorfismus v sekvenci pri-miRNA inhibuje proces biogeneze 18
snižováním afinity mezi Droshou a pri-miRNA. Tento mechanismus zapříčiňuje snížení exprese; d) zvýšená regulace enzymu Diceru je dalším mechanismem vedoucím ke zvýšené produkci miRNA; e) androgen-dependentní receptory (AR) zahrnují androgenně indukovanou vazbu receptoru na miR-21 promotor, který má za následek zvýšenou expresi miR-21. V nádorových prostatických buňkách může poškození DNA přes aktivaci proteinu p53 spustit overexpresi miR-34a/34c. 44, 45
Obr. 5: Mechanismy zapříčiňující zvýšenou či sníženou expresi miRNA v prostatické tkáni. 1. epigenetická modifikace. 2. Genomické přeskupení 3. Jednonukleotidový polymorfismus (SNP). 4. Zvýšená regulace Diceru. 5. Androgen-dependentní receptory (AR): I. Androgeně indukovaná vazba. II. Aktivace p53 poškozením DNA. Převzato z Pang et al. 44
2.5. Biomarkery nádoru prostaty Hledání ideálního biomarkeru pro včasnou detekci nádorového onemocnění se dostalo do popředí onkologického výzkumu. U nádoru prostaty je jako základním biomarkerem používán prostatický specifický antigen (PSA), ale stále se hledá přesnější a senzitivnější marker, jakým může být např. volně cirkulující sérová miRNA, zvýšená koncentrace 19
metalothioneinu a α-Methylacyl-CoA racemázy v neoplastické tkáni příp. v tělních tekutinách. Charakteristiku ideálního biomarkeru shrnuje schéma na obr. 6.
Výrazně zvýšená exprese v příslušné nemocné tkáni
Prokazatelně korelující s daným vývojovým
Ekonomický a
Ideální
rychle
Biomarker
detekovatelný
stádiem nemoci
Lehce kvantifikovatelný v přístupných biologických tekutinách
Obr. 6: Charakteristiky ideálního biomarkeru. Převzato a upraveno dle Chikezie et al.
49
2.5.1. MiRNA v séru Použití miRNA jako biomarkeru má své výhody, jakými je její snadná neinvazivní dostupnost, detekovatelnost přímo ze séra, rezistence vůči působení RNázy A a stabilita. V publikacích, které se věnují stabilitě miRNA bylo sérum podrobeno vysoce extrémním podmínkám jako je např. var, extrémní snížení (pH=1), nebo naopak zvýšení (pH=13) pH , nebo dlouhodobému uchování a několik po sobě jdoucích cyklů zmrazení a tání. 46 Proč se i při takovýchto podmínkách miRNA nedegradovala, když by se většina RNA již rozpadla se pokusil vysvětlit Hefnawy et al. Sérová miRNA je pravděpodobně chráněná před degradací zapouzdřením pomocí komplexů, které tvoří s lipidy či lipoproteiny.
47
Tyto komplexy se
nazývají exosomy. Exosomy jsou vezikuly o velikosti 50-100 nm, produkované širokým spektrem zdravých i nádorových buněk. Obsahují dva typy funkční RNA: mRNA a microRNA, zvané esRNA (exosomal shuttle). Transfer exosomů je novým a zatím ne zcela objasněným mechanismem genetické výměny informací mezi buňkami. Mohou se vázat na buňky 20
prostřednictvím interakce receptor-ligand, podobně jako je tomu u komunikace dvou buněk.48 Exosomy jsou také součástí moči a často nesou genetickou složku, která pochází přímo z nádorové tkáně. Ačkoliv jsou exosomy ve vzorcích moči přítomny v různých koncentracích, čímž je jejich analýza náročnější, slibují své využití v diagnostice onemocnění ledvin a prostaty. 49 Nicméně pro použití cirkulující miRNA jako diagnostického markeru je zapotřebí lépe porozumět mechanismům, pomocí kterých je miRNA uvolňována do krevního řečiště. V některých organismech jako je C. elegans a D. melanogaster se malé RNA mohou šířit z buňky do buňky. Pro miRNA zůstávají sekreční a inkorporační mechanismy zatím neobjasněné. 50 Exprese miRNA-141 v sérech pacientů V séru
pacientů
s karcinomem
prostaty je MiR-141 prokazatelně zvýšená, jak ukazuje graf na obrázku č. 7.
51
Stejně
tomu tak je i u pacientů s kolorektálním karcinomem.
52
Je proto braná zatím jako
nejslibnější biomarker do budoucna.
Obr. 7: srovnání sérové MiR-141 mezi zdravou kontrolou a nemocnými pacienty s metastázy. Převzato z Mitchell et al. 51
2.5.2. PSA Sérová hladina PSA je zatím považovaná jako nejspolehlivější marker v diagnostice časného stadia karcinomu prostaty,. PSA je glykoprotein složený z 237 aminokyselin o molekulové hmotnosti 34 kDa kódovaný genem uloženým na 19. chromozomu. Enzym je primárně produkován dukty a aciny v epiteliálních buňkách prostaty, dále pak periuretrálními žlázkami. Řadí se mezi kallikreiny a podílí se na zkapalňování spermatu. Hladina PSA, vykazující korelaci s věkem pacienta a objemem prostaty, je ovlivňována řadou dalších faktorů, než jen karcinomem, protože je produkován zdravou i nádorovou tkání. Výskyt PSA je ve volné či vázané formě. Stanovení poměru volného PSA k celkovému výrazně zvyšuje specifitu vyšetření. Zvýšená hladina PSA je např. i u benigní hyperplazie prostaty či u 21
chronické prostatitidy. Tato skutečnost je velkou nevýhodou pro diagnostiku karcinomu prostaty pomocí PSA, protože ukazuje zvýšenou hladinu i u nenádorových onemocnění, čímž se snižuje specifičnost PSA jako nádorového markeru. Referenční hodnoty hladiny PSA jsou od 0 do 4 ng/ml. Převládá názor, že po překročení této hodnoty by měla následovat punkční biopsie prostaty při sonografické kontrole. Pravděpodobnostní výskyt karcinomu prostaty (CaP) ukazuje tabulka č. 1. Vztah hladiny PSA k věku pacienta ukazuje tabulka č. 2. Hladina PSA se užívá i při monitoringu léčby, pro zjištění, zda je léčba účinná a zda nedochází k relapsu onemocnění. 53 Tab. 1: Pravděpodobnost karcinomu prostaty v závislosti na sérových hodnotách PSA. Převzato z www.urologieprostudenty.cz
Tab. 2: Standardizace PSA k věku
54
Převzato z www.urologieprostudenty.cz 54
PSA (ng/ml)
% CaP
PSA (ng/ml)
Věk
<2
1
0 - 0,25
40-49
2-4
20
0 – 3,5
50-59
4-10
25
0 – 4,5
60-69
> 10
> 50
0 – 6,5
70-79
2.5.3. α-Methylacyl-CoA racemáza α-Methylacyl-CoA racemáza (AMACR) je mitochondriální enzym, který hraje důležitou roli v β-oxidaci mastných kyselin a derivátů mastných kyselin a je specifický pro adenokarcinom prostaty.55 V nedávno publikované studii exprese v nádorové tkáni karcinomu prostaty,
byla pozorována jeho zvýšená
zatímco v benigní a normální epiteliální
prostatické tkáni nebyla jeho exprese téměř patrná.
56
Mohl by proto sloužit jako důležitý
nádorový marker. V současné době se používá především k odlišení adenokarcinomu prostaty od myoadenomatózní hyperplazie. 2.5.4. Metalothionein Metalothioneiny (MT) patří do rodiny nízkomolekulárních, intracelulárních proteinů s molekulovou hmotností mezi 6-10 kDa. MT byly objeveny Margoshesem a Valleem v roce 1957 při izolaci z koňských ledvin. 57 Obsahují vysoký podíl aminokyseliny cysteinu (až třetina hmotnosti), zatímco aromatické aminokyseliny zcela chybí. Právě vysoký podíl cysteinu dává MT jeho charakteristické vlastnosti, jako je navázání esenciálních iontů kovů díky sulfhydrylovým 22
skupinám. Uspořádání cysteinů v MT je ve třech charakteristických sekvencích: cys-x-cys, cys-x-y-cys nebo cys-cys, kde x,y jsou aminokyseliny jiné než cystein. MT jsou rozděleny dle své primární struktury a dle organismu, ze kterého pocházejí do dvou tříd MT-I a MT-II. Savčí MT jsou zastoupeny třídou MT-I a jsou tvořeny 61 až 68 aminokyselinami. MT-I jsou rozdělené do čtyř isoforem ( MT-1, MT-2, MT-3 a MT-4).58 Nejrozšířenější ve tkáních a nejlépe prostudované jsou formy MT-1 a MT-2. Isoforma MT-3 je charakteristická pro mozkovou tkáň. Nejméně prozkoumanou formou je MT-4. Všechny jsou kódovány rodinou genů lokalizovaných na lidském chromozomu 16q13. 59 Z terciární struktury vyplývá, kolik iontů je MT schopen navázat na své sulfhydrylové skupiny cysteinů. MT je dvoudoménový protein, skládá se z domény α se třemi vazebnými místy a z domény β se čtyřmi místy pro navázání divalentních iontů. Vážou-li se monovalentní ionty, může jejich počet být až 12. Struktura MT-II, jakožto nejčastěji se vyskytujícího zástupce rodiny MT, je zobrazena na obrázku č. 8. 60
Obr. 8: Struktura MT-2 proteinu zobrazuje dva klastry (C-konec u α-domény a N-konec u β-domény). Zahrnují 20 cysteinových zbytků s jejich atomy síry, které váží dvojmocné nebo jednomocné kationty (zde váží Zn). Domény jsou ohraničeny krátkým peptidem obsahující 30-32 aminokyselinových zbytků. V doméně β mohou být navázány 3 dvojmocné nebo 6 jednomocných iontů, zatímco v doméně α jich může být navázáno 4 dvojmocné nebo 6 jednomocných. Převzato z Nielsen et al. 60
Regulace exprese je ovlivňována přítomností iontů kovů, které ji mohou indukovat. Další faktory indukující expresi MT jsou cytokiny, hormony a xenobiotika. Po navázání transkripčního faktoru MTF-1 (metal-regulatory-transcription factor – 1) na regulační úsek DNA zvaný MRE (metal responsive element), ležící na promotoru genu pro MT, je zahájena 23
transkripce. Za normálních okolností se MTF-1 v buňce nachází v inaktivním stavu s navázaným MTI, což je inhibitor bránící navázání MTF-1 na MRE. Po vstupu iontu do buňky se tento iont naváže na MTI a uvolní se tím MTF-1, který může zahájit transkripci MT. 61
Vzrůstající koncentrace těžkých kovů tak může indukovat syntézu MT. Hlavní úlohou MT je transport esenciálních iontů kovů, regulace exprese, detoxikace a
udržení homeostáze těžkých kovů v organismu. Tyto schopnosti mají díky své vysoké afinitě k těžkým kovům (Zn, Cd, As, atd.). Důležitost MT v nádorových onemocněních potvrzuje jeho zvýšená hladina u proliferujících buněk. 62 Tato anomálie může být způsobena zvýšenou potřebou zinku, jakožto nejrozšířenějšího kovu v lidském organismu. 63
2.6. Způsoby diagnostiky karcinomu prostaty Karcinom prostaty můžeme identifikovat pomocí různých způsobů: 64, 65 2.6.1. Základní rozdělení čtyř stádií rakoviny prostaty Stadium A: Zjištění rakoviny náhodně nebo na základě zvýšeného PSA. Stadium B: Zjištění rakoviny na základě rektálního vyšetření - zůstává v prostatě. Stadium C: Rakovina rozšířená na tkáně vně prostaty. Stadium D: Rakovina rozšířená na lymfatické uzliny nebo kosti. 2.6.2. Obecné označení rakoviny mezinárodním systémem TNM Systém TNM byl založen Pierrem Denoixem mezi lety 1943 – 1952.66 Systém je modifikován pro každé nádorové onemocnění. Základními parametry TNM lze popsat rozsah a stádium nádorového onemocnění. Písmena TNM znamenají vždy nějakou hodnotu: T: Popisuje velikost tumoru číselným označením N: Popisuje rozšíření na lymfatické uzliny M: Popisuje rozšířenost rakoviny a její metastázy 2.6.3. Gleasonův gradingový systém Gleasonův gradingový systém je důležitý výchozí údaj pro určení léčby pro urology i onkology, zavedený doktorem Donaldem Gleasonem před téměř 40 lety.67 Gleasonovo desetistupňové skóre je založeno na zhodnocení stavu žláz v nádoru. Konečný výsledek je dán součtem G1 a G2, dvou stupňů diferenciace nádoru. Např. Gleason grade I. = 4, Gleason grade II. = 3, Gleasonovo skóre = 7. Skóre 7 a výše se považuje za vážné. 68 24
Díky neustálému pokroku medicíny bylo zapotřebí modifikovat i tento systém. Roku 2006 se proto na konferenci United States and Canadian Academy Meeting tento systém upravil. Účelem bylo dosáhnout co největší shody pro aplikaci Gleasonova skórovacího systému.69 Tabulka č. 3 ukazuje stupeň karcinomu dle Gleasonova hodnocení a jeho odpovídající specifickou mortalitu:
Tab. 3: Stupeň karcinomu a jeho odpovídající mortalita. Převzato z www.urologieprostudenty.cz 54
Karcinom
Specifická mortalita
2–4
4–7%
5
6 – 7%
6
18 – 30%
7
42 – 70%
8 – 10
60 – 80%
2.7. Karcinom prostaty v závislosti na hormonálním působení Rakovina prostaty se vyskytuje u mužů, kteří mají zachovanou funkci varlat. Významnou roli zde proto mají androgenní hormony. Androgeny regulující expresi různých genů skrze androgenní receptory udržují v prostatické tkáni rovnovážný stav díky správnému působení produktů právě těchto genů, které ovlivňují především diferenciaci a proliferaci buněk. U nádorové tkáně je tento stav narušen, převažuje zde proliferace buněk nad apoptozóu. 70 Testosteron je steroidní hormon tvořící se v Leydigových buňkách ve varlatech, který ovlivňuje vývoj mužských pohlavních orgánů, sekundárních pohlavních znaků a spermatogenezi. Testosteron se v těle může redukcí na uhlíku č. 5 působením 5α-reduktázy přeměnit na dihydrotestosteron (DTH). Tento endogenní steroidní hormon podporuje zvětšování prostaty díky své vysoké afinitě k androgenním receptorům (5krát vyšší než u testosteronu). Tento fakt podnítil studium fyziologické úlohy DTH a jeho vliv na karcinom prostaty, který spočívá ve funkci DTH jako hlavního androgenu
71
2.8. Léčba Správný výběr léčby závisí na velkém počtu faktorů, které nemoc ovlivňují (věk, 25
stádium a grading onemocnění, atd.). Léčba se dá rozdělit dle způsobu provedení: 72,73 Chirurgie Radikální prostatektomie je závažný zákrok, při kterém je odstraněna celá prostatická žláza i s okolními žlázami. Tento radikální krok je indikován pro závažné a již pokročilé případy rakoviny, kdy se lékař snaží především předejít šíření karcinomu dál z prostaty. Chirurgicky mohou být odstraněny lymfatické uzliny. Tento zákrok se provádí ještě před radikální prostatektomií. Radioterapie Může být použita jako primární radikální nebo jako paliativní léčba. Hlavní cíl této léčby je kontrola růstu nádoru a prevence. Hormonální terapie Karcinom prostaty je stimulován androgeny. Manipulace s hormony se užívá až v metastatickém tumoru. Při léčbě jsou z těla odstraněny mužské pohlavní hormony a nádor může pozastavit svůj růst a dostat se tak do neaktivního stádia. Chemoterapie Cytotoxická léčba se v rámci nádoru prostaty příliš neužívá ani při radikálním či adjuvantním postupu léčby. Volí se jen pro pokročilá stádia rakoviny, rezistentní k hormonální léčbě.
26
3. Cíle práce Optimalizovat izolaci miRNA (kit Roche, Ambion) Objasnit podstatu regulace MT1A a MT2A v nádorových buňkách prostaty v závislosti na Zn2⁺ Stanovit expresi vybraných miRNA ze séra na základě souvislosti s karcinomem prostaty (miR-23a, miR-141, miR-224, miR-296-3p, miR-320, miR-375, miR-376) Stanovit expresi vybraných typů miRNA z buněčných linií v závislosti na různé koncentraci Zn2⁺ (miR-23a, miR-141, miR-224, miR-296-3p, miR-320, miR-375, miR-376) a jejich souvislosti (částečnou homologii) s nádorem prostaty Srovnat výsledky exprese daných miRNA (miR-23a, miR-141, miR-224, miR296-3p, miR-320, miR-375, miR-376) s výsledky exprese genů MT1A a MT2A v prostatických buněčných liniích, popřípadě objasnit jejich vzájemnou souvislost
27
4. Praktická část 4.1. Aberace genů spojené s danými chromozomy (1,7,8,17) a nádorem prostaty Vyhodnocení různých aberací genů na chromozomech 1, 7, 8 a 17, které se na základě článků týmů Matsuuryho74 a Etima75 projevily jako nejčastěji spojené s karcinomem prostaty. První zmíněný článek se zabývá pěti druhy chromosomů: 7, 8, 17, X a Y a to pouze na japonské populaci. Výzkum byl proveden metodou FISH (fluorescence in situ hybridisation), což je metoda umožňující obarvení některých konkrétních částí chromosomů pomocí speciálních, na centromery specifických prób. Pokus byl proveden na zmrazených a čerstvých vzorcích tkáně z benigní hyperplazie prostaty. Z výsledků vyplývá, že není významný rozdíl mezi tkání zmraženou a čerstvou. Bylo testováno 28 vzorků s karcinomem prostaty. Numerické aberace jednoho nebo i více chromozomů se projevily u 20 z nich (70%). Nejčastěji se projevila numerická aberace na chromozomu 8, a to u 16 případů (57%), byla to nejčastěji trisomie (8/16). Druhým nejčastěji postiženým chromozomem byl chromozom 7 se 14 případy (50%). V šesti případech zde byla zaznamenána trisomie i tetrasomie zároveň. Aberace na chromozomech 17, X a Y byly detekovány po 11 (39%), 9 (32%) a 6 (21%) z 28 nádorových vzorků. Monosomie chromosomu byla zaznamenána pouze u dvou případů (7%), a to jen u chromozomu Y. Dvanáct (75%) ze 16 případů s numerickou aberací u chromosomu 8 měly aberaci i u chromosomu 7. Druhý článek vyhodnocoval již zveřejněnou literaturu na základě tří kritérií: věk, národnostní příslušnost a druh metody, jakou byl experiment proveden. Tým vytvořil databázi chromozomálních regionů asociovaných s karcinomem prostaty nazvanou ChromSorter PC. Z tohoto výzkumu vyplývá, že nejvíce referencí pojednávajících o spojitosti karcinomu prostaty a nějaké aberace se týká chromosomů 1,7, 8, 10, 13 a 16 (více než 40 referencí). Získaná data byla zhodnocena na základě počtu citací jednotlivých referencí a nejvíce se týkalo chromosomů 1, 8 a 18 (více než 600 citací). Na základě faktoru národní příslušnosti se jako nejvíce postižení karcinomem prostaty projevili běloši, zatímco Aškenázové, židi pocházející ze střední a východní Evropy, mají nejméně referencí. Citace těchto referencí podle národní příslušnosti se ukázala nejvíce početné pro bělochy a Japonce. Aškenázové spolu s příslušníky ostrovů v Pacifiku měli minimum citací. Reference věkového faktoru byla největší pro věkovou skupinu 59-65 let a stejně tak i citace odkazující na tyto reference. Nejčastěji referovaný typ metody byla CGH (Comparative genomic hybridization), FISH/ISH (fluorescence in situ hybridisation/ In situ hybridization) a LOH (Loss of heterozygosity) 28
s počtem referencí více než 150. Nejmenšího počtu se dostalo metodám conting mapping a segregation analysis. Veškeré zde popsané vyhodnocení bylo vztaženo ke všem chromosomům a jako nejreferovanější i nejcitovanější chromosomy byly vybrány chromosomy 8 a 1.
4.2. Chromozomy 1, 7, 8, 17 a jejich některé geny asociované s karcinomem prostaty 76 Chromozom 1 HPC1 region (heredity prostate cancer 1) – umístění: 1q24 – 1q25 PCAP region (predispoting for prostate cancer) – 1q42 – 1q43 Chromozom 7 EGFR (epidermal growth factor receptor) – umístění: 7p12 JAZF1 (juxtaposed with another zinc finger gene) – umístění: 7p15.2 Chromozom 8 LPL (lipoprotein lipasa) – umístění: 8p22 MYC (myelocytomatosis viral oncogene homolog) – umístění: 8q24 NKX3-1 – umístění: 8p21 TCEB1 – umístění: 8q21 PG1 region – umístění: 8p22-8p23 Chromozom 17 HNF1B – umístění: 17q12 HIC1 (hypermethylated in cancer) – umístění: 17p13.3 TP53 (tumor suppressor) – umístění: 17p13.1 BRCA1 (breast cancer) – umístění: 17q21 NM23 (non – metastatic) – umístění: 17q21.3
4.3. Exprese miRNA v prostatických buňkách v závislosti na metalothioneinu Vyhodnocení některých miRNA na základě částečné homologie se sekvencí genu pro MT1A probíhalo pomocí webu http://www.targetscan.org, kde se po zadání příslušného genu z databáze všech miRNA vyhledaly všechny miRNA, které mají část komplementární k této sekvenci. Takto byly vyhodnoceny miRNA pro MT1A a MT2A. Jako příklad je zde uvedená 29
sekvence pro MT1A, na které je barevně zvýrazněná komplementární část s určitou miRNA stejné barvy. Ostatní miRNA, které tu nejsou vyznačeny jako komplementární, mohou být částečně komplementární k MT2A (miR-376), nebo mají s karcinomem prostaty jinou spojitost, jako je jejich změněná exprese v nádoru prostaty oproti zdravé kontrole.77, 78 MT1A UGUCCGGACAGCCCUGCUCGAAGAUAUAGAAAGAGUGACCUGCACAAACUUGGAAUUUUUUUU CCAUACAACCCUGACCCAUUUACUGUAUUUUUUUUAAUGAAAUAUGUGAAUGAUAAUAAAAGU UGCUGACUU
miR-296-3p, miR-23a 4.3.1. Charakteristiky jednotlivých miRNA Sledovaný parametr u jednotlivých miRNA je jejich snížená či zvýšená produkce v nádoru prostaty oproti zdravé kontrole jak ukazuje tabulka č. 4. 79, 80, 81, 82, 83 Tab. 4: Produkce jednotlivých miRNA v závislosti na vydaných publikacích Exprese
Číslo publikace
MiR-23a
↓
79, 80, 83
MiR-141
↑
81
MiR-224
↑
82
MiR-296-3p
↑
79
MiR-320
↑
80
MiR-375
↑
81
MiR-376
nepotvrzena*
*exprese miR-376 v karcinomu prostaty není v literatuře zaznamenána
4.4. Materiál Prostatické buněčné linie: PNT1A – buněčná linie odvozená ze zdravých prostatických epitelálních buněk (HPA Culture Collections, Salisbury, UK) PC-3 – buněčná linie odvozená ze 4. stupně adenokarcinomu prostaty (HPA Culture Collections, Salisbury, UK) 22RV1 –
lidská buněčná linie odvozená ze štěpu nádorové tkáně (HPA
Culture Collections, Salisbury, UK) 30
LNCaP – lidská nádorová linie odvozená z metastatické lymfatické uzliny (ATCC, Manassas, VA, USA) Média jednotlivých linií: (antibiotikum: penicilin/streptomycin) PNT1A: RPMI-1640 médium s 10% FBS, atb. PC-3: Ham´s F12 médium s 7% FBS, atb. 22RV1: RPMI-1640 médium s 10% FBS, atb . LNCaP: RPMI-1640 médium s 10% FBS, atb. Kultivace při 37°C a 5%CO2
4.5. Použité chemikálie mirVana TM miRNA Isolation Kit (Ambion INC, Austin, Texas) mirVana TM PARIS TM Kit (Ambion INC, Austin, Texas) High Pure miRNA Isolation Kit (Roche) 10mM roztok síranu zinečnatého TaqMan MicroRNA Reverse Transkription Kit (Applied Biosystems, USA) TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems, USA)
4.6. Použité přístroje Minicentrifuga Eppendorf (Hamburg, Germany) NanoDrop, Spectrophotometer, ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA) Real-Time PCR: ABI Prism 7000 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, USA) Pipetovací stanice QIAgility (Qiagen - Gentra Systems, USA)
4.7. Metody 4.7.1. Izolace a kontrola kvality RNA Dvakrát promyté buňky třemi ml PBS
se následně seškrábly do 1ml PBS a
přepipetovaly do čisté zkumavky. Takto sesbírané buňky byly připraveny pro izolaci. Izolace RNA z buněčných linií pomocí komerční sady mirVana TM miRNA Isolation Kit: Podle doporučení výrobce byla izolována celková RNA pro pozdější miRNA stanovení: 1. K buňkám, které byly rozsuspendovány v 1 ml PBS bylo přidáno 600 μl Lysis/Binding Solution, čímž se buňky ihned zlyzovaly.
31
2. Dále byly buňky vortexovány po dobu několika sekund, dokud nedošlo k dokonalé homogenizaci. 3. K lyzátu byla dodána 1/10 objemu miRNA Homogenate Additive (60 μl) a byl promíchán na vortexu. Směs byla inkubována 10 minut na ledu. 4. Ve fázi organické extrakce, která vedla k odstranění proteinů a buněčných složek, bylo přidáno do směsi tolik objemu fenol:chloroformu, kolik měl lyzát před přidáním miRNA Homogenate Additive (600 μl). Celá směs byla vortexována po dobu 1 minuty. 5. Centrifugce probíhala po dobu 5 minut při 10 000 g při pokojové teplotě. 6. Horní fáze se žádoucími složkami byla přepipetována do čisté mikrozkumavky, do které byl pak přidán 100% ethanol v množství 1,25x větším, než je objem ve zkumavce (750 μl). 7. Celý obsah mikrozkumavky byl přenesen na kolonku (Filter Cartrige) umístěnou ve sběrné zkumavce (Collection Tube) dodávané spolu s reakční směsí. Přenesení reakční směsi muselo probíhat nadvakrát, protože se na kolonku může dát najednou max. 700 μl směsi. 8. Centrifugace běžela po dobu 15 s při 10 000 g při pokojové teplotě. 9. Obsah ve sběrné zkumavce byl vylit a byl dodán zbytek směsi. Centrifugace probíhala 15 s při 10 000 g při pokojové teplotě a následovalo opětovné vylití obsahu ve sběrné zkumavce. 10. Do kolonky bylo napipetováno 700 μl miRNA Wash Solution 1 (před použitím smíchán se 100% ethanolem dle návodu). 11. Centrifugace probíhala po dobu 15 s při 10 000 g a při pokojové teplotě. 12. Po vylití obsahu sběrné zkumavky bylo dodáno 500 μl Wash Solution 2/3 (před použitím smíchán se 100% ethanolem dle návodu). 13. Centrifugace trvala 15 s při 10 000 g a při pokojové teplotě. 14. Po opětovném vylití sběrné zkumavky byly předchozí 2 kroky opakovány. 15. Centrifugace probíhala po dobu 1 min při 10 000 g a při pokojové teplotě k odstranění residuálních tekutin z filtru. 16. Kolonka byla přenesena do nové sběrné zkumavky a bylo připipetováno 100 μl Elution Solution předehřátého na 95°C pro eluci při nízké iontové síle. 17. Centrifugace probíhala 30 s při 10 000 g a při pokojové teplotě pro eluci RNA. 18. Roztok ve sběrné zkumavce obsahující RNA skladován minimálně při -20°C. 32
Izolace RNA ze sér pomocí komerční sady mirVana TM PARIS TM Kit: Izolace ze sér probíhala stejným způsobem jako u mirVana
TM
miRNA Isolation Kitu.
Jako vstupní materiál se použilo sérum o objemu 600 μl. Z této procedury byly vyizolovány dvě různé extrakce pro stanovení ideálnějšího postupu izolace ze sér. První produkt byl získán ze zachycených molekul na kolonce, zatímco druhý produkt byl získán z dvakrát přečištěného séra, které proteklo kolonkou. Přečištění probíhalo organickou extrakcí dle návodu. Kontrola kvality Koncentrace a čistota vzorků byla změřena spektrofotometricky za použití přístroje Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies). Čistá RNA bez kontaminačních molekul má parametry A260/A280 > 2 , což
je poměr značící kontaminaci bílkovinami. Druhým
parametrem je poměr A260/A230 > 1,8, který značí kontaminaci chaotropními solemi a fenolem. 4.7.2. Reversní Transkripce Jelikož je pro q-PCR zapotřebí DNA pro amplifikaci, vyizolovaná RNA není pro amplifikaci pomocí q-PCR vhodným substrátem a je třeba ji za pomoci reverzní transkriptázy přepsat na komplementární DNA (cDNA). Pro tento účel posloužil TaqMan MicroRNA Reverse Transciption kit (Applied Biosystems, USA), se kterým byly dodány i TaqMan primery s vlásenkovou strukturou (stem-loop primer). Primer je vždy specifický pro cílovou mikroRNA. Obrázek č. 9 ukazuje postup specifické RT s následnou Real-time PCR. Metoda byla provedena na termocykléru podle následujícího postupu: 1. Příprava mastermixu (pro 1 reakci): 100mM dNTP
0,15 µl
MultiScribeTM Reverse Transcriptase (50 U/µl) 1,00 µl 10 x Reverse Transcription Buffer
1,50 µl
RNase Inhibitor (20U/µl)
0,19 µl
Nuclease-free water
4,16 µl
Celkový objem mastermixu
7,00 µl
2. K objemu 7 µl mastermixu se přidá 5 µl vzorku zředěného na koncentraci 2 ng/µl a 3 µl specifického primeru ke každé miRNA. Na každých 10 reakcí je zapotřebí přidat jednu reakci navíc pro pipetovací přesnost. 33
3. Směs o objemu 15 µl se vloží do termocykléru a běží dle následujícího programu: 30 min
16°C
30 min
42°C
5 min
85°C
∞ min
4°C
4. Získaná cDNA byla ihned použita pro q-PCR nebo uskladněna při -20°C. 4.7.3. Kvantitativní PCR v reálném čase Pro stanovení exprese cílových miRNA z produktu RT - cDNA, se používá kvantitativní PCR v reálném čase (q-PCR). Aby bylo možné vůbec provést q-PCR, je zapotřebí cílovou sekvenci označit sondou. Pro tento účel slouží specifické TaqMan sondy. Sonda má fluorescenční značku na 5´-konci a zhášeč na 3´-konci. Váže se na vnitřní část amplifikované sekvence a vytvoří-li spolu homoduplex, je rozložena 5´ exonukleázovou aktivitou DNA-polymerázy a dá vzniknout fluorescenci. Ta je pak zaznamenávána q-PCR. 84 Stanovení probíhalo na přístroji ABI Prism 7000 Sequence Detection Systems (Applieed Biosystems, USA). Reakční mix obsahoval: 1. Příprava reakční směsi TaqMan® Small RNA Assay
1,00 µl
Produkt RT reakce
4,00 µl
TaqMan® Universal PCR Master Mix
10,00 µl
Nuclease-free water
5, 00 µl
Celkový objem reakční směsi:
20 µl
2. Rozpipetování probíhalo pomocí pipetovací stanice QIAgility (Qiagen - Gentra Systems, USA), čímž bylo docíleno přesnějšího výsledku. Na každých cca 15 reakcí přibyly 3 reakce pro pipetovací chybu. 3. q-PCR reakce dle následujícího programu: 95°C
10 min
95°C
15s
60°C
10 min
40x
4. Měření různých buněčných koncentrací byla provedena v triplikátech a měření exprese v sérech v duplikátech. 34
Obr. 9: Specifická miRNA reverzní transkripce s následnou RT-PCR. Převzato a upraveno z www.ambion.com 85
4.7.4. Zpracování a analýza dat Vyhodnocení dat získaných z q-PCR probíhalo metodou „delta delta CT“ podle metodiky navrhnuté Applied Biosystems.
86
Jako kontrola exprese byl použit housekeeping
gen (hnu24). Exprese housekeeping genu se používá pro normalizování hodnot exprese cílového genu. Výsledky exprese všech triplikátů (duplikátů) stejné miRNA byly nejdříve zprůměrovány. Pokud se nějaká hodnota odchylovala o více než 1,5 cyklu, nebyla brána v potaz.
35
5. Výsledky 5.1. Regulace Zinku pomocí MT Od každé buněčné linie (PNT1A, 22RV1, PC-3, LNCaP) bylo vytvořeno pět vzorků o různé koncentraci. Do jednotlivých linií byl přidán 10 mM Zn2⁺ vždy v jiném množství, aby byla vytvořena koncentrační řada. Objemy přidaného zinku u jednotlivých liniích ukazuje tabulka č. 5. Tab. 5: Objem přidaného 10mM Zn2 ⁺ do 6 ml média PNT1A
22RV1
PC-3
LNCaP
0 μl
0 μl
0 μl
0 μl
30 μl
30 μl
15 μl
15 μl
45 μl
45 μl
30 μl
30 μl
60 μl
60 μl
45 μl
45 μl
90 μl
750 μl
60 μl
60 μl
5.2. Exprese MT1A a MT2A Exprese obou genů se projevila u všech prostatických linií, což potvrzuje jejich přítomnost. Míra přítomnosti těchto genů v jednotlivých liniích je shrnuta v následujících obrázcích č. 10 a 11.
Obr. 10: Exprese genu MT1A v liniích PNT1A, 22RV1, PC-3 a LNCaP
36
Obr. 11: Exprese genu MT2A v liniích PNT1A, 22RV1, PC-3 a LNCaP
5.3. Koncentrace vyizolovaných RNA 5.3.1. Koncentrace vyizolovaných krátkých úseků RNA z buněčných linií Výsledky koncentrací a čistoty jednotlivých linií ukazují tabulky č. 6, 7, 8 a 9. Tab. 6: Objem přidaného Zn2⁺ a jeho výsledné hodnoty koncentrací a čistoty u linie PNT1A Objem přidaného Zn2⁺ [μl]
Koncentrace [ng/μl]
Čistota 260/280
0
68,4
1,76
30
69,8
1,78
45
39,2
1,96
60
57,5
1,57
90
16,9
1,54
Tab. 7: Objem přidaného Zn2⁺ a jeho výsledné hodnoty koncentrací a čistoty u linie 22RV1 Objem přidaného Zn2⁺ [μl]
Koncentrace [ng/μl]
Čistota 260/280
0
205,6
2,06
15
109,0
2,03
30
205,0
2,05
45
99,0
1,97
60
158,8
1,98
37
Tab. 8: Objem přidaného Zn2⁺ a jeho výsledné hodnoty koncentrací a čistoty u linie PC-3 Objem přidaného Zn2⁺ [μl]
Koncentrace [ng/μl]
Čistota 260/280
0
440,8
2,07
30
844,8
2,12
45
448,8
2,08
60
398,1
2,02
750
35,4
1,37*
* koncentrace nebyla použita pro další pokusy díky svému vysokému znečištění
Tab. 9: Objem přidaného Zn2⁺ a jeho výsledné hodnoty koncentrací a čistoty u linie LNCaP Objem přidaného Zn2⁺ [μl]
Koncentrace [ng/μl]
Čistota 260/280
0
254,2
2,09
15
248,5
2,06
30
123,9
2,05
45
71,1
1,42*
60
5,1
1,41*
* koncentrace nebyla použita pro další pokusy díky svému vysokému znečištění
5.3.2. Koncentrace vyizolovaných krátkých úseků RNA ze vzorků sér Výsledky koncentrací a čistoty krátkých úseků dvou frakcí sér je uveden v tabulkách č. 10 a 11. Tab. 10: Vzorek vyizolovaný ze zachycených miRNA na kolonce Koncentrace [ng/μl]
Čistota 260/280
Pacient
1,4
1,78
Kontrola
1,1
1,82
Tab. 11: Vzorek vyizolovaný z proteklého séra kolonkou a následně dvakrát přečištěného Koncentrace [ng/μl]
Čistota 260/280
Pacient
12,2
0,60*
Kontrola
11,7
0,64*
* i přes vysoké znečištění vzorku jsme se vzorkem nadále pracovali
5.4. Srovnání hladin exprese miRNA u jednotlivých zinkových koncentrací U každého zinkové koncentrace byla provedena izolace RNA, následný přepis RNA do cDNA a q-PCR pro amplifikaci a zjištění stavu exprese. Takto bylo zkoumáno sedm miRNA (miR-23a, miR-141, miR-224, miR-296-3p, miR-320, miR-375, miR-376). Hodnocení bylo 38
provedeno na základě grafu závislosti koncentrace dané linie se specifickou sondou pro miRNA na hodnotě 2-ΔΔCT (hodnota vypočítaná z normalizovaných hodnot času exprese). Vyhodnocení trendů exprese jednotlivých miRNA v buněčné linii PNT1A ukazuje tabulka č. 12 a obrázek č. 11. Tab. 12: Trend exprese jednotlivých miRNA u linie PNT1A miRNA 23a 141 224 296-3p 320 375 376
Trend roste neexprimuje se roste roste roste roste* roste*
*nulová koncentrace zinku v reakci RT-PCR nevedla k expresi těchto miRNA, hodnotíme tudíž až od první zinkové koncentrace (30μl)
Obr. 11: Grafické znázornění závislosti času exprese (2-ΔΔCT) na množství přidaného zinku (μl) jednotlivých miRNA v linii PNT1A
39
Vyhodnocení trendů exprese jednotlivých miRNA v buněčné linii 22RV1 ukazuje tabulka č. 13 a obrázek č. 12. Tab. 13: Trend exprese jednotlivých miRNA u linie 22RV1 miRNA 23a 141 224 296-3p 320 375 376
Trend klesá klesá roste roste klesá klesá roste
Obr. 12: Grafické znázornění závislosti času exprese (2-ΔΔCT) na množství přidaného zinku (μl) jednotlivých miRNA v linii 22RV1
40
Vyhodnocení trendů exprese jednotlivých miRNA v buněčné linii PC-3 ukazuje tabulka č. 14 a obrázek č. 13. Tab. 14: Trend exprese jednotlivých miRNA u linie PC-3 miRNA Trend roste 23a neexprimuje se 141 roste 224 296-3p klesá roste 320 roste 375 exprese až po 35. cyklu* 376 * díky snížené expresi nebylo možné posoudit trend této miRNA
Obr. 13: Grafické znázornění závislosti času exprese (2-ΔΔCT) na množství přidaného zinku (μl) jednotlivých miRNA v linii PC-3
41
Vyhodnocení trendů exprese jednotlivých miRNA v buněčné linii LNCaP ukazuje tabulka č. 15 a obrázek č. 14. Tab. 15: Trend exprese jednotlivých miRNA u linie LNCaP miRNA 23a 141 224 296-3p 320 375 376
Trend klesá mírně roste mírně klesá mírně klesá roste roste klesá
Obr. Obr. 14: Grafické znázornění závislosti času exprese (2-ΔΔCT) na množství přidaného zinku (μl) jednotlivých linii LNCaP
42
5.5. Exprese miRNA ze sér Vyhodnocení exprese miR-23a v sérech zobrazuje tabulka č. 16. Tab. 16: exprese miR-23a v sérech miR-23a Pacient 1a Pacient 1b Kontrola 2a Kontrola 2b
Cyklus exprese miRNA 32,60 32,56 35,00 37,71
* symboly a, b značí postup izolace RNA ze séra (a je první frakce - viz. výše)
Vyhodnocení exprese miR-296-3p v sérech zobrazuje tabulka č. 17. Tab. 17: exprese miR-296-3p v sérech miR-296-3p Pacient 1a Pacient 1b Kontrola 2a Kontrola 2b
Cyklus exprese miRNA Nedetekovatelná Nedetekovatelná 39,5 39,13
Vyhodnocení exprese miR-320 v sérech zobrazuje tabulka č 18. Tab. 18: exprese miR-320 v sérech miR-320 Pacient 1a Pacient 1b Kontrola 2a Kontrola 2b
Cyklus exprese miRNA 29,25 25,87 27,96 27,54
Vyhodnocení exprese miR-375 v sérech zobrazuje tabulka č. 19. Tab. 19: exprese miR-375 v sérech miR-375 Pacient 1a Pacient 1b Kontrola 2a Kontrola 2b
Cyklus exprese miRNA 33,48 34,47 38,55 Nedetekovatelná
Zbývající tři miRNA (miR-141, miR-224 a miR-376) se v séru neexprimovaly.
43
6. Diskuze Pohled na mikroRNA je ve většině případů spojován s nádorovými onemocněními všech druhů a typů. Ať už se jedná o prevenci, diagnostiku či léčbu těchto onemocnění, je výzkum miRNA v těchto oblastech velmi aktuální. Vliv, kterým miRNA reguluje exprese nejrůznějších genů a proteinů je čím dál více objasňován a jsou zkoumány jeho účinky. Vztahem mezi miRNA a nádorem prostaty se zabývá velké množství vědeckých týmů po celém světě. Vztah mezi expresí miRNA v rozdílných zinkových koncentracích prostatických buněčných liniích a jejich možnou závislost na vztahu exprese genů MT1A a MT2A nebyl zatím publikován. Tato studie se snaží poukázat na souvislost mezi expresí jednotlivých mikroRNA v závislosti na různých zinkových koncentracích v prostatických buněčných liniích a v séru (bez zinkových koncentrací) pacienta s nádorem prostaty. Z této závislosti jsme se pak snažili vyhodnotit závislost na rostoucím či klesajícím trendu exprese metalothioneinu. Je známo, že u nádorových onemocnění se geny pro MT vyskytují v hojném počtu u prolifeujících buněk.62 Proto jsme vytvořili u čtyř prostatických buněčných linií (PNT1A, 22RV1, PC-3, LNCaP) vždy pět zinkových koncentrací od nulového množství Zn2⁺ po největší (viz. tabulka č. 5). Závislost metalothioneinu na rozdílných zinkových koncentracích se prokázala u zdravé linie PNT1A sníženou expresí MT1A, zatímco MT2A v této linii roste s přibývajícím množstvím zinečnatých iontů. U linie 22RV1 se v obou případech úměrně zvyšuje exprese MT1A i MT2A se zvyšující se přítomností Zn2⁺. V buněčné linii PC-3 se MT1A exprimoval zvýšeně do objemu zinku 30μl a pak z této hodnoty klesl pod počáteční hodnotu. Pro MT2A měla exprese v linii PC-3 rostoucí charakter. Exprese genu MT1A pro linii LNCaP nejevil jednoznačný trend, hodnoty oscilovaly. Pro MT2A měla exprese v linii LNCaP podobný charakter jako exprese MT1A pro linii PC-3. Z každé zinkové koncentrace byly provedeny izolace a exprese sedmi miRNA (miR23a, miR-141, miR-224, miR-296-3p, miR-320, miR-375, miR-376) metodou RT-PCR. Z výsledků jsme zjistili, že u nenádorové linie PNT1A rostou všechny miRNA kromě miR141, která se zde ani neexprimovala. Z literatury 79, 80 vyplývá, že by se měla exprese miR-23a v nádorových buňkách prostaty snižovat. To potvrdila exprese zdravých PNT1A, kde miR23a vzrůstá a také exprese v 22RV1 a LNCaP, kde se exprese snižovala oproti zdravé kontrole. Linie PC-3 tento trend nepotvrdila. MiR-141 se neexprimovala u zdravé linie PNT1A ani u linie 4. stupně adenokarcinomu - PC-3. V ostatních dvou liniích měla exprese 44
miR-141 vždy rozdílný charakter. Exprese miR-224 má rostoucí tendenci u všech linií kromě linie LNCaP. MiR-296-3p u nenádorové linie PNT1A roste, u linie 22RV1 roste velmi mírně a u zbývajících nádorových linií má klesající charakter. To by mohlo značit (s předpokladem, že 22RV1 také klesá nebo se její hodnota exprese nemění), že v nádorové tkáni je přítomnost této miRNA umlčována zvyšujícím se množstvím zinečnatých iontů. MiR-320 a miR- 375 mají rostoucí charakter pro všechny linie až na 22RV1, kde je trend exprese klesající. Poslední ze zkoumaných miRNA - miR-376 je svou expresí jednoznačná pouze u linie 22RV1, kde roste s přibývajícím množstvím zinečnatých iontů. Pro linie PNT1A a LNCaP je míra exprese v závěru klesající, ale tomuto výsledku předchází vysoká exprese. U linie PC-3 se miR-376 exprimovala až po 35. cyklu, kdy byly tyto hodnoty neinterpretovatelné. Pro miR-376 se tedy neprokázal žádný jednoznačný trend v expresi. Trend exprese miR-376 nelze porovnat s publikovanou literaturou, protože se zatím nikdo expresi miR-376 v prostatických liniích nevěnoval. Jako nejlépe exprimovanou miRNA bychom mohli označit miR-23a, která se exprimovala ve třech případech ze čtyř předpokládaným způsobem. Co se ovšem nepotvrdilo, byla zvýšená exprese miR-141 v séru, jak je publikováno v literatuře.
51
MiR-141 se vůbec neexprimovala spolu s dalšími dvěmi miRNA (miR-224 a
miR-376). Zato zajímavých výsledků bylo dosaženo při expresi miR-23a, která se u pacientů exprimovala v dřívějších cyklech než v séru zdravého jedince, což značí její větší množství v séru u pacientů s nádorem prostaty. Podobně tomu je u miR-375, která se u pacientů exprimuje už v polovině 33. cyklu, zatímco u zdravé kontroly až téměř v 39. cyklu, který se již nezapočítává do reálné exprese („předamplifikace“ substrátu by mohla tyto exprese ujasnit). O miR-296-3p by se dalo říci, že se vyskytuje (i když detekce v 39. cyklu není ideální) u zdravých jedinců ve větším množství, zatímco u pacientů se tato miRNA nevyskytuje. Pro miR-320 není výsledek zcela zřejmý díky rozdílné expresi u dvou frakcí pacientů. Z takto získaných výsledků by se mohlo dedukovat, že například rostoucí trend MT2A (tudíž zvýšené množství proteinu MT) v linii PC-3 má pro miR-296-3p u stejné nádorové linie umlčovací vlastnosti a potlačuje tím tvorbu této miRNA.
45
7. Závěr Nádor prostaty je vzhledem k jeho vysokému výskytu a stále vysoké mortalitě závažným a aktuálním tématem pro velkou škálu výzkumných oborů. Souvislost mezi tímto onemocněním a krátkými nekódujícími úseky RNA, zvané mikroRNA, je pro jejich významnou roli v genové expresi v popředí vědeckého výzkumu. V této studii jsme se snažili nalézt souvislost, kterou by mohly vykazovat nádorové prostatické linie se sedmi typy mikroRNA (miR-23a, miR-141, miR-224, miR-296-3p, miR320, miR-375, miR-376). Jejich výběr byl zajištěn díky částečné homologii s geny pro metalothionein, protein, který reguluje těžké kovy. V nádorové tkáni se tento protein vyskytuje ve zvýšeném množství, a proto jsme se snažili poukázat na jeho souvislost s jednotlivými miRNA. Vyizolovali jsme proto RNA z prostatických buněčných linií (PNT1A, 22RV1, PC-3, LNCaP) v pěti různých koncentracích zinkových iontů. RNA jsme podrobili RT-PCR se specifickými sondami pro jednotlivé miRNA a vyhodnotili jejich expresi v závislosti na množství přidaného zniku. Hladiny expresí jednotlivých miRNA korelovaly s hladinou exprese MT různě. Izolaci RNA a její následnou RT-PCR jsme provedli i u séra pacienta s nádorem prostaty ve srovnání se zdravým jedincem. U třech miRNA se exprese mezi pacientem a kontrolou projevila rozdílnou hladinou přítomné miRNA. Naše studie se jako první zaobírá možnou souvislostí mezi metalothioneinem a miRNA k němu částečně komplementárními. V budoucnu by se mohlo využít změn exprese miRNA v závislosti na MT pro diagnostiku nádoru prostaty.
46
8. Souhrn MikroRNA jsou krátké jednovláknové úseky RNA, které mají zásadní význam v základních buněčných procesech. Mezi tyto procesy můžeme zařadit proliferaci, diferenciaci a apoptózu, známé to procesy při vzniku onkogeneze. Účinkem mikroRNA lze pozastavit transkripci jednotlivého genu a tím ovlivnit produkci proteinu, který tento gen kóduje. Souvislost mezi miRNA a rozdílnou hladinou metalothioneinu v buněčných prostatických liniích se snaží tato bakalářská práce objasnit.
47
9. Summary MicroRNAs are short stretches of single-stranded RNA that are essential in basic cellular processes. These processes can include proliferation, differentiation and apoptosis, a process known in the development of carcinogenesis. The effect of microRNAs can suspend an individual gene transcription and thus affect the production of protein that encodes the gene. The link between miRNAs and different levels of metallothionein in prostate cell lines was studied in this bachelor thesis.
48
Literatura 1
Cooppola V., et al. (2010): MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer; 17: F1-F 17
2
Chen K & Rajewsky N (2007): The evolution of gene regulation by transcription factors and
microRNAs. Nature Reviews Genetics; 8: 93–103 3
He L & Hannon GJ 2004 MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature
Reviews Genetics; 5: 522–531 4
Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. (1993): The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small
RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell; 75: 843–854 5
Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001): Identification of novel genes
coding for small expressed RNAs. Science; 294: 853-858 6
Lim, L. P., Glasner, M.E., Yekta,S., Burge,C.B. & Bartel, D.P. (2003): Vertebrate microRNA genes.
Science; 299(5612):1540 7
Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. (2005): Conserved seed pairing, often flanked by adenosines,
indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell; 120: 15–20 8
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E,. Mello, C.C. (1998): Potent and
specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature; 391: 806811 9
Bartel DP (2004): MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell; 116: 281–297.
10
Elena I. Schwartz (2009): Potential application of RNAi for understanding and therapy of
neurodegenerative diseases, Frontiers in Bioscience; 14: 297-320 11 12
www.microrna.ic.cz Amy L. Zimmerman, Shiyong Wu (2011): MicroRNAs, cancer and cancer stem cells, Cancer
letters; 300: 10-19 13
A. Rodriguez, S. Griffiths-Jones, J.L. Ashurst, et al. (2004): Identification of mammalian microRNA
host genes and transcription units, Genome Res. 14: 1902–1910 14
Y.K. Kim, V.N. Kim, (2007): Processing of intronic microRNAs, EMBO J; 26 775–783
15
Lee Y., Kim M., Han J., Yeom K.H., Lee S., Baek S.H., Kim V.N., (2004): MicroRNA genes are
transcribed by RNA polymerase II. EMBO J; 23: 4051–4060 16
Borchert G, Lanier W, Davidson B. (2006): RNA Polymerase III transcribes human microRNAs.
Nat Struct Mol Biol.;12:1097–1101 17
Gregory RI, Yan KP, Amuthan G, et al. (2004): The Microprocessor complex mediates the genesis
of microRNAs. Nature; 432:235-40
49
18
Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H. et al. (2003): The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA
processing. Nature; 425:415-9 19
Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., Hannon, G.J. (2001): Role for a bidentate
ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature; 409: 363–366 20
Han J, Lee Y, Yeom KH, Nam JW, Heo I, Rhee JK, Sohn SY, Cho Y, Zhang BT, Kim VN. (2006):
Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex. Cell; 125:887–901 21
Gwizdek, C., Ossareh-Nazari, B., Brownawell, A.M., Doglio, A., Bertrand, E., Macara, I.G.,
Dargemont, C. (2003): Exportin-5 mediates nuclear export of minihelix-containing RNAs. J. Biol. Chem; 278: 5505–5508 22
Elbashir, S.M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W. and Tuschl, T. (2001): Functional
anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J; 20: 6877–6888 23
Gunter Meister & Thomas Tuschl, (2004): Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA,
Nature; 431: 343-349 24
Cerutti, L., Mian, N., Bateman, A. (2000): Domains in gene silencing and cell differentiation
proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the piwi domain. Trends Biochem. Sci; 25: 481– 482 25
Liu J, Carmell MA, Rivas FV, Marsden CG, Thomson JM, Song JJ, Hammond SM, Joshua-Tor L,
Hannon GJ (2004): Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science;305:1437–41. 26
Rodriguez A., Griffiths-Jones S., Ashurst J.L., Bradley A. (2004): Identification of mammalian
microRNA host genes and transcription units. Genome Res; 14:1902–1910 27
Carthew R. W., Sontheimer E. J. (2009): Origins of mechanisms of miRNA and siRNA. Cell 136,
642–655 28
Vasudevan S., Tong Y., Steitz J.A. (2007): Switching from repression to activation: microRNAs can
up-regulate translation. Science; 318: 1931–1934 29
Julia Winter, Stephanie Jung, Sarina Keller, Richard I. Gregory & Sven Diederichs (2009): Many
roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nature Cell Biology 11, 228 234 30
Volinia, S., Calin, G. A., Liu, C. G., Ambs, S., Cimmino, A., Petrocca, F., Visone, R., Iorio, M.,
Roldo, C., Ferracin, M., Prueitt, R. L., Yanaihara, N., Lanza, G., Scarpa, A., Vecchione, A., Negrini, M., Harris, C. C., and Croce, C. M. (2006): A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci U S A; 103: 2257-2261 31
Kumar, M.S., Lu, J., Mercer, K.L., Gloub, T.R., Jacks, T. (2007): „Impaired microRNA processing
enhances cellular transformation and tumorgenesis.“ Nat. Genet., 39: 673-677
50
32
Johnstone. R.W., Rufl. i A.A., Lowe. S.W. (2002): ,,Apoptosis: a link between cancer genetics and
chemotherapy.“ Cel,l 108(2): 153-64 33
O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, Dang CV, Mendell JT. (2005): c-Myc-regulated microRNAs
modulate E2F1 expression. Nature; 435(7043): 839–43 34
Calin, G.A., Sevignani, C., Dumitru, C.D., Hyslop, T., Noch, E., Yendamuri, S., Shimizu, M.,
Rattan, S., Bullrich, F., Negrini, M. and Croce, C.M. (2004): Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A; 101(9): 2999-3004 35
Hamilton A, Baulcombe D (1999): A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene
silencing in plants. Science; 286 (5441): 950–2 36
Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001): Duplexes of 21-
nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature; 411 (6836): 494–8 37
Leuschener, P.J.F., Ameres, S.L., Kueng, S. and Martinez, J. (2006): Cleavage of the siRNA
passenger strand during RISC assembly in human cells. EMBO rep 7: 314–320 38
Nykanen, A., Haley, B., Zamore, P.D. 2001: ATP requirements and small interfering RNA structure
in the RNA interference pathway. Cell 107: 309- 321 39
www.wikipedia.org
40
John E. McNeal, MD, David G. Bostwick, MD, (1984): Anatomy of the Prostatic Urethra, Jama;
251(7):890 41
http://prostata.ordinace.biz/
42
Parwani AV, Kronz JD, Genega EM, Gaudin P, Chang S, Epstein JI. (2004): Prostate carcinoma
with squamous differentiation. An analysis of 33 cases. Am J Surg Pathol; 28(2): 651-657 43
Petruželka, Konopásek a kolektiv (Praha, 2003): Klinická Onkologie, ISBN 80-246-0395-0
44
Yingxin Pang, Charles Y.F. Young, and Huiqing Yuan, (2010): MicroRNAs and prostate cancer,
Acta Biochim Biophys Sin; 42: 363–369 45
http://www.prostata.nadory.cz/
46
Xi Chen, Yi Ba, Lijia Ma, Xing Cai, Yuan Yin, Kehui Wang et al. (2008): „Characterization of
microRNA in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis cancer and other diseases. Cell Research, 18:997–1006 47
El-Hefnawy T., Raja S., Kelly L. et al.(2004): Characterization of amplifiable, circulating RNA in
plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics. Clin Chem; 50: 564-573 48
Hadi Valad, Karin Ekström, Apostolos Bossios, Margareta Sjöstrand, James J Lee & Jan O Lötvall,
(2007): Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells, Nature Cell Biology; 9, 654 - 659
51
49
Chikezie O. Madu and Yi Lu (2010): Novel diagnostic biomarkers for prostate cancer, Journal of
Cancer; 1: 150–177 50
Nobuyoshi Kosaka, Haruhisa Iguchi and Takahiro Ochiya, (2010): Cirulating microRNA in body
fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer science; 101:10, 20872092 51
Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL and Peterson
A, et al. (2008): Circulating microRNA as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci USA; 105: 10513–10518 52
Hanyin Cheng, Lina Zhang, David E. Cogdell, Hong Zheng, Aaron J. Schetter, Matti Nykter, Curtis
C. Harris, Kexin Chen, Stanley R. Hamilton, and Wei Zhang, (2011): Circulating Plasma MiR-141 Is a Novel Biomarker for Metastatic Colon Cancer and Predicts Poor Prognosis. PLoS One; 6(3): e17745 53
MUDr. Michael Pešl, MUDr. Libor Zámečník, prof. MUDr. Jan Dvořáček, DrSc. (2004):
Prostatický specifický antigen a odvozené parametry. Urologie pro praxi; 2004/2 54
www.urologieprostudenty.cz
55
Bridget Bickers, Claire Aukihm-Hastie, (2009): New Molecular Biomarkers for the Prognosis and
Management of Prostate Cancer - The Post PSA Era, Anticancer reseach; 29:(8) 3289-3298 56
Ichiya Honma, Toshihiko Torigoe, Yoshihiko Hirohashi, Hiroshi Kitamura, Eiji Sato, Naoya
Masumori, Yasuaki Tamura, Taiji Tsukamoto, and Noriyuki Sato, (2009): Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of alpha-methylacyl-coenzyme A racemase in prostate cancer, J Transl Med; 7: 103 57
M. Margoshes, and B. L. Vallee, (1957): Journal of the American Chemical Society, 79, (17), 4813-
4814 58
Zelená J, Potěšil D, Vacek J, Adam V, Hradecký J, Průša R, Kizek R, Vojtěšek B, (2004):
Metalothionein jako prognostický marker nádorového onemocnění, Klinická onkologie; vol. 17/2004, s. 190-195 59
Miles, A.T., Hawksworth, G.M., Beattie, J.H. and Rodilla, V. (2000): Induction, regulation,
degradation, and biological significance of mammalian metallothioneins. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology; 35, 35-70 60
Allan Evald Nielsen, Adam Bohr, and Milena Penkowa (2006): The Balance between Life and
Death of Cells: Roles of Metallothioneins, Biomark Insights; 1: 99–111 61
Gunes, C., Heuchel, R., Georgiev, O., Muller, K.H., Lichtlen, P., Bluthmann, H., Marino, S.,
Aguzzi, A. and Schaffner, W. (1998): Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the metal-responsive transcriptional activator MTF-1. Embo Journal; 17, 2846-2854 62
W. W. Nagel, and B. L. Vallee (1995): Cell cycle regulation of metallothionein in human colonic
52
cancer cells Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 92, (2), 579-583 63
R. Studer, C. P. Vogt, M. Cavigelli, P. E. Hunziker, and J. H. R. Kagi (1997): Metallothionein
accretion in human hepatic cells is linked to cellular proliferation, Biochemical Journal; 328, 63-67 64
Adam, Vorlíček a kolektiv, (Brno, 2002): Speciální onkologie, ISBN 80-210-2826-2
65
Okada K, Yamanaka Y, Hachiya T, Ishida H., (1998): Clinical staging of prostate cancer, Nippon
Rinsho, 56(8):1963-8 66
Denoix PF. (1946): Enquete permanent dans les centres anticancereaux. Bull Inst Nat Hyg;1:70–5
67
Donald F. Gleason, George T. Mellinger (1974): Prediction of prognosis for prostatic
adenocarcinoma by combined histological grading and clinical paging of prostatic carcinoma, J. Urol, 111: 58–64 68
J. I. Epstein, Co je nového v hodnocení patologie karcinomu prostaty v roce 2006, Urologické listy;
4: 4 69
Epstein JI, Allsbrook WC jr, Amin MB. (2005): The 2005 International Society of Urological
Pathology (ISUP) Consensus Conference on leason Grading of Prostatic Carcinoma. Am J Surg Pathol; 29: 1228-1242 70
L. Stárky (2009): Dihydrotestosteron a inhibitory steroidní 5α-reduktázy, Urologické listy; 5(3): 11-
16 71
Marks LS, Hess Dl, Dorey FJ, Macairan ML, (2006): Prostatic tissue testosterone and
dihydrotestosterone in African-American and white men. Urology; 68(2): 337-241 72
L. Klotz, K. Pienta (2009): Terapeutické možnosti pro léčbu pokročilého karcinomu prostaty,
Urologické listy; 7(3): 15-23 73
Andreoiu M, Cheng L. (2010): Multifocal prostate cancer: biologic, prognostic, and therapeutic
implications. Human patology; (6):781-93 74
H. Matsuura, T. Shiraishi, R. Yatani and J. Kawamura, (1996): Interphase cytogenetics of prostate
cancer: fluorescence in situ hybridisation (FISH) analysis of Japanese cases, British Journal of Cancer; 74: 1699-1704 75
Ann Etim, Guohui Zhou, Xinyu Wen, Hang Liu, Victor Ruotti, Simon Twigger, et al. (2003):
ChromSorter PC: A database of chromosomal regions associated with human prostate cancer, BMC Genomic; 5: 27 76
www.genecards.org
77
www.targenscan.org
78
www.mirbase.org
53
79
Michael D Mattie, Christopher C Benz, Jessica Bowers et al., (2006): Optimized high-throughput
microRNA expression profilig provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Molecular Cancer; 5:24 80
Kati P. Porkka, Minja J. Pfeiffer, Kati K. Waltering, et al., (2007): MicroRNA Expression Profiling
in Prostate Cancer, Cancer Res; 67:6130-6135 81
Jan C. Brase, Marc Johannes, Thorsten Schlomm et al., (2011): Circulating miRNAs are correlated
with tumor progression in prostate cancer, International Journal of Cancer; 128: 608-616 82
Robyn L. Prueitt, Ming Yi, Robert S. Hudson, Tiffany A. Wallace, et al. (2008): Expression of
microRNAs and Protein-coding Genes Associated with Perineural Invasion in Prostate Cancer. Prostate; 68(11): 1152–1164 83
A W Tong, P Fulgham, C Jay, P Chen, I Khalil, S Liu, N Senzer, A C Eklund, J Han and J
Nemunaitis, (2009): MicroRNA profile analysis of human prostate cancers Differential miRNA expression in prostate cancer; Cancer Gene Therapy ; 16: 206-216 84
Šmarda J., Doškař J., Pantůček R. et al. (2008): Metody molekulární biologie. 1. vydání. Brno:
vydala Masarykova univerzita. ISBN 978–80-210–3841-7 85
www.ambion.com
86
www.appliedbiosystems.com
54
